BR112012008102B1 - sonda distintiva alvo (sonda td) e métodos para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de dna ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda td) - Google Patents

sonda distintiva alvo (sonda td) e métodos para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de dna ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda td) Download PDF

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Abstract

SONDA TD E SEUS USOS. A presente invenção relaciona-se a uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e seus usos ou aplicações. A sonda TD é hibridizada com uma sequência-alvo de ácido nucleicos através tanto da segunda porção de hibridização 5' quanto da primeira porção de hibridização 3'. Quando a sonda TD é hibridizada com uma sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação não são hibridizadas com a sequência não alvo de ácidos nucleicos tal que ambas as porções formem uma fita única devido ao seu baixo valor de Tm. Como tal, a sonda TD exibe modelos de hibridização distintamente diferentes de cada uma das sequências alvo e não alvo de ácidos nucleicos, discriminando a sequência-alvo de ácidos nucleicos da sequência não alvo de ácido nucleicos com especificidade muito mais alta.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção relaciona-se a uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e seus usos ou aplicações.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
[002] A hibridização de DNA é um processo fundamental na biologia molecular. Muitas tecnologias usando hibridização de DNA serão seguramente instrumentos muito úteis na detecção de sequência- alvo específicas e claramente serão valiosas em diagnóstico clínico, pesquisa genética, e análise laboratorial forense.
[003] Recentemente, houve muitos esforços para melhorar a especificidade da hibridização oligonucleotídica porque a hibridização de DNA é afetada por muitas condições como concentração salina, temperatura, solventes orgânicos, composição de bases, comprimento das fitas complementares, e o número de incompatibilidades de base nucleotídicas entre os ácidos nucleicos de hibridização (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982 e Sambrook et al., 1989). Ao longo da década passada, muitos métodos foram propostos; um método para modificar quimicamente bases de DNA para hibridização de alta sensibilidade (Azhikina et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11460-11462) e um método no qual a lavagem após a hibridização é conduzida em baixas temperaturas durante um período longo para aumentar a capacidade de discriminar a incompatibilidade (Drmanac et al., (1990) DNA and Cell Biology, 9:527-534). Recentemente, outro método foi introduzido para aumentar o poder de resolução de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) na hibridização de DNA por meio de incompatibilidades artificiais (Guo et al., (1997) Nature Biotechnology, 15:331-5). Além disso, muitas patentes americanas incluindo as Patentes U.S. Nos. 6.077.668, 6.329.144, 6.140.054, 6.350.580, 6.309.824, 6.342.355 e 6.268.128 revelam a sonda da hibridização e suas aplicações.
[004] Muitos métodos foram propostos para a detecção de sequências alvo usando sondas. Entre estes tipos de métodos, há diversos métodos propostos usando sondas de hibridização e enzimas nucleolíticas. O método de sonda TaqMan™ é um dos exemplos típicos de uso destes princípios. As sondas TaqMan™ são oligonucleotídeos que contêm um corante fluorescente, tipicamente na extremidade 5', e um corante de extinção, tipicamente localizado na extremidade 3'. Quando irradiado, o corante fluorescente excitado transfere a energia para a molécula do corante de extinção próxima em vez de fluorescer, resultando em um substrato não fluorescente. As sondas TaqMan™ são projetadas para hibridizar a uma região interna de um produto de PCR. Durante a PCR, quando a polimerase replica um molde no qual as sondas TaqMan™ estão ligadas, a atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase cliva as sondas. Isto separa os corantes fluorescentes e de extinção e a transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) não ocorre mais. A fluorescência aumenta em cada ciclo, proporcional à taxa da clivagem de sonda. (Parashar et al, Indian J Med Res 124: 385-398 (2006)). Ou seja, é a característica do método de sonda TaqMan™ para utilizar a hibridização e reações de clivagem pela atividade de nuclease 5' a 3' da polimerase. Entretanto, esta tecnologia transporta uma limitação inerente por si mesma. O problema mais crítico associado ao método de sonda TaqMan™ é a hibridização não específica de sondas porque é necessariamente acompanhado pela hibridização entre as sondas e as sequências alvo. Além disso, este método com muita probabilidade produzirá sinais falsos-positivos (resultados), especialmente na detecção múltipla de uma pluralidade de sequências alvo.
[005] Outra abordagem para a detecção de sequências alvo é usar métodos de ligação de sonda (D. Y. Wu, et al., Genomics 4:560 (1989), U. Landegren, et al., Science 241:1077 (1988), e E. Winn-Deen, et al., Clin. Chem. 37:1522 (1991)). A reação de ligação é considerada como um instrumento promissor para a detecção de mutações pontuais. No ensaio de ligação de oligonucleotídeo (OLA), duas sondas que transpõem uma região alvo de interesse são hibridizadas à região alvo. Onde as sondas são hibridizadas com bases alvo adjacentes, as extremidades confrontantes dos elementos da sonda podem ser juntadas por ligação, por exemplo, pelo tratamento com ligase. A sonda ligada é indicativa da presença da sequência-alvo. Relata-se que DNA ligases catalisam a ligação de substratos de DNA com nucleotídeos incompatíveis no sítio de ligação (Luo J, et al., Nucleic acid res 24:3071 (1996)). Mesmo nas abordagens de detecção do alvo baseadas em ligação, também permanece a necessidade de prevenir a ligação não específica de sondas a sequências alvo. Também, é necessário que a reação de ligação ocorra com especificidade muito mais alta, por exemplo, com discriminação de um nucleotídeo incompatível único presente em um sítio de ligação.
[006] Existem necessidades de desenvolvimento para um método útil para detectar a presença, nível ou modelos de expressão de cada um de um grande número de um gene ou uma população gênica simultaneamente. Um dos métodos mais promissores para estes fins são tecnologias baseadas em microarranjo (Schena et al., 1995. Quantitative Monitoring of Gene Expression Patterns with a Complementary DNA Microarray, Science, 270:467-470; DeRisi et al., 1996, Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patterns in Human Cancer, Nature Genetics 14:457-460). As tecnologias baseadas em microarranjo sugeridas por enquanto relacionam-se a detecção de genes ou variações de nucleotídeos e análise dos seus modelos de expressão.
[007] As tecnologias baseadas em microarranjo geralmente usam oligonucleotídeos de fita simples (sondas de ácidos nucleicos) que são complementares a uma sequência de ácidos nucleicos específica no ácido nucleico alvo. Entretanto, uma vez que os microarranjos de DNA convencionais dependem na maioria das vezes de hibridização para detectar sequências nucleotídicas alvo, eles têm deficiências como uma alta taxa de falsos-positivos. Especialmente, quando um grande número de sondas é usado, a ocorrência de eventos de hibridização cruzada não pode ser excluída. Esta hibridização cruzada pode afetar dramaticamente a qualidade dos dados e causar resultados falsos- positivos/falsos-negativos. Além disso, o microarranjo necessita de numerosas etapas líquidas de manipulação, e as temperaturas de incubação e lavagem devem ser cautelosamente controladas para a discriminação da incompatibilidade de nucleotídeo único. Foi provado que a multiplexação desta abordagem é muito difícil por causa das condições ótimas de hibridização diferentes entre muitas sequências de sondas. (William E. Bunney, et al. 2003. Microarray Technology: A Review of New Strategies to Discover Candidate Vulnerability Genes in Psychiatric Disorders, Am. J. Psychiatry 160:4, 657-666).
[008] Embora abordagens melhoradas de cada método tenham sido continuamente introduzidas, todos estes métodos e técnicas que envolvem hibridização oligonucleotídica não podem ser completamente livres das limitações e problemas que resultam da não especificidade da hibridização oligonucleotídica.
[009] Em todas as partes desta aplicação, várias patentes e publicações são referidas e as citações são fornecidas em parênteses. A revelação destas patentes e publicações em suas totalidades é por meio deste incorporada por referências neste pedido de patente a fim de descrever mais totalmente esta invenção e o estado da técnica avançada à qual esta invenção pertence.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[010] Em tais circunstâncias, entendemos que as novas sondas capazes de hibridizar especificamente com sequências alvo em uma forma de hibridização diferente das sondas convencionais devem ser fornecidas para superar desvantagens das tecnologias convencionais. Especialmente, apreciamos que as novas sondas devem ter desempenho de discriminação do alvo peculiar em reações nucleolíticas por nuclease bem como ligações.
[011] Os presentes inventores fizeram estudos intensivos para desenvolver novas tecnologias de Detecção-alvo para detecção ou identificação de sequências alvo de ácidos nucleicos sem resultados falsos positivos e negativos de maneira mais adequada. Como resultado, os presentes inventores projetaram uma nova sonda distintiva alvo que tem modelos de hibridização diferentes para sequências de ácidos nucleicos alvo e não alvo e por isso inerentemente a capacidade de discriminação de sequências de ácidos nucleicos distintivas de sequências não alvo de ácidos nucleicos. Além disso, com o auxílio de novas sondas distintivas alvo, os presentes inventores propuseram novos protocolos para detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos plausivelmente aplicáveis tanto a reações em fase líquida como em fase sólida.
[012] Consequentemente, é um objeto desta invenção fornecer uma sonda distintiva alvo (sonda TD) para permitir à discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[013] É outro objeto desta invenção fornecer um método para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) por uma reação 5' a 3' exonucleolítica em uma fase líquida ou uma fase sólida.
[014] É ainda outro objeto desta invenção fornecer um método para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e uma reação de polimerase em cadeia (PCR).
