CN105769890A - 桔梗皂苷d在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了桔梗皂苷D在制备抗PRRSV及防治猪繁殖与呼吸综合征药物上的应用。从桔梗根中分离获得桔梗皂苷D，通过免疫荧光显微镜分析、RT‑PCR及Western blot等方法证实桔梗皂苷D在Marc‑145细胞上具有良好的抗PRRSV活性，有望成为防治猪繁殖与呼吸综合征的药物。本发明的优点在于：首次发现桔梗皂苷D具有抗PRRSV活性，对感染PRRSV猪只具有显著治疗效果。

Description

桔梗皂苷D在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途

技术领域

本发明属于兽医药物技术领域，更具体地，涉及一种从中药桔梗中提取的成分桔梗皂苷D在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的用途。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起猪的一种急性、接触性、高度传染性的疾病。其主要临床特征是引起怀孕母猪流产、早产、产死胎、弱胎及木乃伊胎等繁殖障碍，仔猪和育肥猪出现呼吸道症状。因临床上发病猪只耳朵呈蓝色，因此该病俗称“猪蓝耳病”。PRRS于1987年在北美首次爆发，1996年在中国大陆流行，2006年高致病性PRRS在我国江西首先爆发，迅速蔓延至全国，造成大量猪只死亡，给我国养猪业造成巨大的经济损失。PRRS已经成为影响养猪业最为严重的疾病之一，严重制约养猪业的可持续发展。

PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arterivirdae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)。目前，根据基因组序列和血清型特性分析，将PRRSV分为两种基因型，一种以LelystadVirus(LV)毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCCVR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。PRRSV是有囊膜包被的单股、正链、不分节段的RNA病毒，基因全长约15.4kb，含有10个开放阅读框(openreadingframe，ORF)，所编码的蛋白分为非结构蛋白和结构蛋白。ORF1编码病毒的非结构蛋白，ORF2-ORF7编码病毒的结构蛋白，其中ORF5编码的GP5蛋白和ORF7编码的N蛋白是最重要的蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中具有重要的作用。

目前对于PRRS的防治主要靠疫苗预防，尚无有效的药物治疗。PRRSV易变异，可以在猪体内持续感染，导致机体免疫抑制。PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用。这些因素使得PRRSV疫苗接种的预防效果不理想。因此，迫切需要寻找新的方法防治。

中医中药是我国特有的医学资源，数千年来为保障中华民族的繁衍和人民的健康发挥了重要作用。同时中药也被广泛用于养殖业防治多种畜禽疾病。目前已有多种中药被证明具有体外抗PRRSV作用，如板蓝根、鱼腥草、黄芪、山楂、甘草、青蒿、穿心莲及连翘等。但单味中药或中药复方的成分十分复杂，难以阐明其药效成分，因而无法阐明其作用机制并保障药物质量，从而导致其临床上应用疗效不确切、不稳定。因此，从中药中寻找发现具有确切抗PRRSV作用的单体化学物，并以此为基础开发新药，对防治PRRS具有重要意义。

桔梗(Platycodongrandiforus)是桔梗科桔梗属植物，多年生草本。中医认为，本品性味苦、辛、平，归肺经。有宣肺祛痰、排脓消痈之功，适用于咳嗽痰多，或咯痰不爽、胸膈满闷、咽痛嘶哑及肺痈胸痛、咳吐脓血、痰黄腥臭等。临床上常用于止咳化痰平喘，除治疗慢性支气管炎和哮喘外，桔梗还被广泛用于慢性咽喉炎、感冒、音哑声带息肉、鼻窦炎、肺梗塞、肺脓肿、肺心病、郁证等治疗。

已有大量的研究表明，桔梗抗炎、祛痰的有效组分是五环三萜皂苷，其中又以含量较高的桔梗皂苷D(PlatycodinD，PD)为代表。2010版《中国药典》桔梗项下的含量测定也是以桔梗皂苷D为质控对象。桔梗皂苷D是存在于桔梗根部的主要三萜皂苷类化合物。大量研究表明，桔梗皂苷D作为桔梗中发挥疗效的主要物质，在抗炎镇痛、抗肿瘤、保肝、调节免疫等方面均表现出良好的药理活性。Kim等2013在国际杂志《FoodChem.Toxicol.》51期364-369页中提出通过对胆管结扎引起胆汁淤积型肝损伤小鼠进行研究，发现除上述抗氧化作用外，桔梗皂苷D对NF-κB和iNOS表达的显著抑制作用，亦能降低其引起的肝细胞凋亡，从而起到保肝作用。SunH等2011年在国际杂志《Int.Immunopharmacol.》12卷2047-2056页上提出桔梗皂苷D通过促进ConA蛋白、脂多糖、脾细胞抗原分化，增强小鼠血清中IgG1、IgG2a、IgG2b的抗原活性，增强小鼠的免疫力。李伟等在《中药药理与临床》杂志2009第2期37-40页中提出桔梗皂苷具有抑制人肝癌细胞、人胃癌细胞和人乳腺癌细胞增殖的作用效应。

