CN101595388A - 多分析物免疫分析 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了用于测定流体样品中两种或更多种目标分析物的量的方法，以及该方法中使用的试剂盒。该方法涉及确定检测到的一种目标分析物的量与检测到的每种目标分析物的量加上检测到的对照的量的总和的比值，其中，每种目标分析物的量与每种目标分析物的比值正相关或负相关。
Description
相关申请
本申请要求于2006年12月12日提交的美国临时申请No.60/874315的优先权。上述申请的全部教导在此引入作为参考。
背景技术
流体样品、尤其是体内流体样品中细胞和分析物的定量分析通常可以为医生和病人提供重要的诊断和治疗信息。定量免疫分析利用抗原(Ag)-抗体(Ab)反应的特异性来检测和定量样品中Ag或Ab的量。在固相免疫分析中，一种试剂(例如Ag或Ab)附着在固体表面上，以便将已结合的试剂或分析物从游离的试剂或分析物中分离出来。固相暴露于含有分析物的样品中，该分析物与其Ag或Ab相结合；通过测定该结合的程度来测定样品中分析物的浓度。但是，将结合事件转换为可测量的信号受到多种限制因素的影响，包括在固相上微粒运动的约束，这影响了定量免疫分析的特异性与适用性。此外，相关的目标分析物还可能在分析中互相竞争，使得难以正确地评估多于一种的目标分析物的存在。
发明内容
本发明涉及通过使用固相分析(例如夹心免疫分析或抑制免疫分析)来测定流体样品中两种或更多种目标分析物的量的方法，其中目标分析物和捕获试剂分别被作为特异性结合对的一方使用；本发明还涉及该方法中所使用的试剂盒。在本发明的方法中，检测到的一种目标分析物的量的比值与每种目标分析物的比值正相关或负相关。在某些实施方式中，在确定该比值之前，从检测到的每种目标分析物的量和对照的量中减去检测到的背景的量。
本发明的方法使用固相装置，例如侧向流动固相装置或毛细流动装置。在本发明的代表性方法中，固相装置包括一个施加位点、两个或更多个样品捕获区(每个样品捕获区与每种目标分析物相对应)和一个对照捕获区；样品捕获区和对照捕获区可以顺序地(相对于在毛细作用下液体的流动)位于固相装置上；或者，样品捕获区和对照捕获区与施加位点之间的距离大约是等距的。样品捕获试剂(例如与目标分析物相结合的试剂，例如目标分析物的抗体)吸附在每个样品捕获区内，一种样品捕获试剂对应一种目标分析物。对照捕获试剂(例如与分析物结合微粒相结合的试剂，例如抗免疫球蛋白抗体)吸附在对照捕获区内。
本发明还提供了样品收集装置，该装置包含以稳定形式被储存的微粒群，例如脂质体、胶体金或有机聚合物乳胶微粒。在本发明的夹心免疫分析中，微粒是由对应于目标分析物的结合试剂(例如抗体)涂覆的、或由对应于多种目标分析物的结合试剂涂覆的分析物结合微粒；或者，使用不同的分析物结合微粒群，每群由对应于一种目标分析物的结合试剂涂覆。在竞争或抑制分析中，微粒为由目标分析物涂覆或者由多种目标分析物涂覆的“分析物涂覆的”微粒；或者使用不同的分析物涂覆的微粒群，每群由一种目标分析物涂覆。在任一种类型的分析中，都可以使用比色、荧光、发光、化学发光或其它适合的标记物对微粒进行标记，以便于检测。
在这些方法的一个实施方式中，向样品收集装置中引入用于评估两种或更多种目标分析物的流体样品，随后将缓冲液引入混合的流体样品中。在这些方法的另一个实施方式中，向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入用于评估目标分析物的流体样品。在这些方法的第三个实施方式中，流体样品是通过将固体引入缓冲液中而形成的，随后将该流体样品引入样品收集装置中。在这些实施方式的任一实施方式中，产生了包含微粒的缓冲的、混合的流体样品。
在夹心分析中，样品中存在的目标分析物与分析物结合微粒相互作用，结果造成在混合的流体样品中形成了接触的分析物结合微粒。将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上。然后将该固相装置维持在一定条件下，该条件足以允许流体的毛细作用将微粒转运到和穿过样品捕获区，以及将微粒转运到和穿过对照捕获区。样品捕获试剂与接触的分析物结合微粒相互作用，结果造成微粒在样品捕获区被捕获。流体的毛细作用还可以使接触的分析物结合微粒流动起来，不仅使其到达和穿过样品捕获区，还可以使其到达和穿过对照捕获区，在该区内微粒与对照捕获试剂相结合。然后确定每个样品捕获区和对照捕获区内捕获的分析物结合微粒的量。
然后再确定流体样品中目标分析物的量。例如，流体样品中目标分析物的量可以被确定为1)在对应于目标分析物的样品捕获区内被捕获的分析物结合微粒的量与2)在所有的样品捕获区内和对照捕获区内的分析物结合微粒的总量之间的比值。在另一个实施方式中，若需要，在确定比值之前，在每个样品捕获区和对照捕获区内检测到的微粒的量中分别减去检测到的背景的量。
在竞争或抑制型分析中，将缓冲的、混合的流体样品施加在固相装置的施加位点上。然后将固相装置维持在一定条件下，该条件足以允许流体的毛细作用将分析物涂覆的微粒转运到和穿过样品捕获区，以及将分析物涂覆的微粒转运到或者穿过对照捕获区，在该区内分析物涂覆的微粒与对照捕获试剂相结合。样品捕获试剂与分析物涂覆的微粒相互作用；样品捕获试剂与分析物涂覆的微粒的相互作用导致了分析物涂覆的微粒在样品捕获区内被捕获。由于在样品捕获区内存在分析物涂覆的微粒和样品中分析物(如果存在的话)之间对于样品捕获试剂中结合位点的竞争，在样品捕获区内被捕获的分析物涂覆的微粒的量与样品中分析物的量成反比。然后确定在样品捕获区和对照捕获区内被捕获的分析物涂覆的微粒的量。
然后再确定在流体样品中的目标分析物的量。例如，在流体样品中的目标分析物的量与1)在与目标分析物相对应的样品捕获区内被捕获的分析物涂覆的微粒的量和2)在所有的样品捕获区和对照捕获区内的分析物涂覆的微粒的总量之间的比值负相关。在另一实施方式中，若需要，在确定比值之前，在每个样品捕获区和对照捕获区内检测到的微粒的量分别减去检测到的背景的量。
具体实施方式
本发明的示例实施方式描述如下。本文引用的所有专利、公开申请和参考文献的教导在此完整引入作为参考。
本发明涉及通过使用固相分析来定量测定两种或更多种目标分析物的量的方法，以及所使用的试剂盒。本发明的固相分析是侧向流动固相分析或毛细流动固相分析。
此处所使用的分析是指用于确定分析物的存在、缺失或量的样品分析的体外过程。本发明的分析使用至少两种目标分析物以及与其相对应的分析物结合试剂。每种目标分析物及其分析物结合试剂是特异性结合对的成员，其中，结合对的第一个成员(例如分析物)特异性地与第二个成员(例如结合试剂)反应。结合对中的一个或两个成员可以是抗体。例如，结合对的第一个成员(例如目标分析物)可以是抗体，结合对的第二个成员(例如结合试剂)可以是抗免疫球蛋白抗体；或者，结合对的第一个成员(例如分析物)可以是抗原，结合对的第二个成员(例如结合试剂)可以是抗体。
在一个实施方式中，该分析是使用抗体作为其程序组分的免疫分析。在一个优选的实施方式中，免疫分析是测试分析物的夹心分析，其中，待评估其分析物的存在、缺失或量的流体样品与涂覆有分析物结合试剂(例如分析物的抗体)的微粒相接触，将所得到的混合物施加到固相上，随后在毛细作用下穿过固相移动。在固相捕获区内检测到分析物和分析物结合试剂涂覆的微粒之间的相互作用显示为阳性结果，在捕获区内分析物结合试剂涂覆的微粒的量与流体样品中分析物的量相关。在另一个优选实施方式中，免疫分析是测试分析物的抑制或竞争分析，其中，待评估其分析物的存在、缺失或量的流体测试样品与涂覆有分析物的微粒相接触，将所得到的混合物施加在固相上，随后在毛细作用下穿过固相移动。在固相捕获区内检测到分析物结合试剂和分析物涂覆的微粒之间的相互作用显示为阳性结果，在捕获区内分析物涂覆的微粒的量与流体样品中分析物的量负相关。
在本发明的分析的其它实施方式中，特异性结合对中的分析物和结合试剂都不是抗体：例如，结合对的第一个成员可以是配体，结合对的第二个成员可以是受体；或者，结合对的第一个成员可以是凝集素，结合对的第二个成员可以是糖。在另一个实施方式中，结合对的第一个成员可以是核酸(例如DNA、RNA)，结合对的第二个成员可以是与结合对的第一个成员特异性杂交的核酸。此处所使用的特异性杂交是指第一个核酸与第二个核酸杂交的能力，并且杂交的方式为第一个核酸除了与第二个核酸杂交之外不与其它任何核酸杂交(例如，当与进行杂交的样品中的其它任何核酸相比，第一个核酸与第二个核酸具有更高的相似度时)。杂交的“严格性条件”是一个技术术语，指的是允许特定的核酸与第二个核酸杂交的温育和洗涤条件，例如温度和缓冲液浓度条件；第一个核酸与第二个核酸可以是完全(即100％)互补的，或者第一个核酸和第二个核酸可以共有一定程度的、低于完全互补的互补性(例如70％、75％、80％、85％、90％、95％)。例如，可以使用某些高严格性条件来区别完全互补的核酸和那些低互补性的核酸。用于核酸杂交的“高严格性条件”、“中等严格性条件”和“低严格性条件”在Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons，(1998)，其全部教导在此引入作为参考)的2.10.1～2.10.16页和6.3.1～6.3.6页中已做解释。决定杂交严格性的确切条件不仅取决于离子强度(例如0.2×SSC、0.1×SSC)、温度(例如室温、42℃、68℃)，以及去稳定试剂(例如甲酰胺)或变性试剂(例如SDS)的浓度，还取决于例如核酸序列的长度、碱基组成、杂交序列间的错配百分比和在其它不同序列中出现该序列子集的频率这些因素。因此，在保持两个核酸分子的相同性或相似性的程度相似的同时，可以通过改变一个或多个这些参数来确定等效条件。
无论分析物及其结合试剂的组成如何，这两种成分形成了特异性的结合对，其中，第一个成员特异性地与第二个成员反应。结合对成员之间的特异性相互作用是指结合对的第一个成员优先与结合对的第二个成员相结合或者以其它方式相互作用，优选地，不与分析中的其它化合物相结合。
此处所使用的术语分析物或目标分析物是指上述结合对中的第一个成员。分析物是其量待测的分子或化合物。分析物的形式可以是例如干物质(例如粉末、颗粒；孢子；或其它微粒)的固体，或者也可以是流体形式(例如上述固体溶于或悬浮于流体中，或者其它液体样品)。分析物的例子包括细菌、孢子、例如激素或酶的蛋白质、糖蛋白、肽、小分子、多糖、抗体、核酸、药物、毒素(例如环境毒素)、病毒或病毒微粒、细胞壁的部分和其它化合物。在优选实施方式中，每种分析物为“免疫原性的”，表示可以对该分析物或与载体结合的该分析物(例如，半抗原-载体偶联物，可以产生针对半抗原的抗体)产生抗体(如下所述)。在一些代表性的实施方式中，第一个目标分析物可以是甲型流感病毒，第二个目标分析物可以是乙型流感病毒。目标分析物可以在液体样品中；或者，目标分析物可以在干(非流体)样品(例如固体，例如颗粒样品、粉末样品，或土壤样品)中。每种目标分析物是上述结合对中的第一个成员，即每种目标分析物特异性地与结合对中的第二个成员反应。
