TWI565946B

TWI565946B - 生物檢測方法及其生物感測器

Info

Publication number: TWI565946B
Application number: TW104112606A
Authority: TW
Inventors: 王玉麟; 綦振瀛; 朱珈禾; 月銘
Original assignee: 國立清華大學
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2015-04-20
Publication date: 2017-01-11
Also published as: US10379078B2; TW201638580A; US20160305900A1

Description

生物檢測方法及其生物感測器

本發明是有關於一種生物檢測方法及其生物感測器，特別是指一種檢測蛋白質方法及其生物感測器。

參閱圖1，一種現有的金氧半場效電晶體(metal-oxide-semiconductor field effect transistor，MOSFET)生物感測器1，包括一基體11、一閘極端12、一源極端13，及一汲極端14。該閘極12設置於該基體11上並位於該源極端13與該汲極端14間，且該閘極端12具有一可供一受體(receptor)15鍵結的反應層121，該受體15能與一待測的配體(ligand)16相互結合。以該生物感測器1進行生物檢測時，是對鍵結有該配體16的閘極12施加一固定偏壓(圖未示)，此時該生物感測器1會因該配體16具有不同的濃度而產生不同電流。據此，藉由量測已知待測配體16的濃度，以建立一電流的感測指標，用以推知未知之待測配體16的濃度。

由於現有生物感測器1的尺寸微小化，要將該受體15鍵結於該閘極12的反應層121上並進行後續封裝製程時，會具有製程困難的缺點。此外，實際情況所欲量測的配體16通常是處於高鹽濃度環境(例如人體血液)，而現有生物感測器1的檢測方式是於該受體15與該配體16反應達平衡時，才給予固定電壓；然而，此時配體16會因高鹽濃度而產生屏蔽效應(screening effect)，導致無法量測。因此，現有方式通常是先稀釋具有高鹽濃度的待測配體液後，才可進行後續檢測，此方式雖可量測到待測配體液中配體16的濃度，然而，因為該待測配體液的濃度已經過稀釋，因此，量測結果已跟原始待測配體16的量測值產生落差。

因此，改良現有的生物感測器1的元件結構及其量測方法，以降低感測元件製作難度，並能直接於接近人體生理鹽環境的高鹽濃度下進行量測，是此技術領域的相關技術人員所待突破的課題。

因此，本發明之目的，即在提供一種生物檢測方法。

本發明生物檢測方法，包含一準備步驟及一檢測步驟。

該準備步驟是先準備一生物感測器，及一受體，該生物感測器包括一電晶體，及一反應電極，該反應電極是相對該電晶體的一閘極端而與該電晶體彼此間隔設置，該受體設置於該反應電極且與該反應電極相互鍵結。

該檢測步驟是將一能與該受體產生反應的配體結合於該受體上，並施加一可調變脈波寬度與高度的脈波電壓於該反應電極，以令該反應電極與該電晶體的該閘極端之間產生一壓差，並於該脈波寬度內量測運算自該電晶體產生的檢測電流，得到一第一感測指標。

此外，本發明之另一目的，在提供一種生物感測器。

該生物感測器包含一具有一閘極端的電晶體及一反應電極。該反應電極相對該電晶體的該閘極端而與該電晶體彼此間隔設置，並供鍵結一受體。其中，施加一電壓於該反應電極時，該反應電極與該電晶體的閘極端之間會產生一壓差。

本發明之功效在於，藉由施加可調變脈波寬度與高度的脈波電壓於鍵結有受體與配體液的該反應電極，令該反應電極與間隔設置的該閘極產生壓差並具有電容效應，而能克服屏蔽效應，以直接於高鹽濃度下量測該配體液的濃度，且該反應電極與該電晶體間隔的設置亦能降低感測元件的製作難度。

