CN107656079A - 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法 - Google Patents

一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107656079A
CN107656079A CN201610590297.0A CN201610590297A CN107656079A CN 107656079 A CN107656079 A CN 107656079A CN 201610590297 A CN201610590297 A CN 201610590297A CN 107656079 A CN107656079 A CN 107656079A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoparticle
sulfa antibiotics
probe
fluorescent microspheres
monoclonal antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610590297.0A
Other languages
English (en)
Inventor
庄捷
张玲
杨小如
梁俊
张琪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI SUYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
SHANGHAI SUYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI SUYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical SHANGHAI SUYUAN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201610590297.0A priority Critical patent/CN107656079A/zh
Publication of CN107656079A publication Critical patent/CN107656079A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9446—Antibacterials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明公开了一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法，其包括以下的步骤：制备羧基化聚苯乙烯纳米微球、制备纳米荧光微球；其中，稀土元素离子、β‑二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为2∶3∶3；所述稀土元素离子为Nd3+和Tb3+、制备纳米微球时间分辨荧光‑磺胺类抗生素探针、制备层析试纸条、利用上述探针和层析试纸条检测磺胺类抗生素。该检测方法检测灵敏度高，检测范围广，稳定可靠，拥有良好的商业化应用前景。

Description

一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的 方法
技术领域
本发明属于检测技术领域，具体涉及一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法。
背景技术
时间分辨荧光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是上世纪80年代提出的一种较为新型的检测手段，TRFIA是用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要)在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生反应后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。TRFIA与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、生物学科研检测以及环境检测等方面有较为广泛的应用。
由于稀土元素络合物的荧光强度都较低，因此需要采用荧光增强技术来提高检测灵敏度。目前，根据信号增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型，解离再增强技术、CyberFluor系统和基于纳米微球的TRFIA(Nano-TRFIA)。其中，Nano-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了稀土元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将稀土元素及其配合物共同掺杂在纳米及微球上，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围。
磺胺类抗生素为人工合成的抗菌药，用于临床已近50年，它具有抗菌谱较广、性质稳定、使用简便、生产时不耗用粮食等优点。特别是1969年 抗菌增效剂——甲氧苄氨嘧啶(TMP)发现以后，与磺胺类抗生素联合应用可使其抗菌作用增强、治疗范围扩大，因此，虽然有大量抗生素问世，但磺胺类药仍是重要的化学治疗药物。目前亟待获得快速、简便、可靠、准确地检测磺胺类抗生素的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题就是针对现有的、缺乏快速、简便、可靠、准确地检测磺胺类抗生素的方法不足，提供一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法。所述的方法能够快速、可靠、准确地检测磺胺类抗生素的含量，并且灵敏度高、重复性好、稳定性高、节约时间。该方法能够广泛用于商业化对磺胺类抗生素的检测。
