CN107656049A - 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法 - Google Patents

一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法，其包括以下的步骤：制备羧基化聚苯乙烯纳米微球、制备纳米荧光微球；其中，稀土元素离子、β‑二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3；所述稀土元素离子为铽离子和镝离子、制备纳米微球时间分辨荧光‑喹诺酮类抗生素探针、制备层析试纸条、利用上述探针和层析试纸条检测喹诺酮类抗生素。该检测方法检测灵敏度高，检测范围广，稳定可靠，拥有良好的商业化应用前景。

Description

一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的 方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法。
背景技术
时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，TRFIA是用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。TRFIA与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测等方面有较为广泛的应用。
由于稀土元素络合物的荧光强度都较低，因此需要采用荧光增强技术来提高检测灵敏度。目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型，解离再增强技术(DELFIA)、Cyber Fluor系统和基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。其中，Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了稀土元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将稀土元素及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围。
喹诺酮类抗生素是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药。喹诺酮类以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)为靶，妨碍DNA回旋酶，进一步造成细菌DNA的不可逆损害，达到抗菌效果。1979年合成诺氟沙星，随后又合成一系列含氟的新喹诺酮类药，通称为氟喹诺酮类。喹诺酮类药物分为四代，目前临床应用较多的为第三代，常用药物有诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、氟罗沙星等。此类药物对多种革兰阴性菌有杀菌作用，广泛用于泌尿生殖系统疾病、胃肠疾病，以及呼吸道、皮肤组织的革兰阴性细菌感染的治疗。目前亟待获得快速、简便、可靠、准确地检测喹诺酮类抗生素的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的、缺乏快速、简便、可靠、准确地检测喹诺酮类抗生素的方法不足，提供一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法。所述的方法能够快速、可靠、准确地检测喹诺酮类抗生素的含量，并且灵敏度高、重复性好、稳定性高、节约时间。该方法能够广泛用于商业化对喹诺酮类抗生素的检测。
针对检测喹诺酮类抗生素的目的，本发明的发明人对纳米微球时间分辨荧光探针的结构，尤其是对其组成部分纳米荧光微球的制备原料中稀土元素离子的品种——铽元素和镝元素进行特殊选择，从而使制备的纳米荧光微球的荧光强度极大地提高，并使稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3，通过上述改进，提高了利用含有该纳米荧光微球的纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素含量的灵敏度、准确性和可靠性。
本发明的技术方案是：一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法，其包括以下的步骤：
(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；所述羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径为60±8nm；
(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3；所述稀土元素离子为铽离子和镝离子；
(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和喹诺酮类抗生素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；
(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；
(5)利用喹诺酮类抗生素制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；
(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；
(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；
(8)向步骤(7)的孔中插入步骤(5)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到所述孔中的液体，浸入后插入荧光读数仪中读数，得到检测结果。
本发明中，所述喹诺酮类抗生素为本领域常规的喹诺酮类抗生素，较佳地为诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星或氟罗沙星。
本发明中，较佳地，步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将10mM苯乙烯单体和0.95mM丙烯酸单体溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀；
用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃。加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温；
将反应液用whatman 2v滤纸过滤，用截留分子量25,000Da的透析袋对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％叠氮钠后4℃保存，所述百分比为质量百分比。
本发明步骤(2)中，所述β-二酮体类螯合物为本领域常规的β-二酮体类螯合物，较佳地为β-萘甲酰三氟丙酮。所述荧光增强协同剂为本领域常规的荧光增强协同剂，较佳地为三辛基氧化膦和/或菲罗啉。
更佳地，步骤(2)所述纳米荧光微球由包括以下步骤的方法制得：
取步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，得反应液A；
使反应液A中羧基化的聚苯乙烯微球的密度为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化镝50μL、0.1M三氯化铽50μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮400μL、0.1M三辛基氧化膦150μL和0.1M菲罗啉150μL，加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B；
将反应液B通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，对去离子水透析5天，去除其余剩余小分子物质，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存，所述百分比为质量百分比。