2‧‧‧生物感測器

21‧‧‧電晶體

211‧‧‧基體

212‧‧‧源極端

213‧‧‧汲極端

214‧‧‧閘極端

22‧‧‧反應電極

221‧‧‧第一子電極

222‧‧‧第二子電極

223‧‧‧玻璃基板

224‧‧‧反應層

225‧‧‧氮化矽層

226‧‧‧矽基板

23‧‧‧受體

24‧‧‧配體液

241‧‧‧配體

3‧‧‧準備步驟

4‧‧‧檢測步驟

5‧‧‧轉換步驟

I‧‧‧檢測電壓

I₁‧‧‧第一電流

I₂‧‧‧第二電流

V‧‧‧脈波電壓

本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1是一側視示意圖，說明現有的金氧半場效電晶體生物感測器；圖2是一側視示意圖，說明本發明生物感測器的一第一實施例；圖3是一俯視示意圖，說明本發明生物感測器的一第二實施例；圖4是一電流對時間的關係圖，說明本發明一緩衝溶液(1X PBS)、一脫氧核醣核酸(DNA)、一牛血清蛋白(BSA)，及具體例1~6於一脈波寬度內所量測而得的電流值；圖5是一電流對時間的關係圖，輔助說明圖4之脈波寬度於3μs以下時的電流值；圖6是一特定時間與電流值關係圖，輔助說明圖5在2.015μs時的電流值；圖7是一電流變化值對濃度的關係圖，輔助說明圖5在2.015μs時，各具體例1~6的第二電流值扣除牛血清蛋白(BSA)的第一電流值所得到的檢測電流值；圖8是一電荷對時間的關係圖，說明圖4的電流對時間作積分的曲線圖；圖9是一特定時間與電荷關係圖，輔助說明圖8在50μs時的電荷值；圖10是一電荷變化值對濃度的關係圖，輔助說明圖8在50μs時，各具體例1~6的電荷值扣除牛血清蛋白的電荷值所得到的電荷變化值；圖11是一時間常數曲線圖，說明對圖4的電流曲線進行運算所得的時間常數曲線圖；圖12是一特定時間與時間常數關係圖，輔助說明將圖11在50μs時所取得各具體例1~6扣除牛血清蛋白的時間常數值；圖13是一電流對時間的關係圖，說明以第二實施例的生物感測器量測緩衝溶液癌胚原抗原Anti-CEA與各具體例7~11的電流值；圖14是一電流對濃度的關係圖，輔助說明圖13在50μs時的電流值；圖15是一電荷對時間的關係圖，輔助說明圖13的電流對時間作積分的曲線圖；圖16是一電荷對濃度的關係圖，說明在50μs時，各具體例7~11的電荷值。

<發明詳細說明>

在本發明被詳細描述之前，應當注意在以下的說明內容中，類似的元件是以相同的編號來表示。

參閱圖2，本發明第一實施例的生物感測器2包含一電晶體21及一反應電極22。

該電晶體21包括一基體211、一源極端212、一汲極端213，及一設置於該源極端212與該汲極端213之間的閘極端214。

具體地說，適用於本發明生物感測器2的電晶體21是選自高速電子遷移率場效電晶體(high electron mobility transistor，HEMT)、奈米碳管場效電晶體、石墨烯場效電晶體，或二硫化鉬場效電晶體，但不限於此。本實施例是使用高速電子遷移率場效電晶體(HEMT)為例作說明，其結構是於一藍寶石(sapphire)基板上依序形成一氮化鎵(GaN)層及一氮化鋁銦(AlInN)層，得到一基體211，並透過曝光顯影製程於該基體211形成該源極端212、該汲極端213，及該閘極端214以構成該電晶體21，由於曝光顯影製程為本領域所周知技術且非本發明之重點，於此不加以贅述。

本例使用高速電子遷移率場效電晶體(HEMT)主要是藉由AlInN/GaN之間具有低維異質結構界面，使該電晶體21應用於生物感測器時，能具有卓越的載子傳輸特性，其中，形成於該氮化鎵(GaN)層上的材料並不限於該氮化鋁銦(AlInN)，也可以是氮化鋁鎵(AlGaN)等具有壓電特性的材料。

該反應電極22包括一位於頂面並由金所構成的反應層224，並以該反應層224相對該電晶體21的閘極端214，而與該電晶體21彼此間隔設置於該電晶體21的閘極端214上方，且該反應電極22與該閘極端214無電連接。

