CN108872570A - 基于Fiber1蛋白的检测血清4型禽腺病毒的双单抗夹心ELISA试剂盒 - Google Patents

基于Fiber1蛋白的检测血清4型禽腺病毒的双单抗夹心ELISA试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于Fiber1蛋白的FAdV‑4病毒检测用杂交瘤细胞株、抗体及试剂盒，属于生物技术检测技术领域。本发明提供的基于Fiber1蛋白的FAdV‑4病毒检测用杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株FAdV‑4‑F1‑3B5和杂交瘤细胞株FAdV‑4‑F1‑6H9。本发明所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够实现FAdV‑4病毒的双抗夹心高效检测，特异性强且灵敏度高，适用于临床样本中微量抗原的检测。

Description

基于Fiber1蛋白的检测血清4型禽腺病毒的双单抗夹心ELISA 试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术检测技术领域，具体涉及基于Fiber1蛋白的FAdV-4 病毒检测用杂交瘤细胞株、抗体及试剂盒。
背景技术
根据基因组特征及血清交叉试验，禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV) 可分为5个种(A，B，C，D，E)和12个血清型(1-7，8a，8b，9-11)。流行病学调查发现，FAdV对不同的家禽均易感，其急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液综合症、肌胃糜烂等。值得注意的是，近年来由血清4型禽腺病毒(FAdV-4)引起的包涵体型肝炎-心包积液综合症在国内鸡群流行、爆发，给养鸡业造成了严重的经济损失。然而目前尚没有针对FAdV-4的有效疫苗以及基于纤突蛋白1的快速检测血清4型禽腺病毒特异性商品化的抗原及抗体检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供基于Fiber1蛋白的FAdV-4病毒检测用杂交瘤细胞株、抗体及试剂盒。本发明所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够实现 FAdV-4病毒的双抗夹心高效检测，特异性强且灵敏度高，适用于临床样本中微量抗原的检测。
本发明提供了一组基于Fiber1蛋白的FAdV-4病毒检测用杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5和杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9。
本发明还提供的一组检测FAdV-4病毒的单克隆抗体，包括捕获抗体和检测抗体；所述捕获抗体由杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5分泌获得；所述检测抗体由杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9分泌获得。
本发明还提供了基于上述技术方案所述单克隆抗体的检测FAdV-4病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：包被有捕获抗体的酶标板、酶标记的检测抗体、碳酸盐包被稀释液、PBST缓冲液、脱脂乳、阳性对照、阴性对照、TMB显色液和终止液。
优选的是，所述捕获抗体的包被浓度为0.21μg/mL。
优选的是，所述酶标记用酶包括辣根过氧化物酶。
优选的是，所述酶标记的上述技术方案所述检测抗体的工作浓度为 3.75μg/mL。
优选的是，所述PBST缓冲液中吐温的体积分数为0.05％。
优选的是，所述脱脂乳为含质量分数为5％脱脂奶粉的PBST缓冲液。
优选的是，所述阳性对照包括浓度为1.58×106TCID50/mL的血清4型禽腺病毒。
优选的是，所述阴性对照包括浓度为1.58×106TCID50/mL的血清8型禽腺病毒。
本发明提供了基于Fiber1蛋白的FAdV-4病毒检测用杂交瘤细胞株。本发明所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够实现FAdV-4病毒的双抗夹心高效检测，特异性强且灵敏度高，适用于临床样本中微量抗原的检测。由本发明杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体制备得到的试剂盒特异性好、操作简便、重复性好以及高通量，适用于基层临床推广应用。本发明的杂交瘤细胞株为FAdV-4流行病学研究及疫病防控、净化提供实用、快速、有效的检测工具奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的纯化后FAdV-4-F1-6H9和FAdV-4-F1-3B5 单抗的SDS-PAGE鉴定结果图；
