CN110763743A - 甘油三酯的电化学检测试纸及其制备方法和应用、包含其的检测传感器 - Google Patents
甘油三酯的电化学检测试纸及其制备方法和应用、包含其的检测传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种甘油三酯的电化学检测试纸及其制备方法和应用、包含其的检测传感器;包括油墨层和反应酶层;其中,油墨层的组成原料包括碳油墨、电子媒介体和碳纳米管。本发明提供的电化学检测试纸在实际测试时,电流梯度变化大,精密度高,并且可以常温保存,稳定性好。
Description
技术领域
本发明属于电化学生化检测技术领域,涉及一种甘油三酯的电化学检测试纸及其制备方法和应用、包含其的检测传感器。
背景技术
电化学试纸条检测法能用少量的血样在很短时间内获得被检测样本的多种化学和生物学的信息。作为筛选试验被广泛的应用在医学检验,家庭自测等方面。例如,利用电化学试纸条检测血样中的葡萄糖,尿酸含量等。
甘油三脂是人体内含量最多的脂类,大部分组织可以利用甘油三脂分解产物供给能量,同时肝脏等组织还可以进行甘油三脂的合成,在脂肪组织中贮存。高甘油三脂作为高血脂的一种,对人体的危害主要是引起动脉粥样硬化,造成血管堵塞和形成血栓,引发心脑血管疾病。理想的甘油三酯水平应该低于1.7mol/L,超过1.7mol/L,则需要改变生活方式,控制饮食,增加运动,高于2.26mol/L,则表示甘油三脂偏高,需要吃药,以防病变。
检测血液中的甘油三脂含量时,反应过程如下:利用脂蛋白脂肪酶(LPL)与样本中的甘油三脂作用生成甘油和脂肪酸;反应过程中产生的甘油被甘油激酶催化。并与ATP和镁离子作用生成3-磷酸甘油和ADP;新生成的3-磷酸甘油与氧化态的电子媒介体在甘油磷酸氧化酶活甘油磷酸脱氢酶的作用下生成磷酸二羟丙酮酸和还原态的电子媒介体。在合适的电压条件下,产生还原态电子媒介体的多少和电流大小呈正相关,而电流大小和甘油三脂浓度呈正相关。通过以上反应,能准确测定甘油三脂含量。
CN109655508A公开了一种用于检测甘油三酯的电化学传感器的制备方法和其应用;该传感器是由氮掺杂石墨烯固定在玻碳电极上制备而成,该专利是利用固定脂肪酶,直接使用脂肪酶检测甘油三酯,检验灵敏度较差。CN109313155A公开了一种用于电化学甘油三酯测定的系统和方法,系统包括测试条,所述测试条包括电极和反电极,所述电极和反电极位于样品接收区附近;以及电极和反电极之一上的涂层,所述涂层包括用于甘油三酯的试剂涂层。所述试剂涂层所用的试剂混合物包括表面活性剂、甘油三酯水解试剂、甘油激酶、甘油-3-磷酸脱氢酶、辅酶和能够被氧化或还原形成产物的氧化还原试剂;虽然该专利提供的测试条能够实现对甘油三酯的检测,但是其使用的电子媒介体为铁氰化钾,由于脂蛋白脂肪酶和表面活性剂能使红细胞裂解,释放出血样中的血红蛋白,导致铁氰化钾可以和亚铁血红蛋白反应生成亚铁氰化钾和高铁血红蛋白,亚铁氰化钾的生成使得测试背景电流太高,导致在检测甘油三脂时测试的电流梯度比较小,即铁氰化钾并不适合用于甘油三酯的电化学检测中。
因此,目前需要开发一种新的甘油三酯的电化学检测试纸。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘油三酯的电化学检测试纸及其制备方法和应用、包含其的检测传感器。本发明提供的电化学检测试纸在实际测试时,电流梯度变化大,精密度高,并且可以常温保存,稳定性好。
为达到此发明目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种甘油三酯的电化学检测试纸,包括油墨层和反应酶层;
其中,油墨层的组成原料包括碳油墨、电子媒介体和碳纳米管。
本发明选择在碳油墨中同时加入电子媒介体和碳纳米管,碳纳米管材料和电子媒介体有效结合,可以增加电子媒介体和反应物测试的比表面积,提高反应物有效测试水平,因而提高测试过程中的电流梯度,进而可以提高甘油三酯的电化学检测试纸的检测精密度。
若单独在碳油墨中加入电子媒介体而不加入碳纳米管,则电流梯度较小,导致检测试纸精密度不高,推测可能的原因是由于电子媒介体不溶于水,与碳油墨相容性极差,则导致在测试时,电子媒介体和测试药品直接有效接触的比表面积比较小,有效反应的体系比较小,导致电流梯度比较小。