在本发明的方法中，评估流体样品中两种或更多种目标分析物的存在、缺失或量。流体可以是将固相材料湿润的流体；其支持每种目标分析物与其分析物结合试剂之间的反应，例如抗体/抗原反应(即不干扰抗体/抗原相互作用)；其具有足以允许流体通过毛细作用而移动的低粘性。在一个优选实施方式中，流体是水溶液(例如体液)。流体样品可以是含有相对少的成分的流体，例如含有目标分析物的水溶液；或者，流体样品可以是含有多种成分的流体，例如复合环境样品(例如污水、废水、地下水，或其它水样品)，或者是复合生物流体(例如全血、血浆、血清、尿液、脑脊髓液、唾液、精液、玻璃状液、滑液，或其它生物流体)。在一个流体是生物流体的优选实施方式中，流体是全血、血浆或血清。在另一个流体是生物流体的实施方式中，流体是粘膜液。若需要，可以将流体样品稀释；例如，如果复合生物流体被作为流体样品使用，则该流体可以使用溶液(例如水溶液)进行稀释。
如果一种目标分析物不在溶液中(例如目标分析物在上述的干或固体样品中)，可以先将其提取、悬浮或溶解到流体样品中。例如，如果目标分析物是核酸，可以将其从目标细胞中提取到溶液(例如水溶液，例如下述的缓冲液)中；在另一个例子中，如果目标分析物是粉末或颗粒物质(例如粉末、颗粒、土壤样品或孢子)，可以将其悬浮或溶解到溶液(例如水溶液，例如下述的缓冲液)中，例如可以先得到干物质样品(例如使用药签或其它工具)，然后再把干物质样品置于溶液中。因此，流体样品不仅指用于评估目标分析物的液体样品，还包括被提取、悬浮或溶解固体物质(用于评估目标分析物)的流体样品。
此处所使用的分析物结合试剂是指上述结合对中的第二个成员。每种分析物结合试剂都是特异性地与目标分析物(结合对中的第一个成员)相结合的化合物，例如抗体、半抗原或药物偶联物、受体，或另一个结合配偶体。在优选实施方式中，分析物结合试剂是针对其目标分析物的抗体。
夹心分析
本发明的夹心分析可以使用固相装置。在一个实施方式中，固相装置是侧向流动固相装置。在另一个实施方式中，固相装置是毛细流动固相装置。
侧向流动固相装置可以是被设计用于侧向流动分析的任何固相装置，例如RAMPTM装置(Response Biomedical，伯纳比，不列颠哥伦比亚省，加拿大；例如请见美国专利6509196、7175992中描述的装置)。通常，侧向流动固相装置包含一个测试样品将会流过的膜。该膜可以由具有下述特性的物质制成：足以允许流体的毛细作用沿着膜表面和穿过膜内部作用的多孔性；允许涂覆的微粒(例如下述分析物结合微粒)或微粒和目标分析物的复合物(例如下述接触的分析物结合微粒)通过毛细作用移动的能力(即不能阻断微粒或微粒和目标分析物的复合物)；以及可被包含分析物的流体湿润的能力(例如对于水流体的亲水性、对于有机溶液的疏水性)。通过某些方法可以改变膜的疏水性，以使膜具有亲水性而用于水流体，这些方法例如是在美国专利No.4340428或美国专利No.4618533中描述的那些方法，其中描述了将疏水表面转变为亲水表面。膜物质的例子包括：纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、玻璃纤维、尼龙、聚合电解质离子交换膜、丙烯酸共聚物/尼龙和聚醚砜。在优选实施方式中，膜是由硝酸纤维素制成的(例如由Mylar做衬背(backing)的硝酸纤维素膜)。侧向流动固相装置还可以任选地包括其它部件，包括样品垫、芯吸垫、内部标准组分、对照组分或其它部件。
毛细流动固相装置可以是被设计用于毛细流动分析的任何固相装置，例如BioSite
免疫分析产品(BioSite Inc.，圣地亚哥，加州)。通常，毛细流动固相装置包含一个测试样品将会流过的毛细通道。
无论使用侧向流动固相装置还是毛细流动固相装置，固相装置都包括一个施加位点，两个或更多个样品捕获区和一个对照捕获区。施加位点(或施加区域)是膜上或毛细通道内可以施加流体的位置。还可以任选地使用施加垫；施加垫设置于固相上，紧挨着或者覆盖着施加位点。施加垫可以由吸收性物质制成，当向施加垫施加流体样品时，施加垫可以将流体样品传递到膜上或毛细通道内的施加位点上。代表性的物质包括纤维素、硝酸纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚合电解质离子交换膜、丙烯酸共聚物/尼龙、聚醚砜或玻璃纤维。在一个实施方式中，施加垫是玻璃纤维垫。如果存在芯吸垫的话，芯吸垫同样可以由这些吸收性物质制成。
样品捕获区是指在膜上或毛细通道中吸附样品捕获试剂的位点(例如涂覆在膜上和/或透过膜，或者涂覆在毛细通道的表面上)。此处所使用的术语“吸附”是指通过非共价相互作用，试剂被固定或者被粘附，与共价连接相反(共价连接是采用化学手段产生两个相连分子之间共用电子的不可逆的化学键)。还可能发生吸附在膜上或者毛细通道内的试剂的增量运动(incremental movement)(例如解吸附作用)，但是对于本发明的分析所产生的影响可以忽略不计。
样品捕获试剂是用于特定目标分析物的分析物结合试剂，例如上述那些试剂。样品捕获试剂不需要是与所述微粒上的分析物结合试剂相同的分析物结合试剂；但是，每种样品捕获试剂同样与其目标分析物形成结合对，因为它特异性地和优先地与其目标分析物相结合。在优选实施方式中，样品捕获试剂是针对其目标分析物的抗体；它可以针对那些同与用作涂覆在微粒上的分析物结合试剂的抗体相结合的表位相同的分析物表位，或者针对不同的分析物表位。由于存在多于一种的目标分析物，因此也会存在多于一个的样品捕获区——每个样品捕获区与各自的目标分析物相对应。每个样品捕获区上吸附有至少一种样品捕获试剂，其中，样品捕获试剂是用于特定的(相对应的)目标分析物的分析物结合试剂。若需要，每个样品捕获区可以存在多于一种的样品捕获试剂，条件是在特定样品捕获区内的所有样品捕获试剂都以相同的目标分析物为目标(尽管不一定是该目标分析物的相同的表位)。若需要，可以在每个样品捕获区使用多于一种的样品捕获试剂。
该装置还包括被吸附在对照捕获区的对照捕获试剂。对照捕获试剂是与分析物结合微粒反应、但是不与任何待测分析物相互作用的试剂：例如，对照捕获试剂可以与分析物结合试剂涂覆的微粒上的分析物结合试剂反应；可以与微粒上的另一种物质反应；或者与微粒本身反应。例如，如果分析物结合试剂是抗体的话，对照捕获试剂可以是抗免疫球蛋白抗体。在优选实施方式中，每种分析物结合试剂是一种抗体，对照捕获试剂是抗免疫球蛋白抗体。在对照捕获区内，对照捕获试剂吸附于固相装置(涂覆在膜上和/或渗入膜内，或者涂覆在毛细通道内)上。
在某些实施方式中，样品捕获区在固相装置上按照液体通过毛细作用流动的方向顺序排列，并且接近施加位点。在另外一些实施方式中，不同的样品捕获区与施加位点之间的距离大约是等距的(例如彼此平行、放射状分布，或者以其它方式设置使得相对于液体的流动，样品捕获区接近施加位点)。若需要，与靠近施加位点相比，样品捕获区可以相对更靠近固相装置的远端。在进一步的实施方式中，样品捕获区互相交叠或者占用相同的区域；在这样的实施方式中，区别地标记所使用的微粒(如下所述的)(即采用如此方式进行标记，以使得微粒可以分别被确定，例如通过不同的光密度、不同的化学发光标志，和/或不同的荧光标志)。
在样品捕获区不互相交叠或者不占用相同区域的实施方式中，在样品捕获区的顺序排列中，每个区之间的距离是不同的；所要求的就是其距离足以确保这些区不互相交叠。在优选实施方式中，正如下面所详细描述的，顺序区之间留有一定距离，使得不同区之间的背景水平也可以被确定。每个样品捕获区与相邻的样品捕获区之间的距离大约是等距的。在一个具体实施方式中，“大约等距”是指使用标准生产仪器测到的尽可能接近的距离：例如如果生产仪器分辨率是毫米，大约等距是指在1mm以内。或者，在另一个具体实施方式中，大约等距的分辨率可以与从第一样品捕获区的中心到第二捕获区的中心的距离相关：例如，从第一样品捕获区的中心到第二样品捕获区的中心的距离与从第二样品捕获区的中心到第三样品捕获区的中心的距离的差距是在从施加位点的中心到样品捕获区的中心的距离长度(路径长度)的10％以内，优选7％以内，优选5％以内，更优选4％以内，更优选3％以内，再更优选2％以内，再更优选1％以内。
样品捕获区和对照捕获区与施加位点分开一定的距离，该距离长到足以将毛细前沿的速度延缓到一定的速度，该速度慢到当毛细前沿到达第一样品捕获区时足以捕获微粒。此外，该距离还必须足够长，以使得总的迁移(毛细前沿穿过整个固相装置的移动)时间长到足够允许流体样品中游离的分析物与分析物结合微粒相结合。固相装置上的部分间的最佳距离可以使用常规实验来进行确定和调节。
定量分析还使用样品收集装置。此处所使用的样品收集装置是指可以用于收集流体样品、或者存放或储藏所收集的流体样品的装置。样品收集装置可以是下述包含分析物结合微粒的任何装置，可以是可以向其添加测量过体积的流体样品的任何装置。代表性的样品收集装置包括样品管、试管、小瓶、吸液管或吸液管端头，或注射器。在优选实施方式中，样品收集装置是吸液管或吸液管端头。
在一个实施方式中，样品收集装置包括由用于每种目标分析物的分析物结合试剂涂覆的分析物结合微粒群：例如，对应第一目标分析物的第一分析物结合试剂、对应第二目标分析物的第二分析物结合试剂等等，这样存在对应于每种目标分析物的分析物结合试剂。或者，样品收集装置可以包括对应每种分析物结合试剂的分析物结合微粒群，即，对应第一目标分析物的分析物结合微粒群、对应第二目标分析物的分析物结合微粒群等等，这样存在对应于每种目标分析物的分析物结合微粒群。若需要，也可以使用不同类型的分析物结合微粒群的组合。
取决于微粒的大小和组成、固相装置的组成和分析的灵敏度水平，微粒群也随之变化。典型的群大小的范围为大约1×103～1×109个，但是根据需要也可以使用更少或者更多的微粒。在优选实施方式中，该群包括大约2×108个微粒。若需要，还可以相应地增加该群的量(例如如果评估三种目标分析物的话，可以使用三倍量的微粒)。
分析物结合微粒是可以由对应于每种目标分析物的分析物结合试剂(结合对的第二个成员)涂覆的微粒。在优选实施方式中，分析物结合微粒是脂质体、胶体金、有机聚合物乳胶微粒、无机荧光微粒或磷光微粒。在特别优选的实施方式中，微粒是聚苯乙烯乳胶珠子，最优选地是在不含表面活性剂的条件下制成的聚苯乙烯乳胶珠子，例如不含表面活性剂的超活性均一乙醛/硫酸盐乳胶(Superactive Uniform Aldehyde/Sulfate Latexes)(InterfacialDynamics Corp.，波特兰，OR))。
