CN1975403B

CN1975403B - 用于快速电化学分析的方法和仪器

Info

Publication number: CN1975403B
Application number: CN2006101420388A
Authority: CN
Inventors: S·郭; A·霍德格斯; R·查特里尔; B·张
Original assignee: LifeScan Inc
Current assignee: LifeScan Inc
Priority date: 2005-09-30
Filing date: 2006-09-30
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2026-09-30
Also published as: EP2278330A3; ES2800977T3; US20070074977A1; US20100270178A1; EP1770396A2; JP4964552B2; JP2007108171A; US8404102B2; EP2280276A2; JP4988059B2; EP2278330B1; ES2592268T3; EP2278330A2; EP3138490A1; EP2280276A3; EP1770396A3; EP1770396B1; CN1975403A; JP2012008151A; US7749371B2

Abstract

公开了用于通过电化学方法确定生理样品中的分析物的浓度值的方法和仪器。该方法包括使用测试条，在所述测试条中，通过和电化学测试条电连接的表测量两个时间-电流瞬态。从时间-电流瞬态推导积分电流值并将其用于分析物浓度的计算。

Description

用于快速电化学分析的方法和仪器

发明背景

生理流体例如血液或来源于血液的产品中的分析物检测对于今天的社会越来越重要。分析物检测测定法用于多种应用，包括临床实验室测试、家庭测试等，其中这些测试的结果在各种疾病状况的诊断和管理中起着重要作用。目的分析物包括糖尿病人的管理中的葡萄糖、酮、胆固醇(包括HDL、LDL和/或甘油三酯)、血红蛋白A1C等。响应于该分析物检测的逐渐增加的重要性，已开发了许多用于临床和家庭使用的分析物检测方案和设备。

用于分析物检测的一种类型的方法是电化学方法。在这些方法中，将水性液体样品置于测试条(test strip)的样品反应室中，所述样品反应室在该情况下是个电化学小室，其包括两个电极，即第一和第二电极，其中电极具有使其适合于电流测量的阻抗。使待分析的组分直接与电极反应，或直接或间接地和介质(mediator)反应以形成可氧化的(或可还原的)的物质，所生成的物质的量对应于被分析的组分即分析物的浓度。然后通过电化学的方法估计存在的可氧化(或可还原的)的物质的量，并使该量和存在于起始样品中的分析物的量关联。

可用于定量分析物的一个策略是在通过电化学方法测量可氧化的(或可还原的)物质之前在电化学小室内基本上耗尽(deplete)分析物。然而，在某些条件下，该方法可能需要较长时间段以达到耗尽分析物。用于定量分析物的其他策略依赖于更短的等待时间段。例如，可在短于完全耗尽分析物所需的时间段内测量氧化电流(或还原电流)，并通过外推收集的数据可计算出浓度。尽管更短的计算程序满足快速分析(尤其是在监控葡萄糖的情况下)的要求，但这些方法可能缺少想要的准确度。因此，想要开发在电化学小室中快速而准确地测量分析物的浓度的方法。

发明概述

本发明总的来说提供了用于通过电化学方法确定生理样品中分析物的浓度的方法和仪器。在此处所描述的一个方面，是使用测试条的方法，其中通过和电化学测试条电连接的表来测量两个时间-电流瞬态(transient)(例如，作为时间的函数的电流)。

在一个实施方案中，测试条包含电化学小室，该小室包含间隔开的工作电极和对电极/参比电极以及氧化还原剂。在使用中，将生理样品导入反应小室中，在该小室中，样品开始和氧化还原剂反应。将具有第一极性的第一电位用于工作电极和对电极/参比电极之间的反应小室，并测量作为时间的函数的小室电流以获得第一时间-电流瞬态。然后基于用于小室的具有第二极性的第二电位测量第二时间-电流瞬态。

在第一实施方案中，利用曲线拟合方法从第一和/或第二时间电流瞬态推导出初步的分析物的浓度，将该浓度用从稳态电流值和前脉冲电流值(分别为i_ss和i_pp)推导出的校正因子进行校正。在通过经验推导的等式中使用这些值的比率来计算校正因子。

在另一个实施方案中，从第一和第二时间-电流瞬态收集的数据的至少部分数据的积分或和提供了第一和第二积分电流值(integrative current values)。将这些积分电流值用于获得校正因子。积分电流值更加稳定并且可在无需复杂计算的情况下获得。

在另一个实施方案中，积分电流值用于获得初始的分析物的浓度和校正因子。该方法包括将积分电流值用作初始分析物浓度，及将积分电流值的比率作为校正因子。从而可直接从时间-电流瞬态数据快速地计算出初始分析物浓度和校正因子，而无需费时的计算。此外，所得的分析物浓度高度准确。

