CN104407129A - 一种捡测发酵液中重组人白细胞介素-29的间接elisa方法 - Google Patents

一种捡测发酵液中重组人白细胞介素-29的间接elisa方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测发酵液中重组人白细胞介素-29活性的间接ELISA方法，用于基因工程菌株发酵条件优化过程中简便、快速检测发酵液中表达产物rhIL-29的活性。检测方法包括以下步骤：将表达rhIL-29的基因工程菌株的发酵液上清用包被液稀释后，直接包被酶标反应板，经37℃孵育3h、4℃过夜；洗板三次，加入封闭液37℃孵育3h：洗板三次，加入羊抗人IL-29抗体37℃孵育30min；洗板三次，加入HRP标记的兔抗羊IgG，37℃孵育30min；洗板三次，加入TMB底物，37℃显色10min；加终止液终止反应，在A450波长测定OD值。本发明的检测方法适用于基因工程菌株发酵条件优化过程中检测发酵液中表达产物的活性，根据不同发酵条件下测得的发酵液OD450值，可判定该基因工程菌株的最佳发酵条件。

Description

一种捡测发酵液中重组人白细胞介素-29的间接ELISA方法
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，涉及一种检测发酵液中重组人白细胞介素-29(rhIL-29)的间接ELISA方法。
背景技术
人白细胞介素-29(interleukin 29，IL-29)是2003年新发现的一种新的细胞因子，其结构和功能与I型干扰素(interferon，IFN)相似，因此又称为IFN-λ1。
人IL-29主要由上皮细胞和肝细胞合成并分泌到细胞外作用于靶细胞。研究发现，人体不同组织器官的IL-29受体分布具有明显差异，在胃肠、呼吸系统、心脏和一些腺体细胞中高水平表达，而在大脑中表达水平最低，表明IL-29作用的靶细胞比I型IFN的更局限。这种IL-29受体分布的组织器官差异，使IL-29引起发热、寒冷、恶心和关节痛等效应比I型IFN的更小。因此，IL-29作为新型的干扰素类，其临床副作用可能比I型IFN的更小，具有潜在的临床应用价值。
IL-29作为一种细胞因子，其在人体内的产生特点与其它细胞因子类似，具有多源性和自限性，作用特点具有多效型、时效性和重叠性。因此，人IL-29的制备只能通过基因克隆、构建重组表达载体、构建重组基因工程菌株、发酵表达、从发酵液分离和纯化表达产物的一系列生物技术，才能获得大量的重组人IL-29(rhIL-29)产物。
在对表达rhIL-29的重组毕赤酵母工程菌株进行发酵的过程中，既要提高目的基因hIL-29的表达量又要保持表达产物rhIL-29的生物学活性。因此，需要对基因工程菌株的发酵条件进行全面优化。IL-29是一种细胞因子，其生物学活性广泛，各种动物体内实验方法由于操作复杂和费时较长，不适用于发酵条件优化过程中检测表达产物rhIL-29的活性，而检测发酵液中的蛋白质表达量又不能反映出表达产物rhIL-29的活性。因此，在发酵条件优化过程中，对发酵液中表达产物rhIL-29的活性和表达量的检测至关重要。
本发明是在对表达rhIL-29的基因工程菌株进行发酵条件优化的过程中，通过大量实验而建立的一种适用于检测发酵液中rhIL-29活性的间接ELISA方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测发酵液中重组人白细胞介素-29活性的间接ELISA方法，用于基因工程菌株发酵条件优化过程中简便、快速检测发酵液中表达产物rhIL-29的活性。
本发明提供的检测方法如下：
1)酶标反应板的包被：取基因工程菌株的发酵液上清200μL，加800μL包被液，混匀后包被96孔酶标板，100μL/孔；同时设置阴性对照孔和空白孔，取空载体转化表达菌的发酵液上清200μL，加800μL包被液，混匀后包被阴性对照孔，100μL/孔；空白孔只加包被液，100μL/孔，置37℃孵育3h，4℃过夜；
2)酶标反应板的封闭：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，每孔加封闭液200μL，37℃孵育3h；
3)加一抗：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加1∶200稀释的羊抗人IL-29抗体，100μL/孔，置37℃孵育30min；
4)加二抗：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加1∶2500稀释的HRP标记兔抗羊IgG，100μL/孔，置37℃孵育30min；
5)加底物显色：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加TMB显色液，100μL/孔，置37℃反应15min；
6)终止反应：加入终止液(1mol/L的H28O4)，50μL/孔；
7)OD值的测定：用酶标仪测定，以空白孔调零，在A450波长测定样品和阴性对照的OD值。
附图说明
图1诱导毕赤酵母工程菌株表达rhIL-29的诱导剂甲醇的最佳添加量
图2诱导毕赤酵母工程菌株表达rhIL-29的最佳培养温度
具体实施方法
