CN103665164A - 一种检测Tim-3的ELISA试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法。本发明还公开了所述ELISA试剂盒中抗人Tim-3中和性单克隆抗体L3C的序列及制备过程，本发明还公开了检测人Tim-3蛋白的ELISA试剂盒的特异性和灵敏度。本发明公开的检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒能够准确检测出样品中Tim-3的含量，其灵敏度达到1ng/ml。
Description
技术领域
本发明涉及一种ELISA试剂盒，具体而言涉及检测人Tim-3的ELISA试剂盒，还涉及该ELISA试剂盒中Tim-3单克隆抗体的制备和试剂盒的使用方法。
背景技术
Tim-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulindomain and Mucin domain protein，Tim)家族成员。由于Tim家族广泛参与了机体的免疫调节过程，其功能正日益受到人们的重视。Tim-3特异性表达于活化的Th1、Th17效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9(Galectin-9，Gal-9)为Tim-3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，Gal-9与Th1、Th17细胞上的Tim-3分子特异性结合，可引发后者的调亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。除了膜结合形式的Tim-3分子，可溶性的Tim-3分子是否，以及如何影响免疫调节过程是目前尚不清楚的内容。目前，研究证实Tim-3分子主要通过调节不同CD4+ T细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过程[Anderson DE.TIM-3 as a therapeutic target inhuman inflammatory diseases.Expert OpinTher Targets.2007；11(8)：1005-9.Anderson AC，Anderson DE.TIM-3 in autoimmunity.CurrOpinImmunol.2006；18(6)：665-9.Degauque N，Mariat C，Kenny J，et al.Regulation of T-cellimmunity by T-cell immunoglobulin and mucin domain proteins.Transplantation2007；84：S12-16.Zhu C，Anderson AC，Schubart A，et al.The Tim-3 ligand galectin-9negatively regulates T helper type 1 immunity.Nat Immunol 2005；6：1245-1252.]。
目前的研究证实Tim-3表达的异常与许多疾病有密切的关系，如研究发现HIV，HCV感染的患者以及一些肿瘤患者，其T细胞上Tim-3表达升高，由于Tim-3能介导T效应细胞的调亡，传递负性调节信号，可导致机体的免疫功能瘫痪。任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均可以使Th1、Th17细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能[Kassu A，Marcus RA，D′Souza MB，et al.Regulation ofVirus-Specific CD4+ T Cell Function by Multiple Costimulatory Receptors duringChronic HIV Infection.Immunol.2010；185(5)：3007-18.Huang X，et al.Lymphomaendothelium preferentially expresses Tim-3 and facilitates the progression oflymphoma by mediating immune evasion.Exp Med.2010；207(3)：505.N.Castelblanco，V.Kuchroo，D.R.Gretch，and H.R.Rosen.2009.Negative immuneregulator Tim-3 is overexpressed on T cells in hepatitis C virus infection and itsblockade rescues dysfunctional CD4+ and CD8+T cells.Virol.83：9122-9130.]。