例如，该方法可包括这样的步骤，即将生理样品导入电化学小室中，该小室包含间隔开的关系的第一和第二电极以及包含酶和介质的试剂层。在样品处于适当位置后，对反应小室应用具有第一极性的第一电位。测量作为时间的函数的小室电流以获得第一时间-电流瞬态。然后对小室应用具有第二极性的第二电位，其中测量作为时间的函数的小室电流以获得第二时间-电流瞬态。从第二时间-电流瞬态计算第一积分电流值，第一积分电流值和分析物浓度成比例(该第一积分电流值提供了初始的分析物浓度)。从第二时间-电流瞬态推导出第二积分电流值，并从第一时间-电流瞬态推导出第三积分电流值。将这些积分电流值用于计算校正因子。然后通过将第一积分电流值乘以校正因子推导分析物浓度。

在一个方面，积分电流值包含作为时间的函数的小室电流的积分。可选择地，积分电流值包含作为时间的函数的小室电流的和。在另一方面，积分电流值是时间-电流瞬态的时间间隔乘以时间-电流瞬态的平均或单一电流值的乘积。第一、第二和第三积分电流值可在其各自的时间-电流瞬态的任何部分期间进行计算。可选择地，可通过测量随时间推移的小室的电荷来获得积分电流值。例如，可以以和积分电流值相同的方式确定和使用积分库仑值。

在进一步的实施方案中，基于等式[C]＝(I₂/I₃)^p*(a*I₁-Z)计算分析物浓度，其中[C]是分析物浓度，I₁是第一积分电流值，I₂是第二积分电流值，且I₃是第三积分电流值。Z是背景值，其可消除背景电流的影响。为计算出进行该方法的电化学小室中的变动，上面的等式包含经验参数。例如，赋予比率(I₂/I₃)p次幂，且将I₁乘以常数a。可确定各电化学小室或成组的电化学小室的这些参数的值。

在一个实施方案中，第一电位具有和第二电位相反的第一极性。例如，第一极性可以是负的而第二极性是正的。第一电位可在大约0.0至-0.6V的范围内变动，而第二电位可在大约0.0至0.6V的范围内变动。在一个方面，第一和第二电位各使用大约1秒至5秒范围内的持续时间。

在一个实施方案中，用此处公开的方法测量的分析物是葡萄糖。例如，可测量全血、血浆、血清、组织液或尿的生理样品中的葡萄糖浓度。用于葡萄糖分析中的介质可以是例如铁氰化物、二茂铁、二茂铁衍生物、锇联吡啶复合物(osmium bipyridyl complexes)和/或醌的衍生物。

附图简述

本发明的新特征专门列于所附的权利要求中。通过参考下列详细的描述和附图可更好地理解本发明的特性和优点，所述描述提供了说明性的实施方案，在所述实施方案中使用了本发明的基本原理，其中：

图1显示了适合用于本发明的测试条的分解透视图；

图2是测试条的底平面图；

图3是测试条的顶平面图；

图4是测试条的远侧部分的部分横截面侧视图；

图5是显示和测试条电连接的表的简化示意图；

图6显示时间-电位波形的示例，所述时间-电位波形的第一电位后紧跟着第二电位；

图7是由表产生的时间-电流瞬态，该表正在测试载有生理样品的测试条；和

图8是显示葡萄糖浓度和相对于参照方法的偏差(bias)之间的关系的偏差图(bias graph)。

本发明的说明性实施方案的详述

主题方法和设备适合用于在许多样品中确定各种分析物，且特别是适合用于确定全血或其衍生物中的分析物，其中特定的目的分析物是葡萄糖。主题发明提供了以快速的方式且以准确的结果确定生理样品中的分析物的浓度值的方法。此处描述了可用于测量分析物浓度值的示例性测试条实施方案的结构。此外，此处还描述了使用该测试条的方法，其中通过与测试条电连接的表测量和收集时间-电流瞬态。此处还描述了被用于以快速的方式处理时间-电流瞬态并且输出准确的分析物浓度值的算法。

主题方法原则上可用于具有间隔开的第一和第二电极和试剂层的任何类型的电化学小室，例如电化学测试条。在一个方面，电化学测试条包含两个通过薄的间隔物层分开的相反的电极，其中这些组分限定了位于试剂层中的样品反应室或区域。

图1至4分别显示了适合用于此处描述的方法的示例性测试条62的分解透视图、底视图、顶视图和横截面侧视图。测试条62包含第一电极层66、间隔物60、第二电极层64、远侧部分80和近侧部分82。在完全组装后，测试条62具有用于接受样品的样品反应室61。在一个方面，由间隔物60的挖切区域68、第二电极层64和第一电极层66形成样品反应室61。可通过孔70递送生理流体，且在一个实施方案中，有两个孔70。在一个方面，孔70之一可提供样品入口而另一个可充当出口。

在说明性的实施方案中，第一电极层66和第二电极层64以面对或相反面对的排列方式被间隔开。然而，本领域技术人员将认识到可以各种方式放置电极，包括共面和非共面的构型。