关于桔梗皂苷抗猪繁殖与呼吸症病毒的作用未见报道，也未见相关专利公开。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种源自中药桔梗的有效成分桔梗皂苷D的一种新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：桔梗皂苷D在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物的应用。

所述猪繁殖与呼吸综合征是指由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的一种猪传染性疾病。

所述桔梗皂苷D结构式如下所示，为白色结晶粉末，熔点为228～237℃，分子式C₅₇H₉₂O₂₈，分子量为1224.38，水溶性好。

桔梗皂苷D作为单一成分或与其它药学上可接受的成分构成组合物制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物。所述药学上可接受的成分是指一种或多种药物辅料，或与桔梗皂苷D没有拮抗作用的药物。

所述的药物剂型为喷雾剂、注射液、水溶性粉或颗粒剂。

本发明优点在于：

本发明提供了桔梗皂苷D的一种兽医学新用途。首次发现桔梗皂苷D可有效抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖，抑制病毒N蛋白的合成及病毒mRNA的表达；首次发现桔梗皂苷D可有效保护感染PRRSV的猪只。以上发现说明桔梗皂苷D具有抑制PRRSV活性，能够作为有效成分用于制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物。

桔梗皂苷D通过以下方法制备得到：

(1)桔梗干燥根2.0kg，粉碎过50目筛，用25L75％乙醇冷浸24h，于超声波器中提取30min，过滤，药材中再分两次加入75％的乙醇，每次10L，于超声波器中提取30min，合并3次提取液，减压浓缩挥干乙醇，残留物加水500mL分散溶解；(2)将桔梗提取物水溶液上大孔树脂D101柱色谱，先后以水、30％、40％乙醇梯度洗脱，收集40％乙醇组分，冷冻干燥后，得到黄白色粉末16.6g；(3)取黄白色粉末干法上样经硅胶湿柱色谱分离，以氯仿-甲醇(10∶1-10∶2-10∶3)系统梯度洗脱，以氯仿∶甲醇∶水(6∶4∶1)作为展开剂追踪分离成分，合并含桔梗皂苷D的组分，浓缩得到桔梗皂苷D粗提物56mg，进一步用制备HPLC获得纯度达98％的桔梗皂苷D32mg。

桔梗皂苷D的配制：12.24mg桔梗皂苷D溶于1mLDMSO中，再加入9mL灭菌蒸馏水，配制成1mM的母液。用细胞培养液按1∶66.7、1∶200的比例稀释，分别得到15μM和5μM的工作液，用于体外药理学试验。

本发明的桔梗皂苷D在浓度低至5μM时对Marc-145细胞中PRRSV的增殖仍具有显著抑制作用。

本发明的桔梗皂苷D在浓度为5μM及15μM时，使Marc-145细胞中PRRSV的mRNA的含量分别是病毒对照组的29％及12％(P＜0.001)，表明桔梗皂苷D能显著抑制PRRSV病毒繁殖。

本发明的桔梗皂苷D能显著抑制PRRSV的N蛋白的合成。

本发明的桔梗皂苷D具有良好的抗PRRSV活性，有效抑制浓度低于5μM。因此，本发明的桔梗皂苷D可用于抗PRRSV病毒，有望用于制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物。

本发明提供的桔梗皂苷D可作为有效成分配以辅助剂制成喷雾剂、注射液、水溶性粉或颗粒剂，可望用于临床上防治猪繁殖与呼吸综合征。

附图说明

图1表示免疫荧光显微镜观察到的5μM及15μM桔梗皂苷D对PRRSV在Marc-145细胞上增殖的抑制效果。

图2表示5μM及15μM桔梗皂苷D在mRNA水平对PRRSV增殖的抑制作用。

图3表示5μM及15μM桔梗皂苷D对PRRSV的N蛋白合成的抑制效果。

具体实施方式

下面结合实施例与附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：本发明药物对感染PRRSV的Marc-145细胞的保护效果