以下结合对诱导毕赤酵母工程菌株表达rhIL-29的诱导剂甲醇的添加量和诱导表达温度进行优化过程中，检测发酵液中rhIL-29活性的实施例具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实施例1诱导毕赤酵母工程菌株表达rhIL-29的诱导剂甲醇添加量的优化过程中检测发酵液中rhIL-29的活性
1、从保存的毕赤酵母工程菌种管取菌种划线接种YPD平板，活化菌株后，从YPD平板上挑取单菌落接种于YPD液体培养基；于30℃、220rpm/min，振荡培养24h，作为发酵优化的一级种子。
2、按4％的接种量，取毕赤酵母工程菌的一级种子接种BMGY液体培养基中，于30℃、220rpm/min，振荡培养至OD600＝2-6(16-18小时)，作为发酵优化的二级种子。
3、将二级种子室温静置1h，倒去上清，用25mL BMMY重悬细胞，于30℃、220rpm/min继续培养；在0h、24h、48h时，分别添加0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％的甲醇，诱导培养72h，分别取500μL发酵液检测rhIL-29的活性。
4、间接ELISA检测发酵液中rhIL-29的活性
1)包被酶标反应板：取发酵液上清200μL，加800μL包被液，混匀后包被96孔酶标板，100μL/孔；同时设置阴性对照孔和空白孔，取空载体转化表达菌的发酵液上清200μL，加800μL包被液，混匀后包被阴性对照孔，100μL/孔；空白孔只加包被液，100μL/孔，置37℃孵育3h，4℃过夜；
2)封闭酶标反应板：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，每孔加封闭液200μL，37℃孵育3h；
3)加一抗：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加1∶200稀释的羊抗人IL-29抗体，100μL/孔，置37℃孵育30min；
4)加二抗：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加1∶2500稀释的HRP标记兔抗羊IgG，100μL/孔，置37℃孵育30min；
5)加底物显色：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加TMB显色液，100μL/孔，置37℃反应15min；
6)终止反应：加入终止液(1mol/L的H2SO4)，50μL/孔；
7)OD值的测定：用酶标仪测定，以空白孔调零，在A450波长测定样品和阴性对照的OD值。
5、发酵过程中诱导剂甲醇的最佳添加量的确定
以甲醇添加量为横坐标、在A450波长测定的发酵液OD值为纵坐标绘制曲线，根据曲线即可确定毕赤酵母工程菌发酵过程中诱导剂甲醇的最佳添加量，在本例中甲醇的最佳添加量为1.5％，如图1所示。
实施例2诱导毕赤酵母工程菌株表达rhIL-29的培养温度的优化过程中检测发酵液中rhIL-29的活性
1、从保存的毕赤酵母工程菌种管取菌种划线接种YPD平板，活化菌株后，从YPD平板上挑取单菌落接种于YPD液体培养基；于30℃、220rpm/min，振荡培养24h，作为发酵优化的一级种子。
2、按4％的接种量，取毕赤酵母工程菌的一级种子接种BMGY液体培养基中，于30℃、220rpm/min，振荡培养至OD600＝2-6(16-18小时)，作为发酵优化的二级种子。
3、将二级种子室温静置1h，倒去上清，用25mL BMMY重悬细胞，分别在22℃、24℃、26℃、28℃、30℃下，220rpm/min继续培养；在0h、24h、48h时，添加1.5％的甲醇，诱导培养72h，分别取500μL发酵液检测rhIL-29的活性。
4、间接ELISA检测发酵液中rhIL-29的活性
1)包被酶标反应板：取发酵液上清200μL，加800μL包被液，混匀后包被96孔酶标板，100μL/孔；同时设置阴性对照孔和空白孔，取空载体转化表达菌的发酵液上清200μL，加800μL包被液，混匀后包被阴性对照孔，100μL/孔；空白孔只加包被液，100μL/孔，置37℃孵育3h，4℃过夜；
2)封闭酶标反应板：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，每孔加封闭液200μL，37℃孵育3h；
3)加一抗：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加1∶200稀释的羊抗人IL-29抗体，100μL/孔，置37℃孵育30min；
4)加二抗：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加1∶2500稀释的HRP标记兔抗羊IgG，100μL/孔，置37℃孵育30min；
5)加底物显色：用洗涤液洗涤酶标板3次，拍干，加TMB显色液，100μL/孔，置37℃反应15min；
6)终止反应：加入终止液(1mol/L的H2SO4)，50μL/孔；
7)OD值的测定：用酶标仪测定，以空白孔调零，在A450波长测定样品和阴性对照的OD值。
5、发酵过程中最佳培养温度的确定
以培养温度为横坐标、在A450波长测定的发酵液OD值为纵坐标绘制曲线，根据曲线即可确定毕赤酵母工程菌发酵过程中的最佳培养温度，在本例中的最佳培养温度为26℃，如图2所示。

