CN113786404A - 溴酚-吡唑啉化合物在治疗禽冠状病毒疾病中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，具体涉及溴酚‑吡唑啉类化合物在治疗禽类冠状病毒疾病中的应用。本发明研究发现溴酚‑吡唑啉类化合物能够抑制鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和鸭冠状病毒（DCV）的复制。在攻毒实验和临床实验中，溴酚‑吡唑啉类化合物能够治疗鸡传染性支气管炎和鸭冠状病毒性肠炎，极大的提高病禽的存活率，可用于制备治疗鸡传染性支气管炎和鸭冠状病毒性肠炎等禽类冠状病毒疾病的药物。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及溴酚-吡唑啉类化合物的新用途，尤其是溴酚-吡唑啉类化合物在治疗鸡、鸭冠状病毒疾病中的应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎(IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)引起的仅发生于鸡的急性、高传染性的呼吸道疾病。该病1930年首先在美国Dakota洲被发现，我国20世纪50年代就有本病的报道。临床常表现伸颈，张口呼吸，咳嗽，喷嚏，气管口罗音，流粘性鼻液，眼泪多，死亡率为20％-80％。IBV主要通过空气传播，具有高度的传染性，往往整栋鸡舍同时发病。该病的潜伏期很短，一般在感染后36～48h内就会表现出临床症状。主要侵害鸡的呼吸系统和泌尿生殖系统，能够引起鸡的呼吸道炎症、肾脏损伤、产蛋量和蛋品质下降。IB是影响我国养禽业快速发展的重要疫病之一，给养禽业造成了重大的经济损失。目前，对于IB没有特效治疗药物，有报道称可采用接种减毒活疫苗或灭活疫苗进行预防。但是由于需要多次接种且IBV存在众多的变异血清型，预防效果不明显，限制了疫苗的广泛使用。
鸭冠状病毒性肠炎由鸭冠状病毒(DCV)感染引起的急性传染病。临床表现以腹泻为主，发病急，传播快。20日龄前后的鸭发病率较高，开始少数发病，1～2天后出现死亡高峰，发病率和死亡率达80％～100％。病雏缩头拱背、畏寒和眼半闭，有黏液性分泌物。开始排稀粪，进而剧烈腹泻，呈白色或黄绿色，发病后喙壳由黄变紫，喙壳上皮脱落破溃。有的表现神经症状，两脚后蹬、直伸或头向后弯曲，呈观星状，稍加驱逐或应激可促进死亡。迄今为止，鸭冠状病毒性肠炎无特效治疗药物，主要依赖于疫苗的主动免疫，但预防和治疗效果均不明显。
溴酚-吡唑啉类化合物是发明人前期研究开发设计的具有干扰人新型冠状病毒复制的化合物，在制备治疗人冠状病毒肺炎的药物中具有广阔的应用前景。后续研究发现其在猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)也有治疗作用。因此，溴酚-吡唑啉类化合物是一类极具药用潜力的化合物，进一步发现其新的药用功效，特别是本发明的禽类冠状病毒疾病的治疗将具有十分重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供溴酚-吡唑啉类化合物新的医药用途。
发明研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够抑制禽类冠状病毒(如IBV和DCV等)的复制；在临床试验中能够治疗禽类冠状病毒疾病(如鸡传染性支气管炎、鸭冠状病毒性肠炎等)，极大提高染病仔禽的存活率，可用于制备治疗禽类冠状病毒疾病的药物。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供溴酚-吡唑啉类化合物可用于制备治疗鸡传染性支气管炎和鸭冠状病毒性肠炎等禽类冠状病毒疾病的药物。
上述应用中，所述溴酚-吡唑啉类化合物具有如下式I所示的结构通式：
其中：R1、R2、R3、R4、R5分别选自H、F、Br、OH、OCH3中的任一种；
R6选自H、CHO、COCH3、COCH2CH3、COCH2CH2CH3、COOCH3、COOCH2CH3、Ph、CH2Ph、CONH2、CSNH2或
中的任一种；
R7、R8、R9分别选自H、F、Cl、Br、NO2、OH、CH3、OCH3或
中的任一种；所述