本发明通过对纳米微球时间分辨荧光探针的结构，尤其对其组成部分纳米荧光微球的制备原料中稀土元素离子、β-二酮类螯合剂和荧光增强协同剂的摩尔比特殊选择为2∶3∶4，对稀土元素离子特异性选择为钕离子和铽离子，使制备的纳米荧光微球的荧光强度极大，有利于提高利用含有该纳米荧光微球的纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素含量的灵敏度、准确性和可靠性。
本发明的技术方案是：一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法，其包括以下的步骤：
(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；
(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为2∶3∶3，所述稀土元素离子为Nd3+和Tb3+；
(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和磺胺类抗生素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；
(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针 和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；
(5)利用磺胺类抗生素制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；
(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；
(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；
(8)向步骤(7)的酶标板的孔中插入步骤(5)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到所述孔中的液体，浸入后插入荧光读数仪中读数，得到检测结果。
本发明中，所述磺胺类抗生素为本领域常规的磺胺类抗生素，较佳地为磺胺异恶唑(SIZ)、磺胺二甲嘧啶(SM2)、磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲恶唑(SMZ)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、柳氮磺吡啶(SASP)、磺胺米隆(SML)、磺胺嘧啶银和磺胺醋酰(SA)。
本发明中，较佳地，步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将10mM苯乙烯单体和0.95mM丙烯酸单体溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀；
用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃。加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温；
将反应液用whatman 2v滤纸过滤，用截留分子量25,000Da的透析袋对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％叠氮钠后4℃保存，所述百分比为质量百分比。
本发明步骤(2)中，所述稀土元素离子为本领域常规的稀土元素离子，较佳地为铽离子和/或铽离子。所述β-二酮体类螯合物为本领域常规的β-二酮体类螯合物，较佳地为β-萘甲酰三氟丙酮。所述荧光增强协同剂为本领 域常规的荧光增强协同剂，较佳地为三辛基氧化膦和/或菲罗啉。
更佳地，步骤(2)所述纳米荧光微球由包括以下步骤的方法制得：
取步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，得反应液A；
使反应液A中羧基化的聚苯乙烯微球的密度为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化钕100μL、0.1M三氯化铽100μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮300μL、0.1M三辛基氧化膦200μL和0.1M菲罗啉200μL，加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B；
将反应液B通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，对去离子水透析5天，去除其余剩余小分子物质，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存，所述百分比为质量百分比。
本发明中，较佳地，步骤(3)所述纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(2)制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL。400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ；
将反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀。用0.01M pH 8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀。重复离心步骤2次，即得活化的荧光微球；
将活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg磺胺类抗生素单克隆抗体，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ；
将反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀。将该沉淀复溶于含1.5％海藻糖和2％牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，较佳地，所述纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针的制备方法与所述纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针的制备方法相同，仅将磺胺类抗生素单克隆抗体替换为兔IgG单克隆抗体。