Claims (3)

1.一种捡测发酵液中重组人白细胞介素-29(rhIL-29)的间接ELISA方法，其特征在于：所述的间接ELISA方法，用于对表达rhIL-29的毕赤酵母工程菌发酵条件优化过程中检测发酵液中rhIL-29的活性。
2.根据权利要求1所述的捡测发酵液中rhIL-29的间接ELISA方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
(1)用表达rhIL-29的毕赤酵母工程菌株的发酵液上清包被酶标反应板，包被条件为37℃孵育3h，4℃过夜，洗板三次；
(2)用封闭液封闭酶标反应板，封闭条件为37℃孵育3h，洗板三次；
(3)加1∶200稀释的羊抗人IL-29抗体，37℃孵育反应30min，洗板三次；
(4)加1∶2500稀释的HRP标记兔抗羊IgG，37℃孵育反应30min，洗板三次；
(5)加TMB底物，37℃显色15min；
(6)加终止液终止反应，检测OD450值
3.根据权利要求2所述的捡测发酵液中rhIL-29的间接ELISA方法，其特征在于：所述的检测步骤中包括以下试剂：
(1)包被液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，pH 9.6；
(2)封闭液为0.85％的NaCl溶液，含1％BSA；
(3)洗涤液为10mmol/L的PBS，pH 7.4，含0.15％的Tween-20；
(4)抗体稀释液为15mmol/L的PBS，pH 7.4，含0.4％的Tween-20；
(5)底物溶液：A液：磷酸-柠檬酸缓冲液，pH 5.0，量取24.3mL 0.1M的柠檬酸和25.7mL0.2M的磷酸氢二钠，用去离子水定容至100mL，4℃保存；B液：TMB溶液，称取10mgTMB溶解于1mL的二甲基甲酰胺中，4℃避光保存；临用前取50μL的B液，加入到10mL的A液，再加入10μL 30％的H2O2，混匀即成底物溶液；
(6)终止液为1mol/L的H2SO4。
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