中的R10、R11、R12分别选自H、F、Cl、Br、NO2、OH、CH3、C2H5、OCH3、OC2H5、异丙基、异丁基、叔丁基、特戊基中的任一种。
本发明的有益效果：
本发明首次研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够抑制禽类冠状病毒IBV和DCV的复制；临床试验证明，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗由IBV和DCV等引起的禽类冠状病毒疾病，极大提高染病仔禽的存活率。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合具体实施例，对本发明进行更详细的说明。具体实施例中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，禽类冠状病毒疾病给鸡、鸭养殖业造成了严重的经济损失，但目前尚无针对禽类冠状病毒疾病的有效治疗药物。
针对2019年底爆发的新冠病毒肺炎疫情，发明人研发一种能够高效抑制新型冠状病毒(COVID-19)的溴酚-吡唑啉类化合物，其具有治疗冠状病毒肺炎的功效(具体见中国专利公开号CN111848516A)。后续的研究发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗猪冠状病毒PEDV和TGEV引起的猪流行性腹泻和猪传染性胃肠炎病毒(具体见中国专利公开号CN112472698A)。
冠状病毒分为4个冠状病毒属，分别是α，β，γ和δ冠状病毒属。虽然冠状病毒种类繁多，存在广泛，但通常对其天然宿主的受体亲和性最高，对于感染宿主有明显的种属特异性。猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)属于α冠状病毒属。人冠状病毒非典病毒SARS-COV、新型冠状病毒(SARS-COV2)和中东呼吸综合征病毒(MERS)属于β冠状病毒属。本发明的涉及的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭冠状病毒(DCV)属于γ冠状病毒属禽冠状病毒(Avian coronavirus)。哺乳动物冠状病毒的某些毒株之间具有血清学上的交叉反应性，但与禽类冠状病毒迥然不同。目前还未发现有人源性冠状病毒、猪冠状病毒与禽类冠状病毒夸物种感染的现象。
禽类冠状病毒IBV、DCV与猪冠状病毒、人冠状病毒属于冠状病毒的不同属，同源性较低，亲缘关系较远，病毒结构具有很大不同，相互之间不具有跨物种传染性。因此，禽类冠状病毒IBV、DCV与人冠状病毒、猪冠状病毒属于不同类型的病毒，能够抑制人新型冠状病毒、猪冠状病毒的物质是难以预知其对禽类冠状病毒的作用效果的。
为进一步拓展溴酚-吡唑啉类化合物的药用领域，本发明进行了大量的尝试，结果意外的发现，溴酚-吡唑啉类化合物能够抑制禽类冠状病毒IBV、DCV的复制；临床试验证明，溴酚-吡唑啉类化合物能够治疗由IBV、DCV等引起的鸡传染性支气管炎和鸭冠状病毒性肠炎，极大提高染病仔禽的存活率，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
其中：示例化合物1-8的结构式如下所示：
化合物1-8的合成方法参照发明人申请专利CN111848516A。
实施例1：溴酚-吡唑啉类化合物干扰鸡胚中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的复制
本实施例评估了溴酚-吡唑啉类化合物是否可以在临床分离株IBV感染的鸡胚中阻止IBV的复制。
具体操作：
取110枚鸡胚随机分为11组，即正常对照组、攻毒对照组、中药给药组、化合物1-8给药攻毒组，每组10只。正常对照组，灭菌生理盐水0.1mL/枚尿囊腔接种。攻毒对照组、中药给药组、化合物1-8给药组，先105EID50/0.1mL攻毒，后按照用灭菌生理盐水0.1mL/枚、灭菌生理盐水稀释的中药原药液0.1mL/枚、灭菌生理盐水稀释的化合物1-8的0.25mg/0.1mL/枚给药。其中中药原药液是由金银花、连翘、大青叶、板蓝根、杏仁、浙贝壳、黄芩等为主要成分制备。
攻毒后每天照蛋2次，连续观察8天。记录、观察各组鸡胚死亡数、死亡时间；并观察死亡鸡胚是否存在发育受阻、胚体萎缩(成小丸形)、羊膜增厚、卵黄囊缩小，尿囊液增多等特征性变化。观察期结束，统计各组死亡胚胎数、发育受阻鸡胚数，计算鸡胚发育正常保护率。