一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表达的升高，导致Th1细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3/Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。如给哮喘模型动物注射抗Tim-3抗体或重组Tim-3融合蛋白均能通过阻断Tim-3/Gal-9结合，增强Th1细胞活性，纠正由Th2细胞介导的哮喘症状，恢复体内Th1/Th2细胞平衡[Hu WK，Lu XX，Yang S et al.Expression of theTh1-specific cell-surface protein Tim-3 increases in a murine model of atopicasthma.Asthma.2009；46(9)：872.Pan HF，Zhang N，Li WX，Tao JH，Ye DQ.TIM-3as a new therapeutic target in systemic lupus erythematosus.Mol Biol Rep.2010；37(1)：395-8.Wang Y，Meng J，Wang X，Expression of human TIM-1 and TIM-3on lymphocytes from systemic lupus erythematosus patients.Scand Immunol.2008；67(1)：63-70.Kearley J，McMillan SJ，Lloyd CM.Th2-driven，allergen-inducedairway inflammation is reduced after treatment with anti-Tim-3 antibody in vivo.ExpMed 2007；204：1289；Fukushima A，Sumi T，Fukuda K，Kumagai N，et al.Antibodiesto T-cell Ig and mucin domain-containing proteins(Tim)-1 and -3 suppress theinduction and progression of murine allergic conjunctivitis.Biochem Biophys ResCommun.2007；353(1)：211.]。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Th1效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用[Sanchez-Fueyo A，Tian J，Picarella D，et al.Tim-3 inhibits T helpertype 1-mediated auto- and alloimmune responses and promotes immunologicaltolerance.Nat Immunol 2003；4：1093-1101.Li X，et al.Clinical Immunol.2010，134：169-177.]。
上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，其表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。尽管研究表明Tim-3的中和抗体也在一些疾病模型中发挥了很好的干预作用，但目前国内外尚没有上市的Tim-3抗体，因此建立和发展具有自主知识产权的以抗体为基础的检测和诊治用品，对于多种相关性疾病的干预具有重要的现实意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种检测Tim-3蛋白的ELISA试剂盒及其使用方法，所述试剂盒能够准确检测出样品中的Tim-3蛋白含量。本发明还公开了试剂盒中抗Tim-3抗体的序列及其制备方法。
本发明公开了一种抗人Tim-3的单克隆抗体L3C，所述单克隆抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
本发明所述的单克隆抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。所述单克隆抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示。
本发明还公开了上述单克隆抗体L3C的制备方法，主要包括如下：
1.抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建
首先，原核表达人Tim-3蛋白，免疫Balb/c小鼠，用常规方法进行细胞融合。用间接ELISA法筛选阳性细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。对杂交瘤细胞L3C进行了染色体核型分析，杂交瘤细胞L3C染色体平均数目为106条，用双相琼脂扩散实验证明L3C杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a。
2.杂交瘤细胞L3C轻、重链基因的钓取
提取中和性单克隆抗体L3C细胞的RNA，经RT-PCR，用特异性引物钓取抗体的轻重链基因。常规法连接入载体，转化感受态细菌，培养后挑取单个菌落，提取质粒PCR鉴定后进行DNA测序分析。
通过上述步骤，构建了含有人Tim-3中和抗体L3C轻、重链基因的载体，经序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
3.单克隆抗体L3C轻、重链可变区基因序列和氨基酸序列的确定
用www.expasy.org在线软件将编码人Tim-3中和性单克隆抗体L3C的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，单克隆抗体L3C的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
本发明应用一套设计的引物成功地从培养的人Tim-3中和性单克隆抗体L3C杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因。所得轻链和重链可变区基因可编码正确的小鼠抗体可变区。本发明的单克隆抗体基于上述已克隆到的人Tim-3中和性单克隆抗体L3C轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、Fab抗体、抗体融合蛋白等；基于上述基因所编码的多肽或蛋白质，可以交联上多种生物活性分子，制备用于Tim-3表达水平检测、诊断和治疗Tim-3高表达所导致疾病的诊断或治疗药物。