微粒的大小与膜的多孔性或毛细通道的尺寸相关，还与目标分析物的大小相关(例如对于颗粒分析物)：微粒必须小到足以在流体的毛细作用下沿着膜或者穿过毛细通道进行转运，对于下述接触的分析物结合微粒的复合物来说，微粒还必须小到足以在毛细作用下沿着膜或者穿过毛细通道进行转运(对于固体，例如颗粒分析物)。微粒可以被标记以便于检测。标记微粒的方式应该不会显著地影响微粒的物理性质，例如将微粒内部标记(即，标记包含在微粒内部，例如在脂质体或聚苯乙烯乳胶珠子内)。代表性的标记包括发光标记、化学发光标记、磷光标记、酶联标记、化学标记(例如电活性试剂(例如亚铁氰化物))和比色标记(例如染料或荧光标记)。在一个实施方式中，使用荧光标记。在另一个实施方式中，使用磷光微粒，特别是“上转(up-converting)”磷光微粒，例如那些在美国专利No.5043265中所述的微粒。例如，如果样品捕获区是分开的，相同类型的标记就可以被用于每种分析物结合微粒群(例如，用于第一目标分析物的微粒群和用于第二目标分析物的微粒群)。或者，还可以使用不同类型的标记(区别性的标记)，例如，如果样品捕获区互相叠加或者占用相同的区域时。
微粒由分析物结合试剂涂覆，该分析物结合试剂是对应每种目标分析物的结合对的第二个成员(例如由多于一种类型的分析物结合试剂涂覆的微粒；或者不同的微粒群，每个群由对应其分析物的一种类型的分析物结合试剂涂覆)。如上所述，分析物结合试剂(结合对的第二个成员)特异性地和优先与其目标分析物(结合对的第一个成员)相结合。代表性的分析物结合试剂包括抗体(或其片段)、半抗原、药物偶联物、受体或其它结合配偶体。在一个优选实施方式中，分析物结合试剂是目标分析物的抗体。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。此处所使用的术语“抗体”还指足以与目标分析物相结合的抗体片段。或者，在另一个实施方式中，还可以使用与目标分析物特异性结合的分子，例如包含分析物结合位点的改造的(engineered)蛋白质(Holliger，P.和H.R.Hoogenbloom，Trends inBiotechnology 13：79(1995)；Chamow，S.M.和A.Ashkenazi，Trendsin Biotechnology 14：5260：1996)。在另一个实施方式中，如果目标分析物是药物的话，半抗原或其它药物偶联物可以作为分析物结合试剂使用。或者，在进一步的实施方式中，可以使用与分析物相结合的受体(例如，如果目标分析物是配体的话)。如果分析物是具有已知特异性的抗体的话，微粒可以由分析物抗体所针对的抗原涂覆，或者可以由针对分析物-抗体的抗体涂覆。此外，正如此处所描述的，由于分析物和分析物结合试剂可以形成结合对，被描述为代表性分析物的化合物和分子还可以作为分析物结合试剂使用，那些被描述为代表性分析物结合试剂的化合物和分子也同样可以作为分析物使用。
样品收集装置内所包含的分析物结合微粒以一种稳定的形式被储存在样品收集装置内。此处所使用的术语“稳定的形式”是指在储存过程中，微粒的化学组成或物理形态不发生显著改变的形式。稳定的形式可以是液体、凝胶或固体形式。在优选实施方式中，样品收集装置内所包含的分析物结合微粒是被蒸发干燥的、冷冻干燥的和/或真空干燥的。
在特别优选的实施方式中，样品收集装置是含真空干燥的分析物结合微粒的吸液管端头。
为了进行分析，可以使用上述用于评估目标分析物的存在的流体样品。在一个实施方式中，流体样品被引入(吸入、倒入或者以其它方式放入)样品收集装置内。例如，在一个实施方式中，流体样品被吸至带有吸液管端头的样品收集装置内。将流体样品引入样品收集装置内会使流体样品与分析物结合微粒相混合，形成“混合的流体样品”。如果分析物结合微粒是被蒸发、冷冻，或真空干燥的，将流体样品引入样品收集装置内会使分析物结合微粒再水合和悬浮于流体样品中。缓冲液(例如用于稀释的)也被引入到混合的流体样品中，形成“缓冲的、混合的流体样品”。缓冲的、混合的流体样品可以通过将混合的流体样品分配至含缓冲液的“缓冲液容器”(例如试管)，或者通过在引入流体样品之前将缓冲液引入到样品收集装置内而形成。或者，如果目标分析物是固体(例如上述粉末、颗粒；孢子；或其它微粒)的话，上述流体样品可以通过将固体引入到缓冲液容器中而制备；在这个实施方式中，缓冲的、混合的流体样品是通过将流体样品(包含缓冲液)引入到样品收集装置内而形成的。在另一个实施方式中，将缓冲液引入到样品收集装置中，然后再将流体样品引入到样品收集装置中。
缓冲液可以是用于支持目标分析物和分析物结合试剂之间的反应的水性流体(例如不干扰抗原/抗体相互作用)；其粘性低到足以允许流体在毛细作用下移动。在一个实施方式中，缓冲液包含一种或多种下述组分：缓冲试剂(例如磷酸盐)、盐(例如NaCl)、蛋白质稳定剂(例如BSA、酪蛋白、血清)、和/或例如非离子去污剂的去污剂或表面活性剂(例如一种或多种通常可以在表面活性剂工具试剂盒中获得的下述试剂：NINATE 411、Zonyl FSN100、气溶胶OT 100％、GEROPON T 77、BIO TERGE AS 40、STANDAPOL ES 1、Tetronic 1307、Surfnyol 465、Surfnyol 485、Surfynol 104PG 50、IGEPAL CA210、TRITON X 45、TRITON X 100、TRITON X305、SIL WET L7600、RHODASURF ON 870、Cremophor EL、TWEEN 20、TWEEN 80、BRIJ 35、CHEMAL LA 9、Pluronic L64、SURFACTANT10G、SPAN 60、CREL)。任选地，若需要，缓冲液可以包含增稠剂。缓冲液的这些组分可以商购获得。代表性的缓冲液包括，例如盐水或50mM Tris HCl，pH 7.2。或者，可以使用水来代替缓冲溶液；此处所使用的术语“缓冲液”是指缓冲溶液或者水。在另一实施方式中，缓冲液的组分被冻干，并且包含在样品收集装置中；在该实施方式中，本发明的方法使用水来代替缓冲溶液。
为了将分析物结合微粒进一步分散到流体样品中，若需要，可以搅动(例如旋震、摇动、吸上吸下等等)已引入流体样品和缓冲液的样品收集装置，或者已引入混合的流体样品的缓冲液容器。
在优选实施方式中，样品收集装置包括其端头内含有真空干燥的分析物结合微粒的吸液管端头；流体样品被吸入到吸液管中，从而将干燥的分析物结合微粒再水合，形成了混合的流体样品。在特别优选的实施方式中，混合的流体样品被引入到缓冲液容器中，形成了缓冲的、混合的流体样品；使用样品收集装置将缓冲液容器中缓冲的、混合的流体样品吸上吸下，从而进一步分散分析物结合微粒。
如果缓冲的、混合的流体样品中存在目标分析物，该分析物与其分析物结合微粒之间会发生结合。分析物与分析物结合微粒的“结合”指示涂覆于微粒上的分析物结合试剂与其目标分析物相互作用(例如结合)。被维持在(温育在)足以使流体中的分析物(如果存在的话)与吸附在接触区中的分析物结合微粒相结合的条件下的分析物结合微粒在此被称为“接触的分析物结合微粒”。接触的分析物结合微粒可以带有或者不带有与分析物结合试剂相结合的分析物，这取决于每种目标分析物是否存在于流体样品中，以及分析物是否已经与分析物结合微粒上的分析物结合试剂相结合。由于分析物结合微粒上有许多分析物结合位点，因此与分析物结合微粒相结合的分析物的存在状态和浓度是不同的；与分析物结合微粒相结合的分析物的浓度随着流体样品中存在的分析物的量成比例增加，在相应的样品捕获区中捕获分析物结合微粒的可能性(如下所述)也同样随着与分析物结合微粒相结合的分析物的量的增加而增加。因此，接触的分析物结合微粒群可以包括含有不同量的与分析物结合试剂相结合的分析物的微粒，也可以包括不含与分析物结合试剂相结合的分析物的微粒(正如最初的那些不含与分析物结合试剂相结合的分析物的分析物结合微粒)。此外，结合的程度随着条件中时间因素的增加而增加：虽然大部分的结合发生在一分钟之内(例如60秒，优选小于60秒(例如45秒、30秒或更短))，但是额外的温育(例如多于1分钟(2分钟、5分钟、10分钟、15分钟)会导致额外的结合。如果分析物结合微粒多于一群(例如，用于不同目标分析物的单独的群)，被维持在(温育在)足以使流体中的分析物(如果存在的话)与分析物结合微粒相结合的条件下的分析物结合微粒在此被称为对于每种目标分析物的“接触的第一分析物结合微粒”、“接触的第二分析物结合微粒”等，并且这些分析物结合微粒通称为接触的分析物结合微粒。
将缓冲的、混合的流体样品施加在固相装置的施加位点上，或者如果有施加垫的话，也可以施加在施加垫上。当固相装置与缓冲的、混合的流体样品相接触后，将固相装置维持在允许流体通过毛细作用移动到和穿过该装置的条件下。接触的分析物结合微粒由于流体的毛细作用而从缓冲的、混合的流体样品中移动出来。将固相装置维持在一定条件下(例如足够长的时间和足够大的流体体积)，该条件允许接触的分析物结合微粒在毛细作用下移动到和穿过样品捕获区，以及移动到和穿过对照捕获区，任选地，还允许随后移动到捕获区之外(例如进入芯吸垫)，由此可以从捕获区中除去任何未结合的微粒。
通过接触的分析物结合微粒与对应每种目标分析物的样品捕获区内的样品捕获试剂相结合，以及通过部分接触的分析物结合微粒与对照捕获区内的对照捕获试剂相结合，捕获部分接触的分析物结合微粒的移动。在一个优选实施方式中，分析物结合试剂是目标抗原的抗体，对照捕获试剂可以是针对一些物种的免疫球蛋白的抗体(该分析物结合试剂来源于该物种)。在这个实施方式中，免疫球蛋白的抗体与样品中的其它组分应该是非交叉反应的：例如，如果检测人体样品，可以使用不与人免疫球蛋白反应的抗体作为对照捕获试剂。
通过与在接触的分析物结合微粒上的分析物结合试剂相结合的目标分析物结合，样品捕获试剂与接触的分析物结合微粒相结合。此处所使用的术语“样品-试剂微粒复合物”是指样品捕获试剂和接触的分析物结合微粒的复合物。由于通过分析物与样品捕获区内的样品捕获试剂相互作用而实现的接触的分析物结合微粒的捕获，接触的分析物结合微粒在样品捕获区被捕获，形成样品-试剂-微粒复合物。每个样品捕获区中可以捕获到样品-试剂-微粒复合物，这取决于具体每个目标分析物是否存在于样品中，以及是否已经与接触的分析物结合微粒上的其分析物结合试剂相结合。
通过与接触的分析物结合微粒上的分析物结合试剂相结合，对照捕获试剂与接触的分析物结合微粒相结合。此处所使用的术语“对照-试剂-微粒复合物”是指对照捕获试剂和接触的分析物结合微粒的复合物。由于通过分析物结合微粒与对照捕获区中的对照捕获试剂相互作用而实现的接触的分析物结合微粒的捕获，接触的分析物结合微粒在对照捕获区中被捕获，形成对照-试剂-微粒复合物。正如上面所提到的那样，对照捕获试剂与分析物结合微粒相互作用(例如，与分析物结合试剂涂覆的微粒上的分析物结合试剂，或者微粒上的另外一种物质，或者与微粒本身相互作用)，但是不与测试中所使用的任何分析物(存在针对这些分析物的样品捕获区)本身相互作用。