本发明中，较佳地，步骤(4)所述冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针用冻干稀释液分别依次稀释20倍和30倍，得稀释液A和稀释液B，所述冻干稀释液为含有6％蔗糖、4％牛血清白蛋白、1％甘露醇的0.05M pH 7.4的PBPS缓冲液，所述百分比为质量百分比；
将所述稀释液A和稀释液B按1:1的体积比混匀后冷冻真空干燥。
本发明中，较佳地，步骤(5)所述层析试纸条由包括以下步骤的方法制得：
将磺胺类抗生素用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温-20的0.01MpH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A，用喷膜机将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端2mm处形成检测线T线，所述百分比为质量体积百分比；
将羊抗兔二抗用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端4mm处形成质控线C线，质控线与检测线相隔5mm，所述百分比为质量体积百分比；
将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干；
在硬板纸上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维素垫、划有检测线T线的硝酸纤维素膜、划有质控线C线的硝酸纤维素膜、滤纸、样品垫以及吸水纸，再剪切成4mm宽的试纸条。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明提供的检测方法检测灵敏度高，其定量限能够最小至10ng/mL；该检测方法的检测范围广，其定量线性范围能 够达到10-1000ng/mL；该检测方法检测稳定可靠，其样品添加回收率高达110-130％。此外，该检测方法操作简便易行，仅需5分钟就能获得准确、可靠的测定结果，拥有良好的商业化应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述常温的含义为本领域常规的常温的含义，能够进行实施例中所记载的反应即可。较佳地为15～30℃。
实施例中所述的磺胺类抗生素可为本领域常规的磺胺类抗生素，能够进行实施例中所记载的反应即可。较佳地，实施例中采用磺胺米隆，购自武汉市合中生化制造有限公司。
实施例1羧基化聚苯乙烯纳米微球的制备
将10mM苯乙烯单体(购自德国巴斯夫公司)和0.95mM丙烯酸单体(购自德国巴斯夫公司)溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀。然后用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃。加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温，然后将反应液用whatman 2v滤纸(购自whatman公司，孔径8μm)过滤，最后用透析袋(购自美国Spectrum公司，截留分子量25,000Da)对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％(w/w)叠氮钠后，即得羧基化聚苯乙烯纳米微球，将其置于4℃保存。
通过测定，所制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球的直径为55±10nm，表面电荷为220-300μeq/g，羧基密度为20-40sq.A/grp。
实施例2纳米荧光微球的制备
(1)取实施例1中制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液(其中，去离子水和丙酮的体积比为1:1)，得反应液A。
(2)步骤(1)所得的反应液A中聚苯乙烯微球的密度约为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化钕100μL、0.1M三氯化铽100μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮300μL、0.1M三辛基氧化膦200μL和0.1M菲罗啉200μL。加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B。
(3)将步骤(2)所得的反应液B通过减压蒸馏方式去除其中的有机溶剂。再用去离子水透析5天，去除其中剩余的其他小分子物质，收集透析袋(购自美国Spectrum公司，截留分子量10,000Da)内液体，加入0.05％(w/w)叠氮钠后，将其置于4℃保存，即得纳米荧光微球。该纳米荧光微球中包裹了铽离子螯合物和铽离子螯合物。
通过测试和计算(参照GB/T 21883-2008披露的方法)，平均每个步骤(3)所得的纳米荧光微球中包裹的铽离子螯合物的数量为30万个。
实施例3纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体的制备
(1)取实施例2中制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL。400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺(EDC)200μL，得反应液Ⅰ。
(2)将步骤(1)所得的反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀。用0.01M pH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀。重复步骤(2)所述的离心步骤2次，即得活化的荧光微球。
(3)将步骤(2)所得的活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg磺胺米隆单克隆抗体(参照杜玉玲等，磺胺母核单克隆抗体的制备及其免疫学特性研究，2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集，2012中记载的制备方法制得)，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ。