[015] É objeto adicional desta invenção fornecer um método para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) por uma reação de ligação.
[016] É ainda objeto adicional desta invenção fornecer conjuntos para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos.
[017] Outros objetos e as vantagens da presente invenção ficarão evidentes da descrição detalhada a seguir tomados em conjugação com as reivindicações e desenhos adicionados.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[018] A figura 1 representa esquematicamente a discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma sonda TD marcada dualmente e uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'. A sonda TD tem uma molécula repórter na sua segunda porção de hibridização 5' e uma molécula supressora na sua primeira porção de hibridização 3'.
[019] A figura 2 representa esquematicamente a discriminação de um ácido nucleico alvo de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma sonda TD marcada dualmente e uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'. A sonda TD tem tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5'.
[020] A figura 3 representa esquematicamente nenhuma geração de sinal em uma reação PCR em tempo real usando uma DNA polimerase dependente de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' quando uma sonda TD marcada dualmente tendo tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5' é hibridizada em uma sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[021] A figura 4 representa esquematicamente a discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma sonda TD imobilizada tendo uma marcação única e uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' na fase sólida. A figura 4A representa uma modificação da intensidade de sinal fluorescente na hibridização alvo-específica da sonda TD imobilizada. A figura 4B não representa nenhuma modificação da intensidade de sinal fluorescente na hibridização não alvo da sonda TD imobilizada.
[022] A figura 5 representa esquematicamente a discriminação de um ácido nucleico alvo e uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma sonda TD imobilizada tendo marcações duais e uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' na fase sólida. A figura 5A representa a geração de sinal na hibridização alvo-específica da sonda TD imobilizada. A figura 5B não representa nenhum sinal na hibridização não alvo da sonda TD imobilizada.
[023] A figura 6 representa esquematicamente a discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando um oligonucleotídeo não imobilizado como uma primeira sonda única marcada, uma sonda TD imobilizada como uma segunda sonda única marcada, e uma ligase em fase sólida. A figura 6A representa a ligação entre a primeira sonda e a segunda sonda na hibridização alvo-específica. A figura 6B não representa nenhuma ligação das sondas na hibridização não alvo.
[024] A figura 7 representa esquematicamente a ligação na hibridização alvo-específica usando um oligonucleotídeo não imobilizado como uma primeira sonda única marcada, uma sonda TD imobilizada como uma segunda sonda não marcada, e uma ligase em fase sólida.
[025] A figura 8 mostra os resultados da atividade de clivagem de uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' sobre sondas incompatíveis da extremidade 5'. Símbolos, 1)Molde é um oligonucleotídeo sintético para o gene de Staphylococcus aureus; 2)Sonda tem uma molécula repórter na sua extremidade 5' e uma molécula supressora na sua porção da extremidade 3'; 3) SA_P0 tem uma sequência compatível na sua porção da extremidade 5'; 4) SA_P1 tem um nucleotídeo incompatível único na sua extremidade 5'; 5) SA_P3 tem três nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'; 6) SA_P6 tem seis nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'; 7) SA_P9 tem nove nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'.
[026] A figura 9 mostra os resultados da discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos dependendo da hibridização da segunda porção de hibridização 5' de uma sonda TD marcada dualmente. As Figs. 9A e 9B mostram a detecção do gene de Staphylococcus aureus e do gene de Neisseria gonorrhoeae, respectivamente. Na figura 9A, Símbolos: 1)Molde é um oligonucleotídeo sintético para o gene de Staphylococcus aureus; 2)Sonda TD tem uma molécula repórter na sua extremidade 5' e uma molécula supressora na sua primeira porção de hibridização 3'; 3) SA_TD_M tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; 4) SA_TD_m tem uma sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'. Na figura 9B, Símbolos: 1)Molde é um oligonucleotídeo sintético para o gene de Neisseria gonorrhoeae; 2)Sonda TD tem uma molécula repórter na sua extremidade 5' e uma molécula supressora na sua primeira porção de hibridização 3'; 3) NG_TD_M tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; 4) NG_TD_m tem uma sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'.
[027] A figura 10 mostra os resultados de comparação entre uma sonda TD e uma sonda convencional para a detecção do gene de Staphylococcus aureus. Símbolos, 1)Molde é um oligonucleotídeo sintético para o gene de Staphylococcus aureus; 2)Sonda tem uma molécula repórter na sua extremidade 5' e uma molécula supressora na sua porção da extremidade 3'; 3) SA_TD_M é uma sonda TD e tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; 4) SA_TD_m1 é uma sonda TD e tem três nucleotídeos incompatíveis na sua segunda porção de hibridização 5'; 5) SA_Con_M é uma sonda convencional e tem uma sequência compatível na sua porção da extremidade 5'; 6) SA_Con_m1 é uma sonda convencional e tem três nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'.
[028] A figura 11 mostra os resultados de uma reação PCR em tempo real para a detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos usando uma sonda TD que tem tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5'. A figura 11A e 11B mostra a detecção do gene de Staphylococcus aureus e do gene de Neisseria gonorrhoeae, respectivamente. Na figura 11A, Símbolos: 1)Molde é DNA genômico de Staphylococcus aureus; 2Sonda TD tem tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5'; 3)SA_TD2_M tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; 4)SA_TD2_m tem uma sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'. Na figura 11B, Símbolos: 1)Molde é DNA genômico de Neisseria gonorrhoeae; 2)Sonda TD tem tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5'; 3)NG_TD2_M tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; 4)NG_TD2_m tem uma sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'.
[029] A figura 12 mostra os resultados de uma reação PCR em tempo real para a discriminação de uma incompatibilidade de nucleotídeo única usando uma sonda TD tendo tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5'. Símbolos, 1)Molde é DNA genômico de Staphylococcus aureus; 2)Sonda TD tem tanto uma molécula repórter como uma molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5'; 3)SA_TD_S_M tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; 4)SA_TD_S_m tem um nucleotídeo incompatível único na sua segunda porção de hibridização 5'.
[030] A figura 13 mostra os resultados da discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos dependendo da hibridização da segunda porção de hibridização 5' de uma sonda TD marcada dualmente imobilizada em uma superfície do substrato sólido. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados. Símbolos: SA_TD1_Chip_M é uma sonda TD tendo uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; SA_TD1_Chip_m é uma sonda TD tendo uma sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'.
[031] A figura 14 mostra os resultados da comparação entre uma sonda TD e uma sonda convencional para a detecção do gene de Staphylococcus aureus em fase sólida. Símbolos: SA_TD1_Chip_M é uma sonda TD tendo uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'; SA_TD1_Chip_m1 é uma sonda TD tendo três nucleotídeos incompatíveis na sua segunda porção de hibridização 5'; SA_Con_Chip_M é uma sonda convencional tendo uma sequência compatível na sua porção da extremidade 5'; SA_Con_Chip_m1 é uma sonda convencional tendo três nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'.
DESCRIÇÃO DETALHADA DESTA INVENÇÃO
[032] A presente invenção é desenhada para uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e seus usos ou aplicações. Sondas TD
[033] Em um aspecto da presente invenção, é fornecida uma sonda distintiva alvo (sonda TD) tendo uma estrutura oligonucleotídica de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral para permitir à discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[034] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência de ácidos nucleicos não alvo, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação formarão uma fita única, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[035] Os presentes inventores fizeram estudos intensivos para desenvolver novas tecnologias de Detecção-alvo para detecção ou identificação das sequências alvo de ácidos nucleicos sem resultados falsos positivos e negativos de maneira mais adequada. Como resultado, os presentes inventores projetaram uma nova sonda distintiva alvo que tem modelos de hibridização diferentes para sequências de ácidos nucleicos alvo e não alvo e por isso inerentemente a capacidade de discriminação de sequências alvo de ácidos nucleicos de sequências não alvo de ácidos nucleicos. Além disso, com o auxílio de novas sondas distintivas alvo, os presentes inventores propuseram protocolos de detecção novos para as sequências alvo de ácidos nucleicos plausivelmente aplicáveis tanto a reações em fase líquida como em fase sólida.
[036] Por isso, a sonda usada na presente invenção é chamada uma "Sonda Distintiva Alvo" (sonda TD) e as presentes tecnologias usando a sonda TD chamadas de "Ensaio de Detecção-alvo de sonda TD".
[037] A sonda TD da presente invenção tem a estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) compreendendo três porções diferentes com propriedades distintas dentro de uma molécula de oligonucleotídeo: segunda porção de hibridização 5', primeira porção de hibridização 3' e porção de separação. Tal estrutura permite a sonda TD servir como uma sonda que exibe especificidade muito mais alta, tornando a presente invenção ser nova e não óbvia sobre a técnica anterior.
[038] A estrutura de mDSO é uma versão recentemente modificada de uma estrutura de DSO (oligonucleotídeo de especificidade dual) que foi primeiro proposta pelo presente inventor (ver WO 2006/095981). A estrutura de DSO também é chamada DPO (oligonucleotídeo de preparação dual) já que serve como iniciadores (Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
[039] O DSO personifica um conceito novo no qual sua hibridização ou anelamento são duplamente determinados por porção de especificidade 5' de alta Tm (ou primeira porção de hibridização 5', primeira porção de preparação 5') e porção de especificidade 3' de baixa Tm (ou a segunda porção de hibridização 3', segunda porção de preparação 3') separado pela porção de separação, exibindo especificidade de hibridização dramaticamente aumentada (ver WO 2006/095981; Kim et al., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84 (2008); Kim, et. al., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii et. al., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009)). Como tal, o DSO tem consequentemente dois segmentos com propriedades de hibridização distintas: a primeira porção de hibridização 5' que inicia hibridização estável, e a segunda porção de hibridização 3' que determina principalmente a especificidade alvo.