本发明中，较佳地，步骤(3)所述纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(2)制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL。400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ；
将反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀。用0.01M pH 8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀。重复离心步骤2次，即得活化的荧光微球；
将活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg喹诺酮类抗生素单克隆抗体，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ；
将反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀。将该沉淀复溶于含1.5％海藻糖和2％牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，较佳地，所述纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针的制备方法与所述纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针的制备方法相同，仅将喹诺酮类抗生素单克隆抗体替换为兔IgG单克隆抗体。
本发明中，较佳地，步骤(4)所述冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针用冻干稀释液分别依次稀释20倍和30倍，得稀释液A和稀释液B，所述冻干稀释液为含有6％蔗糖、4％牛血清白蛋白、1％甘露醇的0.05M pH 7.4的PBPS缓冲液，所述百分比为质量百分比；
将所述稀释液A和稀释液B按1:1的体积比混匀后冷冻真空干燥。
本发明中，较佳地，步骤(5)所述层析试纸条由包括以下步骤的方法制得：
将喹诺酮类抗生素用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温-20的0.01MpH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A，用喷膜机将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端2mm处形成检测线T线，所述百分比为质量体积百分比；
将羊抗兔二抗用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端4mm处形成质控线C线，质控线与检测线相隔5mm，所述百分比为质量体积百分比；
将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干；
在硬板纸上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维素垫、划有检测线T线的硝酸纤维素膜、划有质控线C线的硝酸纤维素膜、滤纸、样品垫以及吸水纸，再剪切成4mm宽的试纸条。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的检测方法检测灵敏度高，其定量限能够最小至10ng/mL；该检测方法的检测范围广，其定量线性范围能够达到10-820ng/mL；该检测方法检测稳定可靠，其样品添加回收率高达90-120％。此外，该检测方法操作简便易行，仅需5分钟就能获得准确、可靠的测定结果，拥有良好的商业化应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述常温的含义为本领域常规的常温的含义，能够进行实施例中所记载的反应即可。较佳地为15～30℃。
实施例中所述喹诺酮类抗生素为本领域常规的喹诺酮类抗生素，能够进行实施例中所记载的反应即可。较佳地，实施例中采用诺氟沙星，购自石药集团欧意药业有限公司。
实施例1羧基化聚苯乙烯纳米微球的制备
将10mM苯乙烯单体(购自德国巴斯夫公司)和0.95mM丙烯酸单体(购自德国巴斯夫公司)溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀。然后用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃。加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温，然后将反应液用whatman 2v滤纸(购自whatman公司，孔径8μm)过滤，最后用透析袋(购自美国Spectrum公司，截留分子量25,000Da)对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％(w/w)叠氮钠后，即得羧基化聚苯乙烯纳米微球，将其置于4℃保存。
通过测定，所制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径为48±6nm，表面电荷为180-220μeq/g，羧基密度为20-32sq.A/grp。
实施例2纳米荧光微球的制备
(1)取实施例1中制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液(其中，去离子水和丙酮的体积比为1:1)，得反应液A。
(2)步骤(1)所得的反应液A中聚苯乙烯微球的密度约为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化镝50μL、0.1M三氯化铽50μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮400μL、0.1M三辛基氧化膦150μL和0.1M菲罗啉150μL。加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B。
(3)将步骤(2)所得的反应液B通过减压蒸馏方式去除其中的有机溶剂。再用去离子水透析5天，去除其中剩余的其他小分子物质，收集透析袋(购自美国Spectrum公司，截留分子量10,000Da)内液体，加入0.05％(w/w)叠氮钠后，将其置于4℃保存，即得纳米荧光微球。该纳米荧光微球中包裹了镝离子螯合物和铽离子螯合物。
通过测试和计算(参照GB/T 21883-2008披露的方法)，平均每个步骤(3)所得的纳米荧光微球中包裹的镝离子螯合物的数量为30万个。
实施例3纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体的制备
(1)取实施例2中制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL。400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺(EDC)200μL，得反应液Ⅰ。
(2)将步骤(1)所得的反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀。用0.01M pH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀。重复步骤(2)所述的离心步骤2次，即得活化的荧光微球。
(3)将步骤(2)所得的活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg诺氟沙星单克隆抗体(参照占春霞，诺氟沙星单克隆抗体的筛选、制备及初步鉴定，硕士学位论文，暨南大学，2007中记载的制备方法制备)，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ。
(4)将步骤(3)所得的反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀。将该沉淀复溶于含1.5％(m/v)海藻糖和2％(m/v)牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体，置于4℃保存备用。
实施例4纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体的制备
