DE4403780A1 - Non-radioactive assay for bio-molecules, esp. nucleic acids - Google Patents
Non-radioactive assay for bio-molecules, esp. nucleic acidsInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum nichtradioaktiven Nachweis von Biomolekülen
(insbesondere Nukleinsäuren) in spezifischen Bindungsassays (Hybridisierung)
Der Einzug und die Verbreitung von Analysentechniken, die auf der hochspezifischen
Wechselwirkung komplementärer Nukleinsäuresequenzen basieren, hat stark die Entwick
lung nichtradioaktiver Markierungsstrategien stimuliert. Vor allem die durch den natürli
chen Zerfall von bislang verwendeten Isotopen verursachte Kurzlebigkeit der genutzten
Nukleinsäuresonden, die für das Arbeiten mit radioaktiven Isotopen notwendigen
Sicherheitsvorkehrungen, das gesundheitliche Restrisiko und Probleme der Abfallbesei
tigung, stellen eine breite Nutzung radioaktiver Markierungsverfahren in Frage.
Alternativ wurden dementsprechend eine Reihe nichtradioaktiver Varianten zur Nuklein
säuremarkierung entwickelt. Man unterscheidet zwei grundlegende Verfahren der Markie
rung, das direkte und das indirekte Markieren.The invention relates to a method for the non-radioactive detection of biomolecules (in particular nucleic acids) in specific binding assays (hybridization).
The advent and spread of analytical techniques based on the highly specific interaction of complementary nucleic acid sequences has strongly stimulated the development of non-radioactive labeling strategies. Above all, the short-lived nature of the nucleic acid probes used, which is caused by the natural decay of isotopes used to date, the safety precautions necessary for working with radioactive isotopes, the residual health risk and problems with waste disposal, call into question the widespread use of radioactive labeling methods. Alternatively, a number of non-radioactive variants for nucleic acid labeling have been developed accordingly. There are two basic methods of marking, direct and indirect marking.
Beim direkten Verfahren werden ein oder mehrere Markermoleküle mit der nachzuweisen den Nukleinsäure verbunden und der eigentliche Nachweis über die chemischen, biochemi schen oder physikochemischen Eigenschaften der Markierungsmoleküle geführt.In the direct method, one or more marker molecules are detected with the linked to the nucleic acid and the actual evidence of the chemical, biochemical or physicochemical properties of the marker molecules.
Diese Markierungsmoleküle können zum Beispiel Komplexe von Seltenerden- oder Über gangsmetallen mit organischen Liganden sein [Oser et al., Anal. Biochem. 191 (1990) 295; EP 0 340 675]. Zum eigentlichen Nachweis (Nukleinsäuredetektion) werden die Fluores zenzeigenschaften dieser Komplexe genutzt. Weiterhin sind an Nukleinsäuremoleküle ge bundene Proteine (z. B. alkalische Phosphatase oder Meerrettichperoxidase) und die Nutzung von deren Enzymaktivität in einer zur Produktion von Signalen geeigneten Folge reaktion (z. B. Lichtemission, Bildung eines Farbniederschlages) [Pollard-Knight et al., Anal. Biochem. 185 (1990) 84; Jablonski et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 6115] be kannt. Der Einsatz von sequenzspezifisch an Nukleinsäuren bindende Proteine als direkte DNA-Marker [EP 0 310 251] ist ebenfalls erwähnt, wie der Einsatz von DNA-Doppel strang spezifischen Antikörpern [EP 0 135 159].These labeling molecules can, for example, complexes of rare earth or over transition metals with organic ligands [Oser et al., Anal. Biochem. 191 (1990) 295; EP 0 340 675]. For the actual detection (nucleic acid detection) the fluores characteristics of these complexes. Furthermore, there are ge on nucleic acid molecules bound proteins (e.g. alkaline phosphatase or horseradish peroxidase) and the Use of their enzyme activity in a sequence suitable for the production of signals reaction (e.g. light emission, formation of a color precipitate) [Pollard-Knight et al., Anal. Biochem. 185 (1990) 84; Jablonski et al., Nucleic Acids Res. 14 (1986) 6115] be knows. The use of sequence-specific proteins that bind to nucleic acids as direct DNA markers [EP 0 310 251] are also mentioned, such as the use of double DNA strand-specific antibodies [EP 0 135 159].