[040] A estrutura de mDSO é uma reversão da estrutura de DSO: a segunda porção de hibridização 5' que principalmente determina a especificidade alvo, e a primeira porção de hibridização 3' que inicia a hibridização estável.
[041] Onde a sonda TD tendo a estrutura de mDSO é hibridizada com sequências não alvo, sua porção da extremidade 5' em vez da porção da extremidade 3' não está envolvida na hibridização, que é distintamente diferente da estrutura de DSO anteriormente sugerida pelo presente inventor.
[042] Para superar completamente problemas associados com sinais falsos-positivos particularmente associados a sondas, os presentes inventores fizeram esforços intensivos de propor abordagens mais confiáveis e exatas nas quais a geração de sinal indicativa de sequências alvo é realizada não somente por sonda de hibridização mas também reações enzimáticas adicionais tal como reação 5' a 3' de exonuclease e ligação de duas sondas. Considerando que as novas abordagens dependem pesadamente da hibridização da porção da extremidade 5' de sondas, os presentes inventores projetaram sondas que são capazes de exibir desempenho maximizado de especificidade da extremidade 5' e modificaram o DSO conhecido para propor a sonda TD.
[043] A sonda TD com 5 modelos de hibridização de '-extremidade peculiares permite à detecção de sequências alvo sem sinais falsos- positivos, que não foi realizada por sondas convencionais e sondas de DSO.
[044] A especificidade de hibridização (ou especificidade alvo) da sonda TD devido à estrutura de mDSO contribui para a Detecção-alvo livre de falso na presente invenção.
[045] De maneira interessante, a sonda TD tendo a estrutura de mDSO exibe comportamentos de hibridização distintamente diferentes para cada uma das sequências alvo e não alvo de ácidos nucleicos. Como representado esquematicamente nas Figs. 1-3, quando a sonda TD é hibridizada com uma sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD formam uma fita dupla com a sequência- alvo de ácidos nucleicos. Onde a sonda TD é hibridizada com uma sequência não alvo de ácidos nucleicos (isto é, hibridização ou ligação não alvo), sua primeira porção de hibridização 3' frequentemente ligase à sequência não alvo de ácidos nucleicos mas tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação não é hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos tal que ambas as porções formem uma fita única.
[046] Enquanto a primeira porção de hibridização 3' é anelada a uma sequência não alvo, a segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência mais curta (baixo valor de Tm) provavelmente não hibridizará à sequência não alvo sob condição de hibridização alvo- específica da sonda TD. As razões consistem em que primeira porção de hibridização 3' e a segunda porção de hibridização 5' são separadas pela porção de separação em termos de eventos de hibridização. Em outras palavras, a segunda porção de hibridização 5' está envolvida em eventos de hibridização de uma maneira relativamente independente da primeira porção de hibridização 3' e a hibridização da segunda porção de hibridização 5' é menos afetada pela hibridização de primeira porção de hibridização 3'. Nesta conexão, a probabilidade da hibridização da segunda porção de hibridização 5' a uma sequência não alvo fica muito mais baixa.
[047] Onde tanto primeira porção de hibridização 3' como a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD têm uma sequência complementar a um molde, a sonda TD pode ser especificamente hibridizada à sequência-alvo de ácidos nucleicos do molde sob condição de hibridização alvo-específica. Entretanto, onde somente a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD tem uma sequência complementar a um molde, a sonda TD não pode ser hibridizada ao molde sob condição de hibridização alvo-específica.
[048] As características da sonda TD descrita acima permitem detectar sequências alvo com especificidade alvo dramaticamente aumentada pelos dois seguintes eventos de vigilância do alvo. Em primeiro lugar, a sonda TD tendo modelos de hibridização diferentes de cada uma das sequências alvo e não alvo de ácidos nucleicos como descrito acima é capaz de discriminar sequências alvo de ácidos nucleicos das sequências não alvo de ácidos nucleicos com especificidade muito mais alta. Em segundo lugar, a ocorrência de reações enzimáticas sucessivas (reação exonucleolítica ou ligação 5' a 3') é determinada dependendo dos modelos de hibridização da sonda TD, elevando a especificidade alvo nos procedimentos de Detecção- alvo.
[049] A sonda TD é hibridizada com uma sequência-alvo de ácidos nucleicos e forma uma fita dupla. Como discutido mais acima, a sonda TD tendo a estrutura de mDSO com tal desenho curioso permite discriminar perfeitamente a sequências alvo de ácidos nucleicos das sequências não alvo de ácidos nucleicos.
[050] De acordo com uma modalidade preferencial, a base universal na porção de separação é selecionada a partir do grupo consistindo de desoxinosina, inosina, 7-deaza-2'-desoxinosina, 2-aza- 2'-desoxinosina, 2'-OMe inosina, 2'-F inosina, desóxi 3-nitropirrol, 3- nitropirrol, 2'-OMe 3-nitropirrol, 2'-F 3-nitropirrol, 1-(2'-desóxi-beta-D- ribofuranosil)-3-nitropirrol, desóxi 5-nitroindol, 5-nitroindol, 2'-OMe 5- nitroindol, 2'-F 5-nitroindol, desóxi 4-nitrobenzimidazol, 4- nitrobenzimidazol, desóxi 4-aminobenzimidazol, 4-aminobenzimidazol, desóxi nebularina, 2'-F nebularina, 2'-F 4-nitrobenzimidazol, PNA-5- introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitrobenzimidazol, PNA-3-nitropirrol, morfolino-5-nitroindol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitrobenzimidazol, morfolino-3-nitropirrol, fosforamidato-5-nitroindol, fosforamidato-nebularina, fosforamidato- inosina, fosforamidato-4-nitrobenzimidazol, fosforamidato-3-nitropirrol, 2'-0-metoxietil inosina, 2'-0-metoxietil nebularina, 2'-0-metoxietil 5- nitroindol, 2'-0-metoxietil 4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metoxietil 3- nitropirrol e combinações dos mesmos. Mais preferencialmente, a base universal é desoxinosina, 1-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol ou 5-nitroindol, ainda mais preferencialmente, desoxinosina.
[051] Preferencialmente, a porção de separação compreende nucleotídeos tendo pelo menos três, mais preferencialmente pelo menos quatro, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco bases universais. Mais preferencialmente, a porção de separação compreende nucleotídeos contíguos tendo pelo menos três, mais preferencialmente pelo menos quatro, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco bases universais. Alternativamente, a porção de separação compreende 3-10, 3-8, 4-7 ou 4-5 bases universais contíguas.
[052] Preferencialmente, a primeira porção de hibridização 3' é mais longa do que a segunda porção de hibridização 5'. A primeira porção de hibridização 3' tem preferencialmente 15 a 60 nucleotídeos, mais preferencialmente 15 a 40 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 15 a 30 nucleotídeos de comprimento.
[053] Preferencialmente, a segunda porção de hibridização 5' é pelo menos 3, mais preferencialmente 5 e ainda mais preferencialmente 6 nucleotídeos no comprimento. Preferencialmente, a segunda porção de hibridização 5' não tem mais do que 15, mais preferencialmente não mais do que 13 e ainda mais preferencialmente não mais do que 12 nucleotídeos de comprimento.
[054] É preferencial que a segunda porção de hibridização 5' tenha 3 a 15 nucleotídeos, mais preferencialmente 3 a 13 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 4 a 12 nucleotídeos e ainda mais preferencialmente 5 a 11 nucleotídeos de comprimento. A porção de separação tem preferencialmente 3 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 3 a 8 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 4 a 7 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 4 a 5 nucleotídeos de comprimento. O comprimento tanto da segunda porção de hibridização 5' como da porção de separação é preferencialmente pelo menos seis, mais preferencialmente pelo menos nove, ainda mais preferencialmente pelo menos doze e ainda mais preferencialmente pelo menos quinze nucleotídeos.
[055] De acordo com uma modalidade preferencial, a Tm da primeira porção de hibridização 3' varia de 40°C a 80°C, mais preferencialmente 45°C a 70°C. A Tm da segunda porção de hibridização 5' varia preferencialmente de 6°C a 40°C e mais preferencialmente de 10°C a 40°C. A Tm da porção de separação varia preferencialmente de 2°C a 15°C e mais preferencialmente 3°C a 15°C.
[056] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem uma marcação ou um sistema de marcação interativa contendo uma pluralidade de marcações para gerar um sinal detectável indicativo das sequências alvo de ácidos nucleicos.
[057] A marcação que gera um sinal detectável útil na presente invenção inclui qualquer marcação conhecida por um versado na técnica. Algumas marcações são compostas de uma molécula única ou uma marcação de átomo única; entretanto a maioria das marcações (por exemplo, sistema de marcação interativa) é composta de pelo menos duas ou mais moléculas de marcação ou átomos.
[058] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação na sonda TD é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação fluorescente, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica (por exemplo, ouro).
[059] A marcação química inclui biotina. A especificidade de ligação da biotina à estreptavidina (ou avidina) permite uma geração de sinal indireta indicativa das sequências alvo de ácidos nucleicos.