第一电极层66和第二电极层64的部分可分别提供电极166、164。例如，暴露在反应室61内的第一电极层66和第二电极层64的部分可限定第一电极166和第二电极164。另外，第一电极层66可包含如图1中所示的第一电触点(electrical contact)67和U形槽65。通过第一连接线(connection track)76与第一电极166电连接的第一电触点67用于建立和表的电连接。如图1至3中所示，第二电极层64可包含通过第二连接线78与第二电极164电相互连接的第二电触点63。如图1所示，第二电触点可通过U型槽65由表访问。本领域技术人员将意识到测试条62可包括许多可选择的用于和表电连接的电触点构型。例如，美国专利号6,379,513公开了电化学小室的连接方式，且以其全文在此引用作为参考。

在一个实施方案中，第一和/或第二电极层可以是由这样的材料例如金、钯、碳、银、铂、氧化锡、铱、铟和其组合(例如掺有铟的氧化锡)形成的导电材料。此外，可通过溅射、无电镀膜法或丝漏印刷方法将导电材料沉积在绝缘薄片(未显示)上来形成电极。在一个示例性实施方案中，第二电极64层可以是溅射形成的金电极，而第一电极层66可以是溅射形成的钯电极。可用作绝缘薄片的合适的材料包括，例如，塑料(例如，PET、PETG、聚酰亚胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯)、硅、陶瓷、玻璃和其组合。

可使用如下方法将试剂层72置于反应室61中，例如狭缝式涂布(slot coating)、通过从管的末端分配液体进行涂布、墨水喷射(ink-jetting)和丝漏印刷。在例如下面的美国专利号6,749,887；6,689,411；6,676,995和6,830,934(以其全文在此引用作为参考)中描述了这些方法。在一个实施方案中，将试剂层72沉积在第一电极166上，且该试剂层包含至少介质和酶。介质可以是可被称为可氧化的物质或可还原的物质的两种氧化还原态中的任一种。合适的介质的例子包括铁氰化物、二茂铁、二茂铁衍生物、锇联吡啶复合物和/或醌的衍生物。合适的酶的例子包括葡糖氧化酶、基于吡咯并喹啉醌辅因子的葡糖脱氢酶(GDH)和基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子的GDH。适合用于制备试剂层72的一个示例性试剂制剂描述于作为美国公开专利申请号2004/0120848公开的，名称为Method forManufacturing a sterilized and Calibrated Biosensor-Based MedicalDevice的未决美国申请号10/242,951，以其全文在此引用作为参考。

在一个实施方案中，如图1至4所示，通过第一电极166、第二电极164和间隔物60限定样品反应室61。具体地，第一电极166和第二电极164限定了样品反应室61的顶部和底部，而间隔物层限定了样品反应室61的侧壁。例如，间隔物60可包括限定测试条62的样品反应室61的挖切区域68。

间隔物60的高度可限定第一电极166和第二电极164之间的距离。在一个方面，间隔物60的高度在大约1微米至500微米的范围内变动，优选地在大约10至400微米，且更优选地在大约40微米至200微米变动。

在一个实施方案中，测试条62包含这样定位的第一电极166和第二电极164，从而它们只通过较短的距离被分开。在该情况下，可发生氧化还原循环，其中在第一电极166处产生的被氧化的介质可扩散至第二电极164以被还原，且然后扩散回第一电极166以再被氧化。

第一电极166或第二电极164可执行工作电极的功能，所述工作电极依赖于所用的表的极性，氧化或还原有限量的介质。例如，如果限流种类是被还原的介质，那么只要使用相对第二电极164足够正的电位，其就可在第一电极166处被氧化。在该情况下，第一电极166执行工作电极的功能，而第二电极164执行对电极/参比电极的功能。

类似地，如果使用相对第二电极164足够负的电位，那么可在第二电极164处氧化被还原的介质。在该情况下，第二电极164执行工作电极的功能，而第一电极166执行对电极/参比电极的功能。

本方法中的第一步包括将一定量的目的生理样品导入包含间隔开的第一和第二电极以及试剂层的电化学小室中。生理样品可以产生变化，但在许多实施方案中，其一般是全血或其衍生物或级分，其中全血特别引人观注。将生理样品例如血液通过孔70加入样品反应室61中。在一个方面，按照这样的大小制作孔70和/或反应室61，从而毛细管作用可使生理样品充满样品反应室。

图5提供了显示表100和第一电触点67和第二电触点63连接的简化示意图，所述电触点分别和测试条62的第一和第二电极166、164电连接。改装表100，使之通过电触点63和第二电触点67(如图2和5中所示)和第一电极166和第二电极164电连接。在一个方面，表100通过U型槽65和电触点63接触。

如图5中举例说明的，电触点67可包含两个叉67a、67b，在一个示例性实施方案中，表100独立地与叉67a、67b连接，这样当表100和测试条62连接时，电路就完成了。表100可使用横跨电极层66的闭合电路作为测试条处于适当位置的信号。本领域技术人员将认识到表100可使用各种传感器和电路以确定相对于表，测试条62何时处于正确的位置。