在本发明中,以所述碳油墨的质量为100%计,所述碳纳米管的添加量为0.01-5%,例如0.05%、、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%等。
在本发明中,若碳纳米管的添加量过大,则可能反而会导致电流梯度的减小,若碳纳米管的添加量过小,则对电流梯度的增加效果较小。
优选地,以所述碳油墨的质量为100%计,所述电子媒介体的添加量为0.01-5%,例如0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%等。
优选地,所述电子媒介体选自二茂铁及其衍生物,优选二茂铁、二茂铁甲醛、已基二茂铁、正丁基二茂铁、1-2-乙基二茂铁、叔丁基二毛铁、二茂铁甲酰胺、乙酰基二茂铁、苯甲酰基二茂铁、双乙酰基二茂铁、带有羟基的二茂铁的衍生物、带有醛基的二茂铁的衍生物或带有羧基的二茂铁的衍生物中的任意一种或至少两种的组合;进一步优选带有羟基的二茂铁的衍生物或带有羧基的二茂铁的衍生物。
当电子媒介体选择带有羟基的二茂铁的衍生物或带有羧基的二茂铁的衍生物时,检测过程中的电流梯度较大,推测可能的原因是由于碳纳米管表面通常带有羟基或羧基等可反应基团,当电子媒介体带有羟基或羧基基团时,碳纳米管和电子媒介体更加有效的链接,形成稳定的基团,即二者的有效接触较多,使碳纳米管进一步促进了电子媒介体与反应物测试的比表面积。
优选地,所述带有羟基的二茂铁的衍生物包括羟甲基二茂铁、1.1-二(1-羟基乙基)二茂铁、2-羟基-2-二茂铁基丙胺或1-羟基乙基二茂铁中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,所述带有羧基的二茂铁的衍生物包括二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁乙二酸或1,1'-二茂铁甲酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,所述碳纳米管带有羧基,所述电子媒介体选自带有羟基的二茂铁的衍生物。
所述碳纳米管带有羟基,所述电子媒介体选自带有羧基的二茂铁的衍生物。
当碳纳米管表面带有的基团和电子媒介体带有的基团可以进行反应时,可以进一步增加检测过程中的电流梯度,推测可能的原因是,碳纳米管和电子媒介体一定程度上发生了缩合反应,形成了连接键,可以使得电子媒介体与碳纳米管有效结合程度更高,进而使得电流梯度更明显。
优选地,在所述油墨层的组成原料中,还包括纳米二氧化硅。
当油墨层的组成原料进一步包括纳米二氧化硅时,可以更进一步增加检测过程中的电流梯度,即,使得最后得到的检测试纸精密度较高并且重复性好。推测可能的原因是纳米二氧化硅比表面积较大,活性较大,能形成三维网状结构,同时纳米二氧化硅具有很好的吸附性质,有良好的稳定性;同时纳米二氧化硅可能会缓慢降低测试样品的扩散,提高重复性。
优选地,以所述组成原料的总质量为100%计,所述纳米二氧化硅的添加量为0.01-5%,例如0.05%、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%等。
若纳米二氧化硅添加量过小时,则对电流梯度的增大效果不明显,且不能增加检测试纸的重复性;若纳米二氧化硅的添加量较大时,则其比表面积过大,反而会使得有效反应的电子媒介体的量减少。
优选地,所述二氧化硅的质量为所述碳纳米管的质量的20%以上,例如25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%等。
当二氧化硅的量大于五分之一的碳纳米管的添加量时,电流梯度的增大效果较为理想。
优选地,所述纳米二氧化硅的平均粒径为10-50nm,例如15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm等。
本发明优选粒径为10-50nm范围内的纳米二氧化硅,粒径过小或过大,二氧化硅均容易脱离油墨层,无法起到作用。
优选地,在所述油墨层的组成原料中,还包括无机盐。
优选地,以所述组成原料的总质量为100%计,所述无机盐的添加量为0.01-5%,例如0.05%、、0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%等。