本发明基于L3C抗体构建了用于检测Tim-3的ELISA试剂盒，所述的ELISA试剂盒包括：rhGal-9蛋白、抗Tim-3抗体L3C、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品人Tim-3(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA。
本发明还公开了检测Tim-3的ELISA试剂盒的使用方法：
1)包被重组人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
2)按合适的稀释度(1∶2～1∶10)稀释正常人或患者的血浆，加入到包被有rhGal-9的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
3)加入抗人Tim-3的抗体L3C，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
4)最后加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，37度孵育0.5小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
5)最后加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值。
通过分析OD450值的大小，判断人血清中Tim-3浓度。
本发明还对单克隆抗体L3C的灵敏性进行了检测，结果显示本发明的试剂盒能够灵敏的检测样品中Tim-3的含量，其灵敏度能够达到1ng/ml。
附图说明
图1 抗Tim-3抗体L3C的蛋白电泳图。
图2 L3C抗体特异性检测结果，用L3C抗体检测不同浓度的Tim-3-Trx和Trx，L3C抗体特异性的结合Tim-3-Trx中的Tim-3。
图3 L3C抗体灵敏性检测结果，用L3C抗体和mIgG检测不同浓度的Tim-3-Trx，L3C抗体对Tim-3的检测灵敏度达到1ng/ml。
图4 检测Tim-3的ELISA试剂盒的设计原理，以Tim-3的配体rhGal-9为包被蛋白，以抗人Tim-3抗体为检测抗体，检测样品中Tim-3的含量。
图5 rhGal-9蛋白的SDS电泳图。
图6 rhGal-9蛋白与Tim-3的结合活性检测，rhGal-9能特异性的与重组人Tim-3(rh Tim-3)结合。
图7 rhGal-9蛋白诱导淋巴细胞凋亡的活性检测，rhGal-9蛋白能特异性结合THP1细胞的Tim-3，诱导THP1细胞凋亡。
图8 检测Tim-3的ELISA试剂盒的临床样品检测，脓毒血症患者血清(sepsis1sepsis2)中Tim-3的含量明显少于正常人血清(Health control)中Tim-3的含量。
具体实施方式
通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
实施例一 抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞株的构建
1.材料
福氏完全佐剂及福氏不完全佐剂，显色试剂TMB：Sigma公司产品；20％胎牛血清：北京元亨圣马生物技术研究所产品；无血清RPMI 1640：Gibco公司产品；SP2/0细胞：ATCC引进，军事医学科学院基础医学研究所保存；Balb/c以及C57BL/6小鼠：军事医学科学院实验动物中心提供；其余试剂均为市购。
2.方法和结果
(1)Balb/c小鼠免疫。选用4～6周龄的雌性Balb/c小鼠6只，用100μg ricin于腹股沟皮下免疫，第一针加福氏完全佐剂，第二针加福氏不完全佐剂，每3周免疫1次，共免疫3次。第3次免疫后尾静脉采血，用间接ELISA检测抗体产生情况，在融合前3天，以100μg ricin腹腔加强免疫一次，第3天融合。
(2)细胞融合。将免疫的小鼠摘眼球后脱颈处死，无菌摘取小鼠脾细胞，按常规方法进行细胞融合。具体方法为：①将免疫的小鼠摘眼球放血后脱颈处死，75％酒精浸泡3min，无菌取出脾脏，用200目钢网研磨单个细胞悬液，无血清RPMI 1640洗两次并记数；②收集对数生长期的SP2/0细胞，用无血清RPMI1640洗两次并记数；③按SP2/0细胞∶脾细胞＝1∶5的比例混合两种细胞，用RPMI 1640洗1次，弃尽上清，轻轻将细胞打散；④在1min时间里缓慢加入1ml50％PEG(MW为1500)溶液，置37℃水浴1min；⑤在1min、2min、5min时间内加无血清RPMI1640 1ml、5ml、10ml、10ml；⑥800r/min离心7min，弃上清，尽可能轻地将细胞悬起；⑦加含20％FCS的HAT(Sigma)-RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为2×106/ml，混匀后滴加在铺有滋养细胞(1×104细胞/孔)96孔培养板(Gibco)中，100μl/孔，置于37℃的5％ CO2孵箱中培养。
(3)用间接ELISA筛选抗人Tim-3单克隆抗体杂交瘤细胞。用10μg/ml重组人Tim-3(rhTim-3)包被ELISA板，于4℃过夜并封闭。依次加入待测细胞培养上清液(37℃ 1h，PBST洗板4次)，以及1∶500稀释的50μl HRP-GAM(37℃45min，PBST洗板4次)。以TMB底物显色后，于450nm波长测定OD值。