通常，毛细作用随后可以将任何没有在样品捕获区或对照捕获区中被捕获的接触的分析物结合微粒移动到这些区之外，从而除去任何没有被捕获的微粒。在优选实施方式中，流体将任何没有被捕获的接触的分析物结合微粒移动到在捕获区之后的芯吸垫上。
若需要，还可以使用第二洗涤步骤。在缓冲的、混合的流体样品已经浸透膜、穿过毛细管或者(如果有施加垫的话)浸透施加垫之后，缓冲液(例如上述缓冲液)可以被施加在施加位点上。第二洗涤步骤可以在之后的任何时候使用，只要该步骤不稀释缓冲的、混合的流体样品即可。如下所述，当检测分析物结合微粒的时候，第二洗涤步骤可以降低背景信号。
然后针对分析物结合微粒上使用的标记类型采用适当的手段，检测在每个样品捕获区中捕获的分析物结合微粒(样品-试剂-微粒复合物)的量。在优选实施方式中，通过光学方法来检测该量，例如通过测定分析物结合微粒的标记的荧光量。
在特别优选的实施方式中，对从第一样品捕获区的上游到对照捕获区之后的整个区域进行扫描，使得沿着液体流动的方向进行几百次的测定。通过这种方式，可以确定在每个区内、区之间、初始区之前以及对照区之后的结合的量，其分辨率足以测定这些区域中的每一个区内的标记的量。如下所述，区之间的结合的量可以用于校正背景信号。
或者，可以通过使用电导率或电介质(电容)来检测样品-试剂-微粒复合物的量。或者，可以使用如Hayes等人(Analytical Chem.66：1860-1856(1994))所述的被释放的电活性试剂如铟、铋、镓或碲离子的电化学检测，或者使用如Roberts和Durst(AnalyticalChem.67：482-491(1995)所建议的亚铁氰化物的电化学检测。例如，如果使用脂质体，可以通过在捕获区加入一滴去污剂而释放包封在脂质体中的亚铁氰化物，释放的亚铁氰化物通过电化学法检测(Roberts和Durst，同上)。如果使用螯合剂-蛋白质偶联物螯合金属离子，在捕获区加入一滴酸可以释放该离子，并且允许通过阳极溶出伏安法进行定量(Hayes等人，同上)。同样，在对照捕获区(在此也被称作“对照”)内捕获的分析物结合微粒的量可以通过与检测样品捕获区中分析物结合微粒的量的相同的方式来进行检测。
然后确定对于每种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量。校正的分析物结合微粒的量是基于在对应于目标分析物的样品捕获区内、其它样品捕获区内以及对照捕获区内被捕获的分析物结合微粒的量。例如，在一个实施方式中，对应第一种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量被确定为比值(R)，该比值(R)为在第一样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量与在第一样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量加上在其它每个样品捕获区和对照捕获区内存在的量的总和的比值。例如，在一个实施方式中，如果存在两种目标分析物，对应第一种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量是通过下述比值来确定的：在第一样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量与总和(在第一样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量，加上在第二样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量，加上在对照捕获区内存在的分析物结合微粒的量)的比值。同样，如果有两种目标分析物，对应第二种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量是通过下述比值来确定的：在第二样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量与总和(在第一样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量，加上在第二样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量，加上在对照捕获区内存在的分析物结合微粒的量)的比值。
一旦确定了每种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量，目标分析物的存在与否就可以通过使用适当的对比、通过该分析物的校正的分析物结合微粒的量来进行确定。在一个实施方式中，将每种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量与预先由标准曲线确定的阈值进行比较，该标准曲线包含校正的结合微粒的量与已知的分析物浓度之间的确立的关系；等于或者高于阈值的校正的分析物结合微粒的量指示阴性结果(即指示测试样品中存在该目标分析物)，而低于阈值的校正的分析物结合微粒的量指示阴性结果(即指示测试样品中不存在该目标分析物)。
或者，一旦确定了每种目标分析物的校正的分析物结合微粒的量，目标分析物的量就可以通过使用适当的计算、通过该分析物的校正的分析物结合微粒的量来进行确定。例如，使用标准曲线，存在的分析物的量可以与校正的分析物结合微粒的量(比值)正相关。标准曲线是如下得到的：通过制备一系列的、在待测其分析物的流体(例如，如去除分析物的血清)中含有已知浓度的目标分析物的对照样品。然后对这一系列的对照样品进行分析，测定每种对照样品的R值，然后将R值相对于对照样品中包含的分析物的浓度作图。通过测定测试样品的R值来分析含未知量的分析物的样品(测试样品)，通过参考标准曲线来确定测试样品中分析物的浓度。如上所述，可以制作一条标准曲线，并用于一批中所有的测试样品(例如用于使用测试试剂的特定制品的所有测试样品)；并不需要对每种测试样品都重新制作标准曲线。或者，还可以使用其它的比值和/标准曲线来确定样品中分析物的量。
此外，若需要，在计算校正的分析物结合微粒的量过程中，以及在计算比值(R)之前，可以从每个样品捕获区内存在的分析物结合微粒的量以及从对照捕获区内存在的分析物结合微粒的量中减去背景中存在的标记的量。例如，在运行完分析之后(液体已移动穿过和超过捕获区)，可以对固相装置的全部或者部分进行扫描来评估在每个捕获区之前、之中或者之后的区域中标记微粒的量。扫描主要可以在包括捕获区的区域附近进行，但是也可以在延伸到捕获区之外或/和之间的区域进行。在捕获区之外的区域存在的微粒是“背景”，即，在样品的存在下非特异性地与固相装置相结合的微粒以及也存在于捕获区的样品基质中的其它组分。在捕获区中存在的微粒的量除那些由捕获试剂捕获的特异性微粒外还包括该非特异性背景。检测到的背景微粒的量(即在捕获区之外的位置上检测到的微粒的量，例如捕获区之前和/或之后)可以从每个捕获区所确定的总的微粒的量中减去。这就相对于背景的量进行了校正，能够更加精确地确定样品中存在的分析物的量。例如，检测到的背景的量可以在紧挨着捕获区的上游的位置上被确定；或者在紧挨着捕获区的下游的位置上被确定；或者在施加位点和第一样品捕获区之间被确定；或者在捕获区之外的另一个位置上被确定。或者，检测到的背景的量可以在多于一个的位置上被确定：例如，检测到的背景的量可以在捕获区的上游的位置上被确定，也可以在相同捕获区的下游的位置上被确定；检测到的这两种背景的量的平均值可以作为检测到的背景微粒的量使用，从分析物结合微粒的量中减去该量可以得到“背景校正的分析物结合微粒的量”。此处所使用的背景校正的分析物结合微粒的量是指已经减去微粒的背景量的分析物结合微粒的量。
在优选实施方式中，检测到的背景微粒的量在紧挨着每个捕获区的上游被确定：例如，在一个存在两种目标分析物因而存在两个样品捕获区的实施方式中，在第一样品捕获区的上游(用于第一样品捕获区)、在第一样品捕获区的下游和第二样品捕获区的上游(用于第二样品捕获区)、以及第二样品捕获区的下游和对照捕获区的上游(用于对照捕获区)检测背景的量。或者，被检测到的相同的背景量还可以用于每个样品捕获区和对照捕获区。
在另一个优选实施方式中，检测到的背景微粒的量在紧挨着每个捕获区的上游、紧挨着每个捕获区的下游被确定，这两个量的平均值用于确定背景校正的分析物结合微粒的量。例如，在一个存在两种目标分析物因而存在两个样品捕获区的实施方式中，在第一样品捕获区的上游和第一样品捕获区的下游检测背景的量，将这两个量平均，用作第一样品捕获区的背景量；第一样品捕获区下游的背景量还可以用作第二样品捕获区上游的背景量，该数值与第二样品捕获区下游的背景量取平均值，所得到的平均值可以用作第二样品捕获区的背景量，等等。若需要，也可以使用其它读数的组合，并且取其平均值来用作背景量。
在本发明的一个优选实施方式中，两种目标分析物是甲型流感和乙型流感。在该实施方式中，使用甲型流感的抗体作为第一分析物结合试剂，使用乙型流感的抗体作为第二分析物结合试剂使用。
“竞争”或“抑制”分析
与夹心分析一样，本发明的竞争或抑制分析使用上述的固相装置，该固相装置包括一个施加位点、两个或更多个样品捕获区和一个对照捕获区。该实施方式还使用上述的样品收集装置。用于竞争(抑制)分析的样品收集装置包括一群由所有目标分析物(代替如夹心分析所描述的由分析物结合试剂涂覆)或所有目标分析物的类似物涂覆的分析物涂覆的微粒；或者，样品收集装置包括多于一群的分析物涂覆的微粒(每种目标分析物对应一群)；每群由目标分析物或目标分析物的类似物或它们的组合涂覆。此处所使用的分析物的类似物是与分析物具有类似的结合特性的化合物，该化合物与上述的分析物结合试剂形成结合对。分析物和/或分析物的类似物可以直接涂覆到微粒上，或者也可以直接结合在微粒上。如下所用的术语“分析物涂覆的微粒”是指由目标分析物和/或目标分析物的类似物涂覆的微粒。正如上面所述的夹心分析那样，微粒群根据微粒的大小和组成、固相装置的组成以及分析的灵敏度水平而不同。
如上所述，样品捕获区是固相装置上吸附有样品捕获试剂的位置。样品捕获试剂是分析物结合试剂，例如上述那些试剂。样品捕获试剂并不需要是与上述相同的分析物结合试剂；但是，样品捕获试剂同样与目标分析物形成结合对，特异性地、优先地与目标分析物相结合。由于存在多于一种的目标分析物，因此也会存在多于一个的上述样品捕获区。如上所述，在优选实施方式中，样品捕获试剂是针对分析物的抗体；它可以针对那些同与用作涂覆在微粒上的分析物结合试剂的抗体相结合的表位相同的分析物表位，或者针对不同的分析物表位。若需要，每个样品捕获区可以使用多于一种的样品捕获试剂。