Die genannten direkten Verfahren zur Nukleinsäuremarkierung erfordern jedoch, um die notwendige Empfindlichkeit zu erreichen, einen nicht unerheblichen instrumentellen Auf wand an hochempfindlicher Analysentechnik zur Registrierung der Fluoreszenz- bzw. an derer Emissionen. Bei der Nutzung von Proteinen als direkte Nukleinsäuremarker wird da gegen die Anwendungsbreite der markierten Derivate dadurch eingeschränkt, daß die Wahl der Bedingungen für die den Assays zugrundeliegenden Hybridisierungsreaktionen, immer an den für die Enzymaktivität optimalen Parametern orientiert werden muß. Gleiches gilt für vorbereitende Amplifikationen (z. B. PCR). Dies ist erforderlich, um nicht durch Dena turierungserscheinungen die Marker irreversibel zu schädigen und damit die Sensitivität der Nachweise zu beeinträchtigen.However, the direct methods mentioned for nucleic acid labeling require in order to necessary sensitivity to achieve a not inconsiderable instrumental up used highly sensitive analysis technology to register the fluorescence or their emissions. When using proteins as direct nucleic acid markers there will be restricted against the scope of application of the marked derivatives by the fact that the choice the conditions for the hybridization reactions on which the assays are based, always must be based on the optimal parameters for the enzyme activity. same for for preparatory amplifications (e.g. PCR). This is necessary in order not to be dena through tururing phenomena irreversibly damage the markers and thus the sensitivity of the evidence.
Indirekte Verfahren der Nukleinsäuremarkierung nutzen im Gegensatz zu direkten Anker moleküle, die in die zu markierenden Spezies eingeführt werden. Dies können Haptene sein, von denen bislang das Aglycon des Digitalistoxins "Digoxigenin" [Kessler, Mol. Cell. Probes 5 (1991) 161] aber auch andere Verbindungen, wie Nitrobenzenderivate [EP 0 485 155], Fluoreszein oder Xanthinverbindungen [EP 0 485 156] beschrieben sind. In ähnlicher Weise kommt Biotin zum Einsatz. Zur eigentlichen Detektion der mit Haptenen bzw. Bio tin markierten Biomoleküle wird der mit einem Enzym konjugierte spezifische Antikörper oder im Fall des Biotins Avidin bzw. Streptavidin gegeben. Nach erfolgter Bindung an das Hapten wird überschüssiges Antikörper/Enzymkonjugat aus dem Ansatz entfernt (i.d.R. durch Waschoperationen) und dann über die Enzymaktivität mit entsprechenden signal erzeugenden Reaktionen der eigentliche Nachweis durchgeführt.In contrast to direct anchors, indirect methods of nucleic acid labeling use molecules that are introduced into the species to be labeled. Haptens can do this , of which the aglycon of the digitalistoxin "digoxigenin" [Kessler, Mol. Cell. Probes 5 (1991) 161] but also other compounds, such as nitrobenzene derivatives [EP 0 485 155], fluorescein or xanthine compounds [EP 0 485 156]. More like that Biotin is used wisely. For the actual detection of those with haptens or bio In labeled biomolecules, the specific antibody conjugated to an enzyme becomes or in the case of biotin, avidin or streptavidin. After binding to the Excess antibody / enzyme conjugate is removed from the mixture (usually by washing operations) and then via the enzyme activity with the corresponding signal generating reactions the actual detection is carried out.
Problematisch beim Einsatz enzymkonjugierter Antikörper ist vor allem, daß die verwendeten Derivate zur unspezifischen Bindung mit verwendeten Matrizes (z. B. Nylon- oder Nitrozellulosemembranen) neigen, was insbesondere bei längeren Inkubationszeiten zu unerwünschten Untergrundsignalen führt und die Sensitivität der Nachweise beein trächtigt. Deshalb sind zusätzliche Blockierungsschritte erforderlich, die das Gesamtverfah ren erschweren und die Assayzeit verlängern.The main problem with the use of enzyme-conjugated antibodies is that the derivatives used for non-specific binding with the matrices used (e.g. nylon or nitrocellulose membranes), which is particularly the case with longer incubation times leads to unwanted background signals and affects the sensitivity of the evidence is pregnant. Additional blocking steps are therefore required that affect the overall process complicate and extend the assay time.