本實施例的該反應電極22實質上是由兩個結構相同的一第一子電極221與一第二子電極222彼此相對地連接所構成。詳細地說，該第一子電極221與該第二子電極222均是於一矽基板226上形成氮化矽(Si₃N₄)層225，再於該氮化矽層225上形成由金所構成的該反應層224。該氮化矽層225可阻隔該反應層224於後續進行生物檢測產生的電子傳遞至該矽基板226上，而可降低量測的誤差值。該反應電極22是藉由將該第一子電極221以該反應層224遠離該矽基板226的方向設置於一玻璃基板223上，且該第一子電極221與該玻璃基板223的高度和大於該電晶體21的高度，再將該第二子電極222的反應層224與該第一子電極221的反應層224彼此相連接，且令該第二子電極222的反應層224凸伸出該第一子電極221，而令該第二子電極222的反應層224位於該電晶體21的閘極端214上方，並與該閘極端214彼此成一間隙間隔。

此外，要說明的是，該反應電極22的形成方式並不限於前述結構，也可視情況以一體成型方式而構成該反應電極22。

參閱圖3，本發明生物感測器2的一第二實施例的層體結構與組成材料大致是相同於該第一實施例，不同之處在於，該反應電極22是與該電晶體21的閘極端214位於同一平面，且形成於該電晶體21的氮化鎵(GaN)層上的是氮化鋁鎵(AlGaN)。詳細地說，該第二實施例是藉由延伸該電晶體21的基板，並將該反應電極22設置於該基板上，以令該反應電極22可與該電晶體21的閘極端214位於同一平面並間隔相對設置。

本發明可利用前述該第一實施例或該第二實施例的生物感測器2進行生物檢測。茲將該生物檢測方法說明如下：該生物檢測方法包含：一準備步驟3，及一檢測步驟4。

該準備步驟3是準備一如圖2或圖3所示的生物感測器2，在此是以圖2所示的該生物感測器2作說明。

配合參閱圖2，先將一受體23鍵結於該反應電極22上，接著，進行該檢測步驟4，將一具有預定濃度且能與該受體23產生反應之配體241的配體液24滴加於該反應電極22，令該配體241鍵結於該受體23上，並施加一具有可調變脈波寬度與高度的脈波電壓V於該反應電極22的反應層224上，以令該反應電極22與該電晶體21的閘極端214之間產生一壓差，並於該脈波寬度內量測運算該電晶體21產生的檢測電流I，以得到一由該配體241產生的第一感測指標。

具體地說，該受體23與該配體241的選擇並沒有特別的限制，只要該配體241能與該生物感測器2上的受體23相互反應鍵結，且透過該檢測步驟4而能得到檢測電流I即可。本發明的該受體23與該配體241是分別舉例兩組作說明：(1)當該配體241選用HIV-1逆轉錄酶蛋白質(HIV-1 Reverse Transcriptase(HIV-1 RT)protein)時，該受體23則選用具有特定序列而能與HIV-1 RT蛋白質產生反應的脫氧核醣核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)；(2)當該配體241選用癌胚原抗原CEA(carcino-embryonic antigen，CEA)時，該受體23則選用能與該癌胚原抗原CEA產生反應的抗體。

要說明的是，本發明該反應電極22的反應層224的目的是要使該等受體23鍵結於其上，因此，該反應層224材質的選用並沒有特別限制，只要能使該受體23鍵結於該反應層224上即可，例如，前述該偵測方法中使用的受體23是選自DNA及抗體，由於DNA及抗體可與金產生鍵結，因此，該反應層224是由金所構成，而能使上述的該等受體23(DNA及抗體)鍵結於其上。

該檢測步驟4會先給予該電晶體21一固定電壓後，再對該反應電極22施加該脈波電壓V，從而使該反應電極22與該電晶體21的閘極端214之間產生壓差。因此，當具有預定濃度的該配體241鍵結於該受體23時，透過施加該脈波電壓V產生的壓差而能使該反應電極22與該電晶體21的閘極端214之間具有一電容效應，而得到由該電容效應所貢獻的電流值。值得一提的是，利用此電容效應進行生物檢測時，能量測該受體23與該配體241在反應未達平衡狀態前的動態資訊，也就是說，藉由量測反應未達平衡狀態前的動態資訊，而能克服習知因為須在平衡狀態時量測，該配體液24因高鹽濃度於平衡時產生的屏蔽效應，也毋須將例如人類血液之高鹽濃度的配體液24進行繁複的稀釋步驟，有關詳細的分析數據容後說明。