(4)将步骤(3)所得的反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀。将该沉淀复溶于含1.5％(m/v)海藻糖和2％(m/v)牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体，置于 4℃保存备用。
实施例4纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体的制备
(1)取实施例2中制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL。400w超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ。
(2)将步骤(1)所得的反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀。用0.01M pH8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀。重复步骤(2)所述的离心步骤2次，即得活化的荧光微球。
(3)将步骤(2)所得的活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入600μg兔IgG单克隆抗体(购自上海吉奉生物科技有限公司)，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅲ。
(4)将步骤(3)所得的反应液Ⅲ12000g离心10分钟，收集沉淀。将该沉淀复溶于含1.5％(m/v)海藻糖和2％(m/v)牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，即得纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体，置于4℃保存备用。
实施例5纳米荧光微球标记的单克隆抗体的冻干
(1)将实施例3制备的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和实施例4中制备的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体(又可分别称为“纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针”和“纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针”)用冻干稀释液(含6％蔗糖、4％牛血清白蛋白、1％甘露醇的0.05MpH 7.4的PBPS缓冲液，所述百分比为质量百分比)分别依次稀释20倍和30倍，得稀释液A和稀释液B。
(2)将步骤(1)制备的稀释液A和稀释液B按1:1(v/v)混合均匀，以100μL每孔分装于96孔可拆卸微孔板中，采用冷冻真空干燥方式将其干燥(冻干工艺见表1)，即得冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体，可用硅胶塞密封保存。
表1冻干工艺
温度 调节时间 保持时间 压力
-55℃ 30min 240min 100KPa
-35℃ 30min 180min 0.15mbar
-15℃ 30min 480min 0.15mbar
-5℃ 30min 120min 0.11mbar
5℃ 30min 120min 0.11mbar
25℃ 30min 240min 0.15mbar
25℃ 5min 60min 0mbar
实施例6层析试纸条的制备
1)硝酸纤维素膜C/T线的制备
(1)将磺胺米隆用含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白、0.05％(v/v)吐温-20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A。用喷膜机(购自北京金施泰生物工程科技有限公司)将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端2mm处形成检测线T线。
(2)将羊抗兔二抗(购自Elabscience公司)用含1.5％(m/v)海藻糖、2％(m/v)牛血清白蛋白、0.05％(m/v)吐温20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端4mm处形成质控线C线，质控线与检测线相隔5mm。
(3)将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干，室温干燥环境中保存备用。
2)试纸条的组装
在硬板纸上依次搭接并粘贴：硝酸纤维素膜、玻璃纤维素垫、划有检测线T线的硝酸纤维素膜、划有质控线C线的硝酸纤维素膜、滤纸、样品垫以及吸水纸。组装完毕后剪切成4mm宽的试纸条，即得层析试纸条。将该层析试纸条放入干燥的塑料小桶中密封保存，保质期可达一年以上。
实施例7磺胺类抗生素的检测
A、检测步骤
(1)将实施例5制备的冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到96孔可拆卸微孔酶标板(购自CORNING公司)的孔中。
(2)再取100μL待测样品加入步骤(1)的96孔可拆卸微孔酶标板的孔中。
(3)向步骤(2)的孔中插入实施例6制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到步骤(2)的孔的液体中0.5cm，5min后插入便携式荧光读数仪(购自南京微测生物科技有限公司)中即可读数，通过内置的标准曲线即可给出定量的检测结果。
B、准确性测试
(1)向经高效液相色谱质谱联用仪(购自南京科捷分析仪器有限公司)检测磺胺类抗生素含量为0的去离子水中添加磺胺类抗生素，使其浓度分别达到0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL、160ng/mL、320ng/mL和640ng/mL，通过步骤A的检测方法进行检测。
(2)将步骤(1)重复实验15次。