收集对数生长期的Marc-145细胞，在96孔板中每孔加入0.1mL(约3×10⁴个细胞/孔)，待细胞单层长至汇合度80％后弃去培养基，用PBS液清洗两遍，，然后加入0.2MOI(病毒感染复数)的PRRSV病毒量，100μL/孔，37℃孵育2h，弃去病毒上清，PBS清洗两遍，分别加入5μM及15μM的桔梗皂苷D，100μL/孔。实验同时设正常对照组(不加受试药物，不加PRRSV)与病毒对照组(不加受试药物)，每个受试浓度设三个平行。细胞继续培养至48h，终止培养。弃去上清液，PBS洗3遍，每孔加入质量浓度为4％的低聚甲醛500μl固定10min；PBS清洗3次，加入质量浓度为0.25％TritonX-100透膜化，室温下15min；加入质量浓度为5％BSA封闭杂蛋白，室温封闭2h；PBS清洗3次，加入鼠源PRRSV的N蛋白单抗(1∶400稀释)，4℃孵育过夜；PBS清洗3次，避光加入二抗(Alexa488标记抗小鼠IgG，1∶1000)，37℃避光孵育1h，PBS洗净；荧光显微镜下观察，绿色荧光代表PRRSV的N蛋白。试验结果如图1所示，本发明的药物桔梗皂苷D在5μM及15μM的浓度对PRRSV在MARC-145细胞内增殖具有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

实施2：本发明药物在mRNA水平对PRRSV在Marc-145细胞上增殖的抑制作用

收集对数生长期的Marc-145细胞，在六孔板中每孔加入2.0mL(1×106个细胞/孔)，待细胞单层长至汇合度80％后弃去培养基，PBS清洗两遍，然后加入0.2MOI的PRRSV病毒量，700μL/孔，37℃孵育2h，弃去病毒上清，PBS清洗两遍，分别加入5μM及15μM的桔梗皂苷D，2mL/孔，分别记为PD5μM组和PD15μM组。实验同时设正常对照组(不加受试药物，不加PRRSV)与病毒对照组(不加受试药物)，每个受试浓度设三个平行。细胞继续37℃培养，至感染后48h终止培养。观察其病变状况后，于-80℃和4℃反复冻融细胞板三次，使细胞充分裂解，致使细胞内的病毒全部释放进入细胞上清，然后收集各孔上清液。用总RNA极速抽提试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)推荐的操作方法，将收集到的细胞上清液进行总RNA抽提。提取RNA后立即进行反转录，以cDNA为模板，GAPDH为内参基因，RealTimePCR检测PRRSV的NSP9基因的拷贝数；以正常对照组做参照，评价NSP9mRNA的变化情况。

PRRSVNSP9基因上下游引物序列：

NSP9-F：5’-CTAAGAGAGGTGGCCTGTCG-3’

NSP9-R：5’-GAGACTCGGCATACAGCACA-3’

GAPDH基因上下游引物序列：

GAPDH-F：5’-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3’

GAPDH-R：5’-TGCTGTAGCCAAATTCGTTG-3’

试验结果如图2所示，表明本发明的药物桔梗皂苷D在5-15μM的浓度范围内，对MARC-145细胞内猪繁殖与呼吸综合征病毒的RNA增殖有极显著的抑制作用(P＜0.001)，且呈现良好的量效关系。

实施例3：本发明药物抑制PRRSV的N蛋白合成

实验分组、细胞接种、病毒感染及加药同实施例2，细胞37℃培养至感染后48h终止培养，进行样品蛋白提取及N蛋白的Westernblot分析。

样品蛋白提取：

细胞培养至48h后弃去培养基，用预冷的PBS清洗两次，弃去PBS溶液，根据细胞数加入适量的细胞裂解液，冰浴5-10min，裂解过程中不断用枪头轻轻吹打裂解液，裂解结束后，将液体转移至新的EP管中，4℃离心(14000rpm，5min)；吸取上清液转入预冷的离心管中，即为提取的细胞总蛋白。提取的细胞总蛋白分装保存于-80℃直至用于Westernblot分析。

样品蛋白浓度定量：

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白浓度。

N蛋白免疫印迹分析包括以下几个步骤：

(1)SDS-PAGE电泳：根据样品的蛋白含量测定结果确定每个试样的上样体积，样品的上样量约20μg的总蛋白。样品与蛋白Marker依次加入上样孔，随后在积层胶以恒压80V开始电泳15min，进入分离胶后将电压提高到120V，继续电泳直至溴酚兰到达分离胶底部，共约90min。