(1)取实施例2中制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL。400w超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ。
(2)将步骤(1)所得的反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀。用0.01M pH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀。重复步骤(2)所述的离心步骤2次，即得活化的荧光微球。
(3)将步骤(2)所得的活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入600μg兔IgG单克隆抗体(购自上海吉奉生物科技有限公司)，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅲ。
(4)将步骤(3)所得的反应液Ⅲ12000g离心10分钟，收集沉淀。将该沉淀复溶于含1.5％(m/v)海藻糖和2％(m/v)牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体，置于4℃保存备用。
实施例5纳米荧光微球标记的单克隆抗体的冻干
(1)将实施例3制备的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和实施例4中制备的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体(又可分别称为“纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针”和“纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针”)用冻干稀释液(含6％蔗糖、4％牛血清白蛋白、1％甘露醇的0.05M pH 7.4的PBPS缓冲液，所述百分比为质量百分比)分别依次稀释20倍和30倍，得稀释液A和稀释液B。
(2)将步骤(1)制备的稀释液A和稀释液B按1:1(v/v)混合均匀，以100μL每孔分装于96孔可拆卸微孔板中，采用冷冻真空干燥方式将其干燥(冻干工艺见表1)，即得冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体，可用硅胶塞密封保存。
表1冻干工艺
温度 调节时间 保持时间 压力
-55℃ 30min 240min 100KPa
-35℃ 30min 180min 0.15mbar
-15℃ 30min 480min 0.15mbar
-5℃ 30min 120min 0.11mbar
5℃ 30min 120min 0.11mbar
25℃ 30min 240min 0.15mbar
25℃ 5min 60min 0mbar
实施例6层析试纸条的制备
1)硝酸纤维素膜C/T线的制备
(1)将诺氟沙星用含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白、0.05％(v/v)吐温-20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A。用喷膜机(购自北京金施泰生物工程科技有限公司)将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端2mm处形成检测线T线。
(2)将羊抗兔二抗(购自Elabscience公司)用含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白、0.05％(m/v)吐温20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端4mm处形成质控线C线，质控线与检测线相隔5mm。
(3)将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干，室温干燥环境中保存备用。
2)试纸条的组装
在硬板纸上依次搭接并粘贴：硝酸纤维素膜、玻璃纤维素垫、划有检测线T线的硝酸纤维素膜、划有质控线C线的硝酸纤维素膜、滤纸、样品垫以及吸水纸。组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，即得层析试纸条。将该层析试纸条放入干燥的塑料小桶中密封保存，保质期可达一年以上。
实施例7喹诺酮类抗生素的检测
A、检测时间的优化
(1)将实施例5制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到96孔可拆卸微孔酶标板(购自CORNING公司)的孔中。
(2)再取100μL待测样品加入步骤(1)的96孔可拆卸微孔酶标板的孔中。
(3)向步骤(2)的孔中插入若干张实施例6制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到步骤(2)的孔的液体中1cm，分别浸入1min、3min、5min和7min后插入便携式荧光读数仪(购自南京微测生物科技有限公司)中即可读数，通过内置的标准曲线即可给出定量的检测结果。
结果发现，只有当浸入的时间为5min时，该层析试纸条对喹诺酮类抗生素的检测效果最为准确、可靠。
B、层析试纸条接触待测样品距离的优化
(1)将实施例5制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到96孔可拆卸微孔酶标板(购自CORNING公司)的孔中。
(2)再取100μL待测样品加入步骤(1)的96孔可拆卸微孔酶标板的孔中。
(3)向步骤(2)的孔中插入若干张实施例6制备的层析试纸条，样品垫一端分别浸入到步骤(2)的孔的液体中0.1cm、0.3cm、0.5cm、0.7cm和1cm，浸入3min后插入便携式荧光读数仪(购自南京微测生物科技有限公司)中即可读数，通过内置的标准曲线即可给出定量的检测结果。
结果发现，只有当层析试纸条接触待测样品距离为0.5cm时，该层析试纸条对喹诺酮类抗生素的检测效果最为准确、可靠。
实施例8喹诺酮类抗生素的检测
A、检测步骤
(1)将实施例5制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到96孔可拆卸微孔酶标板(购自CORNING公司)的孔中。
(2)再取100μL待测样品加入步骤(1)的96孔可拆卸微孔酶标板的孔中。
(3)向步骤(2)的孔中插入实施例6制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到步骤(2)的孔的液体中0.5cm，5min后插入便携式荧光读数仪(购自南京微测生物科技有限公司)中即可读数，通过内置的标准曲线即可给出定量的检测结果。
B、准确性测试
(1)向经高效液相色谱质谱联用仪(购自南京科捷分析仪器有限公司)检测喹诺酮类抗生素含量为0的去离子水中添加喹诺酮类抗生素，使其浓度分别达到0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL和640ng/mL，通过步骤A的检测方法进行检测。
(2)将步骤(1)重复实验15次。
结果表明：层析试纸条对样品中的喹诺酮类抗生素的定量限为7ng/mL，定量线性范围在7-700ng/mL内，样品添加回收率均在100％～110％以内，完全满足定量检测的需要。其灵敏度比用喹诺酮类抗生素单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条要高12倍以上。
对比例1
A、不同纳米荧光微球荧光强度的比较
反应液A中聚苯乙烯微球的密度约为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入：
①、0.1M三氯化镝80μL、0.1M三氯化铽20μL、0.1Mβ-二酮(β-NTA)400μL、0.1M三辛基氧化膦(TOPO)300μL；
②、0.1M三氯化镝50μL、0.1M三氯化铽50μL、0.1Mβ-二酮(β-NTA)400μL、三辛基氧化膦(TOPO)250μL和0.1M菲罗啉250μL；
加热至60℃恒温搅拌避光反应8小时，然后降至室温反应1.5小时，得反应液B。
其余所有步骤和条件均与实施例2完全一致。从而依次得到纳米荧光微球①和纳米荧光微球②。
将实施例2、8制得的纳米荧光微球和上述纳米荧光微球进行荧光强度的比较，结果见表2。
表2荧光强度的检测