该装置还包括如上所述的对照捕获试剂，该对照捕获试剂与分析物涂覆的微粒反应，但是不与待测定的分析物相互作用：例如，对照捕获试剂可以与微粒上的另一种物质(例如与微粒相结合的分析物的载体；抗体)反应；或者与微粒本身反应。在优选实施方式中，样品捕获试剂和对照捕获试剂都是抗体。对照捕获试剂吸附在对照捕获区中。竞争分析的组件通过与上述夹心分析类似的方式进行排列。
为了进行竞争分析，使用上述用于评估目标分析物的存在的流体样品。在一个实施方式中，流体样品被引入(吸入、倒入或者以其它方式放入)样品收集装置中。例如，在一个实施方式中，样品被吸至一个包括吸液管端头的样品收集装置中。向样品收集装置中引入流体样品可以使流体样品与分析物涂覆的微粒相混合，形成混合的流体样品。如果分析物涂覆的微粒是被蒸发、冷冻或真空干燥的，向样品收集装置中引入流体样品可以使分析物结合微粒再水合和悬浮于流体样品中。也将缓冲液(例如上述的)引入到混合的流体样品中，形成缓冲的、混合的流体样品。缓冲的、混合的流体样品可以通过将混合的流体样品分配至含缓冲液的缓冲液容器(例如试管)中，或者通过在引入流体样品之前将缓冲液引入到样品收集装置中来形成。在另一个实施方式中，将缓冲液引入到样品收集装置中，然后再将流体样品引入到样品收集装置中。或者，如果目标分析物是固体(例如上述粉末、颗粒；孢子；或其它微粒)，上述流体样品可以通过将固体引入到缓冲液容器中进行制备；在这个实施方式中，缓冲的、混合的流体样品是通过将流体样品(包含缓冲液)引入到样品收集装置中而形成的。
为了将分析物涂覆的微粒进一步分散到流体样品中，若需要，可以搅动(例如旋震、摇动、吸上吸下等等)已引入流体样品和缓冲液的样品收集装置，或者已引入混合的流体样品的缓冲液容器。
在优选实施方式中，样品收集装置包括其端头内含有真空干燥的分析物涂覆的微粒的吸液管端头；流体样品被吸入到吸液管中，从而将干燥的分析物涂覆的微粒再水合，形成混合的流体样品。在特别优选的实施方式中，混合的流体样品被引入到缓冲液容器中，形成缓冲的、混合的流体样品；使用样品收集装置将缓冲液容器中的缓冲的、混合的流体样品吸上吸下，从而进一步分散分析物涂覆的微粒。
缓冲的、混合的流体样品被施加在固相装置的施加位点上，或者(如果有施加垫)施加在施加垫上。当固相装置与缓冲的、混合的流体样品相接触后，将固相装置维持在允许流体通过毛细作用移动到和穿过固相装置的条件下。分析物涂覆的微粒(和分析物，如果样品中存在的话)由于流体的毛细作用移动穿过装置，从缓冲的、混合的流体样品移动到和穿过样品捕获区，以及移动到和穿过对照捕获区。
通过分析物涂覆的微粒与样品捕获区内的样品捕获试剂相结合，以及通过部分分析物涂覆的微粒与对照捕获区内的对照捕获试剂相结合，捕获部分分析物涂覆的微粒的移动。分析物涂覆的微粒与样品中的分析物(如果存在的话)竞争结合样品捕获试剂。通过与分析物涂覆的微粒上的分析物相结合，样品捕获试剂与分析物涂覆的微粒相结合。此处所使用的术语“样品-试剂-分析物涂覆的微粒复合物”是指样品捕获试剂和分析物涂覆的微粒的复合物。分析物涂覆的微粒在样品捕获区内被捕获，由于通过微粒上的目标分析物与样品捕获区内的样品捕获试剂的相互作用而发生的分析物涂覆的微粒的捕获，形成了样品-试剂-分析物涂覆的微粒复合物。
通过与除了分析物自身之外的任一分析物涂覆的微粒组分的结合，对照捕获试剂与分析物涂覆的微粒相结合。上述所使用的术语“对照-试剂-分析物涂覆的微粒复合物”是指对照捕获试剂和分析物涂覆的微粒的复合物。上述分析物涂覆的微粒在对照捕获区被捕获，由于通过分析物结合微粒与对照捕获区内的对照捕获试剂的相互作用而发生的分析物涂覆的微粒的捕获，形成了对照-试剂-分析物涂覆的微粒复合物。
随后，毛细作用可以将任何没有在样品捕获区或对照捕获区被捕获的分析物涂覆的微粒移动至捕获区之外。
然后检测在每个捕获区内被捕获的分析物涂覆的微粒。如以上对于夹心分析中分析物结合微粒的量的检测所述，使用用于分析物涂覆的微粒上所使用的标记类型的适当手段来检测分析物涂覆的微粒。同样地，通过与检测样品捕获区内分析物涂覆的微粒量相同的方式检测在对照捕获区中捕获的分析物涂覆的微粒的量(在此也被称作“对照”)。
然后确定每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量。校正的分析物涂覆的微粒的量是基于对应于目标分析物的样品捕获区内被捕获的分析物涂覆的微粒的量，以及在其它样品捕获区和对照捕获区内被捕获的分析物涂覆的微粒的量。例如，在一个实施方式中，对应第一目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量与比值(R)负相关，比值(R)为在第一样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量与在第一样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量加上在其它每个样品捕获区、对照捕获区内存在的量的总和的比值。例如，在一个实施方式中，如果存在两种目标分析物，对应第一种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量与下述比值负相关：在第一样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量与总和(在第一样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量，加上在第二样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量，加上在对照捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量)的比值。同样，如果存在两种目标分析物，对应第二种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量与下述比值负相关：在第二样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量与总和(在第一样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量，加上在第二样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量，加上在对照捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量)的比值。
一旦确定了每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量，目标分析物的存在与否就可以通过使用适当的对比、通过该分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量来确定。在一个实施方式中，如以上对于夹心分析所述，每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量与预先确定的阈值进行比较；等于或者高于阈值的校正的分析物涂覆的微粒的量指示阴性结果(即，指示测试样品中不存在目标分析物)，而高于阈值的校正的分析物涂覆的微粒的量指示阳性结果(即，指示着测试样品中存在目标分析物)。
或者，一旦确定了每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量，目标分析物的量就可以通过使用适当的计算、通过分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量来确定。例如，通过使用标准曲线，存在的分析物的量可以通过校正的分析物涂覆的微粒的量(比值)来确定。标准曲线是如下产生的：通过准备一系列的、在待检测分析物的流体(例如，如去除分析物的血清)中含有已知浓度的目标分析物的对照样品。然后对这一系列的对照样品进行分析，测定每种对照样品的R值，然后R值相对于对照样品中包含的分析物的浓度作图。通过测定测试样品的R值来分析含未知量的分析物的样品(“测试样品”)，通过参考标准曲线来确定测试样品中分析物的浓度。如上所述，可以制作一条标准曲线，并用于批次中的所有的测试样品(例如用于所有使用测试试剂的特定制品的测试样品)；并不需要对每种测试样品都重新制作标准曲线。
或者，如上所述，还可以使用其它的比值和/或标准曲线来确定样品中分析物的量。
此外，若需要，在计算校正的分析物涂覆的微粒的量的过程中，以及在计算比值(R)之前，可以从每个样品捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内存在的分析物涂覆的微粒的量中减去背景中存在的标记的量。例如，检测到的背景的量可以在紧挨着捕获区上游的位置上被确定；或者在紧挨着捕获区下游的位置上被确定；或者在施加位点和第一样品捕获区之间被确定；或者在捕获区之外的另一个位置上被确定。或者，检测到的背景的量可以在多于一个的位置上被确定：例如，检测到的背景的量可以在捕获区上游的位置上被确定，也可以在相同捕获区下游的位置上被确定；检测到的这两种背景的量的平均值可以用作从分析物涂覆的微粒的量中减去的检测到的背景微粒的量，以得到“背景校正的分析物涂覆的微粒的量”。此处所使用的“背景校正的分析物涂覆的微粒的量”是指已经减去背景微粒的量的分析物涂覆的微粒的量。
在优选实施方式中，检测到的背景微粒的量在紧挨着每个捕获区的上游被确定：例如，在一个存在两种目标分析物因而存在两个样品捕获区的实施方式中，在第一样品捕获区的上游(用于第一样品捕获区)、在第一样品捕获区的下游和第二样品捕获区的上游(用于第二样品捕获区)、以及在第二样品捕获区的下游和对照捕获区的上游(用于对照捕获区)检测到背景的量。或者，检测到的相同的背景的量还可以用于每个样品捕获区和对照捕获区。在另一个优选实施方式中，检测到的背景微粒的量在紧挨着每个捕获区的上游、紧挨着每个捕获区的下游被确定，这两个量的平均值用于确定背景校正的分析物涂覆的微粒的量。例如，在一个存在两种目标分析物因而存在两个样品捕获区的实施方式中，在第一样品捕获区的上游和第一样品捕获区的下游检测到背景的量，取这两个量的平均值，用作第一样品捕获区的背景的量；第一样品捕获区下游的背景的量还可以用作第二样品捕获区上游的背景的量，该数值与第二样品捕获区下游的背景量取平均值，所得到的平均值可用作第二样品捕获区的背景量，等等。若需要，也可以使用其它读数的组合，并且取其平均值来作为背景的量使用。
本发明的优点