(2)蛋白质转移：采用湿法转膜转移蛋白。将预先裁剪好的PVDF膜浸泡到甲醇中活化1-2min，从电泳槽中取下凝胶，切胶后用去离子水漂洗；在转膜器中，从下到上依次

按厚滤纸、PVDF膜、凝胶、厚滤纸的顺序叠放置并对齐，形成“三明治”结构，并在上层厚滤纸上赶压，避免气泡残留；将转膜仪组装好后连接电源，转膜器置于冰浴中，150mA恒流60min。

(3)免疫印迹：将转完蛋白的PVDF膜取出并用TBST缓冲液漂洗5min，三次；然后置于摇床用5％BSA的封闭液室温封闭1h或4℃过夜；TBST漂洗5min，三次；加入适当稀释的一抗(N蛋白的一抗为1∶400稀释，内参GAPDH的一抗为1∶1000稀释)，置于摇床，4℃过夜；弃去一抗，TBST漂洗5min，三次；加入1∶2000稀释的二抗，37℃孵育1h；TBST洗膜5min，三次；将化学荧光发光底物与PVDF膜共孵育1min，于暗室中进行曝光、显影、定影。

试验结果如图3所示，本发明的药物桔梗皂苷D在5μM及15μM的浓度对MARC-145细胞内PRRSVN蛋白合成均具有显著的抑制作用，且呈现良好的量效关系。

实施例4：本发明药物对感染PRRSV猪只的保护效果

桔梗皂苷D注射液的配制：5g桔梗皂苷D溶解于30mLDMSO中，加入70mL灭菌过的0.9％的NaCl水溶液，加0.5mL的Tween80，溶液混匀后分装至5mL及10mL的安瓿瓶中，熔封，100℃中煮沸30min灭菌。该注射液桔梗皂苷D含量为50mg/mL，置于4℃冰箱备用。

猪接种PRRSV致病：采集确诊为高致病性猪蓝耳病的病猪肺门淋巴结剪碎，用组织匀浆器研磨，然后用灭菌生理盐水配成1∶5乳悬液，4℃下3000r/min离心15min，取上清液加入青霉素(100IU/mL)和链霉素(100μg/mL)溶液，置4℃冰箱中作用4h。从PRRS抗体阴性试验场临床健康杜长大三元杂猪群中随机选取大小(20-30kg)和体况基本一致的生猪85头，取制做好的PRRSV病料经人工猪鼻腔接种，每头猪接种2mL组织病毒，使猪只发病，观察猪只发病情况。

试验分组：病毒接种后第2天开始测量猪体温，每8h测定一次并记录。同时观测猪只的精神状况、采食量等。至接种后第5天，选取平均体温39.5℃以上、精神沉郁昏睡、食欲不振的猪只共60头，随机分为3组，每组20头。三组的处理分别为每次注射5mg/kg(体重)的桔梗皂苷D、15mg/kg(体重)的桔梗皂苷D、及2mL/头的生理盐水。肌肉注射，每天2次，连续给药5天。

药效判定：(1)有效：病猪体温、体色、精神、食欲逐步恢复正常，病猪逐渐痊愈，观察期内又复发的；(2)治愈：病猪体温、体色、精神、食欲恢复正常，且不复发的；(3)无效：经用药后，病猪症状并未缓解，甚至加重死亡。自投药之日起连续观察21d，每天上午、下午各观察1次，及时做好观察记录。

治疗试验结果：桔梗皂苷D注射液对高致病性猪蓝耳病的治疗试验结果见表1。可以看出，5mg/kg和15mg/kg桔梗皂苷D注射液试验组病猪的死亡率极显著低于生理盐水组(P＜0.01)，15mg/kg桔梗皂苷D注射液试验组的有效率优于5mg/kg试验组(P＜0.05)，说明桔梗皂苷D对高致病性猪蓝耳病具有良好的治疗效果，且疗效具有剂量依赖性。本发明的药物桔梗皂苷D用于制备防治猪蓝耳病的药物疗效确切。

表1桔梗皂苷D注射液对感染PRRSV猪只的治疗试验结果

Claims (1)

1.本发明提出应用桔梗皂苷D制备防治猪繁殖与呼吸综合征的药物，所述的药物是以桔梗皂苷D作为有效成分配以辅助剂制成喷雾剂、注射剂、水溶性粉或颗粒剂。