优选地,所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁中的任意一种或至少两种的组合。
当进一步包括无机盐时,可能再进一步地提升检测过程中的电流梯度,以及增加检测试纸的重复性。
在本发明中,所述反应酶层的制备原料包括水、醋酸缓冲液、无水氯化镁、表面活性剂、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、海藻糖、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
第二方面,本发明提供了根据第一方面所述的甘油三酯的电化学检测试纸,所述制备方法包括如下步骤:
将油墨利用丝网印刷的方法得到油墨层,然后在得到的油墨层上涂覆酶溶液并干燥,得到所述甘油三酯的电化学检测试纸。
优选地,将碳油墨、电子媒介体和碳纳米管以及任选的纳米二氧化硅和任选的无机盐混合并进行发酵。
优选地,所述发酵的温度为2-8℃,例如3℃、4℃、5℃、6℃、7℃等,时间为10-30天,例如12天、15天、18天、20天、22天、25天、28天等。
利用是丝网印刷技术得到的油墨层需要进行干燥,现有技术中常用的干燥方式即可,例如在80-120℃下干燥20min。
第三方面,本发明提供了根据第一方面所述的甘油三酯的电化学检测试纸在制备甘油三酯的检测传感器中的应用。
本发明提供的检测试纸用于电化学检测中,可以直接插入测试仪器中进行检测,也可以制成传感器然后进行检测。
第四方面,本发明提供了一种甘油三酯的检测传感器,包括第一方面所述的甘油三酯的电化学检测试纸以及工作电极和参比电极。
相对于现有技术,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明选择在碳油墨中同时加入电子媒介体和碳纳米管,碳纳米管材料和电子媒介体有效结合,可以增加电子媒介体和反应物测试的比表面积,提高反应物有效测试水平,因而提高测试过程中的电流梯度,进而可以提高甘油三酯的电化学检测试纸的检测精密度;
(2)当油墨层的组成原料除了碳油墨、电子媒介体和碳纳米管还包括纳米二氧化硅和无机盐时,可以进一步增加检测过程中的电流梯度,并且可以增加检测试纸的重复性和稳定性。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了,所述实施例仅仅是帮助理解本发明,不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种甘油三酯的电化学检测试纸,制备方法如下:
(1)按下述组分配置酶溶液:1000mL水、2g醋酸缓冲液(pH=7)、1g无水氯化镁、1gTriton x-100、1g ATP、1g海藻糖、100KU脂蛋白脂肪酶、100KU甘油激酶和100KU甘油磷酸氧化酶。
(2)按下述组分配制油墨:1000g碳油墨(杜邦公司)、1g羟甲基二茂铁、5g带有羧基的多壁碳纳米管、5g纳米二氧化硅(SP30)和0.05g无机盐(氯化钠),将上述组分在常温下搅拌为均一无成块的混合液,然后放于5℃温度下发酵4天。
(3)将油墨利用丝网印刷的制备方法制备油墨层:将PET片定位于印刷台面的合适位置。将网版装于丝印机网架上,使网版上定位孔与PET定位孔对准后,锁紧固定网版。将网版与PET板的间距调好,并且要求网版和PET板平行,外置偏差比较小。
(4)将酶溶液点在油墨层上,在55℃下干燥30min得到反应酶层;然后将亲水膜利用双面胶粘贴在反应酶层上,得到检测试纸。
实施例2
与实施例1的区别在于,步骤(2)中的油墨中不添加无机盐。
实施例3-4
与实施例2的区别在于,步骤(2)中的油墨中,纳米二氧化硅的平均粒径为15nm(实施例3)、50nm(实施例4)。
实施例5-8
与实施例2的区别在于,步骤(2)中的油墨中,纳米二氧化硅的添加量为1g(实施例5)、3g(实施例6)、0.5g(实施例7)、8g(实施例8)。
实施例9
与实施例2的区别在于,步骤(2)中的油墨中,将羟甲基二茂铁替换为二茂铁甲酸,将带有羧基的多壁碳纳米管替换为带有羟基的多壁碳纳米管。
实施例10-11
与实施例9的区别在于,步骤(2)中的油墨中,纳米二氧化硅的平均粒径为15nm(实施例10)、50nm(实施例11)。