与那些分析物结合微粒被嵌入固相装置的膜内、或者被包含在与固相装置的膜相接触的配合垫上、或者同样被置于毛细流动固相装置内的分析相对比，本发明的方法提供了灵敏度提高的分析。对于夹心分析，例如，由于在施加在固相装置之前，用于分析目标分析物的流体样品与分析物结合微粒相混合，因此在固相上发生捕获反应之前，目标分析物具有更长的时间来与分析物结合微粒相结合。此外，与固相装置基质中可能会形成的目标分析物和分析物结合微粒之间相同的相互作用相比，由于目标分析物与分析物结合微粒的相互作用发生在流体相中，因此由于微粒的移动性更好，具有更有效的结合。而且，对于夹心和竞争分析，与可能嵌入固相装置的量相比，流体收集装置可包括更多量的微粒；该更多的量进一步提高了反应的灵敏度。此外，在向固相上施加缓冲的、混合的流体样品之前，由于分析物结合微粒(或者分析物涂覆的微粒)被分散在缓冲的、混合的流体样品中，所以微粒通过流体的毛细作用穿过捕获区是以一种连续的方式，而不是以在流体前沿峰顶的快波方式。因此，较低浓度的微粒穿过捕获区需要更长的时间：因此，微粒被“捕获”的时间也就有效地延长了，允许在捕获区发生更高特异性的结合，同时，穿过捕获区的微粒的量也有效地减少了，从而避免了当微粒通过流体前沿峰顶时发生的，其它物质对一些微粒的捕获的非特异性物理阻断。
此外，使用一个内部对照就可以评估多种分析物，因此方便了同时分析多种化合物。此外，使用比值可以提供基于内部校准器的校正，还可以校正分析中微粒总量的变化值，因此可以弥补不同量的标记以及分析灵敏度的差异。
尽管本发明的分析已经通过免疫分析进行了具体描述，但是通过使用所需的组分作为分析物和分析物结合试剂进行上述相同的方法，该分析同样还可以使用上述其它结合对(例如核酸、受体-配体、凝集素-糖)。
本发明的试剂盒
本发明还包括用于此处所描述的方法中的试剂盒。试剂盒组分可包括：特异性结合对的第一个和/或第二个成员、缓冲液和/或缓冲液容器、流体收集工具、一个或多个固相装置(任选地包括施加垫和/或芯吸垫)、至少一个样品收集装置、一个或多个缓冲液容器、用于产生标准曲线和/或其它标准曲线信息的对照样品、分析物结合微粒、分析物涂覆的微粒，和/或对照微粒、捕获试剂、抗体、用于评估目标分析物的样品的辅助收集工具(例如药签)、一次性装置(例如生物危险废品袋)、和/或其它关于样品收集装置的信息或指示(例如批次信息、有效期等)。例如，在一个实施方式中，试剂盒包括至少一个其中含有分析物结合微粒的样品收集装置；在优选实施方式中，试剂盒包括至少一个其中含有被蒸发干燥的、真空干燥的或冷冻干燥的分析物结合微粒的吸液管端头。在另一个实施方式中，试剂盒包括至少一个此处所描述的固相装置和至少一个样品收集装置。在另一个优选实施方式中，试剂盒包括至少一个吸液管、至少一个或多个的其中含有被蒸发干燥的、真空干燥的或冻干的分析物结合微粒的吸液管端头，以及至少一个固相装置。这个优选实施方式还可以任选地包括关于标准曲线、批次信息，和/或关于吸液管端头内的分析物结合微粒的有效期的信息。在另一个优选实施方式中，试剂盒包括至少一个样品收集装置、至少一个其中含有制干的分析物结合微粒的吸液管端头、至少一个固相装置、以及至少一个缓冲液容器。这个优选实施方式还可以任选地包括在缓冲液容器中的缓冲液以及用于收集固体样品的工具(例如药签)。
本发明通过下述实施例进行阐明，但并不局限于其中任一种方式。
实施例：甲型和乙型流感样品的分析
A.材料
为了给免疫色谱分析准备膜条，使用下述过程：
1.5mg/ml，1ul/cm FluA抗体条带分布在TL位置(第一样品捕获区)
1.5mg/ml，1ul/cm FluB抗体条带分布在UL位置(第二样品捕获区)
1mg/ml，1ul/cm山羊抗小鼠抗体条带分布在ISL位置(对照捕获区)
上述抗体按如下被条带分布：将抗体溶液以1ul/cm的速度施加在硝酸纤维素膜上，然后使用1％PVA封闭该膜，使用10mM PB溶液洗涤，然后干燥。将该膜切成5mm宽的小条。
通过使用此处所描述的小条、样品垫和芯吸垫来组装测试柱(固相装置)。
为了准备分析物结合微粒，使用下述两个方式之一：
方式1：共偶联
使0.25mg FluA抗体和0.125mg FluB抗体共价偶联到4ml的荧光染色的乳胶珠子上面。
将乳胶抗体偶联物点到吸液管端头(样品收集装置)内，并且使用真空泵干燥来准备分析端头，或者在冻干的缓冲液中包括含样品缓冲液的乳胶抗体偶联物。
方式2：分开偶联
使0.25mg FluA抗体共价偶联到4ml的荧光染色的乳胶珠子上面。
使0.125mg FluB抗体共价偶联到4ml的荧光染色的乳胶珠子上面。
合并FluA抗体-乳胶偶联物和FluB抗体-乳胶偶联物，将合并的偶联物点在吸液管端头(样品收集装置)内，使用真空泵干燥来准备分析端头，或者在冻干的缓冲液中包括含样品缓冲液的乳胶抗体偶联物。
为了准备缓冲液，使用下述两个方式之一：
方式1：液体缓冲液方式：样品缓冲液组成：138mM PB，138mMNaCl，3.6％BSA，0.84％表面活性剂10G，0.6％酪蛋白，0.05％Polyox，0.05％ v/v ProClin 300，pH 7.2的样品缓冲液。该方式使用上述分析端头。
方式2：冻干缓冲液方式：冷冻干燥在冻干样品缓冲液中含有或者不含乳胶抗体偶联物的上述液体缓冲液。如果在冻干缓冲液中包含乳胶，乳胶不需要在吸液管端头中干燥。
B.方法
将怀疑含有流感(flu)的测试样品在上述缓冲液中进行制备(例如通过直接加入液体样品缓冲液中来稀释测试样品，或者利用样品重建冻干样品缓冲液)。冻干样品缓冲液中包含乳胶-抗体偶联物，或者通过使用分析端头来混合样品，将乳胶-抗体偶联物加入到制备好的样品中。然后将样品加入到测试柱(RAMP柱，ResponseBiomedical，伯纳比，加拿大)和插在RAMP荧光读数器(ResponseBiomedical)中的柱中。
14分钟之后，使用RAMP荧光读数器对柱进行扫描。测量UL(第一样品捕获区)、TL(第二样品捕获区)、ISL(对照捕获区)以及这些区每个相应的背景位置的荧光。通过减去相应的背景信号，校正UL、TL和ISL信号。使用读数器进行FluA和FluB分析的比值的计算，如下：
FluA比值＝dR10＝TL/(TL+UL+ISL)
FluB比值＝dUR10＝UL/(TL+UL+ISL)
将dR10和dUR10比值与每个值预先限定的阈值水平进行比较。如果比值等于或者大于阈值水平，结果就是阳性。如果比值小于阈值水平，结果就是阴性。
或者，可以将计算的比值与预先确定的标准曲线进行比较，该值可以转换为定量结果来确定样品的浓度。
已经参考其优选实施方式对本发明进行了具体说明和描述，但是本领域技术人员将会明白在形式上和细节上可以进行不同的变化，而不会偏离附加的权利要求所包含的本发明的范围。
Claims (21)
1.一种通过使用固相分析测定测试样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括确定检测到的一种目标分析物的量与检测到的每种目标分析物的量加上检测到的对照的量的总和的比值，其中每种目标分析物的量与每种目标分析物的比值正相关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在确定检测到的一种目标分析物的量与检测到的每种目标分析物的全部量加上检测到的对照的量的总和的比值之前，从检测到的每种目标分析物的量和对照的量中减去检测到的背景的量。
3.一种测定测试样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，施加位点、第一样品捕获区、第二样品捕获区和对照捕获区顺序地位于该固相装置上；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含第一分析物结合微粒群和第二分析物结合微粒群，其中，第一分析物结合微粒由第一分析物结合试剂涂覆，第二分析物结合微粒由第二分析物结合试剂涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液中引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，由此产生了包含接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的第一分析物结合微粒与第一样品捕获区中的第一样品捕获试剂相结合，并且允许接触的第二分析物结合微粒与第二样品捕获区中的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量、以及对照捕获区内接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的量；
g)确定第一校正分析物结合微粒量，该量为第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的量的总和的比值；并且确定第二校正分析物结合微粒量，该量为第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正分析物结合微粒量正相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正分析物结合微粒量正相关。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置进一步包含对应每种另外的目标分析物的另外的分析物结合微粒群；其中，所述固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物结合微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正分析物结合微粒量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物结合微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有分析物结合微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正分析物结合微粒量正相关。