[060] A marcação enzimática inclui fosfatase alcalina, β- galactosidase, β-glicosidase, luciferase, citocromo P450 e peroxidase de rábano silvestre. Usando substratos para as marcações enzimáticas, o sinal indicativo das sequências alvo de ácidos nucleicos pode ser obtido. Onde usando fosfatase alcalina, o bromocloroindolilfosfato (BCIP), azul de nitrotetrazólio (NBT) ou ECF podem ser usados como um substrato de reações de desenvolvimento de cor no caso de utilização de peroxidase de rábano silvestre, cloronaftol, aminoetilcarbazol, diaminobenzidina, D-luciferina, lucigenina (bis-N-metilacridínio nitrato), benzil éter de resorufina, luminol, reagente Vermelho de Amplex (10- acetil-3,7-dihidroxifenoxazina), HYR (p-fenilenediamina-HCl e pirocatecol), TMB (3,3,5,5-tetrametilbenzidina), ABTS (2,2-Azina-di[3- etilbenztiazolina sulfonato]), o-fenilenediamina (OPD) ou naftol/pironina pode ser usado como um substrato; e em caso da utilização de glicose oxidase, t-NBT (azul de nitrotetrazólio) ou m-PMS (metossulfato de fenazina) podem ser usados como um substrato.
[061] A marcação radioativa inclui C14, I125, P32 e S35.
[062] De acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção, a marcação ligada à sonda TD é uma marcação única capaz de fornecer o sinal em tempo real. Por exemplo, a marcação única é quelato de térbio fluorescente (Nurmi e al, Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28 N. 8). Nurmi et al. revelaram que a marcação emite baixo nível da fluorescência em uma forma ligada à sonda, mas quando a marcação é liberada do molde da sonda dúplex pela atividade nucleolítica 5' a 3', o sinal de fluorescência é aumentado. Por isso, o quelato de térbio fluorescente permite a Detecção-alvo em tempo real embora uma marcação única seja ligada à sonda TD para a presente invenção.
[063] O sistema de marcação interativa é um sistema de geração de sinal no qual a energia é passada não radioativamente entre uma molécula doadora e uma molécula aceptora.
[064] Como um representante do sistema de marcação interativa, o sistema de marcação FRET (transferência de energia de ressonância de fluorescência) inclui uma molécula repórter fluorescente (molécula doadora) e uma molécula supressora (molécula aceptora). No FRET, o doador de energia é fluorescente, mas o aceptor de energia pode ser fluorescente ou não fluorescente.
[065] Em outra forma de sistemas de marcação interativa, o doador de energia é não fluorescente, por exemplo, um cromóforo, e o aceptor de energia é fluorescente. Ainda em outra forma de sistemas de marcação interativa, o doador de energia é luminescente, por exemplo, bioluminescente, quimioluminescente, eletroquimioluminescente, e o aceptor é fluorescente.
[066] Mais preferencialmente, a marcação na sonda TD são os sistemas de marcação interativa, ainda mais preferencialmente o sistema de marcação de FRET, ainda mais preferencialmente um par de uma molécula repórter e uma molécula supressora.
[067] Preferencialmente, onde a marcação de FRET é usada, duas marcações (uma molécula repórter e uma molécula supressora posicionada sobre a sonda TD) são separadas por um sítio dentro da sonda TD suscetível à clivagem de nuclease, pela qual permitindo a atividade de exonuclease 5' a 3' separar a molécula repórter da molécula supressora por clivagem no sítio suscetível por meio disso obtendo o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[068] A marcação pode ser ligada à sonda TD conforme métodos convencionais. Por exemplo, a marcação pode ser ligada à sonda TD através de um espaçador contendo pelo menos três átomos de carbono (por exemplo, espaçador de 3 carbonos, espaçador de 6 carbonos ou espaçador de 12 carbonos).
[069] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' ou a molécula repórter e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação. Por exemplo, a molécula repórter é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' e a molécula supressora na porção de separação. Alternativamente, a molécula supressora é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' e a molécula repórter na porção de separação.
[070] Mais preferencialmente, uma da molécula repórter e da molécula supressora é localizada na extremidade 5' da sonda TD e outra localizada em um sítio da segunda porção de hibridização 5'.
[071] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem uma da molécula repórter e da molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5' e outra na sua primeira porção de hibridização 3'.
[072] Mais preferencialmente, uma da molécula repórter e da molécula supressora é localizada na extremidade 5' da sonda TD e outra localizada em um sítio da primeira porção de hibridização 3'.
[073] A sonda TD da presente invenção tem uma larga variedade de aplicações para detecção de sequência-alvo como se segue: 1. Processo de Detecção-alvo por Reação 5' a 3' Exonucleolítica em uma Fase Líquida ou em uma Fase Sólida 1. Processo de Detecção-alvo em uma fase Líquida
[074] A sonda TD da presente invenção exibe desempenho excelente na detecção de sequência-alvo.
[075] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[076] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é duplamente marcada com uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter; pelo menos uma da molécula repórter e a molécula supressora é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5'; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[077] em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) contato do resultante da etapa (a) à enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração de um sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhum sinal de fluorescência; e (c) detecção do sinal de fluorescência, tal que o sinal de fluorescência gerado por digestão na segunda porção de hibridização 5' seja indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[078] Conforme a presente invenção, a sonda TD é hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[079] Conforme a presente invenção, a sequência-alvo de ácidos nucleicos pode ser detectada somente usando a sonda TD e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' sem sinais falsos-positivos, que é primeiro proposta pelos presentes inventores.
[080] Como representado na figura 1, a sonda TD exibe comportamentos de hibridização distintamente diferentes de cada uma das sequências alvo e não alvo de ácidos nucleicos. Quando a sonda TD é hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD formam uma fita dupla com a sequência- alvo de ácidos nucleicos. Ao contrário, onde a sonda TD é hibridizada com uma sequência não alvo de ácidos nucleicos (isto é, hibridização ou ligação não alvo), sua primeira porção de hibridização 3' frequentemente se liga à sequência não alvo de ácidos nucleicos mas tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação da sonda TD não são hibridizadas com a sequência não alvo de ácidos nucleicos tal que ambas as porções formem uma fita única.
[081] Consequentemente, onde a sonda TD é hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' é digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' (por exemplo, uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3') e a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora são separadas uma da outra para gerar o sinal de fluorescência da sequência-alvo de ácidos nucleicos. Geralmente, digestão da sonda TD ocorre inicialmente na sua extremidade 5' e posteriormente na direção 5' a 3'.
[082] Ao contrário, onde a sonda TD é hibridizada com uma sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formam uma fita única que não é digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da enzima. Finalmente, a sonda TD não gera nenhum sinal na hibridização não alvo.
[083] Por tais comportamentos únicos de hibridização da sonda TD, a sequência-alvo de ácidos nucleicos pode ser detectada somente usando a sonda TD e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' sem falsos sinais.
[084] De acordo com uma modalidade preferencial, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' usada atuando somente na extremidade 5' da fita dupla ácidos nucleicos e catalisa a reação exonucleolítica em uma direção 5' a 3', sem digestão de ácidos nucleicos de fita única.
[085] De acordo com uma modalidade preferencial, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma enzima termoestável. De acordo com uma modalidade preferencial, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde, mais preferencialmente uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde termoestável.
[086] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3'. Por exemplo, a molécula repórter fluorescente pode ser posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' e a molécula supressora na primeira porção de hibridização 3'. Alternativamente, a molécula supressora pode ser posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' e a molécula repórter fluorescente na primeira porção de hibridização 3'.
[087] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' ou a molécula repórter e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação. Ainda mais preferencialmente, a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD.
[088] É conhecido que algumas enzimas (incluindo polimerases de ácidos nucleicos dependentes do molde) tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tem também atividade de endonuclease que é geralmente muito baixa. A extensão da atividade de endonuclease pode ser afetada por tipos (i) de enzimas, (ii) condições de reação tal como temperatura, tempo da reação e composição de reação, (iii) comprimento, sequência e comprimento de sequência 5' de incompatibilidade de sondas ou (iv) sequências alvo. De acordo com uma modalidade preferencial, onde o presente método usa enzimas que têm tanto atividade de exonuclease 5' a 3' como atividade de endonuclease, é realizado sob condições suficientes para proteger a atividade de endonuclease. Preferencialmente, a presente invenção é realizada usando enzimas tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e pouca ou nada de atividade de endonuclease.
[089] Por isso, a atividade de endonuclease não é um fator considerável na Detecção-alvo usando sondas TD com uma enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e atividade de endonuclease. Entretanto, para a Detecção-alvo mais definida, um bloqueador pode ser incorporado na primeira porção de hibridização 3' da sonda TD para bloquear uma digestão catalisada pela atividade de endonuclease da primeira porção de hibridização 3' da sonda TD hibridizada com uma sequência não alvo de ácidos nucleicos. Particularmente quando a sonda TD é usada em uma fase líquida, a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora, todas podem ser posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD da Detecção-alvo mais definida.
[090] Na presente invenção, a enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' geralmente inclui enzimas tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' e normalmente inclui enzimas tendo uma atividade de endonuclease adicional bem como a atividade de exonuclease 5' a 3'. Na presente invenção, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' geralmente inclui polimerases de ácidos nucleicos tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' e normalmente inclui polimerases de ácidos nucleicos tendo uma atividade de endonuclease adicional bem como a atividade de exonuclease 5' a 3'.