(4)杂交瘤细胞克隆化。用间接ELISA法筛选阳性的细胞克隆再反复亚克隆，直到所有杂交瘤细胞培养上清检测为100％阳性。杂交瘤细胞的克隆化用有限稀释法：①在克隆化的当天或前1天制备滋养细胞：脱颈处死昆明小鼠，75％酒精浸泡消毒皮肤，无菌剥离腹部皮肤，注射器抽取5ml 1640培养液注入小鼠腹腔，反复冲洗后吸出腹腔洗液，用加20％胎牛血清的1640培养液稀释后滴入96孔板，每孔约0.1ml。②取少许待作克隆化的杂交瘤细胞移至另一无菌试管中，并准确计数。③有限稀释法进行亚克隆。④将培养板置于37℃的5％ CO2孵箱中培养，约5天后在显微镜下可观察到细胞克隆。适时换液，检测，取阳性单克隆细胞株进行扩大培养，及时冻存细胞株。
(5)杂交瘤细胞免疫球蛋白亚型的确定。用羊抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3，就杂交瘤细胞浓缩后的培养上清作双相琼脂扩散实验，结果表明杂交瘤细胞培养上清只能与羊抗鼠IgG2a抗体形成结合条带，证明L3C杂交瘤细胞所分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a，通过上述步骤，筛选到人Tim-3单克隆抗体L3C。
实施例二 人Tim-3中和性单克隆抗体杂交瘤细胞L3C轻、重链基因的钓取
1.材料
1)轻链上下游引物
轻链上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7，其序列分别见序列表SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13；轻链下游引物MuCK，其序列见序列表SEQ ID NO：14，引物在PCR扩增时的使用浓度为10pM/μl。
2)重链上下游引物
重链上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8，其序列见序列表SEQ IDNO：15、SEQ ID NO 16、SEQ ID 17和SEQ ID 18；重链下游引物MuIgG2a见序列表中SEQ ID NO：19，引物在PCR扩增时的使用浓度为10pM/μl。
3)DNA片段纯化试剂盒：OMEGA生物科技公司产品；T4 DNA连接酶：New England Biolabs产品；载体PGEM Teasy：Promega公司产品；感受态细菌JM109：购自Promega公司。其余同实施例一。
2.方法结果
(1)取对数生长期的中和性单克隆抗体L3C细胞5×(106～107)个，离心去除上清，将细胞均匀弹起。加1ml TRIzol(Invitrogen)反复吹打使细胞充分裂解，振荡5分钟后，加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2～3min，2℃～8℃ 12000r/min，离心15分钟，取上清于另一新管中，加500μl异丙醇混匀后室温放置10分钟，2℃～8℃12000r/min离心10min。75％乙醇洗涤沉淀，干燥后，用20μl无RNA酶的去离子水溶解沉淀。
(2)取含1μg总RNA的溶液，依次加入AMV5×缓冲液4μl，Oligo(dT)(500ng/μl)0.5μl，2.5mmol/L dNTP2μl，Rnasin(50U/μl)0.5μl，补去离子水至20μl、反转录酶2～5U，42℃延伸1小时。95℃变性5min，置冰浴中，产物为cDNA第一链。分别用特异性引物扩增轻链可变区和重链可变区。
轻链可变区扩增体系：反转录产物2μl，Taq酶10×buffer 2μl，轻链上游引物MuLC5、MuLC6和MuLC7各1μl，下游引物MuCK 3μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，加Taq酶1～2U，补去离子水至50μl。95℃变性2分钟，循环参数为：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃后延伸10min。
重链可变区扩增体系：反转录产物2μl，Taq酶10×buffer 2μl，重链上游引物MuHC5、MuHC6、MuHC7和MuHC8各1μl，下游引物MuIgG2a 3μl，2.5mmol/LdNTP 4μl，加Taq酶1～2U，补去离子水至50μl。95℃变性2分钟，循环参数为：94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共30个循环，72℃后延伸10min。
(3)用分离出欲回收的DNA片段，在长波紫外光下切下含目的DNA片段的胶块，放入离心管中，加入三倍胶体积的化胶液，55℃水浴完全溶解胶块。用DNA片段纯化试剂盒回收DNA片段并将纯化的DNA片段在水溶液里，将回收的PCR产物在T4 DNA连接酶缓冲液中按2∶1的比例(摩尔比)和载体PGEMTeasy混合后，加入0.5U的T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接反应的总体积为10μL。
(4)取连接液10μl，加于200μl感受态细菌JM109中并轻柔混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，迅速转入冰浴2min，加800μl LB培养基，转入37℃恒温摇床，以150r/min的速度摇动45min，4000r/min离心1min，弃去800μl上清，取沉淀涂布于含Amp(终浓度为100μg/ml)的固体LB平板，将平板倒置于37℃孵箱12～18h。