实验结果：
所有鸡胚经尿囊腔注射给药和接种病毒尿囊液后，除部分组在24h内死亡部分鸡胚外，其余胚均存活至8天观察期结束。各组胚体有效胚胎数、发育受阻情况、受阻胚数、及发育正常保护率观测统计，详见表1。正常对照组所有胚都存活，发育正常。攻毒对照攻毒组所有存活胚均出现不同程度的发育受阻、卷曲、胚体萎缩、羊膜增厚、卵黄囊缩小和表皮水肿等病变。中药给药组胚胎发育受阻数有所降低，保护率为44％。8个给药组的发育正常保护率均高于50％，发育受阻胚胎的病变程度也较轻。以上结果说明，溴酚-吡唑啉类化合物能够抑制IBV的复制，具有较强的抗毒作用，其中，其中化合物7抑制IBV复制活性最强。
表1、溴酚-吡唑啉对感染IBV鸡胚发育影响
实施例2：化合物7的治疗传染性支气管炎病毒(IBV)感染病鸡的攻毒试验
本实施例评估了化合物7是否可以在IBV攻毒实验中，治疗IBV感染的病鸡。
(1)攻毒剂量测定
取20日龄鸡15只，随机分为3组，分别经鼻眼滴入IBV 0.1、0.2、0.3ml。攻毒48h，0.1ml组发病2只，0.2ml组和0.3ml组全部发病，确定攻毒剂量为0.2ml/只。
(2)攻毒操作
150只20日龄鸡随机分为5组，每组30只。第1组为空白对照组：不攻毒，不用药；第2组为攻毒对照组：只攻毒，不用药；第3组为低剂量给药组，给药剂量1mg/只；第4组为中剂量给药组，给药剂量2mg/只；第5组为高剂量给药组，给药剂量4mg/只。
每只鸡经鼻滴入菌毒混合液0.2ml。试验鸡于攻毒48h开始给药，给药方式为灌服，每日2次，给药3天。连续观察10天，记录症状和死亡情况，剖检病死鸡只，试验结束计算治愈率、发病率和死亡率。
(3)试验结果
攻毒2天后，攻毒对照组开始发病，表现为精神不振、毛乱、呆立、粪便变稀、张口呼吸，并伴有啰音和打喷嚏、流眼泪等症状，4天后出现死亡。剖检病死鸡只，可见病鸡颜面肿胀，鼻腔有粘液性分泌物，眼结膜发炎水肿；气管有粘液性渗出物，气囊浑浊。实验用药组发病率明显低于攻毒对照组，试验结果见表2。
试验结果表明：高剂量组未见病鸡死亡，治愈率100％；中剂量组死亡1只，治愈率95％；低剂量组死亡2只，治愈率90％。3个给药组死亡率比对照组低30％以上，说明溴酚-吡唑啉化合物可用于治疗由IBV引起的呼吸道疾病。
表2、化合物7治疗IBV感染病鸡的攻毒试验
实施例3：化合物7治疗传染性支气管炎病毒(IBV)自然感染病鸡的临床试验
本实施例评估了化合物7是否可以在临床试验中，治疗IBV自然感染的病鸡。
(1)试验病鸡临床症状
病鸡精神不振、毛乱、呆立、粪便变稀，咳嗽、气喘、气管啰音，鼻流黏液、眼睛潮湿、采食减少。病理剖检可见鼻道、气管粘膜充血，支气管肿大，有浆液性渗出物，肾脏肿大、苍白。采集气管内黏液，处理后接种于鸡胚尿囊腔，培养2日后，收集尿囊液，经鸡传染性支气管炎抗体ELISA检测试剂盒检测证明为IBV感染。
(2)临床试验操作
选择30日龄内IBV感染病鸡，分为3组，分别为未治疗组、中药治疗组、化合物7治疗组组。中药治疗组采用蒲公英、紫花地丁、黄连、板蓝根等组成的复方煎汤灌服，2次/天，连用3天。化合物7给药剂量2.5mg/只，一日2次，给药方式为葡萄糖溶液冲服。未治疗组、中药治疗组，灌服与化合物7治疗组相同剂量葡萄糖溶液。治疗期间，正常饲料喂养。
(3)临床试验结果：
传染性支气管炎病鸡临床治疗结果见表3，可以看出：化合物7治疗传染性支气管炎病鸡效果显著，死亡率远低于其他2组。未治疗组，死亡16只，死亡率57.1％；中药治疗组死亡7只，死亡率43.8％；化合物7治疗组，死亡5只，死亡率3.7％。十日后，试验鸡精神、食欲均恢复正常，啰音消失，咳嗽音消失，体重上升，解剖无病变判为有效。化合物7治疗组有效率94.8％说明，化合物7能够有效治疗IBV自然感染的传染性支气管炎病鸡。
表3：传染性支气管炎病鸡临床治疗数据汇总
注1：试验观察10天，死亡率按试验终点病鸡死亡数目计算。
实施例4：化合物7的治疗鸭冠状病毒(DCV)感染病鸭的攻毒试验
本实施例评估了化合物7是否可以在DCV攻毒实验中，治疗DCV感染的病鸭。
(1)攻毒剂量测定
取20日龄鸭15只，随机分为3组，分别灌服DCV 0.5、1.0、1.5ml。攻毒48h，0.5ml组发病4只，1.0ml组和1.5ml组全部发病，确定攻毒剂量为1.0ml/只。