[091] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD compreende pelo menos uma marcação em qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 10 nucleotídeos da sua extremidade 5', ainda mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 5 nucleotídeos da sua extremidade 5', ainda muito mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 3 nucleotídeos da sua extremidade 5'. Ainda mais preferencialmente, a sonda TD compreende pelo menos uma marcação na sua extremidade 5'.
[092] De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador a montante a ser hibridizado com um sítio a jusante de um sítio hibridizado da sonda TD e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tal que o iniciador a montante seja estendido pela polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde na etapa (b).
[093] Após hibridização, iniciador a montante hibridizado com a sequência-alvo de ácidos nucleicos é estendido pela atividade de polimerase da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde e a sonda TD é digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora, gerando o sinal de fluorescência.
[094] De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador de sentido reverso e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tal que a etapa (b) produza a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD por uma reação de extensão do iniciador de sentido reverso pela polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde.
[095] O iniciador de sentido reverso produz sequências alvo adicionais de ácidos nucleicos a serem hibridizadas com a sonda TD, resultando em obtenção de sinais de fluorescência mais evidentes e mais altos indicativos das sequências alvo de ácidos nucleicos.
[096] A molécula repórter e a molécula supressora útil na presente invenção podem ser materiais fluorescentes. As moléculas repórter e as moléculas supressoras conhecidas na técnica são úteis nesta invenção. Exemplos daqueles são: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calceína (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™- 1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™- 3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Tiadicarbocianina (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluoresceína (520), Fluoresceína-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) e Quasar 705 (610). O numérico no parêntese é um comprimento de onda de emissão máximo no nanômetro.
[097] Pares adequados dos supressores pelo repórter são revelados em uma variedade de publicações como se segue: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; Patentes U.S. Nos. 3.996.345 e 4.351.760.
[098] É notável que uma molécula supressora negra não fluorescente capaz de extinguir uma fluorescência de uma ampla faixa de comprimentos de onda ou um comprimento de onda específico possa ser usada na presente invenção. Exemplos daqueles são BHQ e DABCYL.
[099] Na marcação de FRET adaptada à sonda TD, o repórter engloba um doador de FRET e o supressor engloba outro parceiro (aceptor) de FRET. Por exemplo, um corante de fluoresceína é usado como o repórter e um corante de rodamina como o supressor.
[0100] O termo usado neste pedido "ácido nucleico alvo", "sequência-alvo de ácidos nucleicos" ou "sequência-alvo" refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos de interesse para detecção, que é anelada a ou hibridizada com um iniciador ou sonda sob condições de hibridização, anelamento ou amplificação.
[0101] O termo "sonda" usado neste pedido refere-se a uma molécula de ácidos nucleicos de fita simples que compreende uma porção ou porções que são substancialmente complementares a uma sequência-alvo de ácidos nucleicos. As sondas desta invenção podem ser compreendidas de dNMP de ocorrência natural (isto é, umidade, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado, ou nucleotídeo não natural. As sondas também podem incluir ribonucleotídeos.
[0102] Preferencialmente, a extremidade 3' da sonda marcada é bloqueada para impedir a extensão da sonda. O bloqueio pode ser alcançado usando bases não complementares ou por adição de uma porção química, tais como biotina ou um grupo fosfato à 3'-hidroxila do último nucleotídeo. O bloqueio também pode ser alcançado por remoção da 3'-OH ou usando um nucleotídeo sem uma 3'-OH, tais como um didesoxinucleotídeo.
[0103] O termo "iniciador" como usado neste pedido refere-se a um oligonucleotídeo, que é capaz de atuação como de um ponto de iniciação da síntese quando colocado sob condições em que a síntese do produto de extensão de iniciador que é complementar a uma fita de ácidos nucleicos (molde) é induzido, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente da polimerização, tal como DNA polimerase, e em uma temperatura e pH adequados. O iniciador é preferencialmente de fita única para eficiência máxima na amplificação. Preferencialmente, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo. O iniciador desta invenção pode ser compreendido de dNMP de ocorrência natural (isto é, umidade, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado, ou nucleotídeo não natural. O iniciador também pode incluir ribonucleotídeos.
[0104] O iniciador deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos de extensão na presença do agente da polimerização. O comprimento exato dos iniciadores dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação e fonte de iniciador. O termo "anelamento" ou "iniciação" como usado neste pedido refere-se à justaposição de um oligodesoxinucleotídeo ou ácido nucleico a um ácido nucleico molde, pelo qual a justaposição permite a polimerase polimerizar nucleotídeos em uma molécula de ácidos nucleicos que é complementar ao ácido nucleico molde ou uma porção do mesmo.
[0105] O termo "hibridização" usado neste pedido refere-se à formação de ácido nucleico de fita dupla a partir de ácidos nucleicos de fita única complementar. Não há nenhuma distinção desejada entre os termos "anelamento" e "hibridização", e estes termos serão usados intercambiavelmente.
[0106] O anelamento ou hibridização da sonda TD pode ser uma ampla variedade de processos de hibridização conhecidos por aqueles versados na técnica. Condições de hibridização adequadas na presente invenção podem ser rotineiramente determinadas por procedimentos de otimização. Condições, tais como temperatura, concentração de componentes, hibridização e tempo de lavagem, componentes de tampões, e seu pH e força iônica podem ser variadas dependendo de vários fatores, incluindo o comprimento e o conteúdo de GC de oligonucleotídeos, tais como sondas e sequências alvo de ácidos nucleicos. Condições detalhadas para hibridização podem ser encontradas em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); e M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y. (1999).
[0107] De acordo com uma modalidade preferencial, a temperatura de hibridização de sonda TD varia de aproximadamente 40°C a 80°C, mais preferencialmente 45°C a 75°C, ainda mais preferencialmente 50°C a 72°C.
[0108] O termo usado neste pedido "iniciador a montante" refere-se a um iniciador a ser hibridizado com um sítio a jusante de um sítio hibridizado da sonda TD e formar uma sequência complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos com o auxílio da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde.
[0109] A sonda TD, iniciador a montante e o iniciador de sentido reverso cada um tem uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos. O termo "complementar" é usado neste pedido para significar que os iniciadores ou sondas são suficientemente complementares para hibridizar seletivamente a uma sequência-alvo de ácidos nucleicos sob condições de anelamento ou condições estringentes designadas, englobando os termos "substancialmente complementar" e "perfeitamente complementar", preferencialmente perfeitamente complementar.
[0110] De acordo com uma modalidade preferencial, a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD é complementar à sequência- alvo de ácidos nucleicos. Em outras palavras, a segunda porção de hibridização 5' pode ter uma sequência de combinação perfeita ou sequência de combinação imperfeita à sequência-alvo de ácidos nucleicos. Se necessário, a segunda porção de hibridização 5' pode ser projetada para ter alguns nucleotídeos incompatíveis.
[0111] De acordo com uma modalidade específica desta invenção, a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD pode ter de um a três nucleotídeos incompatíveis adicionais na sua extremidade 5'. Entre as enzimas (por exemplo, polimerases de ácidos nucleicos) tendo atividade de exonuclease 5' a 3', houve enzimas relatadas sendo capazes de digerir de um a três nucleotídeos da extremidade 5' de oligonucleotídeos hibridizados com sequências alvo (ver Murante et al., Journal of Biological Chemistry Vol. 269. 1191-1196 (1994) e Exemplo 1). Onde tais enzimas são usadas, a sonda TD pode ser construída para ter de um a três nucleotídeos incompatíveis artificiais na sua extremidade 5'.
[0112] A sequência-alvo de ácidos nucleicos a ser detectada na presente invenção inclui qualquer molécula de ácidos nucleicos, por exemplo, DNA (gDNA e cDNA) e RNA. A sequência-alvo de ácidos nucleicos inclui qualquer ácido nucleico de ocorrência natural procariótico, eucariótico (por exemplo, protozoários e parasitas, fungos, levedura, plantas superiores, inferiores e animais superiores, incluindo mamíferos e seres humanos) ou viral (por exemplo, vírus de Herpes, HIV, vírus de influenza, vírus Epstein-Barr, vírus de hepatite, vírus de poliomielite, etc.) ou viroide.
[0113] As sequências alvo de ácidos nucleicos em uma amostra podem ser DNA ou RNA. A molécula pode estar em forma de fita dupla ou de fita simples. Onde o ácido nucleico como material inicial está em fita dupla, é preferencial fornecer as duas fitas em uma forma de fita simples ou parcialmente de fita simples. Métodos conhecidos para separar fitas incluem, mas não limitados a, tratamento com aquecimento, álcali, formamida, ureia e glicoxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicase), e proteínas de ligação. Por exemplo, a separação de fita pode ser alcançada por aquecimento na temperatura variando de 80°C a 105°C. Métodos gerais para realizar este tratamento são fornecidos por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
[0114] Onde um mRNA é empregado como material inicial, uma etapa de transcrição reversa é necessária antes da execução da etapa de anelamento, os detalhes da qual são encontrados em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Para a transcrição reversa, um hexâmero randômico ou um iniciador oligonucleotídeo dT hibridizável a uma policauda A de mRNA é usada. O iniciador oligonucleotídeo dT é compreendido de dTMPs, um ou mais dos quais podem ser substituídos com outros dNMPs contanto que o iniciador dT possa servir como iniciador. A transcrição reversa pode ser feita com transcriptase reversa que tem atividade de RNase H. Se usar uma enzima tendo atividade de RNase H, pode ser possível omitir uma etapa de digestão de RNase H separada escolhendo cuidadosamente as condições de reação.