(5)在上述平板中挑取单个克隆，接种于含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培养基中。37℃恒温摇床170rpm，震荡培养过夜。取3ml菌液加入1.5mlEppendorf管中，10000r/min离心1min，弃上清。将沉淀菌体重悬于100μL溶液I中，加新鲜配制的溶液II200μL，轻缓地上下颠倒数次，至液体变清澈为止。随后，再加入150μL溶液III，轻柔地上下颠倒数次使液体混匀，此时出现大量白色絮状沉淀。4℃，12000r/min离心5min，取上清加至另一Eppendorf管中，加入等体积的Tris-HCl饱和酚，剧烈震荡后，12000rpm离心5min，将上层水相移至一新管中。再加入500μL氯仿，重新抽提一次。其后，小心吸取上层水相，移至一新管中，加2倍体积的无水乙醇混匀，于-20℃放置3h。4℃，12000rpm离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀2次，室温干燥20min，以40μL无菌双蒸水溶解，进行PCR鉴定及DNA测序分析。
通过上述步骤构建了含有人Tim-3中和抗体L3C轻、重链基因的载体，经测序分析、序列比对为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，其对应的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2。
实施例三 单克隆抗体L3C的Protein A纯化及其特异性及灵敏性检测
1.材料
Protein A Sepharose CL 4B柱蛋白柱：北京本元正阳生物技术有限公司产品；其余同实施例一。
2.方法和结果
(1)单克隆抗体L3C的纯化
将含有人Tim-3中和抗体L3C轻、重链基因的载体转入哺乳动物细胞中，进行表达。收集表达上清，加入1mL pH 8.0，0.1moL/L磷酸缓冲液并用pH9.0，1moL/L TRIS-HCL调整pH至9.0。把小鼠腹水加入已经用0.1moL/L磷酸缓冲液pH8.0平衡好的Protein A Sepharose CL 4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子，直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用1moL/L pH8.5 TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2，0.01M PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测OD260、OD280，计算蛋白质含量，冻干后于-20℃保存，纯化后单克隆抗体L3C的蛋白电泳图见图1。
(2)单克隆抗体L3C的特异性
以Tim-3-Trx或Trx(硫氧还蛋白)包被酶标板每孔50uL，浓度梯度分别为：10ug/ml、2ug/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0ng/ml。37℃孵育3-4小时包被。PBST洗5遍，封闭，200ul封闭液封闭2小时，PBST洗5遍。按10ug/ml的终浓度加入L3C抗体50ul，37℃反应1小时，PBST洗5遍。加入300X稀释anti-mouse抗体(KPL公司)，37℃反应45min。PBST洗7遍，加入50ul/well的TMB，室温避光孵育10min。加入50ul/well的2N的硫酸终止反应，酶标仪OD450nm检测。
L3C抗体特异性结果见图2，结果显示本发明所述的L3C抗体能够特异性的与Tim-3结合。
(3)单克隆抗体L3C的灵敏性检测
以Tim-3-Trx包被酶标板每孔50uL，浓度梯度分别为：10ug/ml、2ug/ml、400ng/ml、80ng/ml、16ng/ml、3.2ng/ml、0.64ng/ml、0ng/ml。37℃孵育3-4小时包被。PBST洗5遍，封闭，200ul封闭液封闭2小时。PBST洗5遍，按10ug/ml的终浓度加入L3C抗体和mIgG各50ul。37℃反应1小时。PBST洗5遍，加入300X稀释anti-mouse抗体(KPL公司)，37℃反应45min。PBST洗7遍，加入50ul/well的TMB，室温避光孵育10min。加入50ul/well的2N的硫酸终止反应，酶标仪OD450nm检测。
L3C抗体灵敏度结果见图3，结果显示本发明所述的L3C抗体对Tim-3检测的灵敏度高，能够达到1ng/ml。
实施例四 一种检测Tim-3的ELISA试剂盒的制备
所述检测Tim-3的ELISA试剂盒的设计原理如图4所示。将Tim-3的配体rhGal-9蛋白包被于高亲和力的96孔ELISA板上，用其捕获人血清中的Tim-3，抗人Tim-3抗体L3C为检测抗体，检测血清中的Tim-3，用HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体检测抗人Tim-3抗体L3C，最后加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值，通过分析OD450值的大小，判断患者中Tim-3的水平。
1.rhGal-9蛋白的制备
1)rhGal-9基因的合成：
根据人hGal-9蛋白的基因序列设计引物，通过PCR方法合成hGal-9基因的全长序列如SEQ ID：NO.20。测序正确后，利用EcoR I和Xho I DNA限制性内切酶，将合成的hGal-9全长序列插入到pET32a载体上，构建rhGal-9-pET32a载体，此载体可用于表达rhGal-9-Trx融合蛋白。
2)rhGal-9蛋白的表达、纯化：
将构建好的rhGal-9 -pET32a质粒转化入E.coli BL21(DE3)感受态中，37℃Amp+抗性平板培养，挑单克隆菌落，于10ml含有100ug/ml氨苄青霉素(Amp+)的LB培养基中培养3-5小时。将摇好的菌液按1∶100的比例接种到1L Amp+的LB培养基中37℃培养3-4小时，当菌液OD600＝0.6左右时，加入IPTG至终浓度0.1mM，然后25℃过夜摇动培养。将得到的菌液离心收集菌体，超声破碎菌体，离心收集包涵体，梯度尿素(1M-2M-4M-8M)变性洗涤包涵体，然后梯度尿素(8M-4M-2M-1M-0.5M)复性得到rhGal-9蛋白。最后利用Ni-NTA亲和纯化得到具有较高纯度的蛋白。将得到的rhGal-9蛋白除菌、去内毒素，为以后的实验备用。rhGal-9蛋白的SDS电泳图见图5。