Dioxetane eignen sich aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften gut als Substrate in signal erzeugenden Nachweisreaktionen. Diese Verbindungen lassen sich thermisch zersetzen bzw. zerfallen bei Änderung des Substitutionsmusters spontan. Beide Reaktionen verlaufen unter Emission von Licht, welches als Detektionsgröße in entsprechenden Analysenverfah ren nutzbar ist. So basieren einige der empfindlichsten nichtradioaktiven Nachweis verfahren für Biomoleküle, besonders auch Nukleinsäuren, auf der enzymatischen Ände rung des Substitutionsmusters und dem nachfolgenden Spontanzerfall von Dioxetan substraten, die a priori Bestandteil von Analysenkomponenten sind [Bronstein et al., Bio techniques 9 (1990) 160; Bronstein et al., Biotechniques 8 (1990) 310; Bronstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 4514]. Dabei werden beträchtliche Empfindlichkei ten (10-21 Mol) erreicht.Due to their chemical properties, dioxetanes are well suited as substrates in signal-generating detection reactions. These compounds can be thermally decomposed or disintegrate spontaneously when the substitution pattern changes. Both reactions emit light, which can be used as a detection variable in corresponding analytical processes. For example, some of the most sensitive non-radioactive detection methods for biomolecules, especially nucleic acids, are based on the enzymatic change in the substitution pattern and the subsequent loss of spontaneity of dioxetane substrates, which are a priori component of analysis components [Bronstein et al., Bio techniques 9 (1990) 160 ; Bronstein et al., Biotechniques 8 (1990) 310; Bronstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 4514]. Considerable sensitivities (10 -21 mol) are achieved.
Andererseits wurde vorgeschlagen, mit an Biomoleküle gebundenen Singulettsauerstoff generatoren durch Bestrahlung des zu analysierenden Materials in Gegenwart von in hoch siedenden organischen Lösungsmitteln gelösten Olefinen Dioxetane zu akkumulieren und diese in einer anschließenden Nachweisreaktion durch Erhitzen auf ca. 100°C unter Licht emission zu zersetzen [EP 0 345 776]. Hierbei werden Nachweisgrenzen von 10-15 Mol angegeben. Das Erhitzen von Nylonmembranen, wie die Nutzung hochsiedener und zum Teil halogenierter Lösungsmittel ist jedoch aus technologischer und ökologischer Sicht nicht unproblematisch. Ebenso ist die erreichte Empfindlichkeit für Nukleinsäurenachweise nicht ausreichend.On the other hand, it has been proposed to accumulate dioxetanes with singlet oxygen generators bound to biomolecules by irradiating the material to be analyzed in the presence of olefins dissolved in high-boiling organic solvents and to decompose them in a subsequent detection reaction by heating to about 100 ° C with light emission [EP 0 345 776]. Detection limits of 10 -15 mol are given here. The heating of nylon membranes, such as the use of high-boiling and partly halogenated solvents, is not without problems from a technological and ecological point of view. Likewise, the sensitivity achieved for nucleic acid detection is not sufficient.
Dieser Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein nichtradioaktives Nachweissystem für Biomoleküle zu entwickeln, welches sich durch sehr hohe Empfindlichkeit auszeichnet, was aber nicht durch zusätzliche Wasch- und Blockierungsoperationen verkompliziert wird. Weiterhin sollen die verwendeten Marker einen vielseitigen Einsatz der markierten Biomoleküle in biochemischen und molekularbiologischen Operationen (z. B. enzymatische Amplifikationsschritte) erlauben.The object of this invention is to provide a non-radioactive detection system for To develop biomolecules which are characterized by very high sensitivity, but this is not complicated by additional washing and blocking operations becomes. Furthermore, the markers used are intended for a versatile use of the marked ones Biomolecules in biochemical and molecular biological operations (e.g. enzymatic Allow amplification steps).