其中，表2中荧光强度的定义为一个纳米微球激发后所产生的荧光强度相当于单个游离镝离子螯合物的所产生荧光强度的倍数。
B、准确性测试
(1)将步骤A制备的纳米荧光微球①和纳米荧光微球②按照实施例3～5的步骤，依次获得相应的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体。
(2)将步骤(1)所得的相应的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体按照实施例6、8的步骤，对待测样品进行准确性测试。
(3)将步骤(2)中各个纳米荧光微球对应的冻干的抗体进行重复实验15次。结果如表3所示。
表3准确性测试结果
使用的纳米荧光微球 定量限(ng/mL) 定量线性范围(ng/mL) 样品添加回收率
纳米荧光微球① 15 15-705 80％～100％
纳米荧光微球② 18 18-760 86％～110％
实施例2制得的 10 10-820 90％～120％
表3的结果说明，当纳米荧光微球本身的制备原料中同时含有特定比例的铽、镝时，其最终检测喹诺酮类抗生素的定量限最小——检测灵敏度最高；定量线性范围最大——检测范围最广；样品添加回收率最高——检测稳定可靠。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (7)

1.一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：
(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；
(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为1∶4∶3；所述稀土元素离子为铽离子和镝离子；
(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和喹诺酮类抗生素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；
(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；
(5)利用喹诺酮类抗生素制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；
(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；
(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；
(8)向步骤(7)的孔中插入步骤(5)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到所述孔中的液体，浸入后插入荧光读数仪中读数，得到检测结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将10mM苯乙烯单体和0.95mM丙烯酸单体溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀；
用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃，加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温；
将反应液用whatman 2v滤纸过滤，用截留分子量25,000Da的透析袋对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％叠氮钠后4℃保存，所述百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述β-二酮体类螯合物为β-萘甲酰三氟丙酮；和/或，所述荧光增强协同剂为三辛基氧化膦和/或菲罗啉。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纳米荧光微球由包括以下步骤的方法制得：
取步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，得反应液A；
使反应液A中羧基化的聚苯乙烯微球的密度为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化镝50μL、0.1M三氯化铽50μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮400μL、0.1M三辛基氧化膦150μL和0.1M菲罗啉150μL，加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B；
将反应液B通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，对去离子水透析5天，去除其余剩余小分子物质，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存，所述百分比为质量百分比。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(2)制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL，400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ；
将反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01M pH 8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀，重复离心步骤2次，即得活化的荧光微球；
将活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg喹诺酮类抗生素单克隆抗体，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ；
将反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀，将该沉淀复溶于含1.5％海藻糖和2％牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，所述百分比为质量体积百分比。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述冻干的纳米荧光微球标记的喹诺酮类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-喹诺酮类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针用冻干稀释液分别依次稀释20倍和30倍，得稀释液A和稀释液B，所述冻干稀释液为含有6％蔗糖、4％牛血清白蛋白、1％甘露醇的0.05M pH 7.4的PBPS缓冲液，所述百分比为质量百分比；
将所述稀释液A和稀释液B按1:1的体积比混匀后冷冻真空干燥。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述层析试纸条由包括以下步骤的方法制得：
将喹诺酮类抗生素用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温-20的0.01MpH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A，用喷膜机将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端2mm处形成检测线T线，所述百分比为质量体积百分比；
将羊抗兔二抗用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端4mm处形成质控线C线，质控线与检测线相隔5mm，所述百分比为质量体积百分比；
将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干；
在硬板纸上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维素垫、划有检测线T线的硝酸纤维素膜、划有质控线C线的硝酸纤维素膜、滤纸、样品垫以及吸水纸，再剪切成4mm宽的试纸条。
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