图2为本发明实施例2提供的鸡肝组织PCR鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了一组基于Fiber1蛋白的FAdV-4病毒检测用杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5和杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9，所述杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5和杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9保藏于扬州大学禽类预防医学教育部重点实验室。本发明所述杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5 和杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9均是由Fiber1蛋白作为免疫原免疫小鼠获得的。本发明对所述获得方法没有特殊的限定。
本发明还提供的一组检测FAdV-4病毒的单克隆抗体，包括捕获抗体和检测抗体；所述捕获抗体由杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5分泌获得；所述检测抗体由杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9分泌获得。本发明所述捕获抗体和所述检测抗体针对的是FAdV-4纤突蛋白1(Fiber1蛋白)不同的抗原决定簇。
本发明还提供了基于上述技术方案所述单克隆抗体的检测FAdV-4病毒的试剂盒，所述试剂盒包括：包被有捕获抗体的酶标板、酶标记的检测抗体、碳酸盐包被稀释液、PBST缓冲液、脱脂乳、阳性对照、阴性对照、TMB显色液和终止液。在本发明中，所述包被的方法优选包括以下步骤：将捕获抗体按100μL/孔加入到酶标板中，4℃放置过夜，用PBST洗涤后，得到包被有捕获抗体的酶标板。本发明试剂盒中酶标记的检测抗体的浓度高于使用时的包被浓度，在本发明中，所述捕获抗体的包被浓度优选为0.21μg/mL。在本发明中，所述酶包括辣根过氧化物酶。本发明试剂盒中酶标记的检测抗体的浓度高于工作浓度，在本发明中，所述酶标记的检测抗体的工作浓度优选为3.75μg/mL。在本发明中，所述酶标记的上述技术方案所述检测抗体(简称酶标抗体)优选使用酶标试剂盒进行标记(厂家：Thermo，批号：31489)：具体方法为(1)将1mg冻干的辣根过氧化物酶溶于100μL PBS中；(2)加入1mg纯化后的检测抗体，混匀；(3)在通风橱中加入10μL硼氢化氰钠，混匀，室温静置1h；(4)加入20μL淬灭液终止连接，室温静置15min即得此酶标抗体。4℃保存。在本发明中，所述碳酸盐包被稀释液优选包括NaHCO3 0.258g，Na2CO3 0.159g和100mL水，所述水优选为超纯水。在本发明中，所述PBST缓冲液中吐温的体积分数为0.05％，所述PBST缓冲液的制备优选为取NaCL 8g、KCL0.2g、Na2HPO4·12H2O 3.63g、KH2PO4 0.24g溶于 500mL水后再加入250μL的吐温。在本发明中，所述脱脂乳为含质量分数为5％脱脂奶粉的PBST缓冲液。在本发明中，所述阳性对照包括浓度为 1.58×106TCID50/mL的血清4型禽腺病毒。在本发明中，所述阴性对照包括浓度为1.58×106TCID50/mL的血清8型禽腺病毒。本发明对所述TMB显色液没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售商品化试剂即可。在本发明中，所述终止液优选为2M的H2SO4溶液。
本发明所述试剂盒的使用方法优选为将捕获抗体按100μL/孔加入到酶标板中，4℃放置过夜，用PBST洗涤后，用5％脱脂乳封闭，360μL/孔，于 37℃放置2h，再用PBST洗涤后，加入待检测抗原样品进行37℃孵育，用 PBST洗涤后，加入检测抗体进行37℃孵育，最后进行显色读值。
下面结合具体实施例对本发明所述的基于Fiber1蛋白的FAdV-4病毒检测用杂交瘤细胞株、抗体及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
取体格健康的Balb/c小鼠，取纯化的Fiber1蛋白与等量的弗氏完全佐剂乳化，进行免疫，三免过后。在准备做融合72h以内进行加强免疫，准备进行细胞融合。做融合前，先准备好8瓶正处于生长对数期的骨髓瘤细胞，使用不含双抗、血清的DMEM吹下备用。