Es konnte gezeigt werden, daß in einem heterogenen System (fest/gasförmig), in dem ein Olefin der Struktur I auf eine feste Matrix aufgebracht ist, bei Anwesenheit geringster Spuren (bis zu 10-21 Mol) von Molekülen, die in der Lage sind Singulettsauerstoff zu generieren, nach Bestrahlung mit Licht auf der festen Matrix, Dioxetane gebildet werden. Diese gebildeten Dioxetane sind so substituiert, daß nach Abspaltung eines Substituenten ein Spontanzerfall unter Lichtemission einsetzt. Das freiwerdende Licht ist in einem Strahlungsmeßgerät bzw. auf geeignetem photographischem Material detektierbar. Weiter hin stellte sich heraus, daß die Anwesenheit von biologischem Material, wie z. B. Proteine, Kohlenhydrate oder Nukleinsäuren, die Empfindlichkeit der Nachweise nicht beeinträchti gen. Damit kann das beschriebene Verfahren als hochempfindlicher nichtradioaktiver Nachweis für Biomoleküle genutzt werden.It could be shown that in a heterogeneous system (solid / gaseous) in which an olefin of structure I is applied to a solid matrix, in the presence of the smallest traces (up to 10 -21 mol) of molecules which are capable Generate singlet oxygen, after irradiation with light on the solid matrix, dioxetanes are formed. These dioxetanes formed are substituted in such a way that, after a substituent has been split off, spontaneous decay begins with light emission. The light released can be detected in a radiation measuring device or on suitable photographic material. It also turned out that the presence of biological material, such as. B. proteins, carbohydrates or nucleic acids, the sensitivity of the evidence does not affect gene. Thus, the method described can be used as a highly sensitive non-radioactive detection for biomolecules.
Vorteilhaft sind dabei die folgenden Tatsachen:The following facts are advantageous:
- - es ist, außer den allgemeinbekannten Lichtquellen (z. B. Wolframlampe) kein zusätzliches Gerät zur Detektion von Strahlung in der Routineanalytik erforderlich,- it is none other than the well-known light sources (e.g. tungsten lamp) additional device for the detection of radiation in routine analysis required,
- - die Detektion ist bei Raumtemperatur im wäßrigen Medien möglich. Damit entfallen sämtliche Entsorgungs- und Stabilitätsprobleme, die mit der Nutzung hoher Temperaturen und organischer Lösungsmittel verbunden sind,- Detection is possible at room temperature in aqueous media. This eliminates all disposal and stability problems associated with the use of high Temperatures and organic solvents are connected
- - Probleme mit Untergrundsignalen treten nicht auf, da- Problems with background signals do not occur because
- a) die Sensibilisatoren (Marker) nicht zur unspezifischen Wechselwirkung mit den verwendeten festen Phasen neigen, Wasch- und Blockierungsschritte sind nicht erforderlich unda) the sensitizers (markers) not for non-specific interaction with the solid phases used tend to be washing and blocking steps not required and
- b) das emittierende Molekül sich ausschließlich dort befindet, wo auch das nachzuweisende Biomolekül ist,b) the emitting molecule is located only where that biomolecule to be detected is
- - im Gegensatz zu Meßanordnungen, die a priori Dioxetane verwenden, sind quantitative Aussagen zu treffen, da die Menge des gebildeten Dioxetans und damit die des emittierten Lichtes proportional zur Markerkonzentration ist und keine der bekannten "Equalising" - Erscheinungen zu beobachten sind,- In contrast to measuring arrangements that use dioxetanes a priori are quantitative To make statements because the amount of dioxetane formed and thus that of emitted light is proportional to the marker concentration and none of the known "Equalizing" phenomena can be observed,
- - andere molekularbiologische Verfahren, wie z. B. PCR u.ä. sind aufgrund der thermischen Stabilität der Markenmoleküle möglich, wobei sich der Detektionsprozeß unmittelbar an vorbereitende Arbeiten anschließen kann.- other molecular biological methods, such as. B. PCR and the like are due to the thermal stability of the branded molecules possible, the detection process can immediately follow preparatory work.