此外，該檢測步驟4所施加的脈波電壓V的脈波寬度與高度的大小，是取決於使用者所欲分析的檢測時間及檢測所需的電壓大小，並沒有特別的限制，較佳地，於本發明中，該脈波寬度是選用小於該受體23與該配體241在反應未達平衡的時間，適用於本發明的脈波寬度為不大於10^-3秒，而脈波高度則選用0.5V。

更詳細地來說，該檢測步驟4除了可將不同濃度的配體液24滴於該受體23後直接進行檢測而直接得到由該配體241產生的該檢測電流I之外，更佳地，該檢測步驟4還可再包括以下三個次步驟：一次步驟(a)、一次步驟(b)，及一次步驟(c)：首先，實施該次步驟(a)，將一含有參考蛋白的參考蛋白液滴至結合有該受體23的反應層224上，並施加具有預定脈波寬度的該脈波電壓V於該反應電極22，並於該脈波寬度內量測得到該電晶體21的源極端212產生的電流，得到由該參考蛋白貢獻的一第一電流I₁。

接著，實施次步驟(b)，移除該次步驟(a)的參考蛋白液，再將一含有該參考蛋白液及一配體241的配體液24滴至該受體23上，最後如該次步驟(a)對該反應電極22施加該脈波電壓V，並於該脈波寬度內量測得到該電晶體21的源極端212產生的電流，得到由該參考蛋白及該配體241共同貢獻的一第二電流I₂。

最後，實施該次步驟(c)，將該第二電流I₂扣除該第一電流I₁，運算該配體241所貢獻的該檢測電流I，以得到該第一感測指標。

具體地說，本發明該次步驟(a)所使用的參考蛋白液為含有預定濃度之牛血清蛋白(bovine serum albumin ，BSA)的溶液；該次步驟(b)所使用的配體液24是以該次步驟(a)所使用的該參考蛋白液作為溶劑，並添加HIV-1 RT蛋白質作為配體241，以調配出具有不同濃度之HIV-1 RT蛋白質的配體液24。要說明的是，該次步驟(a)所使用的配體液溶劑並不限於此，除了選用如本發明的牛血清蛋白 (BSA)液外，還可視需求選用其它如TE緩衝溶液(Tris-EDTA buffer)等。本發明選用含有牛血清蛋白的溶液作為溶劑的目的在於，使該配體液24更接近於實際的人體血液環境，且利用先行於該次步驟(a)滴上該參考蛋白液還能避免該配體241直接鍵結於未具有該受體23的反應層224上，也就是說，該參考蛋白能先鍵結於未具有該受體23的反應層224上，從而使該配體241僅鍵結於該受體23上，因此，藉由量測該配體液24所貢獻的第二電流I₂減去該參考蛋白(BSA)所產生的第一電流I₁，而能得到僅是由該配體241與該受體23結合後所貢獻的檢測電流I。

值得一提的是，於該檢測步驟4後還可視需求實施一轉換步驟5，用以將該第一感測指標的檢測電流I進行轉換以得到其他感測指標。

具體地說，第一種轉換方式為對該檢測電流I相對該脈波寬度(t)進行積分轉換，此時即為對電流與時間進行積分，而可得到電荷量，從而得知特定時間於該電晶體21的源極端212所累積的總電荷量，以作為第二感測指標。

另外，第二種轉換方式則是將對應該脈波寬度的檢測電流I除以該檢測電流的最大值I_peak，以得到一動態電流值P(t)，並對該動態電流值P(t)相對該脈波寬度(t)進行積分轉換，得到一時間常數(time constant)，以作為一第三感測指標。

為了可更清楚的說明本發明該生物檢測方法，以下以12個具體例進行說明，該等具體例1~12是根據上述實施方式配合以下流程實施。

要說明的是，為了確保受體確實鍵結於該反應電極22的反應層224上，因此，本發明該等具體例1~12在進行量測之前，會先進行如下量測，以確認受體確實鍵結於該反應電極22的反應層224。