[0115] As sondas ou iniciadores usados na presente invenção são hibridizados ou anelados a sítios nas sequências alvo de ácidos nucleicos (como moldes) em que a estrutura de fita dupla é formada. Condições de hibridização de ácidos nucleicos ou anelamento adequadas para formar tais estruturas de fita duplas são descritas por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985).
[0116] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador a montante e/ou o iniciador de sentido reverso têm uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela seguinte fórmula II geral: 5'-Xp-Yq-Zr-3' (II)
[0117] em que, Xp representa uma primeira porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo; Yq representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Zr representa uma segunda porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo; p, q e r representam o número de nucleotídeos, e X, Y e Z são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da primeira porção de hibridização 5' é mais alta do que aquela da segunda porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a primeira porção de hibridização 5' da segunda porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização ao ácido nucleico alvo, pelo qual a especificidade de hibridização do oligonucleotídeo é determinada duplamente por primeira porção de hibridização 5' e a segunda porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total do oligonucleotídeo seja aumentada.
[0118] As descrições da estrutura de DSO podem ser feitas com referência àquelas da estrutura de mDSO.
[0119] Preferencialmente, na estrutura de DSO, a primeira porção de hibridização 5' é mais longa do que a segunda porção de hibridização 3'. A primeira porção de hibridização 5' tem preferencialmente 15 a 60 nucleotídeos, mais preferencialmente 15 a 40 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 15 a 25 nucleotídeos de comprimento. É preferencial que a segunda porção de hibridização 3' tenha 3 a 15 nucleotídeos, mais preferencialmente 5 a 15 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 6 a 13 nucleotídeos de comprimento. A porção de separação tem preferencialmente 3 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 4 a 8 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 5 a 7 nucleotídeos de comprimento. De acordo com uma modalidade preferencial, a Tm de primeira porção de hibridização 5' varia de 40°C a 80°C, mais preferencialmente 45°C a 65°C. A Tm da segunda porção de hibridização 3' varia preferencialmente de 10°C a 40°C. É preferencial que a Tm da porção de separação varie de 3°C a 15°C.
[0120] Preferencialmente, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' usada na presente invenção pode incluir qualquer polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' (por exemplo, DNA polimerase I de E. coli, uma DNA polimerase termoestável e DNA polimerase de bacteriófago T7), ainda mais preferencialmente uma DNA polimerase termoestável obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus, Thermus filiformis, Thermus flavus, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, espécies Thermus Z05 e espécies Thermus sps 17. Ainda mais preferencialmente, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é Taq DNA polimerase.
[0121] Pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' (preferencialmente, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3'), a sonda TD é clivada e o sinal indicativo da sequência-alvo de ácidos nucleicos é gerado. O sinal pode ser detectado ou medido por métodos convencionais para cada marcação. Por exemplo, o sinal de fluorescência pode ser detectado ou medido por métodos convencionais, por exemplo, fluorômetros.
[0122] O termo "geração de sinal" é usado neste pedido para englobar uma modificação na intensidade de sinal fluorescente, incluindo não somente aumento na intensidade de sinal fluorescente mas também redução na intensidade de sinal fluorescente. De acordo com uma modalidade preferencial, o sinal indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos a ser detectada é um sinal da molécula repórter fluorescente. Alternativamente, a molécula supressora é fluorescente e o sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos a ser detectada é um sinal da molécula supressora fluorescente.
[0123] Quando a sonda TD é hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não é digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhum sinal de fluorescência.
[0124] O termo "sem sinal de fluorescência" se refere a nenhum sinal de fluorescência bem como sinal de fluorescência insignificante. Por exemplo, o termo engloba a intensidade de fluorescência geralmente medida ou observada para controle negativo ou referência.
[0125] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c), e para a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c), a presente invenção compreende ainda a desnaturação entre ciclos de repetição.
[0126] Métodos da desnaturação incluem, mas não limitados a, tratamento com aquecimento, álcali, formamida, ureia e glicoxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicase) e proteínas de ligação. Por exemplo, a desnaturação pode ser alcançada por aquecimento na temperatura variando de 80°C a 105°C. Métodos gerais para realização deste tratamento são fornecidos por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
[0127] A repetição permite aumentar a intensidade do sinal de fluorescência da molécula repórter fluorescente. Especialmente, a repetição no presente método usando iniciadores de sentido reverso permite aumentar as quantidades da sequência-alvo de ácidos nucleicos, contribuindo para aumentar em intensidade do sinal de fluorescência da molécula repórter fluorescente.
[0128] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada por um iniciador de amplificação.
[0129] A sequência-alvo pré-amplificada de ácidos nucleicos pode incluir uma sequência-alvo de ácidos nucleicos pré-amplificada em outro ambiente de reação (ou vaso de reação) que não um ambiente de reação (ou vaso de reação) para as etapas (a) - (c).
[0130] Onde a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c), é preferencial que a detecção de sinal seja realizada para cada ciclo da repetição (isto é, maneira em tempo real), no fim da repetição (isto é, maneira de ponto final) ou em cada um de intervalos de tempo predeterminados durante a repetição. Preferencialmente, a detecção de sinal pode ser realizada para cada ciclo da repetição para melhorar a exatidão da detecção.
[0131] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de amplificação (por exemplo, incluindo um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso) para a produção de sequências alvo pré- amplificadas de ácidos nucleicos tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela fórmula II geral descrita acima.
[0132] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'. De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador é posicionado em um sítio da sonda TD clivada pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e preferencialmente na porção de hibridização 3' da sonda TD.
[0133] Quando uma enzima tendo atividades de exonuclease e de endonuclease 5' a 3' (por exemplo, uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividades de exonuclease e de endonuclease 5' a 3') é usada, para Detecção-alvo mais definida, um bloqueador pode ser incorporado na primeira porção de hibridização 3' de uma sonda TD para bloquear a digestão catalisada por endonuclease pela atividade da primeira porção de hibridização 3' da sonda TD hibridizada com uma sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[0134] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' e o sítio bloqueador é posicionado em um sítio a ser clivado pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' quando a sonda TD é hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos; em que quando a sonda TD que tem o sítio bloqueador é hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' é digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração do sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD tendo o sítio bloqueador é hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, não é digerida pela enzima tendo uma atividade de exonuclease para não gerar nenhum sinal de fluorescência.
[0135] De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador da sonda TD é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD. Mais preferencialmente, o sítio bloqueador da sonda TD é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' adjacente à extremidade 3' da porção de separação.
[0136] De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador compreende 1 a 15 bloqueadores, mais preferencialmente 2 a 10 bloqueadores, ainda mais preferencialmente 3 a 5 bloqueadores.
[0137] Nucleotídeos que servem como bloqueadores, isto é, os que têm um esqueleto resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' incluem qualquer um conhecido por um versado na técnica. Por exemplo, incluem várias ligações fosforotioato, ligações fosfonato, ligações fosforoamidato e modificações de 2'- carboidratos. De acordo com uma modalidade preferencial, os nucleotídeos tendo um esqueleto resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' incluem ligação fosforotioato, ligação alquil fosfotriéster, ligação aril fosfotriéster, ligação alquil fosfonato, ligação aril fosfonato, ligação hidrogeno fosfonato, ligação alquil fosforoamidato, ligação aril fosforoamidato, ligação fosforoselenato, modificação 2'-O-aminopropil, modificação 2'-O-alquil, modificação 2'-O-alil, modificação 2'-O-butil, oligodesoxinucleotídeo α- anomérico e modificação 1-(4'-tio-β-D-ribofuranosil). O nucleotídeo bloqueador presente na sonda TD pode ser um ou mais de maneira contínua ou intermitente.
[0138] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos e a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas.
[0139] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas e o iniciador a montante compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores.
[0140] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas e o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores.
[0141] Além disso, a presente invenção é muito útil na detecção de uma variação de nucleotídeo. O termo "variação de nucleotídeo" usada neste pedido refere-se a um polimorfismo de nucleotídeo em uma sequência de DNA em uma posição particular entre segmentos de DNA contíguos que são de outra forma similares na sequência. Tais segmentos de DNA contíguos incluem um gene ou qualquer outra porção de um cromossomo. Por exemplo, a variação de nucleotídeo detectada na presente invenção inclui SNP (polimorfismo de nucleotídeo único), deleção, inserção, substituição e translocação. A variação de nucleotídeo exemplificada inclui numerosas variações em um genoma humano (por exemplo, variações no gene de MTHFR (metilenotetrahodrofolato redutase)), variações envolvidas na resistência a fármaco por patógenos e variações causadoras de tumorigênese.
[0142] De acordo com uma modalidade preferencial, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' de uma sonda TD. 2. Processo de Detecção-alvo em uma fase Sólida
[0143] A presente invenção tem adaptabilidade excelente em uma fase sólida (por exemplo, microarranjo) bem como em uma fase líquida.
[0144] Em outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos em uma fase sólida de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície do substrato sólido; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0145] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD tem uma marcação que gera um sinal detectável e a marcação é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[0146] em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) contato do resultante da etapa (a) à enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para liberar a marcação da sonda TD, resultando em uma modificação de sinal na sonda TD imobilizada no substrato sólido; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhuma modificação de sinal, pelo qual a modificação de sinal no substrato sólido é detectada para determinar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (c) detecção da modificação de sinal no substrato sólido, tal que a modificação de sinal por digestão na segunda porção de hibridização 5' seja indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0147] Uma vez que o processo da presente invenção na fase sólida usa a sonda TD e segue as etapas do presente método descrito na fase líquida, as descrições comuns entre elas são omitidas a fim de evitar redundância excessiva levando à complexidade este Relatório Descritivo.