Im einzelnen ist der Analysengang wie im Folgenden beschrieben und in den Beispielen demonstriert. Nach einer dem jeweiligen analytischen Problem angepaßten Trennoperation (z. B. Elektrophorese) wird das zu analysierende Biomolekül auf eine allgemein übliche Art und Weise auf eine feste Matrix (z. B. Nitrozellulose- oder Nylonmembran) überführt (Blotting) und an diese feste Phase mit allgemein üblichen Methoden fixiert ("Backen", UV-crosslinking). Weiter wird dann, entsprechend dem Assay, ein komplementäres Mole kül, welches mit dem im Assay genutzten Farbstoff verbunden ist zugegeben (z. B. DNA- Sonde, Beispiel 2) und unter den üblichen Bedingungen an das nachzuweisende Molekül gebunden.In detail, the analysis process is as described below and in the examples demonstrated. After a separation operation adapted to the respective analytical problem (e.g. electrophoresis) the biomolecule to be analyzed is processed in a generally common way and transferred to a solid matrix (e.g., nitrocellulose or nylon membrane) (Blotting) and fixed to this solid phase using generally customary methods ("baking", UV crosslinking). Then, according to the assay, a complementary mole becomes cool, which is associated with the dye used in the assay (e.g. DNA Probe, Example 2) and under the usual conditions to the molecule to be detected bound.
Nach Waschen der festen Phase und Trocknen, wird das zur Bildung des Dioxetans erfor derliche Olefin auf die feste Phase aufgebracht, was durch Bedampfen im Vakuum, Auf tragen als Lösung und Verdampfen des Lösungsmittels, Sublimation u.ä.Verfahren ge schieht. Die so präparierte Matrix wird mit Licht geeigneter Wellenlänge bestrahlt, wobei auch Filter zum Einsatz gelangen können (Beispiel 4).After washing the solid phase and drying, this is needed to form the dioxetane like olefin applied to the solid phase, which by evaporation in vacuo, on wear as a solution and evaporation of the solvent, sublimation and the like ge looks. The matrix thus prepared is irradiated with light of a suitable wavelength, whereby Filters can also be used (example 4).
Im Anschluß an die Bestrahlung wird die Membran mit der entsprechenden Hydrolyselö sung befeuchtet und mit dieser nun feuchten Membran ein geeigneter Film exponiert, der dann nach üblichen Verfahren entwickelt wird.Following the irradiation, the membrane with the corresponding hydrolysis solution solution and exposes a suitable film with this now moist membrane is then developed according to usual procedures.
31,2 mg 3 [N-(4-Carboxybutyl)-N-methylamino]-7-dimethylaminophenazathioniumchl-orid (n = 0,077 mmol, M = 405,94 g/mol) werden in 6 ml absolutem Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird unter Vakuum bis zu einem Volumen von 3 ml eingeengt. Dann gibt man 23,4 mg N-Hydroxysuccinimid (n = 0,2 mmol; M = 115,09 g/mol) und 38,9 mg wasserlösliches Carbodiimid (n = 0,2 mmol; M = 191,71 g/mol) hinzu und läßt das Reaktionsgemisch drei Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur reagieren. Anschließend wird das Lösungsmittel unter Vakuum abdestilliert, der Rückstand in Chloroform aufge nommen und dreimal mit gesättigter NaCl-Lösung ausgeschüttelt. Die vereinigten wäßri gen Phasen werden noch zweimal mit frischem Chloroform gewaschen. Danach werden die organischen Phasen über Na₂SO₄ getrocknet und eingeengt. Man erhält 21,2 mg Rohpro dukt (55%), welches ohne weitere Reinigungsoperationen zur Markierung einsetzbar ist.31.2 mg of 3 [N- (4-carboxybutyl) -N-methylamino] -7-dimethylaminophenazathioniumchloride (n = 0.077 mmol, M = 405.94 g / mol) are dissolved in 6 ml of absolute dimethylformamide solved. This solution is concentrated in vacuo to a volume of 3 ml. Then 23.4 mg of N-hydroxysuccinimide (n = 0.2 mmol; M = 115.09 g / mol) and 38.9 mg are added add water-soluble carbodiimide (n = 0.2 mmol; M = 191.71 g / mol) and leave that React the reaction mixture for three days in the dark at room temperature. Subsequently the solvent is distilled off under vacuum, the residue is dissolved in chloroform taken and shaken three times with saturated NaCl solution. The combined water phases are washed twice with fresh chloroform. After that, the organic phases dried over Na₂SO₄ and concentrated. 21.2 mg of crude pro are obtained product (55%), which can be used for marking without further cleaning operations.