首先，取5μL/pH7.4的磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer Saline，PBS)滴至該生物感測器2的反應電極22與電晶體21上，且使該緩衝溶液覆蓋且連結該反應電極22的反應層224與該電晶體21的閘極端224，並施加脈波寬度與高度分別為50μs及0.5V的脈波電壓V於該反應電極22上，量測該電晶體21的源極端212而得到一由PBS緩衝溶液所貢獻的電流值。接著，移除PBS緩衝溶液，再取5μL的受體(DNA)滴至該反應電極22的反應層224上，且靜待24小時使DNA與金所構成的反應層224反應鍵結，隨後再於該反應電極22與該電晶體21的之間滴上PBS緩衝溶液，並以上述相同條件的脈波電壓V量測該電晶體21而得到一由DNA所貢獻的電流值。當DNA所貢獻的電流值與PBS緩衝溶液所貢獻的電流值不同時，即可判定DNA確實鍵結於該反應電極22的反應層224上。

<具體例1>

本發明生物檢測方法的一具體例1是使用第一實施例，且該反應層224已鍵結有DNA(受體)的生物感測器2進行量測。接著，以PBS緩衝溶液配製含有4%的牛血清蛋白(BSA)的參考蛋白液，並將該參考蛋白液滴至該反應電極22與該電晶體21的間隙之間，再脈波寬度與脈波高度分別為50μs及0.5V的脈波電壓V於該反應電極22，並於該電晶體21的源極端212量測得到一第一電流I₁。

接著，以沖堤緩衝溶液(elution buffer)將該反應電極22與該電晶體21之間的牛血清蛋白溶液清淨，再重新以前述含有4%牛血清蛋白的參考蛋白液作為溶劑，並以HIV-1 RT蛋白質作為溶質，調配濃度為1aM的HIV-1 RT蛋白質溶液(即該配體液24)。

接著，取5μL濃度為1aM的HIV-1 RT蛋白質溶液，滴至該反應電極22的反應層224與該電晶體21的閘極端224之間。隨後對該電晶體21的源極端212與汲極端213施加0.5V的電壓，並在時間經過2μs時，給予該反應電極22一個脈波寬度與高度分別為50μs及0.5V的脈波電壓V，並量測該電晶體21的源極端212而得到一第二電流I₂。

最後，將該第二電流I₂扣除該第一電流I₁即得到該檢測電流I，作為第一感測指標。

<具體例2~6>

本發明生物檢測方法的一具體例2~6的實施條件大致上是相同於該具體例1，其不同之處在於，該具體例2~6所配製的配體液濃度分別為10aM、1fM、10fM、100fM，及1pM的HIV-1 RT蛋白質溶液。

<具體例7>

本發明生物檢測方法的一具體例7的實施條件大致是相同於該具體例1，其不同之處在於，該具體例7是使用該第二實施例的生物感測器2(該反應電極22與該電晶體21的閘極端214位於同一平面)進行量測，且受體是選用抗體，該配體液則是以含有1%的牛血清蛋白(BSA)的參考蛋白液為溶劑，癌胚原抗原CEA為溶質，配製而得濃度為10aM的癌胚原抗原CEA配體液，且對該電晶體21所施加的電壓改為2V。此處要說明的是，該具體例7使用抗體作為受體而欲鍵結於該反應層224時，會先利用將硫醇(mercaptan)配置於該反應層224上作為鏈接器(linker)，從而使該抗體透過硫醇(mercaptan)鍵結於該反應層224上。

<具體例8~11>

本發明生物檢測方法的一具體例8~11的實施條件大致上是相同於該具體例7，其不同之處在於，該具體例8~11是使用濃度分別為100aM、1fM、10fM及50fM的癌胚原抗原CEA配體液進行量測。

<數據分析>

參閱圖4，使用該第一實施例的生物感測器2量測不同待測物(1X PBS、DNA、BSA，及該等具體例1~6的HIV-1 RT蛋白質溶液)時，在對該電晶體21施加電壓後，經過2μs而給予該反應電極22一個脈波寬度與高度分別為50μs及0.5V的脈波電壓V，可由該電晶體21的源極端212量測得到如圖4電流對時間的曲線圖；其中，牛血清蛋白(BSA)及該具體例1~6於圖4的電流值即分別為該第一電流I₁與該第二電流I₂。