[0148] Para a reação de fase sólida, a sonda TD pode ser imobilizada diretamente ou indiretamente (preferencialmente indiretamente) pela sua extremidade 3' à superfície do substrato sólido. Além disso, as sondas podem ser imobilizadas na superfície do substrato sólido de uma forma covalente ou não covalente. Onde as sondas imobilizadas são imobilizadas à superfície do substrato sólido, ligantes adequados são usados. Ligantes úteis nesta invenção podem incluir qualquer ligante utilizado para a imobilização de sonda em um microarranjo. Por exemplo, compostos alquila, ou arila com funcionalidade de amina, ou compostos alquila ou arila com funcionalidade de tiol servem como ligantes para imobilização da sonda. Além disso, bases poli (T) ou bases poli (A) podem ser usadas como um ligante para minimizar o impedimento espacial de reações enzimáticas (por exemplo, reações de clivagem enzimáticas) ou aumentar a eficiência de hibridização. Pode ser apreciado que bases poli (T) ou bases poli (A) não são consideradas como uma sequência que transpõe a sonda TD. Por exemplo, bases poli (T) ou bases poli (A) ligadas à extremidade da primeira porção de hibridização 3' da sonda TD não são consideradas como a primeira porção de hibridização 3'.
[0149] De acordo com uma modalidade preferencial, o substrato sólido usado na presente invenção é um microarranjo. O microarranjo para fornecer um ambiente de reação nesta invenção pode incluir qualquer um dos conhecidos por um versado na técnica. Todos os processos da presente invenção, isto é, anelamento para ácido nucleico alvo, extensão/digestão e detecção de fluorescência, são realizados em microarranjo. As sondas imobilizadas em microarranjo servem como elementos de arranjo hibridizáveis. O substrato sólido para fabricar o microarranjo inclui, mas não limitado a, metais (por exemplo, ouro, liga de ouro e cobre, alumínio), óxido metálico, vidro, cerâmica, quartzo, silício, semicondutor, wafer Si/SiO2, germânio, arsenito de gálio, carbono, nanotubo de carbono, polímeros (por exemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno e poliacrilamida), sefarose, agarose e coloides. Uma pluralidade de sondas imobilizadas nesta invenção pode ser imobilizada em uma região endereçável ou duas ou mais regiões endereçáveis em um substrato sólido que pode compreender 2 a 1.000.000 regiões endereçáveis. Sondas imobilizadas podem ser fabricadas para produzir arranjo ou arranjos de uma dada aplicação por tecnologias de fabricação convencionais, tais como fotolitografia, jato de tinta, micropontos mecânicos, e derivados dos mesmos.
[0150] De acordo com uma modalidade preferencial, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma enzima termoestável. De acordo com uma modalidade preferencial, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde, mais preferencialmente uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde termoestável.
[0151] De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador a montante a ser hibridizado com um sítio a jusante de um sítio hibridizado da sonda TD e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tal que o iniciador a montante seja estendido pela polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde na etapa (b).
[0152] De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador de sentido reverso e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tal que a etapa (b) produza a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD por uma reação de extensão do iniciador de sentido reverso pela polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde.
[0153] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação fluorescente, uma marcação interativa, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica.
[0154] Como mostrado na figura 4 ou 5, o presente método na fase sólida pode ser realizado usando uma marcação única (por exemplo, uma marcação fluorescente única) ou uma marcação interativa (por exemplo, uma molécula repórter e uma molécula supressora).
[0155] Por exemplo, onde a sonda TD que tem uma marcação fluorescente única é usada para a detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos, a marcação fluorescente na segunda porção de hibridização 5' é liberada da sonda TD imobilizada no substrato sólido, levando a diminuir em intensidade de sinal de fluorescência no substrato sólido. A redução ou eliminação do sinal de fluorescência podem indicar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0156] De acordo com uma modalidade preferencial, onde a marcação única é uma molécula repórter fluorescente, a modificação de sinal é a redução ou eliminação de sinais de fluorescência no substrato sólido.
[0157] De acordo com uma modalidade preferencial, onde a sonda TD tendo uma marcação fluorescente única é usada, a etapa de lavagem é opcionalmente ainda compreendida antes da detecção na etapa (c). Alternativamente, onde a sonda TD tendo uma marcação fluorescente única é usada, a etapa de lavagem não é compreendida antes da detecção na etapa (c).
[0158] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula fluorescente única é posicionada em um sítio na segunda porção de hibridização 5' a ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0159] Para clareza, deve ser apreciado que a frase "um sítio na segunda porção de hibridização 5' a ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'" significa que toda, uma parte ou uma posição da segunda porção de hibridização 5' pode ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e a marcação pode ser posicionada em qualquer sítio a ser digerido na segunda porção de hibridização 5'. Por isso, a frase "um sítio na segunda porção de hibridização 5' a ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'" pode ser escrita como "um sítio a ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', na segunda porção de hibridização 5'".
[0160] Mais preferencialmente, a molécula fluorescente única é posicionada em qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 10 nucleotídeos de extremidade 5', ainda mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 5 nucleotídeos de extremidade 5', ainda muito mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 3 nucleotídeos de extremidade 5' da sonda TD. Ainda mais preferencialmente, a molécula fluorescente única é posicionada sobre em extremidade 5' da sonda TD.
[0161] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação é o sistema de marcação interativa compreendendo um par de uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora.
[0162] De acordo com uma modalidade preferencial, uma da molécula repórter e da molécula supressora são posicionadas em um sítio na segunda porção de hibridização 5' de uma sonda TD e outra em um sítio a não ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0163] De acordo com uma modalidade preferencial, uma da molécula repórter e da molécula supressora são posicionadas em um sítio a ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', na segunda porção de hibridização 5' da sonda TD e outra em um sítio a não ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0164] De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio a não ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' pode existir na segunda porção de hibridização 5', porção de separação ou primeira porção de hibridização 3' de uma sonda TD.
[0165] De acordo com uma modalidade preferencial, onde o presente método é realizado na fase sólida, a sonda TD é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície de um substrato sólido; em que a molécula supressora é posicionada em um sítio na segunda porção de hibridização 5' da sonda TD a ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e a molécula repórter fluorescente é posicionada em um sítio a não ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração do sinal de fluorescência da molécula repórter; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhum sinal de fluorescência, pelo qual o sinal fluorescente no substrato sólido é detectado para determinar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0166] Onde a sonda TD imobilizada é hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, é digerido por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' da extremidade 5' em direção à extremidade 3'. Neste tempo, a ligação entre um fragmento da sonda TD imobilizada e o ácido nucleico alvo fica mais fraca, por meio disso resultando na liberação do ácido nucleico alvo do fragmento da sonda TD imobilizada no substrato sólido. Neste sentido, pode ser considerado que a sonda imobilizada TD tem duas porções, uma porção digerida e uma porção não digerida pela enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'. Por isso, a marcação posicionada sobre a porção não digerida da sonda permanece na superfície do substrato sólido.
[0167] Considerando os modelos de digestão da sonda TD imobilizada, pode ser entendido que a sonda TD também pode ter uma porção digerida e uma porção não digerida dentro da segunda porção de hibridização 5'. A formação da porção digerida e porção não digerida dentro da sonda TD pode ser afetada pela porção de separação.
[0168] De acordo com uma modalidade preferencial, quando um bloqueador, tal como nucleotídeos modificados ou esqueletos resistentes à atividade de exonuclease 5' a 3' é incorporado em um sítio da sonda TD entre uma molécula supressora e uma molécula repórter, a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' não é capaz de digestão adicional da sonda TD devido à presença do bloqueador tal que a marcação única contendo o fragmento da sonda TD imobilizada como uma porção indigesta permaneça no substrato sólido.
[0169] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula supressora é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' a ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0170] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' a não ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0171] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente é posicionada sobre a primeira porção de hibridização 3' a não ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0172] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente posicionada em um sítio a não ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' permanece na superfície do substrato sólido após a etapa (b), que permite detectar convenientemente o sinal de fluorescência da molécula repórter de uma maneira em tempo real sem as etapas de lavagem.
[0173] Preferencialmente, a molécula supressora é posicionada na extremidade 5' da sonda TD ou 1-3 nucleotídeos à parte da extremidade 5' e a molécula repórter fluorescente é posicionada sobre a extremidade 3' adjacente da sonda TD ou no meio da primeira porção de hibridização 3' da sonda TD.
[0174] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula supressora é posicionada em qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 10 nucleotídeos de extremidade 5', ainda mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 5 nucleotídeos de extremidade 5', ainda muito mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 3 nucleotídeos de extremidade 5' da sonda TD. Ainda mais preferencialmente, a molécula supressora é posicionada sobre a extremidade 5' da sonda TD.
[0175] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter é posicionada em qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 30 nucleotídeos de extremidade 3', ainda mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 20 nucleotídeos de extremidade 3', ainda muito mais preferencialmente, qualquer sítio de uma sequência compreendendo 1 a 15 nucleotídeos de extremidade 3' da sonda TD.
[0176] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador a montante e/ou o iniciador de sentido reverso têm uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela fórmula II geral descrita acima.
[0177] De acordo com uma modalidade preferencial, a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c) e para a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c), a presente invenção compreende ainda a desnaturação entre os ciclos de repetição.