结果表明：层析试纸条对样品中的磺胺类抗生素的定量限为10ng/mL，定量线性范围在10-1000ng/mL内，样品添加回收率均在110％～130％以内，完全满足定量检测的需要。其灵敏度比用磺胺类抗生素单克隆抗体制备的胶体金免疫层析试纸条要高10倍以上。
对比例1
A、不同纳米荧光微球荧光强度的比较
反应液A中聚苯乙烯微球的密度约为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入：
①、0.1M三氯化铕200μL、0.1Mβ-二酮(β-NTA)300μL、0.1M三辛基氧化膦(TOPO)400μL；
②、0.1M三氯化铽200μL、0.1Mβ-二酮(β-NTA)300μL、三辛基氧化膦(TOPO)150μL和0.1M菲罗啉150μL；
加热至60℃恒温搅拌避光反应8小时，然后降至室温反应1.5小时，得反应液B。
其余所有步骤和条件均与实施例2完全一致。从而依次得到纳米荧光微球①和纳米荧光微球②。
将实施例2、8制得的纳米荧光微球和上述纳米荧光微球进行荧光强度的比较，结果见表2。
表2荧光强度的检测
其中，表2中荧光强度的定义为一个纳米微球激发后所产生的荧光强度相当于单个游离铽离子螯合物的所产生荧光强度的倍数。
B、准确性测试
(1)将步骤A制备的纳米荧光微球①和纳米荧光微球②按照实施例3～5的步骤，依次获得相应的冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体。
(2)将步骤(1)所得的相应的冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体按照实施例6、8的步骤，对待测样品进行准确性测试。
(3)将步骤(2)中各个纳米荧光微球对应的冻干的抗体进行重复实验15次。
结果发现，当纳米荧光微球本身的制备原料同实施例2所述的情况时，其最终检测磺胺类抗生素的定量限最小——检测灵敏度最高；定量线性范围最大——检测范围最广；样品添加回收率最高——检测稳定可靠。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

Claims (7)

1.一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：
(1)制备羧基化聚苯乙烯纳米微球；
(2)利用步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，制备纳米荧光微球；所述纳米荧光微球中，稀土元素离子、β-二酮体类螯合物和荧光增强协同剂的摩尔比为2∶3∶3，所述稀土元素离子为Nd3+和Tb3+；
(3)利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和磺胺类抗生素单克隆抗体，制备纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针；利用步骤(2)制备的纳米荧光微球和兔IgG单克隆抗体制备纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针；
(4)冻干步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针，得到冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体；
(5)利用磺胺类抗生素制备检测线T线，利用羊抗兔二抗制备质控线C线，喷涂、组装获得层析试纸条；
(6)将步骤(4)制备的冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体加入到酶标板的孔中；
(7)取待测样品加入步骤(6)的酶标板的孔中；
(8)向步骤(7)的酶标板的孔中插入步骤(5)制备的层析试纸条，样品垫一端浸入到所述孔中的液体，浸入后插入荧光读数仪中读数，得到检测结果。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述羧基化聚苯乙烯纳米微球，由包括以下步骤的方法制得：
将10mM苯乙烯单体和0.95mM丙烯酸单体溶解于10mL含0.45mM十二烷基磺酸钠的去离子水中，再加入圆底烧瓶，用磁力搅拌子搅拌均匀；
用高纯氮气将圆底烧瓶中的空气除尽，密封加热至70℃，加入0.15mM过硫酸钾0.5mL，密封隔氧搅拌反应8小时后，降至室温；
将反应液用whatman 2v滤纸过滤，用截留分子量25,000Da的透析袋对去离子水透析5天，收集透析袋内液体，加入0.05％叠氮钠后4℃保存，所述百分比为质量百分比。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述β-二酮体类螯合物为β-萘甲酰三氟丙酮；和/或，所述荧光增强协同剂为三辛基氧化膦和/或菲罗啉。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述纳米荧光微球由包括以下步骤的方法制得：
取步骤(1)制备的羧基化聚苯乙烯纳米微球，加入10mL去离子水和丙酮混合液，所述去离子水和所述丙酮的体积比为1:1，得反应液A；
使反应液A中羧基化的聚苯乙烯微球的密度为1×1014个/mL，搅拌均匀，依次加入0.1M三氯化钕100μL、0.1M三氯化铽100μL、0.1Mβ-萘甲酰三氟丙酮300μL、0.1M三辛基氧化膦200μL和0.1M菲罗啉200μL，加热至60℃恒温搅拌避光反应10小时，然后降至室温反应2小时，得反应液B；
将反应液B通过减压蒸馏方式将溶液中的有机溶剂去除，对去离子水透析5天，去除其余剩余小分子物质，收集透析袋内液体，加入0.05％的叠氮钠4℃保存，所述百分比为质量百分比。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(2)制备的纳米荧光微球，溶于10mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，使荧光微球密度约为1.0×1012个/mL，400W超声处理30秒，然后缓慢加入15mg/mL的碳二亚胺200μL，得反应液Ⅰ；
将反应液Ⅰ在室温条件下匀速搅拌温育15分钟后，150000g离心10分钟，收集沉淀，用0.01M pH 8.0的硼酸缓冲液反复洗涤沉淀，重复离心步骤2次，即得活化的荧光微球；