由圖4可知，隨著時間的增加，該等具體例1~6的電流變化趨勢大致相同，但值得注意的是，在2μs對該反應電極22施加脈波電壓V時，明顯具有一電流峰值產生，而隨著時間的增加(>5μs)，電流曲線則趨於平緩。由此電流曲線的特徵可說明：由於該反應電極22是與該電晶體21彼此間隔設置，因此，當施加脈波電壓V於該反應電極22時，即會對該電晶體21的閘極端214產生一因電容效應的充電現象，從而具有明顯的電流峰值產生；當電流曲線趨於平緩時，則代表整體的反應逐漸達平衡狀態。

更詳細地說，此電容效應產生的電流峰值下降至平緩狀態的過程，即代表該等具體例1~6的配體(HIV-1 RT蛋白質)與受體(DNA)在達平衡狀態之前的彼此相互反應的電流變化值，也就是說，此電流由峰值下降至平緩狀態的電流曲線(約2μs~2.5μs)能充分反映出配體與受體的反應動態資訊。

現有的生物檢測方式是等配體與受體反應達平衡時，才給予生物感測器1(見圖1)一固定電壓，當不同濃度的配體鍵結於生物感測器1的表面而具有不同電阻，從而產生不同電流(V=IR)。在實際情況中，欲量測的配體通常屬於高鹽濃度(例如人體血液)，而在配體與受體反應達平衡時，才給予一固定電壓，會因高鹽濃度而具有遮蔽效應，導致施加的電壓衰落而無法量測。因此，現有生物檢測方式通常會先稀釋該配體液再進後續行量。

藉由本發明該生物感測器2特殊的結構配合施加脈波電壓V的檢測方法，可量測該配體與該受體在未達平衡狀態前的動態反應資訊，而可克服現有的生物感測器1(見圖1)因於高鹽濃度環境下於整體達平衡才量測而具有屏蔽效應導致無法量測的缺點。

參閱圖5，圖5是進一步將圖4的時間縮短至3μs，以觀測該等具體例1~6於反應未達平衡前的電流變化，由圖5可清楚得知，不同濃度的配體液確實具有不同電流曲線，且該等電流曲線訊號隨著配體液濃度越大而逐漸降低，具有明顯的趨勢。

參閱圖6，前述說明在2μs時會對該反應電極22施加脈波電壓V，為了能更清楚得知在剛施加脈波電壓V時，配體與受體未達平衡的狀態的電流值，可進一步地對圖5在2.015μs取其相對應的電流值，而得到如圖6所示於該等具體例1~6於特定時間(2.015μs)的電流值。由圖6顯示得知，當配體液的濃度越大時，則具有越低的電流值。要說明的是，本發明是選取2.015μs為例作說明，但並不限於此，特定時間的選取可視情況自由選擇，只要是在配體與受體反應未達平衡狀態前即可。

參閱圖7，圖7是圖5在2.015μs將各具體例1~6的第二電流I₂扣除參考蛋白(BSA)的第一電流I₁，而獲得僅由該配體(HIV-1 RT蛋白質)所貢獻的檢測電流I，且進一步對該等具體例1~6所載的配體液濃度取對數。由圖7可知，配體液的濃度越大，其扣除參考蛋白(BSA)的配體所貢獻的檢測電流I則越大，且呈現一具有相當線性程度的趨勢。此結果與圖6顯示的趨勢正好相反，主要是因為參考蛋白(BSA)於特定時間的電流值為固定值且均大於不同濃度配體(HIV-1 RT蛋白質)所貢獻的電流值(見圖6)。由上述圖4~圖7的量測運算結果可知，該等具體例1~6的不同濃度的配體(HIV-1 RT蛋白質)所得到的檢測電流I確實因濃度的不同而有特定趨勢，所以使用該檢測電流I作為第一感測指標。