在一个实施方案中，第一电触点67和第二电触点63和电压源E连接。当进行测试时，电压源E在第一次时间间隔在第一电极166和第二电极164之间应用第一电位。可在生理样品经检测存在于样品反应室中后，立即应用第一电位。在一个方面，可通过自动化技术检测生理样品，其中表监控电压(例如，如美国专利号6,193,873中所描述的)、电流或电容的变化，监控表明样品已加入样品反应室中的变化。可选择地，可通过人工技术检测生理样品，其中，用户肉眼观察样品反应室的充填和通过按电钮开始进行测试。

在样品已进入小室后，可向样品反应室61应用具有第一极性的第一电位，且测量作为时间的函数的所得电流。至少部分数据(作为时间的函数的电流)提供了第一时间-电流瞬态。对于第二电极164，第一电位可以足够地负，这样可使第二电极164用作工作电极，在该电极测得极限氧化电流(limiting oxidation current)。在第一时间间隔已消逝后，电压源E在第二时间间隔期间在第一电极166和第二电极164之间应用第二电位。第二电位使被作为时间的函数测量的电流产生第二时间-电流瞬态。在一个实施方案中，第二电位具有第二极性，该极性与第一极性相反。例如，对于第二电极164，第二电位可以足够地正，这样可使第一电极166用作工作电极，在该电极测得极限氧化电流。在一个方面，第一电位和第二电位可在大约-0.6V至大约+0.6V范围内变动。在一个实施方案中，时间-电流瞬态的时间间隔可在大约0.5秒至10秒的范围内变动，且优选地在大约1至5秒的范围内变动。在另一个实施方案中，第一时间间隔和第二时间间隔的和少于大约5秒。还应当指出的是第一时间间隔不必和第二时间间隔相等。

在一个实施方案中，在第一电位应用后立即应用第二电位。在可选择的实施方案中，在第一电位和第二电位之间引入延迟电路电位或开路电位。在另一个可选择的实施方案中，在样品反应室中检测到生理样品后，但在应用第一电位之前引入延迟。延迟可在大约0.01至3秒的范围内变动，优选地在0.05至1秒和最优选地在0.1至0.5秒的范围变动。

图6显示时间-电位波形的例子，该时间-电位波形具有3秒、-0.3V的第一电位和紧接着2秒、+0.3V的第二电位。图7显示所得的测得的作为第一时间-电流瞬态73和紧接着的第二时间-电流瞬态74的电流。

在第一实施方案中，根据测得的时间-电流瞬态数据确定分析物浓度(图7)。该方法包括使用如上所述获得的第一和第二时间-电流瞬态以确定：(a)变量γ；和(b)样品中的目的分析物的初步分析物浓度C₀。应当指出，γ定义为

i_pp项是邻近第一时间-电流瞬态末端的较短的时间段内的平均电流。例如，当第一时间间隔长度为3秒时，平均电流可以是从3秒长度时间段中的1.9至2.9秒的平均电流。

i_ss项是第二时间-电流瞬态的稳态电流值。因为间隔物60的高度大致低于或等于扩散层高度，所以电流趋向于稳态值。对于大于最小时间时的电流，可使用等式2估计i_ss项，而可根据等式1估计合适的最小时间。

等式1

t_{\min} = \frac{{- L}^{2} \ln 0.01}{12 π^{2} D}

等式2

i (t) = i_{ss} {1 + 4 \exp (\frac{{- 4 π}^{2} Dt}{L^{2}})}

其中，i_ss是应用第二电位后的稳态电流；i是测得的作为时间的函数的电流；D是氧化还原活性分子的扩散系数，其中可根据菲克第一定律即J(x，t)＝-DdC(x，t)/dx确定该系数；L是间隔物厚度；且t是第二电位应用的时间，其中t＝0表示脉冲的起始。

使用下列等式3计算样品中目的分析物的初步分析物浓度C₀。

等式3

i_{ss} = \frac{{2 FADC}_{o}}{L}

其中，F是法拉第常数，即9.6485×10⁴C/mol，且A是第一电极的面积。

等式4表示用于将测得的电流转化成分析物浓度[C]的等式，其中CF是校正因子，且Z是计算出背景电流的常数。

等式4

[C]＝CF×[C₀-Z]