2.rhGal-9蛋白与Tim-3的结合活性验证
1)ELISA鉴定rhGal-9蛋白对hTim-3的亲和力
96孔高亲和力ELISA板上包被饱和剂量的rhGal-9蛋白(10ug/ml)，然后加入重组人Tim-3蛋白或无关蛋白Trx，4℃包被过夜。洗涤后加入抗人Tim-3的抗体，最后加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，TMB显色，2N硫酸终止。
ELISA结果见图6，结果表明，我们表达的rhGal-9能特异性地与人Tim-3分子结合。
2)rhGal-9蛋白诱导淋巴细胞凋亡的活性检测
24孔板内种THP1细胞至4*105/孔，分别加入rhGal-9-Trx融合蛋白和Trx蛋白，浓度梯度为0.2uM、0.5uM、1uM。12小时后收细胞，用Annexin V和PI凋亡染色，流式细胞仪检测，结果见图7。上述结果表明，上述表达的rhGal-9蛋白能特异性结合人Tim-3，且具有生物学功能。
3.检测Tim-3的ELISA试剂盒组装
检测Tim-3的ELISA试剂盒包括：rhGal-9蛋白、抗Tim-3抗体L3C、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品人Tim-3(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA。其中辣根过氧化物酶底物缓冲液：称取10mg 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于5ml无水乙醇中制备成TMB贮存液。待使用时取0.5ml TMB贮存液加到10ml磷酸柠檬酸底物缓冲液(0.2MNa2HPO4，0.1M柠檬酸)中，再加入32μl 0.75％H2O2混匀，配置成辣根过氧化物酶底物缓冲液。
4.检测Tim-3的ELISA试剂盒的使用方法
1)包被重组人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
2)按合适的稀释度(1∶2～1∶10)稀释正常人或患者的血浆，加入到包被有rhGal-9的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
3)加入抗人Tim-3的抗体L3C，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
4)最后加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，37度孵育0.5小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
5)最后加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值。
通过分析OD450值的大小，判断人血清中Tim-3浓度。
实施例五 一种检测Tim-3的ELISA试剂盒的临床样品检测
利用本发明所述的试剂盒，按照实施例5中所述的试剂盒的使用方法，对正常人和脓毒血症患者血清的Tim-3进行检测。首先包被了人Gal-9蛋白，然后分别加入了标准品(Pos Control)Tim-3，正常人血清(Nor patient)，以及脓毒血症患者血清(sepsis1 sepsis2)，然后用抗人Tim-3抗体(L3C)为检测抗体。
检测结果见图8，实验结果表明脓毒血症患者血清中Tim-3(sTim-3)的含量相对于正常人血清中Tim-3(sTim-3)的含量显著降低。说明本发明试剂盒能够用于临床检测。
通过实施例三对单克隆抗体L3C的灵敏性检测，说明本发明所述的试剂盒能够准确检测出样品中Tim-3的含量，其灵敏度能够达到1ng/ml。
Claims (7)
1.一种抗人Tim-3中和性单克隆抗体或其片段，包括轻链CDR1-3和重链CDR1-3，其特征在于，所述轻链CDR1-3的氨基酸序列为：
CDR1：如序列表中SEQ ID NO：5所示；
CDR2：如序列表中SEQ ID NO：6所示；
CDR3：如序列表中SEQ ID NO：7所示；
所述重链CDR1-3的氨基酸序列为：
CDR1：如序列表中SEQ ID NO：8所示；
CDR2：如序列表中SEQ ID NO：9所示；
CDR3：如序列表中SEQ ID NO：10所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段，其特征在于，所述轻链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO：3的核甘酸序列所示，所述重链可变区的编码序列如序列表中SEQ ID NO：4的核甘酸序列所示。
4.一种含有权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段的Tim-3检测试剂盒。
5.一种检测Tim-3的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-3任意一项所述的单克隆抗体或其片段。
6.如权利要求5所述的一种检测Tim-3的ELISA试剂盒，还包括rhGal-9蛋白、HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品人Tim-3(100ug/ml，0.1ml)、阴性对照样品BSA。