取加强免疫的小鼠，小鼠脱颈椎致死后将其放入75％酒精浸泡10min，在无菌条件下，解剖小鼠，找到脾脏，小心将脾脏剪下，放入提前准备的含有双抗的DMEM里，去除脾脏周围的结缔组织，将其放入另一个盛有DMEM 的平皿中，用弯头针压住脾脏，用针头戳破脾脏，完全释放脾细胞，至脾细胞变白为止。提前领一只ICR小鼠，小鼠脱颈椎致死后放入75％酒精浸泡 10min，在无菌条件下，暴露腹膜，用酒精棉球将腹膜按摩消毒，用注射器注射5mLHAT培养基到腹腔内，用棉球轻轻按摩腹部，用针头抽回腹腔内的液体，打到离心管里。将吹好的骨髓瘤细胞与取到的脾淋巴细胞混合于 50ml融合管里，1000rpm 10min，倒掉上清。将融合管放于手心中，轻轻拍打底部，使两种细胞充分混匀，将预热的PEG在60s内匀速滴加入融合管里，一边加，一遍摇匀并拍打融合管。加完后，立即滴加预热的DMEM，终止融合。放入37℃里静置10min后，1000rpm离心10min，弃掉上清，加入 5mLHAT培养基，轻轻吹打，悬浮沉淀细胞，加入适量的饲养细胞，混匀。分装于96孔板，放入37℃，5％CO2培养箱培养。5天后观察细胞，半换液 HAT培养基。融合后10天左右，在大多数细胞液变黄或者克隆分布孔底面积1/3时，可以进行抗体检测。当大多数细胞液变黄或者克隆分布孔底面积 1/3时，通过间接免疫荧光方法，用感染FAdV-4的LMH细胞作为抗原检测、筛选分泌抗Fiber1蛋白抗体的阳性细胞孔。通过筛选，获得了两株抗FAdV-4 Fiber1的单克隆抗体，将其命名为FAdV-4-F1-6H9，FAdV-4-F1-3B5，保藏于扬州大学禽类预防医学教育部重点实验室。
实施例2
(1)单克隆抗体的制备及特性鉴定
包被在酶标板的捕获抗体(抗FAdV-4纤突蛋白1单克隆抗体)为杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5分泌获得，检测抗体为杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9 分泌获得。制备FAdV-4-F1-3B5和FAdV-4-F1-6H9的单克隆抗体腹水。利用 GE公司的Protein G预装柱进行单克隆抗体IgG纯化。纯化后利用SDS-PAGE 鉴定，结果显示获得了正确的且纯度高的单克隆抗体，纯化后FAdV-4-F1-6H9 和FAdV-4-F1-3B5单抗的SDS-PAGE鉴定如图1所示，其中，泳道M：预染蛋白Marker；泳道1：纯化后的FAdV-4-F1-3B5；泳道2：纯化后的FAdV-4-F1-6H9；泳道3：未纯化的FAdV-4-F1-6H9腹水；泳道4：未纯化的FAdV-4-F1-3B5腹水。由图1可知，获得了正确的且纯度高的单克隆抗体FAdV-4-F1-6H9和 FAdV-4-F1-3B5。
(2)酶标单克隆抗体的制备
使用加强型活化过氧化物酶标记试剂盒说明书进行杂交瘤细胞 FAdV-4-F1-6H9分泌的单克隆抗体进行HRP酶标记。FAdV-4-F1-6H9这株单克隆抗体经过酶标记后，记为6H9-HRP。
(3)捕捉抗体包被浓度及酶标抗体工作浓度的确定
采用方阵滴定法来测定捕捉抗体及检测抗体最佳工作浓度，最终确定捕捉抗体包被浓度为0.21μg/mL，每孔100ul；酶标抗体的工作浓度为3.75μg/mL，每孔100ul。
(4)双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的构建和临床样品检测结果
1.包被酶标板：将杂交瘤细胞FAdV-4-F1-3B5分泌的单克隆抗体的IgG 提取并纯化后，得到捕获抗体，所述捕获抗体稀释为0.21μg/mL，100μL/孔对酶标板进行包被，4℃放置过夜；
2.封闭：取出包被酶标板，用PBST洗涤1次；用5％脱脂乳封闭，360μL/ 孔，37℃放置2h，再用PBST洗涤；
3.加样：取样品加入上述封闭好的酶标板，100μL/孔，其中，阴阳性对照分别以1：50的体积比进行稀释，37℃反应60min，用PBST洗涤5次；
不同检测样品的前处理：
鸡肝：取1g鸡肝组织，加入1ml PBS进行研磨，4℃12000rpm离心5min，取上清，用PBST进行1：10稀释；
分离病毒的鸡肝细胞上清：不用处理，直接取样；
4.加酶标单抗：将酶标抗体用PBST稀释至3.75μg/mL，100μL/孔，37℃反应1h，PBST洗涤5次；
5.显色：加入TMB显色液，100μL/孔，37℃反应15min；
6.终止：显色后，每孔加入50μL 2mo1/mL H2SO4终止；
7.读板：酶标仪上测定各孔OD450nm，进行结果判定。OD450nm大于0.1168 判为阳性，小于0.1168判为阴性。
(5)双单抗夹心ELISA特异性反应
分别在相同条件下，对禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽流感病毒(AIV)、禽白血病毒(ALV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、马立克氏病病毒 (MDV)、鸡贫血病毒(CAV)以及血清8型禽腺病毒(FAdV-8)、血清4型禽腺病毒(FAdV-4)进行检测。结果表明，该ELISA只与FAdV-4病毒反应，而与所检测的其它病毒均没有反应。结果如表1所示，说明该方法具有很好的特异性。