CF项可以是基于γ和C₀的经验等式，其使分析物浓度[C]更准确。CF的数学表达式的一个例子显示于等式5，其中b、c和d是常数。

等式5

CF = \frac{1}{b + [\frac{c \times \ln (C_{o})}{C_{o}}] + [d \times \ln (γ)]}

因此，等式1至5可用于计算分析物浓度。然而，C₀和i_ss的计算在数学上是精深的，且需要相对快速的微处理器。

第二实施方案提供了测量分析物浓度的算法，该算法在数学上是简单的并且能够提供准确的分析物浓度。

在一个方面，将积分电流值用于校正因子的确定。这些积分电流值使分析物浓度能够更快速和更准确地被确定。此外，积分电流值一般比在一个时间点采集的电流值稳固。

在一个示例性实施方案中，使用积分电流值的方法包括应用具有第一极性的第一电位和测量作为时间的函数的小室电流，以获得第一时间-电流瞬态，以及应用具有第二极性的第二电位和测量作为时间的函数的小室电流，以获得第二时间-电流瞬态。在一个方面，第二极性和所述的第一极性相反。基于第一时间-电流瞬态，计算第一积分电流值，且基于第二时间-电流瞬态，计算第二积分电流值。将第二电流值除以第一电流值提供了可用于计算校正因子的比率。所述校正因子和初始的分析物浓度值提供了计算分析物浓度所必需的信息。

在另一个实施方案中，避免了CF和C₀的计算。申请人已发现可通过在短时间间隔内的第二脉冲测量值的积分来计算初始分析物浓度。可用积分电流值代替计算C₀。

例如，为计算CF和C₀，根据第二时间-电流瞬态计算第一积分电流值I₁和第二积分电流值I₂，以及根据第一时间-电流瞬态计算第三积分电流值I₃。然后计算比率，包括将第二积分电流值I₂除以第三积分电流值I₃。该比率提供了校正因子，而第一积分值I₁提供了可根据初始浓度用某数取代的值。本领域技术人员将理解，名称“第一”、“第二”和“第三”是为了方便而被选用的，而非必需反映积分电流被计算的顺序。

为提高结果的准确度和降低测试条的变化的影响，可使用许多经验参数。在一个方面，I₁可乘以常数a，且可从a和I₁的乘积中减去变量Z以计算出背景电流。在另一方面，可赋予比率I₂/I₃p次幂。

等式6举例说明计算步骤。

等式6

[C] = {(\frac{I_{2}}{I_{3}})}^{p} \times (a \times I_{1} - Z)

将第一、第二和第三电流值代入等式6可使得在相对较短的时间范围内确定准确的分析物浓度。避免了对稳态电流和初始分析物浓度进行费时的和计算机集约的计算，从而导致更简单的分析和减少的测定测试时间。具体地，因为可基于电流值的和或积分来确定I₁，所以和C₀的计算(其需要迭代算法)相比，其要求显著较低的计算能力。

在一个实施方案中，积分电流值的使用可提供快速的分析物浓度的计算。例如，可在少于大约10秒的时间内进行应用第一和第二电位和计算分析物浓度的方法。在一个实施方案中，可在少于大约6秒的时间内计算分析物的浓度，且在另一个实施方案中，可在少于大约5秒的时间内计算分析物浓度。

在一个方面，第一积分电流值I₁和第二积分电流值I₂是第二时间-电流瞬态的时间间隔内的电流值的积分、第二时间-电流瞬态的时间间隔内的电流值的和、或第二时间-电流瞬态的时间间隔乘第二时间-电流瞬态的平均或单一电流值。类似地，第三电流值I₃可以是第一时间-电流瞬态的时间间隔内的电流值的积分、第一时间-电流瞬态的时间间隔内的电流值的和、或第一时间-电流瞬态的时间间隔乘第一时间-电流瞬态的平均或单一电流值。对于电流值的和，可将从只有两个电流值至所有电流值的范围内的连续电流测量值加起来。

在另一个实施方案中，可用库仑值代替第一电流值、第二电流值和第三电流值。可测量通过的电荷而不是测量电流。通过的总电荷提供了和对时间-电流数据进行积分提供的信息相同的信息。例如，可在预先确定的时间间隔内测量通过的电荷并将其用于第一、第二和/或第三电流值。

在一个方面，将试剂层72沉积在第一电极166上，并从而在其溶解在生理样品中后，通常保持贴近第一电极166。这至少在一开始导致可氧化的物质的大部分贴近第一电极166。在经过一定时间段后，通过葡萄糖的反应在试剂层72中产生的被还原的介质将被动地从第一电极166扩散至第二电极164。在第一电位的应用期间，当被还原的介质从第一电极166扩散开后，其被第二电极164氧化。在该过程中，第一电极166和第二电极164之间的介质浓度的大小形成了梯度，在该梯度中被还原的介质的浓度在第一电极166处更高而在第二工作电极164处更低。在第一电极166处被还原的介质的大浓度导致梯度的大小变得更陡峭。该氧化电流的大小和该梯度的大小成比例。因此，由试剂层72产生的被还原的介质的量驱动被还原的介质向第二电极164扩散。因此在电极处测得的电流的变化速率指示试剂层72中被还原的介质的浓度的变化速率，且也指示葡萄糖反应的动力学(即，产生还原的介质的葡萄糖的反应速率)。

葡萄糖反应动力学依赖于几个因素，其包括间隔物60的高度(因为其涉及葡萄糖必须扩散以到达试剂层72的最大距离)、生理样品的粘度、血细胞比容浓度(hematocrit concentration)和温度。