5.一种测定测试样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，第一样品捕获区、第二样品捕获区和对照捕获区与固相装置上的施加位点之间的距离大约是等距的；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含第一分析物结合微粒群和第二分析物结合微粒群，其中，第一分析物结合微粒由第一分析物结合试剂涂覆，第二分析物结合微粒由第二分析物结合试剂涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液中引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，从而产生了包含接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将所述固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的第一分析物结合微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并且允许接触的第二分析物结合微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量、以及对照捕获区内接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的量；
g)确定第一校正分析物结合微粒量，该量为第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的量的总和的比值；确定第二校正分析物结合微粒量，该量为第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物结合微粒和接触的第二分析物结合微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正分析物结合微粒量正相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正分析物结合微粒量正相关。
6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置进一步包含对应每种另外的目标分析物的另外的分析物结合微粒群；其中，所述固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物结合微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正分析物结合微粒量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物结合微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物结合微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正分析物结合微粒量正相关。
7.一种定量测定流体样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，施加位点、第一样品捕获区、第二样品捕获区和对照捕获区顺序地位于固相装置上；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含分析物结合微粒群，其中，分析物结合微粒由第一分析物结合试剂和第二分析物结合试剂涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液中引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，由此产生了包含接触的分析物结合微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将所述固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的分析物结合微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并且允许接触的分析物结合微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的分析物结合微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、以及对照捕获区内接触的分析物结合微粒的量；
g)确定第一校正分析物结合微粒量，该量为第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物结合微粒的量的总和的比值；确定第二校正分析物结合微粒量，该量为第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物结合微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正分析物结合微粒量正相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正分析物结合微粒量正相关。
8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置中的分析物结合微粒进一步包含对应每种另外的目标分析物的涂覆在分析物结合微粒上的另外的分析物结合试剂；其中，固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物结合微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正的分析物结合微粒量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物结合微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物结合微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正的分析物结合微粒量正相关。
9.一种定量测定流体样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，每个样品捕获区和对照捕获区与施加位点之间的距离大约是等距的；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含分析物结合微粒群，其中，分析物结合微粒由第一分析物结合试剂和第二分析物结合试剂涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液中引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，从而产生了包含接触的分析物结合微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的分析物结合微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并且允许接触的分析物结合微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的分析物结合微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、以及对照捕获区内接触的分析物结合微粒的量；
g)确定第一校正分析物结合微粒量，该量为第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物结合微粒的量的总和的比值；确定第二校正分析物结合微粒量，该量为第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物结合微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物结合微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正分析物结合微粒量正相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正分析物结合微粒量正相关。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置中的分析物结合微粒进一步包含对应每种另外的目标分析物的涂覆在分析物结合微粒上的另外的分析物结合试剂；其中，固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物结合微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物结合微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正的分析物结合微粒量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物结合微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物结合微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正的分析物结合微粒量正相关。
11.一种测定测试样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，施加位点、第一样品捕获区、第二样品捕获区和对照捕获区顺序地位于固相装置上；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含第一分析物涂覆的微粒群和第二分析物涂覆的微粒群，其中，第一分析物涂覆的微粒由第一分析物或第一分析物的类似物涂覆，第二分析物涂覆的微粒由第二分析物或第二分析物的类似物涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液中引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，由此产生包含接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的第一分析物涂覆的微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并允许接触的第二分析物涂覆的微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量、以及对照捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的量；
g)确定第一校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的量的总和的比值；确定第二校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正的分析物涂覆的微粒的量负相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正的分析物涂覆的微粒的量正相关。