(2)攻毒操作
150只20日龄鸭随机分为5组，每组30只。第1组为空白对照组：不攻毒，不用药；第2组为攻毒对照组：只攻毒，不用药；第3组为低剂量给药组，给药剂量1mg/只；第4组为中剂量给药组，给药剂量2mg/只；第5组为高剂量给药组，给药剂量4mg/只。
每只灌服菌毒混合液1.0ml。试验鸭于攻毒24h开始给药，给药方式为灌服，每日2次，给药3天。连续观察10天，记录症状和死亡情况，剖检病死鸭，试验结束计算治愈率、发病率和死亡率。
(3)试验结果
攻毒1天后，攻毒对照组试验鸭开始发病，表现为精神萎顿，食欲减少，缩颈弓腰，畏寒怕冷；腹泻，黄绿色或白色水样稀粪，含有黏液。2天后出现死亡，死前嘴壳由淡黄色变为淡紫色，嘴壳上皮脱落。剖检病死鸭，可见病鸭十二指肠充血，呈红色，内有血性黏液；肠粘膜脱落，肠壁形成溃疡，直肠和泄殖腔充血水肿。实验用药组发病率明显低于攻毒对照组，试验结果见表4。
试验结果表明：高剂量组死亡1只，治愈率96.7％；中剂量组死亡3只，治愈率90％；低剂量组死亡5只，治愈率83.3％。3个给药组死亡率比对照组低70％以上，说明溴酚-吡唑啉化合物可用于治疗由DCV引起的鸭冠状病毒性腹泻。
表4、化合物7治疗DCV感染病鸭的攻毒试验
实施例5：化合物7的治疗鸭冠状病毒(DCV)感染病鸭的临床试验
本实施例评估了化合物7是否可以在临床试验中，治疗DCV自然感染的病鸭。
(1)试验病鸭临床症状
20日龄病鸭精神萎顿，食欲减少，活动减少，体温降低，缩颈弓腰，畏寒怕冷，眼有粘性分泌物；腹泻，黄绿色或白色水样稀粪，含有黏液；不断鸣叫，扎堆；鸭死前嘴壳由淡黄色变为淡紫色，嘴壳上皮脱落，出现破溃。解剖发现病鸭肠道病变明显，以十二指肠病变最为明显，肠系膜血管扩张、充血、出血，整个十二指肠外观呈红色、紫色或紫红色，内有血性黏液；肠粘膜脱落，肠壁形成溃疡，直肠和泄殖腔充血水肿。采集病鸭组织，匀浆后，取上清，经ELISA检测，证明为DCV感染。
(2)给药方式
选择20日龄内DCV感染病鸭90只，随机分为3组，分别为未治疗组、中药治疗组、化合物7治疗组组。中药治疗组采用蒲公英、紫花地丁、黄连、板蓝根等组成的复方煎汤灌服，2次/天，连用3天。化合物7给药剂量2.5mg/只，一日2次，给药方式为葡萄糖溶液冲服。未治疗组、中药治疗组，灌服与化合物7治疗组相同剂量葡萄糖溶液。治疗期间，正常饲料喂养。
(3)临床试验结果：
DCV感染病鸭临床治疗结果见表5，化合物7治疗鸭冠状病毒性肠炎病鸭效果显著，死亡率远低于其他2组，有效率100％。未治疗组，死亡26只，死亡率86.7％；中药治疗组死亡19只，死亡率63.3％；化合物7治疗组，死亡0只，死亡率0％。十日后，试验鸭精神、食欲恢复正常；粪便正常，无明显黏液有效；解剖肠系膜无明显充血，则判定为有效。化合物7治疗组，治疗3日，恢复7日后，所有试验病鸭进食、行动、排泄恢复正常，解剖病变组织较好恢复，有效率100％。以上结果说明，化合物7能够治疗DCV自然感染的鸭冠状病毒性肠炎。
表5：鸭冠状病毒性肠炎病鸭临床治疗数据汇总
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (2)
1.溴酚-吡唑啉类化合物在制备治疗禽类冠状病毒疾病的药物中的应用；所述溴酚-吡唑啉类化合物具有如下式I所示的结构通式：
其中：R1、R2、R3、R4、R5分别选自H、F、Br、OH、OCH3中的任一种；
R6选自H、CHO、COCH3、COCH2CH3、COCH2CH2CH3、COOCH3、COOCH2CH3、Ph、CH2Ph、CONH2、CSNH2或
中的任一种；
R7、R8、R9分别选自H、F、Cl、Br、NO2、OH、CH3、OCH3或
中的任一种；
所述
中的R10、R11、R12分别选自H、F、Cl、Br、NO2、OH、CH3、C2H5、OCH3、OC2H5、异丙基、异丁基、叔丁基、特戊基中的任一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述禽类冠状病毒疾病是由鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、鸭冠状病毒(DCV)引起的鸡传染性支气管炎和鸭冠状病毒性肠炎。
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