表1双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的特异性
(6)双单体夹心ELISA抗原检测试剂盒敏感度检测
将FAdV-4病毒以及GST-FAdV-4-F1原核表达蛋白进行倍比稀释，对本发明ELISA抗原检测试剂盒的灵敏度进行检测。检测结果如表2所示，由表2可知，该ELISA试剂盒可检测的最低量FAdV-4病毒量约为104个TCID50/ml，可检测的最低量GST-FAdV-4-F1原核表达蛋白约0.625μg/mL。
表2双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的敏感性检测
(7)双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒临床样品检测结果
对临床上采集的36份自然感染FAdV-4病毒死亡鸡的鸡肝组织研磨液、 2份人工感染FAdV-4的鸡的鸡肝组织研磨液及3份SPF鸡肝组织研磨液进行了ELISA检测。并同时进行PCR验证。图2为鸡肝组织PCR鉴定结果图，其中，图2A 1-17号鸡肝组织样品PCR；图2B M:Marker；SD:FAdV-4基因组；37：阴性对照；18-32号鸡肝组织样品PCR；图2C 33-36号鸡肝组织样品PCR。双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒临床样品检测结果如表3所示， 1-36：临床感染FAdV-4的死亡鸡的鸡肝组织研磨液；37-38：已确定的阳性鸡肝组织研磨液：39-41：已确定的阴性鸡肝组织研磨液。可见，本发明构建的基于Fiber1蛋白检测FAdV-4病毒的ELISA能有效的检测出自然感染 FAdV-4病毒死亡鸡的鸡肝组织中的FAdV-4病毒。而且ELISA检测结果与 PCR检测结果阳性率均为100％。这一结果表明，本发明构建的基于Fiber1 蛋白检测FAdV-4病毒的ELISA方法具有良好的应用前景。
表3双单抗夹心ELISA抗原检测试剂盒临床样品检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一组基于Fiber1蛋白的FAdV-4病毒检测用杂交瘤细胞株，其特征在于，包括杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5和杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9。
2.一组检测FAdV-4病毒的单克隆抗体，其特征在于，包括捕获抗体和检测抗体；所述捕获抗体由杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-3B5分泌获得；所述检测抗体由杂交瘤细胞株FAdV-4-F1-6H9分泌获得。
3.基于权利要求2所述单克隆抗体的检测FAdV-4病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有捕获抗体的酶标板、酶标记的检测抗体、碳酸盐包被稀释液、PBST缓冲液、脱脂乳、阳性对照、阴性对照、TMB显色液和终止液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的包被浓度为0.21μg/mL。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记用酶包括辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求3或5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记的检测抗体的工作浓度为3.75μg/mL。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PBST缓冲液中吐温的体积分数为0.05％。
8.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述脱脂乳为含质量分数为5％脱脂奶粉的PBST缓冲液。
9.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括浓度为1.58×106TCID50/mL的血清4型禽腺病毒。
10.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照包括浓度为1.58×106TCID50/mL的血清8型禽腺病毒。
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