12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置进一步包含对应每种另外的目标分析物的另外的分析物涂覆的微粒群；其中，固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物涂覆的微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物涂覆的微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物涂覆的微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正的分析物涂覆的微粒的量负相关。
13.一种测定测试样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，第一样品捕获区、第二样品捕获区和对照捕获区与固相装置上的施加位点之间的距离大约是等距的；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含第一分析物涂覆的微粒群和第二分析物涂覆的微粒群，其中，第一分析物涂覆的微粒由第一分析物或第一分析物的类似物涂覆，第二分析物涂覆的微粒由第二种分析物或第二种分析物的类似物涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，由此产生包含接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的第一分析物涂覆的微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并允许接触的第二分析物涂覆的微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量、以及对照捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的量；
g)确定第一校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的量的总和的比值；确定第二校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的第二分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的第一分析物涂覆的微粒和接触的第二分析物涂覆的微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正的分析物涂覆的微粒的量负相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正的分析物涂覆的微粒的量正相关。
14.根据权利要求13所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置进一步包含对应每种另外的目标分析物的另外的分析物涂覆的微粒群；其中，固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物涂覆的微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物涂覆的微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物涂覆的微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正的分析物涂覆的微粒的量负相关。
15.一种定量测定流体样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，施加位点、第一样品捕获区、第二样品捕获区和对照捕获区顺序地位于固相装置上；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含分析物涂覆的微粒群，其中，分析物涂覆的微粒由第一分析物或第一分析物的类似物涂覆，以及由第二分析物或第二分析物的类似物涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，由此产生了包含接触的分析物涂覆的微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的分析物涂覆的微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并允许接触的分析物涂覆的微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的分析物涂覆的微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、以及对照捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量；
g)确定第一校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量的总和的比值；确定第二校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正的分析物涂覆的微粒的量负相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正的分析物涂覆的微粒的量负相关。
16.根据权利要求15所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置中的分析物涂覆的微粒进一步包含对应每种另外的目标分析物的涂覆在分析物涂覆的微粒上的另外的分析物或分析物的类似物；其中，该固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物涂覆的微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物涂覆的微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物涂覆的微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正的分析物涂覆的微粒的量负相关。
17.一种定量测定流体样品中至少两种目标分析物的量的方法，包括：
a)提供一个固相装置，该固相装置包括一个施加位点、至少两个样品捕获区和一个对照捕获区；第一样品捕获区上吸附有第一样品捕获试剂，第二样品捕获区上吸附有第二样品捕获试剂，对照捕获区上吸附有对照捕获试剂；其中，每个样品捕获区和对照捕获区与施加位点之间的距离大约是等距的；
b)提供一个样品收集装置，该样品收集装置包含分析物涂覆的微粒群，其中，分析物涂覆的微粒由第一分析物或第一分析物的类似物涂覆，以及由第二分析物或第二分析物的类似物涂覆；
c)以下任一：i)向样品收集装置中引入流体样品，产生混合的流体样品，随后再向混合的流体样品中引入缓冲液；ii)向样品收集装置中引入缓冲液，随后再引入流体样品；或者iii)通过向缓冲液中引入固体形成流体样品，随后将该流体样品引入样品收集装置中，由此产生包含接触的分析物涂覆的微粒的缓冲的、混合的流体样品；
d)将缓冲的、混合的流体样品施加到固相装置的施加位点上；
e)将固相装置维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的分析物涂覆的微粒与第一样品捕获区内的第一样品捕获试剂相结合，并允许接触的分析物涂覆的微粒与第二样品捕获区内的第二样品捕获试剂相结合；以及允许样品中的流体通过毛细作用转运接触的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过对照捕获区，从而允许接触的分析物涂覆的微粒与对照捕获试剂相结合；
f)确定第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、以及对照捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量；
g)确定第一校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量的总和的比值；确定第二校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量与第一样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量、第二样品捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量以及对照捕获区内接触的分析物涂覆的微粒的量的总和的比值，
其中，流体样品中的第一种目标分析物的量与第一校正的分析物涂覆的微粒的量负相关，流体样品中的第二种目标分析物的量与第二校正的分析物涂覆的微粒的量负相关。
18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括定量测定一种或多种另外的目标分析物的量，其中，所述固相装置包含对应每种另外的目标分析物的另外的样品捕获区，每个另外的样品捕获区上吸附有一种样品捕获试剂；其中，样品收集装置中的分析物涂覆的微粒进一步包含对应每种另外的目标分析物的涂覆在分析物涂覆的微粒上的另外的分析物或分析物的类似物；其中，该固相装置被维持在一定条件下，该条件允许流体通过毛细作用转运接触的另外的分析物涂覆的微粒穿过固相装置，到达和穿过每个样品捕获区，从而允许接触的另外的分析物涂覆的微粒与每个另外的样品捕获区内的另外的样品捕获试剂相结合；其中，确定对应每种目标分析物的校正的分析物涂覆的微粒的量，该量为每个相对应的另外的样品捕获区内接触的另外的分析物涂覆的微粒的量与所有样品捕获区和对照捕获区内所有的分析物涂覆的微粒的量的比值，其中，流体样品中每种目标分析物的量与相对应的校正的分析物涂覆的微粒的量负相关。
19.根据权利要求3-18中任一项所述的方法，其中在确定所述比值之前，从每个区内确定的微粒的量中减去检测到的背景的量。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述固相装置是侧向流动固相装置。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，所述固相装置是毛细流动固相装置。
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