Zu dem in 50 µl sterilem Wasser gelösten aminofunktionalisierten Oligonukleotid (40 nmol) werden 98,8 µl einer Lösung an TRIS/HCL-Puffer (pH = 8,0) und 39,5 µl einer Lö sung aus 10 mg/ml 3-[N-Methyl-N-(4-succinimidoxycarbonylbutyl)amino]-7- dimethylaminophenazathioniumchlorid in Dimethylformamid zugegeben. Anschließend werden noch 157,7 µl steriles Wasser dem Reaktionsansatz zugesetzt. Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluß bei fortwährender Durchmischung aufbewahrt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erfolgt die Entsal zung des Reaktionsansatzes über eine Sephadex G25 Säule. Im Ausschlußvolumen von 1,5 ml sind sowohl das freie aminofunktionalisierte Oligonukleotid als auch das markierte ent halten. Die weitere Aufarbeitung und Reinigung erfolgt mit Hilfe der präparativen HPLC.To the amino-functionalized oligonucleotide (40 nmol) 98.8 µl of a solution of TRIS / HCL buffer (pH = 8.0) and 39.5 µl of a solution solution of 10 mg / ml 3- [N-methyl-N- (4-succinimidoxycarbonylbutyl) amino] -7- Dimethylaminophenazathioniumchlorid added in dimethylformamide. Subsequently 157.7 ul sterile water are added to the reaction mixture. The reaction solution is 24 hours at room temperature and with the exclusion of light with continuous Mix kept. After removing the solvent, desalination takes place of the reaction mixture via a Sephadex G25 column. In the excluded volume of 1.5 ml are both the free amino-functionalized oligonucleotide and the labeled ent hold. Further processing and cleaning is carried out using preparative HPLC.
Zu dem in 50 µl sterilem Wasser gelösten aminofunktionalisierten Oligonukleotid (40 nmol) gibt man 1 mg 3-[N-(4-Carboxybutyl)-N-methylamino]-7- dimethylaminophenazathionumchlorid (n = 2,46 µmol; M = 405,94 g/mol), 2,7 mg Imidazol (n = 39,76 µmol; M = 68,08), 0,6 mg wasserlösliches Carbodiimid (n = 2,98 µmol; M = 191,71 g/mol) und 100 µl MES-Puffer (pH = 6,0). Die Reaktionslösung wird 24 Stunden bei Raumtemperatur und unter Lichtausschluß bei fortwährender Durchmischung aufbewahrt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erfolgt die Entsalzung des Reaktions ansatzes über eine Sephadex G 25 Säule.To the amino-functionalized oligonucleotide (40 nmol), 1 mg of 3- [N- (4-carboxybutyl) -N-methylamino] -7- dimethylaminophenazathionum chloride (n = 2.46 µmol; M = 405.94 g / mol), 2.7 mg Imidazole (n = 39.76 µmol; M = 68.08), 0.6 mg water-soluble carbodiimide (n = 2.98 µmol; M = 191.71 g / mol) and 100 µl MES buffer (pH = 6.0). The reaction solution turns 24 Hours at room temperature and with exclusion of light with continuous mixing kept. After the solvent has been removed, the reaction is desalted approach using a Sephadex G 25 column.