将活化的荧光微球复溶于5mL 0.01M pH8.0的硼酸缓冲液中，加入250μg磺胺类抗生素单克隆抗体，4℃搅拌反应12小时，得反应液Ⅱ；
将反应液Ⅱ12000g离心10分钟，收集沉淀，将该沉淀复溶于含1.5％海藻糖和2％牛血清白蛋白的、0.01M pH7.4的磷酸缓冲液中，所述百分比为质量体积百分比。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述冻干的纳米荧光微球标记的磺胺类抗生素单克隆抗体和和冻干的纳米荧光微球标记的兔IgG单克隆抗体由包括以下步骤的方法制得：
将步骤(3)制备的纳米微球时间分辨荧光-磺胺类抗生素探针和纳米微球时间分辨荧光-兔IgG探针用冻干稀释液分别依次稀释20倍和30倍，得稀释液A和稀释液B，所述冻干稀释液为含有6％蔗糖、4％牛血清白蛋白、1％甘露醇的0.05M pH 7.4的PBPS缓冲液，所述百分比为质量百分比；
将所述稀释液A和稀释液B按1:1的体积比混匀后冷冻真空干燥。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述层析试纸条由包括以下步骤的方法制得：
将磺胺类抗生素用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温-20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度0.1mg/mL，得喷膜液A，用喷膜机将喷膜液A喷涂在距硝酸纤维素膜左端2mm处形成检测线T线，所述百分比为质量体积百分比；
将羊抗兔二抗用含1.5％海藻糖、2％牛血清白蛋白、0.05％吐温20的0.01M pH7.4的磷酸缓冲溶解至终浓度1.0mg/mL，得喷膜液B，用喷膜机将喷膜液B喷涂在距硝酸纤维素膜右端4mm处形成质控线C线，质控线与检测线相隔5mm，所述百分比为质量体积百分比；
将喷涂好的硝酸纤维素膜置于25℃恒温真空干燥箱中烘干；
在硬板纸上依次搭接并粘贴硝酸纤维素膜、玻璃纤维素垫、划有检测线T线的硝酸纤维素膜、划有质控线C线的硝酸纤维素膜、滤纸、样品垫以及吸水纸，再剪切成4mm宽的试纸条。
CN201610590297.0A 2016-07-25 2016-07-25 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法 Pending CN107656079A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610590297.0A CN107656079A (zh) 2016-07-25 2016-07-25 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610590297.0A CN107656079A (zh) 2016-07-25 2016-07-25 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107656079A true CN107656079A (zh) 2018-02-02

Family

ID=61126388

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610590297.0A Pending CN107656079A (zh) 2016-07-25 2016-07-25 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107656079A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109781691A (zh) * 2019-02-28 2019-05-21 渤海大学 一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法
CN109916873A (zh) * 2019-04-11 2019-06-21 江西农业大学 时间分辨同步荧光法同时检测水中硫酸新霉素和磺胺二甲基嘧啶含量的方法
CN110133257A (zh) * 2019-02-28 2019-08-16 上海健耕医药科技股份有限公司 一种快速检测他克莫司的时间分辨荧光免疫层析试剂条
CN110672843A (zh) * 2019-10-30 2020-01-10 南京海关动植物与食品检测中心 一种用于定量测定磺胺类药物的五联时间分辨荧光免疫试纸条
CN113933502A (zh) * 2021-10-19 2022-01-14 青岛汉唐生物科技有限公司 一种免疫荧光层析法定量检测叶酸的检测卡及试剂盒

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1614422A (zh) * 2004-11-27 2005-05-11 江南大学 一种检测赭曲霉毒素a的试剂盒及其检测方法
CN102192983A (zh) * 2011-05-19 2011-09-21 博阳生物科技（上海）有限公司 时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用
CN103013492A (zh) * 2011-09-26 2013-04-03 上海优你生物科技股份有限公司 一种纳米微球时间分辨荧光探针及其制备方法和用途
CN103760369A (zh) * 2013-05-03 2014-04-30 上海溯源生物技术有限公司 一种人PAPP-A和Free-β-HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒
CN103760368A (zh) * 2013-05-03 2014-04-30 上海溯源生物技术有限公司 一种AFP和Free-β-HCG荧光双标的定量检测试剂盒
CN103792357A (zh) * 2012-11-05 2014-05-14 江苏维赛科技生物发展有限公司 大观霉素快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条