生理样品中粘度的增加可随血细胞比容、蛋白、脂质含量或其组合的增加而发生。血细胞比容是指红细胞在血液样品中的比例。一般地，更高比例的红细胞可使血液更具粘性并导致更高比例的总葡萄糖存在于红细胞内。为了使红细胞内的葡萄糖和试剂层72反应，葡萄糖必须通过运输穿过红细胞膜。在某些情况下，该运输可以相对较慢，从而限制葡萄糖的反应动力学。因此，更高的血细胞比容减慢了葡萄糖反应动力学。粘度通常减慢样品反应室61内的总扩散过程。更高的温度通常增加葡萄糖和试剂层72在样品反应室61内的反应速度，因为其加速了相关的运输过程。

在此处公开的方法中，通过使用时间-电流瞬态说明葡萄糖的反应动力学。该结果对血细胞比容浓度和温度依赖性较小，并且在确定葡萄糖浓度上提高了准确度和精度。

第二时间-电流瞬态的大小一般比第一时间-电流瞬态的绝对大小要大。因此，比率I₂/I₃一般比1大，这时葡萄糖反应在样品反应室61中进行，且当葡萄糖反应完成时其将变成1。因此，比率I₂/I₃从1的背离是指示反应完成程度的因子。I₂/I₃的相对大的值表示葡萄糖反应离完成还很远，而接近1的I₂/I₃值表示葡萄糖反应接近完成。因此，比率I₂/I₃总的来说提供了有关葡萄糖反应的进程的信息，并且可用于消除血细胞比容、粘度和温度对葡萄糖浓度的测量的影响。

为进一步改进计算，可使用一个或多个校正因子。例如，如等式6中所示，给比率I₂/I₃赋予指数p，其中p是可用于特定批次(lot)的测试条的校正因子。通过经验方法发现指数p的使用提高了准确度并使得能够加快测试时间。在一个本发明的实施方案中，p可以在大约0.2至大约4的范围内，且优选地在大约0.4至大约1的范围内变动。

如等式6中所示，校正因子a可用于计算出挖切区域68和间隔物60的高度上的可能变化。挖切区域68上的变化可导致测量的电流的大小上的系统偏移。在某些情况下，生产过程可导致电极面积从一批测试条到另一批测试条之间产生变化。类似地，间隔物60的高度也可在批次之间产生变化。间隔物60的高度上的变化对测得的电流具有成比例的影响。计算各批测试条的校正因子a有助于抵消电极面积和间隔物60的高度上的变化。在测试条批次的校正过程中可计算a项。

在一个实施方案中，如等式6中所示，校正因子Z用于计算出背景的变化。从源产生而不是从葡萄糖产生的电流可对背景信号有贡献。例如，如果在向测试条加入生理样品之前，试剂层72含有少量作为杂质的可氧化物质，那么就存在不能归因于葡萄糖浓度的测得的电流的增加(即背景)。因为这将导致特定批次的测试条的总测得电流中的恒定偏差(constant bias)，所以通过使用校正因子Z可校正该偏差。类似于项p和a，在校正过程中也可计算Z。

尽管用校正因子p、a和Z来描述此处公开的方法，但本领域技术人员将认识到其使用不是必需的。例如，在一个实施方案中，可计算葡萄糖浓度而无需p、a和/或Z(p和/或a可被设为等于1而Z可被设为等于0)。

对于特定类型的测试条可用训练算法(training algorithm)来确定时间间隔的选择，在所述时间间隔的选择内计算I₁、I₂和I₃。在进行训练算法期间，可在用户在测试期间可能遇到的条件范围内测试几个测试条。这些条件可包括20mg/dL至600mg/dL范围内的葡萄糖浓度、0％至70％范围内的血细胞比容、5℃至45℃范围内的温度、5％相对湿度(％RH)至95％RH范围内的湿度和内源以及外源的干扰物。可在题为National Committee for Clinical Laboratory Standards.Interference testing in clinical chemistry；proposed guideline EP7-P.Wayne，Pa.：NCCLS，1986的出版物中查找到内源和外源干扰物的例子和其生理学浓度范围，所述出版物在此引入作为参考。通过使用标准的误差最小化技术，定义针对I₁、I₂和I₃的时间间隔的最优选择，从而利用等式6计算的葡萄糖浓度准确(例如，在参比测量值(reference measurement)的10％之内)和精确(例如，在1σ为大约2％的条与条之间的差异)。本领域技术人员将意识到，第一和第二积分电流值的选择的时间间隔因而可以是相同的或不同的，且在一个实施方案中，只计算两个积分电流值。于是第一积分电流值可用于I₁和I₂。