Ausgehend von einer Stammlösung von Plasmid-DNA (C₀= 4 ng/µl) wird eine Konzen trationsreihe in sterilem Wasser durch jeweilige zehnfache Verdünnung im Bereich von 4 ng - 0,4 pg/µl erstellt. Nach Denaturieren der DNA im siedenden Wasserbad und Abkühlen auf Eis werden je ein Mikroliter der DNA-Lösungen auf eine Nylonmembran (Amersham Hybond N o. ä.) aufgetragen und durch Backen bei 120°C fixiert. Die anschließende Hybridisierung erfolgt nach allgemein bekannten Protokollen mit einer Sondenkonzentra tion (Markierung der DNA-Sonde s. Beispiel 1) von etwa 50 ng/ml. Den der Hybridisation folgenden Waschschritten schließt sich ein einmaliges Waschen der Membran mit ca. 5 ml sterilem Wasser (10 min) an, worauf die Membran mit einem Fön getrocknet wird. Das für den Detektionsprozeß erforderliche Olefin {1-Methoxy-1-(3-acetylphenyl)-2,2′- spiro-adamantyl-ethen} in Pentan (10 mg/100 ml) oder einem analogen Lösungsmittel, wird mittels eines Zerstäubers auf die Membran aufgetragen. Dem Trocknen der Membran folgt die Belichtung mit geeigneter Wellenlänge (z. B. im System Wolframlampe/Rotfilter) innerhalb von 10 Minuten. Im Anschluß daran taucht man die Membran kurz in 10%ige Tetrabutylammoniumhydroxidlösung, läßt überschüssige Flüssigkeit ablaufen und exponiert mit der feuchten Membran geeignetes photographisches Material (z. B. ECL- Hyperfilm, Amersham o. ä.) für ca. 15 Minuten. Nach der Filmentwicklung werden für alle aufgetragenen Konzentrationen Signale sichtbar.Starting from a stock solution of plasmid DNA (C₀ = 4 ng / µl), a conc tration series in sterile water by tenfold dilution in the range of 4 ng - 0.4 pg / µl created. After denaturing the DNA in a boiling water bath and cooling one microliter of the DNA solutions are placed on ice on a nylon membrane (Amersham Hybond N or similar) applied and fixed by baking at 120 ° C. The subsequent one Hybridization is carried out according to generally known protocols with a probe concentration tion (labeling of the DNA probe see Example 1) of about 50 ng / ml. Hybridization The following washing steps involve washing the membrane once with approx. 5 ml sterile water (10 min), after which the membrane is dried with a hair dryer. The olefin {1-methoxy-1- (3-acetylphenyl) -2,2'- required for the detection process spiro-adamantyl-ethen} in pentane (10 mg / 100 ml) or an analog solvent applied to the membrane by means of an atomizer. Drying of the membrane follows exposure with a suitable wavelength (e.g. in the tungsten lamp / red filter system) within 10 minutes. Subsequently, the membrane is briefly immersed in 10% Tetrabutylammonium hydroxide solution, drains excess liquid and exposes suitable photographic material (e.g. ECL- Hyperfilm, Amersham or similar) for approx. 15 minutes. After film development will be for everyone applied concentrations visible signals.
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---|---|
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0944642A1 (en) * | 1996-12-16 | 1999-09-29 | Tropix, Inc. | Dioxetane labeled probes and detection assays employing the same |
EP1523668A1 (en) * | 2002-07-16 | 2005-04-20 | EMP Biotech Gmbh | Sensitizer-labeled analyte detection |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0345776A2 (en) * | 1988-06-08 | 1989-12-13 | London Diagnostics, Inc. | Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signals |
-
1994
- 1994-02-03 DE DE19944403780 patent/DE4403780A1/en not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0345776A2 (en) * | 1988-06-08 | 1989-12-13 | London Diagnostics, Inc. | Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signals |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0944642A1 (en) * | 1996-12-16 | 1999-09-29 | Tropix, Inc. | Dioxetane labeled probes and detection assays employing the same |
EP0944642A4 (en) * | 1996-12-16 | 2002-01-30 | Tropix Inc | Dioxetane labeled probes and detection assays employing the same |
EP1523668A1 (en) * | 2002-07-16 | 2005-04-20 | EMP Biotech Gmbh | Sensitizer-labeled analyte detection |
EP1523668A4 (en) * | 2002-07-16 | 2007-03-21 | Emp Biotech Gmbh | Sensitizer-labeled analyte detection |
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