实施例12
与实施例1的区别在于,步骤(2)中的油墨中不添加无机盐和纳米二氧化硅。
实施例13
与实施例12的区别在于,将步骤(2)中的羟甲基二茂铁替换为二茂铁甲酸。
实施例14-15
与实施例12的区别在于,将步骤(2)中的碳纳米管替换为带有羟基的多壁碳纳米管(实施例14,二茂铁甲酸)、带有醛基的多壁碳纳米管(实施例15,二茂铁甲酸)。
实施例16-17
与实施例13的区别在于,将步骤(2)中的带有羧基的多壁碳纳米管替换为带有羟基的多壁碳纳米管(实施例16,二茂铁甲酸)、带有醛基的多壁碳纳米管(实施例17,二茂铁甲酸)。
实施例18-21
与实施例12的区别在于,将步骤(2)中的二茂铁衍生物替换为二茂铁(实施例18)、二茂铁甲醛(实施例19)、1-2-乙基二茂铁(实施例20)、乙酰基二茂铁(实施例21)。
实施例22-23
与实施例18的区别在于,将碳纳米管替换为带有羟基的多壁碳纳米管(实施例22)、带有醛基的多壁碳纳米管(实施例23)。
实施例24-25
与实施例19的区别在于,将碳纳米管替换为带有羟基的多壁碳纳米管(实施例24)、带有醛基的多壁碳纳米管(实施例25)。
实施例26
与实施例1的区别在于,步骤(2)的油墨不同,步骤(2)的油墨由如下组分构成:1000g碳油墨(杜邦公司)、50g羟甲基二茂铁、50g带有羧基的多壁碳纳米管和0.1g纳米二氧化硅(SP30)。
实施例27
与实施例1的区别在于,步骤(2)的油墨不同,步骤(2)的油墨由如下组分构成:1000g碳油墨(杜邦公司)、0.1g羟甲基二茂铁、0.1g带有羧基的多壁碳纳米管和50g纳米二氧化硅(SP30)。
对比例1
与实施例18的区别仅在于,将碳纳米管替换为石墨烯。
对比例2
与实施例18的区别在于,步骤(2)的油墨由1000g碳油墨(杜邦公司)、1g二茂铁组成。
性能测试
对实施例1-27和对比例1-2提供的检测试纸进行性能测试,方法如下:
(1)电流梯度与理论值的百分比测试:
a、分别配置3种不同浓度的甘油三脂,浓度分别在40-60mg/dL、300-400mg/dL、600-700mg/dL范围内;其中HCT调节在40-42%附近的全血样本,全血标准品中的甘油三酯浓度利用生化分析仪(HITACHI 7100Automatic analyzer)测试;
b、将测试试纸插到电化学工作站上,采用300mV的电压,且工作电极相对于电极的电压为正的300mV,并在室温条件下检测测定的电流,每个浓度的全血样本分别经行20次重复实验,取平均值;
c、利用下述公式计算电流梯度,然后与理论电流梯度求比值,以百分制计:
得到的电流梯度与理论值的百分比见表1:
表1
由实施例和性能测试可知,本发明得到的检测试纸对甘油三酯的测试电流梯度具有较大程度的增长,即本发明提供的检测试纸的精密度较高。
由实施例18-25和实施例12-13的对比可知,选择可以与碳纳米管进行反应的电子媒介体可以在进一步增大检测过程中的电流梯度。由实施例12和实施例2的对比可知,在碳纳米管的基础上加入纳米二氧化硅具有更好的效果。由实施例2和实施例3-4的对比可知,纳米二氧化硅的粒径不能过大或过小。由实施例2和实施例5-8的对比可知,纳米二氧化硅的添加量需要在本发明的限定范围内。由实施例1和实施例2的对比可知,在碳纳米管和纳米二氧化硅的基础上添加无机盐,可以增加电流梯度。
实施例18和对比例2的对比可知,在油墨中加入电子媒介体和碳纳米管可以增加电流反应梯度。由实施例18和对比例1的对比可知,若将碳纳米管替换为其他碳材料无法达到本发明的技术效果。
(2)稳定性测试:比较实施例9提供的检测试纸常温存放两年前后的对甘油三酯的测试电流,评判其稳定性,测试电流的方法如下:
a、分别配置3种不同浓度的甘油三脂,浓度分别在45-60md/dL、300-350md/dL、600-650md/dL范围内;其中红细胞比容调整到40-42%的全血样本,全血标准品中的甘油三酯浓度利用生化分析仪(HITACHI 7100Automatic analyzer)测试;
b、将测试试纸插到电化学工作站上,采用250mV的电压,且工作电极相对于电极的电压为正的250mV,并在室温条件下检测测定的电流,每个浓度的全血样本分别经行20次重复实验,测得到电流值的CV(变异系数)均在1-3%范围内,取测试电流平均值,见表2:
表2
由测试结果可知,本发明提供的检测试纸在放置两年后其测试电流基本没有变化,因此,本发明得到的检测试纸具有较好的重复性以及稳定性。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的甘油三酯的电化学检测试纸及其制备方法和应用、包含其的检测传感器,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,包括油墨层和反应酶层;
其中,油墨层的组成原料包括碳油墨、电子媒介体和碳纳米管。
2.根据权利要求1所述的甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,以所述碳油墨的质量为100%计,所述碳纳米管的添加量为0.01-5%;
优选地,以所述碳油墨的质量为100%计,所述电子媒介体的添加量为0.01-5%;
优选地,所述电子媒介体选自二茂铁及其衍生物,优选二茂铁、二茂铁甲醛、已基二茂铁、正丁基二茂铁、1-2-乙基二茂铁、叔丁基二毛铁、二茂铁甲酰胺、乙酰基二茂铁、苯甲酰基二茂铁、双乙酰基二茂铁、带有羟基的二茂铁的衍生物、带有醛基的二茂铁的衍生物或带有羧基的二茂铁的衍生物中的任意一种或至少两种的组合;进一步优选带有羟基的二茂铁的衍生物或带有羧基的二茂铁的衍生物;
优选地,所述带有羟基的二茂铁的衍生物包括羟甲基二茂铁、1,1-二(1-羟基乙基)二茂铁、2-羟基-2-二茂铁基丙胺或1-羟基乙基二茂铁中的任意一种或至少两种的组合;
优选地,所述带有羧基的二茂铁的衍生物包括二茂铁甲酸、二茂铁乙酸、二茂铁乙二酸或1,1'-二茂铁甲酸中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求2所述的甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,所述碳纳米管带有羧基,所述电子媒介体选自带有羟基的二茂铁的衍生物;
所述碳纳米管带有羟基,所述电子媒介体选自带有羧基的二茂铁的衍生物。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,在所述油墨层的组成原料中,还包括纳米二氧化硅;
优选地,以所述组成原料的总质量为100%计,所述纳米二氧化硅的添加量为0.01-5%;
优选地,所述二氧化硅的质量为所述碳纳米管的质量的20%以上;
优选地,所述纳米二氧化硅的平均粒径为10-50nm。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,在所述油墨层的组成原料中,还包括无机盐;
优选地,以所述组成原料的总质量为100%计,所述无机盐的添加量为0.01-5%;
优选地,所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙或硫酸镁中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,所述反应酶层的制备原料包括水、醋酸缓冲液、无水氯化镁、表面活性剂、腺嘌呤核苷三磷酸、海藻糖、脂蛋白脂肪酶、甘油激酶和甘油磷酸氧化酶。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的甘油三酯的电化学检测试纸,其特征在于,所述制备方法包括如下步骤:
将油墨利用丝网印刷的方法得到油墨层,然后在得到的油墨层上涂覆酶溶液并干燥,得到所述甘油三酯的电化学检测试纸。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述幽默的制备方法包括:将碳油墨、电子媒介体和碳纳米管以及任选的纳米二氧化硅和任选的无机盐混合并进行发酵;
优选地,所述发酵的温度为2-8℃,时间为10-30天。
9.根据权利要求1-6中的任一项所述的甘油三酯的电化学检测试纸在制备甘油三酯的检测传感器中的应用。
10.一种甘油三酯的检测传感器,其特征在于,包括权利要求1-6中的任一项所述的甘油三酯的电化学检测试纸以及工作电极和参比电极。
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