在选择I₁、I₂和I₃的时间间隔后，可校准条批次。在美国专利号6,780,645(以其全文在此引用作为参考)中描述了校准条批次的示例性方法。更具体地，可计算测试条的特定批次的校正因子a、p和/或Z。一般地，使用葡萄糖测试条和已知是准确和精确的参比仪器来测试来自多个供体的血液中的葡萄糖浓度的范围。通过找出a、p和/或Z的最优组合使本发明的测试条和参比方法测量的结果之间的误差最小化。在一个实施方案中，在使用来自测试条批次的测试条之前，可将校准信息传递给葡萄糖表。

在另一个实施方案中，在校准期间足够严格地控制控制a、p和Z的值的因素，以使其在测试条批次之间相同。能够成功地应用该实施方案的标准是多批次的测试条在指定的限度内产生具有相同的a、p和Z值(算法中使用的参数)的反应准确度。该实施方案避免了对将校准信息传递给表的系统的需要，因为在生产过程中可将预先确定的a、p和Z的值储存在表中。对于该实施方案发挥作用来说，需要受到严格控制的主要参数是传感器小室的几何形状(电极面积和间距)和在试剂中存在足够过量的葡萄糖反应活性，这样葡萄糖反应的速率基本上是由质量传递(mass transport)控制的而不是化学反应速率控制的。

下列实施例举例说明了本发明的原理和实践。本发明范围和精神内的许多其他实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。

实施例1

制备含有100mM pH6.5柠康酸盐、0.1％的消泡剂(RNA平衡剂(RNA Equilibrator))和4mM CaCl₂的缓冲液。然后向缓冲液中加入使用PQQ辅因子的GDH，以使其为46mg/mL。然后向缓冲液中加入PQQ，这样就可激活GDH。向缓冲液中加入PQQ，从而使每摩尔GDH存在至少2摩尔PQQ。在加入PQQ后，使制剂温育大约1个小时。然后，向混合物中加入铁氰化钾，从而使其达到800mM。通过美国专利号6749887、6689411和6676995(在此引用作为参考)中描述的狭缝式涂布法将制剂安置到图1中所示的第一电极166上。在涂布制剂并使其干燥从而形成试剂层72后，在其上装配间隔物60和第二电极164以形成测试条62。

实施例2

使用血液，就血液中从大约20mg/dL至大约600mg/dL的大范围内的葡萄糖浓度对几个测试条62进行测试。该研究使用了23个不同的血液供体。使用5秒的测试时间对测试条62进行测试。使用等式5将测得的电流转化为葡萄糖浓度。对照参比方法，计算每一个测试条的偏差。在低葡萄糖浓度(＜100mg/dL)的情况下，计算绝对偏差，且在高葡萄糖(≥100mg/dL)的情况下，计算百分比偏差。图8显示93％的数据点具有低于或等于10％或10mg/dL的偏差。

在电极之间应用第一电位4.0秒，其中涂布有试剂的电极相对于另一电极为-300mV，然后逆转电位，从而使涂布有试剂的电极相对于另一电极为+300mV，进行1秒。测量和储存50ms间隔处的电流值。为进行该分析，在逆转电位后，通过对4.8至5.0秒的储存的电流值求和来获得第一积分电流值I₁。类似地，在电位逆转后，通过对4.7至5.0秒的电流值求和来获得I₂，以及在应用原始电位后，通过对1.6秒至4.0秒的电流值求和来获得I₃。通过经验确定a、p和Z的值，其分别为1.29、0.645和3.64。

如图8所示，使用第一、第二和第三积分电流值计算分析物的浓度以快速的方式提供了准确的浓度信息。

要认识到，等同的结构可替代此处举例说明和描述的结构，且被描述的本发明的实施方案不是可用于实现请求保护的本发明的唯一结构。可用于实现本发明的一个等同结构的例子描述于美国专利号6,413,410，以其全文在此引用作为参考。可用于实现本发明的等同结构的其他例子描述于美国专利号6,612,111和6,284,125，以其全文在此引用作为参考。

尽管在此已显示和描述了本发明的优选的实施方案，但对于本领域技术人员来说很明显的是，这些实施方案仅以例子的形式提供。现在对于本领域技术人员来说，可产生许多变化、改变和替代而不背离本发明。应当理解此处描述的本发明的实施方案的各种可选择方案可用于实践本发明。下面的权利要求限定了本发明的范围并从而涵盖了这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同方案。

Claims

1.在生理样品中确定分析物浓度的方法，该方法包括：

(a)将所述生理样品导入电化学小室中，该电化学小室包括：

(i)间隔开关系的第一和第二电极；和

(ii)包含酶和介质的试剂层；

(b)将具有第一极性的第一电位应用于电化学小室，并测量作为时间的函数的小室电流以获得第一时间-电流瞬态；

(c)对所述小室应用具有第二极性的第二电位，其中第二极性和第一极性相反，并测量作为时间的函数的小室电流以获得第二时间-电流瞬态；和

(d)根据第二时间-电流瞬态计算第一电流值；

(e)根据第二时间-电流瞬态计算第二电流值以及根据第一时间-电流瞬态计算第三电流值；

(f)计算包含被第三电流值除的第二电流值的比率；和

(g)将减去背景值的第一电流值乘以所述比率以推导分析物的浓度。

2.权利要求1的方法，其中步骤(b)至步骤(g)发生的时间短于10秒。

3.权利要求1的方法，其中步骤(b)至步骤(g)发生的时间短于6秒。

4.权利要求1的方法，其中所述比率是被赋以p次幂。

5.权利要求1的方法，其中基于等式[C]＝(I₂/I₃)^p＊((a^＊I₁)-z)计算所述分析物的浓度，其中[C]是分析物浓度，I₁是第一电流值，I₂是第二电流值，I₃是第三电流值，且Z、p和a是校正因子。