本發明除了使用檢測電流I作為第一感測指標外，還可進一步地透過轉換步驟，而得到以電荷作為指標的第二感測指標。

參閱圖8，圖8顯示有圖4的各曲線電流值相對時間進行積分轉換而得到相對時間的電荷曲線。由圖8可知，隨著時間越長，配體液的濃度越小所累積的總電荷量越多。由電荷量等於電流乘以時間(Q=I×t)可知，電荷量與電流成正比，因此，圖8所顯示的電荷曲線確實符合圖4及圖5的結果。

參閱圖9，前述圖6已可清楚瞭解該等具體例1~6在未達平衡狀態前，配體濃度電流值得關係。此處要進一步地探討，當該等具體例1~6逐漸趨近平衡狀態的過程中，該等具體例1~6所累積的電荷量關係。圖9顯示有對圖8在50μs取其相對應的電荷值，同樣地，當配體液的濃度越大時，其所累積的電荷值越低(理由同圖8結果所述)。要說明的是，觀察該等具體例1~6累積的電荷所選取的時間也不限於此，也可視情況而自由選擇。

參閱圖10，圖10是圖8在50μs將該等具體例1~6的電荷值扣除參考蛋白液的電荷值，而獲得僅由該配體(HIV-1 RT蛋白質)所貢獻的檢測電荷，且進一步對該等具體例1~6所載的配體液濃度取對數。由圖10可知，配體液的濃度越大，其扣除參考蛋白液後，該配體(HIV-1 RT蛋白質)所貢獻的檢測電荷則越大，且呈現一具有相當線性程度的趨勢。由圖8~10的轉換結果可知，將該等具體例1~6的不同濃度的配體(HIV-1 RT蛋白質)所得到的檢測電流I轉換成檢測電荷(見圖10)也具有特定趨勢，而能作為第二感測指標。

本發明除了使用電流、電荷作為第一、二感測指標外，還可更進一步地透過轉換步驟，而得到以時間常數作為指標的第三感測指標。

參閱圖11，圖11顯示有將圖4的該等具體例1~6的曲線電流值轉換為一時間常數τ(time constant)曲線圖的轉換結果。此時間常數(τ)可藉由下列公式(1)計算而得：其中，I(t)代表脈波寬度內所對應的電流值；I_peak代表脈波寬度內所對應的電流最大值；且以電流最大值對應的時間作為積分下限，以所選取的脈波寬度作為積分上限。

參閱圖12，圖12是圖11在50μs取該等具體例 1~6並扣除牛血清蛋白的時間常數變化(Δτ)，且進一步對該等具體例1~6所載的配體液濃度取對數。由此結果可知，其所得到的時間常數變化(Δτ)也會因配體液濃度的不同而具有一定的趨勢(濃度越大時間常數變化(Δτ)越小)，因此，可將此時間常數(τ)作為第三感測指標。

參閱圖13與圖14，圖13顯示有使用該第二實施例的生物感測器2量測Anti-CEA及該等具體例7~11的癌胚原抗原CEA配體液的電流對時間的關係圖(對電晶體21施加0.5V，並於2μs給予該脈波電壓V)。由圖13中可觀察到，隨著癌胚原抗原CEA的濃度越大，其電流值相較越低。進一步地，對各具體例7~11的配體液濃度取對數，並於50μs取其電流值，由圖14可知，以該第二實施例的生物感測器2量測不同濃度的癌胚原抗原CEA配體液時，也可得到具有特定趨勢的電流值。

參閱圖15，將圖13以電流對時間進行積分轉換，而得到如圖15具有該等具體例7~11的電荷曲線圖。由圖15可知，癌胚原抗原CEA濃度越大，相較於相同時間則具有越高的電荷值。

參閱圖16，進一步地於50μs時，對圖15取其相對應的電荷值。由此結果可知，以該第二實施例的生物感測器2量測不同濃度的癌胚原抗原CEA配體液時，也可得到具有特定趨勢的電荷值(當癌胚原抗原CEA配體液濃度越大時，具有越大的電荷值)，且由圖16可知，以電荷作為感測指標具有良好的線性度。

由圖4~圖16的量測結果可知，不論是使用該反應電極22位於該電晶體21上方的生物感測器2，或者是使用該反應電極22與該電晶體的閘極端214位於同一平面的生物感測器2，其量測所得的電流曲線，及轉換所得的電荷曲線結果，均與配體濃度具有特定趨勢而確實能達到本發明之目的。