7.如权利要求5所述的种检测Tim-3的ELISA试剂盒，其使用方法如下：
1)包被重组人rhGal-9蛋白(10ug/ml)到高亲和力ELISA板中，4℃过夜后用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
2)按合适的稀释度1∶2～1∶10稀释正常人或患者的血浆，加入到包被有rhGal-9的ELISA板条中，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
3)加入抗人Tim-3的抗体L3C，37℃孵育1小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
4)最后加入羊抗小鼠HRP标记的抗体，37度孵育0.5小时，用含0.2％吐温的PBS缓冲液洗涤5次；
5)最后加入TMB显色，2N硫酸终止后检测OD450的值，通过分析OD450值的大小，判断人血清中Tim-3浓度。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105785051A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-20 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 血清中可溶性Tim-3蛋白作为诊断慢性肾病的标志物 |
| CN110294807A (zh) * | 2014-10-27 | 2019-10-01 | 新加坡科技研究局 | 抗tim-3抗体 |
| CN113164601A (zh) * | 2019-09-19 | 2021-07-23 | 上药生物治疗（香港）有限公司 | 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 |
| CN114751985A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-07-15 | 日照市疾病预防控制中心 | Tim-3抗体、制备方法及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100028341A1 (en) * | 2006-12-15 | 2010-02-04 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system |
| CN102183637A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-09-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法 |
| CN102492038A (zh) * | 2011-12-09 | 2012-06-13 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途 |
-
2012
- 2012-10-24 CN CN201210408986.7A patent/CN103665164A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20100028341A1 (en) * | 2006-12-15 | 2010-02-04 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system |
| CN102183637A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-09-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法 |
| CN102492038A (zh) * | 2011-12-09 | 2012-06-13 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 抗人Tim-3的中和性单克隆抗体L3D及其用途 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110294807A (zh) * | 2014-10-27 | 2019-10-01 | 新加坡科技研究局 | 抗tim-3抗体 |
| CN105785051A (zh) * | 2016-05-05 | 2016-07-20 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 血清中可溶性Tim-3蛋白作为诊断慢性肾病的标志物 |
| CN105785051B (zh) * | 2016-05-05 | 2017-05-31 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 血清中可溶性Tim‑3蛋白作为诊断慢性肾病的标志物 |
| CN113164601A (zh) * | 2019-09-19 | 2021-07-23 | 上药生物治疗（香港）有限公司 | 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 |
| CN113164601B (zh) * | 2019-09-19 | 2023-09-29 | 上药生物治疗（香港）有限公司 | 一种分离的抗原结合蛋白及其用途 |
| CN114751985A (zh) * | 2022-06-07 | 2022-07-15 | 日照市疾病预防控制中心 | Tim-3抗体、制备方法及其应用 |
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