6.权利要求5的方法，其中p在0.2至4的范围内变动，且a在0.2至4的范围内变动。

7.权利要求6的方法，其中p等于1，且a等于1。

8.权利要求5的方法，其进一步包括通过经验确定p和a的步骤。

9.权利要求1的方法，其中所述第一电流值和分析物浓度成比例。

10.权利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三电流值包含作为时间的函数的小室电流的积分。

11.权利要求1的方法，其中所述第一、第二和第三电流值包含小室电流的和。

12.权利要求1的方法，其中所述分析物是葡萄糖。

13.权利要求1的方法，其中所述生理样品是选自全血、血浆、血清、组织液和尿的材料。

14.权利要求1的方法，其中所述第一电极和第二电极包含选自金、钯、铂、银、铱、掺杂的氧化锡和碳的导电材料。

15.权利要求14的方法，其中所述第一电极是钯，且第二电极是金。

16.权利要求14的方法，其中将所述导电材料溅射至绝缘薄片上。

17.权利要求14的方法，其中将所述导电材料丝漏印刷至绝缘薄片上。

18.权利要求1的方法，其中将所述试剂层沉积在第一电极上。

19.权利要求18的方法，其中所述第一极性相对于第二电极是负的，而第二极性相对于第二电极是正的。

20.权利要求18的方法，其中相对于第二电极，所述第一电位在0.0至-0.6V的范围内变动，且相对于第二电极，所述第二电位在0.0至0.6V的范围内变动。

21.权利要求1的方法，其中在应用第一电位后，立即应用第二电位。

22.权利要求1的方法，其中电化学小室具有小于1微升的体积。

23.权利要求1的方法，其中所述酶是选自葡糖氧化酶、基于吡咯并喹啉醌辅因子的葡糖脱氢酶和基于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅因子的葡糖脱氢酶的材料。

24.权利要求1的方法，其中所述介质是选自铁氰化物、二茂铁、二茂铁衍生物、锇联吡啶复合物和醌衍生物的材料。

25.权利要求1的方法，其中在1秒至5秒的持续时间内应用所述第一电位。

26.权利要求1的方法，其中在1秒至5秒的持续时间内应用所述第二电位。

27.权利要求1的方法，其中在不同的时间间隔计算所述第二和第三电流值。

28.在生理样品中确定分析物浓度的方法，该方法包括：

(a)将所述生理样品导入电化学小室中，该电化学小室包括：

(i)间隔开关系的第一和第二电极；和

(ii)包含酶和介质的试剂层；

(d)根据第一时间-电流瞬态计算第一积分电流值，并根据第二时间-电流瞬态计算第二积分电流值；

(e)计算包含被第一积分电流值除的第二积分电流值的比率；

(f)计算包含所述比率的校正因子；

(g)根据第一和/或第二时间-电流瞬态计算初始浓度值；

(h)将减去背景值的初始浓度值乘以校正因子以推导所述分析物浓度。

29.权利要求28的方法，其中所述第一和第二积分电流值包含作为时间的函数的小室电流的积分。

30.权利要求28的方法，其中所述第一和第二积分电流值包含作为时间的函数的小室电流的和。

31.权利要求28的方法，其中所述分析物是葡萄糖。

32.权利要求28的方法，其中所述生理样品是选自全血、血浆、血清、组织液和尿的材料。

33.在生理样品中确定分析物浓度的方法，该方法包括：

(a)将所述生理样品导入电化学小室中，该电化学小室包括：

(i)间隔开关系的第一和第二电极；和

(ii)包含酶和介质的试剂层；

(b)将具有第一极性的第一电位应用于电化学小室，并测量作为时间的函数的小室电荷以获得第一时间-电荷瞬态；

(c)对所述小室应用具有第二极性的第二电位，其中第二极性和第一极性相反，并测量作为时间的函数的小室电荷以获得第二时间-电荷瞬态；

(d)根据第二时间-电荷瞬态计算第一电荷值；

(e)根据第二时间-电荷瞬态计算第二电荷值，并根据第一时间-电荷瞬态计算第三电荷值；

(f)计算基于第二电荷值和第三电荷值的比率；和

(g)将减去背景值的第一电荷值乘以所述比率以获得分析物浓度。