綜上所述，本發明生物檢測方法及其生物感測器，藉該反應電極22與該電晶體21的閘極端214彼此間隔設置的生物感測器2進行生物檢測，主要是於該反應電極22上施加可調變脈波寬度與高度的脈波電壓V，以令該反應電極22與該閘極端214產生壓差而具有電容效應，而能克服屏蔽效應以直接於高鹽濃度下進行生物檢測，此外，該反應電極22與該電晶體21間隔的設置亦降低生物感測器21的製作難度，故確實能達成本發明之目的。

惟以上所述者，僅為本發明之實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即大凡依本發明申請專利範圍及專利說明書內容所作之簡單的等效變化與修飾，皆仍屬本發明專利涵蓋之範圍內。

Claims

一種生物檢測方法，包含：一準備步驟，準備一生物感測器，及一受體，該生物感測器包括一電晶體，及一反應電極，該反應電極是相對該電晶體的一閘極端而與該電晶體彼此間隔設置，該受體設置於該反應電極且與該反應電極相互鍵結；及一檢測步驟，將一能與該受體產生反應的配體結合於該受體上，並施加一可調變脈波寬度與高度的脈波電壓於該反應電極，以令該反應電極與該電晶體的該閘極端之間產生一壓差，並於該脈波寬度內量測運算自該電晶體產生的檢測電流，得到一第一感測指標。
如請求項1所述的生物檢測方法，還包含一實施於該檢測步驟後的轉換步驟，將該檢測電流相對該脈波寬度進行積分轉換，得到一第二感測指標。
如請求項1或2所述的生物檢測方法，還包含一實施於該檢測步驟後的轉換步驟，將對應該脈波寬度的檢測電流值除以該檢測電流的最大值，並對該脈波寬度進行積分轉換，得到一第三感測指標。
如請求項1所述的生物檢測方法，其中，該檢測步驟為連續性地施加該脈波電壓。
如請求項1所述的生物檢測方法，其中，該檢測步驟包括以下次步驟：(a)先將一具有參考蛋白的參考蛋白液滴至結合有該受體的該反應電極，並施加一可產生預定脈波寬度的脈波電壓於該反應電極，並於該脈波寬度內量測該電晶體產生的一第一電流；(b)於該次步驟(a)後，移除該參考蛋白液，再將一含有該參考蛋白液及一配體的配體液滴至該受體上，並施加該脈波電壓於該反應電極，於該脈波寬度內量測該電晶體產生的一第二電流；及(c)將該第二電流扣除該第一電流，得到該配體所貢獻的該檢測電流。
如請求項1所述的生物檢測方法，其中，該檢測步驟的該脈波寬度不大於10^-3秒。
如請求項1所述的生物檢測方法，其中，該準備步驟中的電晶體是選自高速電子遷移率場效電晶體、矽基場效電晶體、奈米線場效電晶體、奈米碳管場效電晶體、石墨烯場效電晶體，或二硫化鉬場效電晶體，該反應電極與該受體相互鍵結的表面是由金所構成。
如請求項1所述的生物檢測方法，其中，該反應電極是間隔地設置於該電晶體的閘極端的上方。
如請求項1所述的生物檢測方法，其中，該反應電極是設置於該電晶體的基板上，而與該電晶體的閘極端位於同一平面。
一種生物感測器，包含：一電晶體，具有一閘極端；及一反應電極，相對該電晶體的該閘極端，而與該電晶體分離設置，且無一導線相連，並供鍵結一受體；其中，施加一電壓於該反應電極時，該反應電極與該電晶體的閘極端之間會產生一壓差。
如請求項10所述的生物感測器，其中，該電晶體是選自高速電子遷移率場效電晶體、矽基場效電晶體、奈米線場效電晶體、奈米碳管場效電晶體、石墨烯場效電晶體，或二硫化鉬場效電晶體，該反應電極與該受體相互鍵結的表面是由金所構成。
如請求項10所述的生物感測器，其中，該反應電極是間隔地設置於該電晶體的閘極端的上方。
如請求項10所述的生物感測器，其中，該反應電極與該電晶體位於同一基板上，並與該電晶體的閘極端位於同一平面。