CN104090248A (zh) * 2013-12-24 2014-10-08 上海容晖生物科技有限公司 铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1614422A (zh) * 2004-11-27 2005-05-11 江南大学 一种检测赭曲霉毒素a的试剂盒及其检测方法
CN102192983A (zh) * 2011-05-19 2011-09-21 博阳生物科技（上海）有限公司 时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条及其制备方法和应用
CN103013492A (zh) * 2011-09-26 2013-04-03 上海优你生物科技股份有限公司 一种纳米微球时间分辨荧光探针及其制备方法和用途
CN103792357A (zh) * 2012-11-05 2014-05-14 江苏维赛科技生物发展有限公司 大观霉素快速时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条
CN103760369A (zh) * 2013-05-03 2014-04-30 上海溯源生物技术有限公司 一种人PAPP-A和Free-β-HCG时间分辨荧光双标的定量检测试剂盒
CN103760368A (zh) * 2013-05-03 2014-04-30 上海溯源生物技术有限公司 一种AFP和Free-β-HCG荧光双标的定量检测试剂盒
CN104090248A (zh) * 2013-12-24 2014-10-08 上海容晖生物科技有限公司 铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109781691A (zh) * 2019-02-28 2019-05-21 渤海大学 一种基于聚苯乙烯纳米荧光微球探针检测氯霉素的方法
CN110133257A (zh) * 2019-02-28 2019-08-16 上海健耕医药科技股份有限公司 一种快速检测他克莫司的时间分辨荧光免疫层析试剂条
CN109916873A (zh) * 2019-04-11 2019-06-21 江西农业大学 时间分辨同步荧光法同时检测水中硫酸新霉素和磺胺二甲基嘧啶含量的方法
CN109916873B (zh) * 2019-04-11 2021-12-24 江西农业大学 时间分辨同步荧光法同时检测水中两种抗生素残留方法
CN110672843A (zh) * 2019-10-30 2020-01-10 南京海关动植物与食品检测中心 一种用于定量测定磺胺类药物的五联时间分辨荧光免疫试纸条
CN113933502A (zh) * 2021-10-19 2022-01-14 青岛汉唐生物科技有限公司 一种免疫荧光层析法定量检测叶酸的检测卡及试剂盒
CN113933502B (zh) * 2021-10-19 2024-02-02 青岛汉唐生物科技有限公司 一种免疫荧光层析法定量检测叶酸的检测卡及试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107656079A (zh) 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测磺胺类抗生素的方法
CN107655864A (zh) 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测四环素的方法
JP2008544246A (ja) 正確な磁気バイオセンサー
CN109239361A (zh) 一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂盒及其制备方法
CN108398562A (zh) 胱抑素c荧光微球免疫层析定量检测试纸条及试纸卡
CN104169710A (zh) 用于时间分辨荧光免疫测定检验的方法和装置
JP2008544246A5 (zh)
CN107656061A (zh) 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测庆大霉素的方法
CN102692504A (zh) D-二聚体荧光免疫定量测定试纸条及其制备方法
JPH0664059B2 (ja) 被検体の濃度の測定方法
CN101595388A (zh) 多分析物免疫分析
CN101819206A (zh) 产前筛查afp测定试剂盒(时间分辨荧光免疫法)及其制备方法
CN101300490A (zh) 多重指向性免疫层析分析
CN106442970A (zh) 一种抗双链DNA抗体IgG化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
CN109444421A (zh) 一种nse检测试纸条的制备方法、试纸条、检测卡及nse检测试剂盒
CN101210922B (zh) 胶体金标记蛋白A检测与SPA的FC片断相结合的哺乳动物血清中IgG总量的方法
CN110455848B (zh) 基于络合反应放大信号的铁离子纵向弛豫时间传感器及其构建方法、用途
CN101762699A (zh) 一种定量检测血液中肿瘤相关抗原125的磁性免疫层析试纸条及制备方法
CN107703110A (zh) 胃泌素17检测试剂盒及其制备方法
CN110133258A (zh) 一种快速检测环孢霉素的时间分辨荧光免疫层析试剂条
CN106872716A (zh) 血清淀粉样蛋白a和降钙素原二合一测定试剂盒及制法
CN107656062A (zh) 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测氯霉素的方法
CN107656049A (zh) 一种利用纳米微球时间分辨荧光探针检测喹诺酮类抗生素的方法
CN108872608A (zh) 一种用于检测犬瘟热病毒抗体的时间分辨荧光免疫试剂盒
Zhang et al. Biological elemental analysis: A cute‐meet of microfluidic device to inductively coupled plasma mass spectrometry

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180202