[0178] Onde a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c), é preferencial que a detecção de sinal seja realizada a cada ciclo de repetição (isto é, em tempo real), no fim da repetição (isto é, em ponto final) ou em cada um de intervalos de tempo predeterminados durante a repetição. Preferencialmente, a detecção de sinal pode ser realizada para cada ciclo da repetição para melhorar a exatidão de detecção e ainda quantificar o ácido nucleico alvo.
[0179] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada por um iniciador de amplificação.
[0180] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de amplificação (por exemplo, incluindo um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso) para a produção de sequências alvo pré- amplificadas de ácidos nucleicos tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela fórmula II geral descrita acima.
[0181] De acordo com uma modalidade preferencial, as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente com a amplificação da sequência- alvo de ácidos nucleicos para detectar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma maneira em tempo real.
[0182] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'. De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador é posicionado em um sítio da sonda TD clivada pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e preferencialmente na porção de hibridização 3' da sonda TD.
[0183] De acordo com outra modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente a uma atividade de exonuclease 5' a 3' de uma enzima (por exemplo, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3') e o sítio bloqueador é posicionado em um sítio clivado pela atividade de endonuclease da enzima quando a sonda TD é hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[0184] De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador da sonda TD é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD. Mais preferencialmente, o sítio bloqueador da sonda TD é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' adjacente à extremidade 3' da porção de separação.
[0185] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos e a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas.
[0186] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas e o iniciador a montante compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores.
[0187] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas e o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores.
[0188] Além disso, a presente invenção é muito útil na detecção de uma variação de nucleotídeo.
[0189] De acordo com uma modalidade preferencial, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' de uma sonda TD. II. Modalidade Preferencial: Ensaio de PCR em Tempo Real Usando a Sonda TD
[0190] Preferencialmente, a presente invenção é realizada simultaneamente com a amplificação da sequência-alvo de ácidos nucleicos usando um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso capaz de amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos. Preferencialmente, a amplificação é realizada conforme PCR (reação de polimerase em cadeia) que é revelado nas Patentes U.S. Nos. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159.
[0191] Ainda em outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e uma reação de polimerase em cadeia (PCR), que compreende as etapas de: (a) preparação de uma mistura de PCR contendo (i) a sequência-alvo de ácidos nucleicos, (ii) a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos, (iii) um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso cada um tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos, e (iv) uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'; em que a sonda TD é hibridizada com um sítio entre os dois iniciadores; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0192] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é duplamente marcada com uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter; a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5', ou a molécula repórter e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; A Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[0193] em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) amplificação da sequência-alvo de ácidos nucleicos usando a mistura de PCR pela execução de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, em que os dois iniciadores são estendidos por uma atividade de polimerase da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde para amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração de um sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tal que a molécula repórter fluorescente não seja separada da molécula supressora na sonda TD, não resultando em nenhum sinal de fluorescência; e (c) detecção do sinal de fluorescência, tal que o sinal de fluorescência gerado seja indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0194] Uma vez que o ensaio de PCR em tempo real da presente invenção usa a sonda TD e segue as etapas do presente método descrito acima, as descrições comuns entre elas são omitidas a fim de evitar redundância excessiva levando à complexidade este Relatório Descritivo.
[0195] Em um ensaio de PCR em tempo real usando reações nucleolíticas 5' a 3', as polimerases de ácidos nucleicos dependentes de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' são empregadas para amplificação alvo bem como geração de sinal (por exemplo, método de sonda TaqMan). Como descrito mais acima, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde pode ter duas atividades nucleolíticas incluindo atividade de exonuclease 5' a 3' e atividade de endonuclease. A atividade de endonuclease pode causar a geração de sinais falsos-positivos em processos acompanhados com a amplificação alvo.
[0196] Para superar completamente problemas e incômodo associado com a atividade de endonuclease, a presente invenção adota uma estratégia única na qual todas as marcações duais são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD.
[0197] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD ou a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação da sonda TD na reação PCR em tempo real.
[0198] Mesmo que a atividade de endonuclease da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde possa atuar no sítio de bifurcação formado na primeira porção de hibridização 3' quando a sonda TD é hibridizada com sequências não alvo de ácidos nucleicos durante a PCR em tempo real, a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' não são separadas uma da outra, tal que um sinal fluorescente da molécula repórter fluorescente não é gerado pela atividade de endonuclase.
[0199] Neste sentido, o ensaio de PCR em tempo real da presente invenção assegura completamente a eliminação de qualquer possibilidade de geração de sinal falsa.
[0200] De acordo com uma modalidade preferencial, a detecção de sinal é realizada para cada ciclo da repetição (isto é, maneira em tempo real), no fim da repetição (isto é, maneira de ponto da extremidade) ou em cada um de intervalos de tempo predeterminados durante a repetição. Preferencialmente, a detecção de sinal pode ser realizada para cada ciclo da repetição para melhorar a exatidão de detecção.
[0201] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas, o iniciador de sentido direto compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores e o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de iniciadores.
[0202] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo.
[0203] De acordo com uma modalidade preferencial, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' de uma sonda TD.
[0204] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de sentido direto e/ou o iniciador de sentido reverso tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela fórmula II geral descrita acima. III. Processo de Detecção-alvo por Reação de Ligação em uma Fase Líquida ou em uma Fase Sólida
[0205] No aspecto adicional desta invenção, é fornecido um método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com uma primeira sonda tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um primeiro sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos e uma segunda sonda tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um segundo sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos que é posicionada a montante do primeiro sítio; em que pelo menos uma da primeira sonda e da segunda sonda tem uma marcação para gerar um sinal detectável; em que a segunda sonda é uma sonda TD; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0206] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a segunda sonda for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' da segunda sonda serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos para permitir a ligação da primeira sonda e a segunda sonda; em que quando a segunda sonda for hibridizada com a sequência de ácidos nucleicos não alvo, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação da segunda sonda formarão uma fita única tal que a primeira sonda e a segunda sonda não sejam ligadas, pelo qual a segunda sonda permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) ligação da primeira sonda e da segunda sonda hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos tal que uma sonda ligada seja produzida; (c) desnaturação do resultante da etapa (b); (d) detecção do sinal de marcação na sonda ligada tal que o sinal seja indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0207] Uma vez que o presente método usando reações de ligação emprega a sonda TD, as descrições comuns são omitidas a fim de evitar redundância excessiva levando à complexidade este Relatório Descritivo.
[0208] O presente método pode ser realizado em uma fase líquida ou em uma fase sólida. Preferencialmente, o presente método é realizado em uma fase sólida.
[0209] No presente método usando as reações de ligação, a primeira sonda e a segunda sonda são primeiro hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos. A segunda sonda é a sonda TD descrita acima. A primeira sonda tem uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao primeiro sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda sonda tem uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um segundo sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos que é posicionada a montante do primeiro sítio. A primeira sonda e a segunda sonda devem ser hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos na ordem descrita acima. A menos que as posições de hibridização da primeira sonda e a segunda sonda sejam cumpridas como acima mencionadas, a Detecção-alvo- específica pela presente invenção não é realizada.
[0210] De acordo com uma modalidade preferencial, a primeira sonda e a segunda sonda são posicionadas em posições imediatamente adjacentes entre si quando hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0211] O posicionamento adjacente é necessário para reações de ligação entre as duas sondas. O termo "adjacente" usado neste pedido em conjunto com posições de hibridização da primeira sonda e a segunda sonda significa que a extremidade 3' de uma sonda e a extremidade 5' de outra sonda está suficientemente perto uma da outra para permitir a conexão das extremidades de ambas as sondas entre si.
[0212] De acordo com uma modalidade preferencial, a extremidade 3' da primeira sonda tem um grupo hidroxila e a extremidade 5' da segunda sonda tem um grupo fosfato.
[0213] O termo "imediatamente adjacente" usado neste pedido em conjunto com posições de hibridização da primeira sonda e da segunda sonda significa que se refere a uma proximidade suficiente entre duas sondas para permitir a extremidade 5' da segunda sonda que é trazida em justaposição com a extremidade 3' da primeira sonda para que possam ser ligadas por um agente adequado, tal como ligase. Onde a extremidade 5' da segunda sonda é o nucleotídeo 0 além da extremidade 3' da primeira sonda, ambas as sondas geram uma lacuna a ser ligada por ligase.
[0214] A primeira sonda ou a segunda sonda tem uma marcação para gerar um sinal detectável. Alternativamente, tanto a primeira sonda como a segunda sonda têm uma marcação.
[0215] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação fluorescente, uma marcação interativa, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica.
[0216] Mais preferencialmente, a marcação é o sistema de marcação interativa compreendendo um par de uma molécula repórter e uma molécula supressora. Por exemplo, a primeira sonda é marcada com a molécula repórter ou com a molécula supressora e a segunda sonda é marcada com a molécula supressora ou com a molécula repórter.
[0217] De acordo com uma modalidade preferencial, a primeira sonda tem uma estrutura de oligonucleotídeo específico dual (DSO) representada pela fórmula II geral descrita acima.
[0218] Mais preferencialmente, a primeira sonda tem a estrutura de DSO e a segunda sonda é a sonda TD e a extremidade 3' da primeira sonda é posicionada imediatamente adjacente à extremidade 5' da segunda sonda.
[0219] A exatidão na detecção de sequências alvo usando sondas geralmente depende da especificidade de sondas a sequências alvo. Onde a primeira sonda tendo a estrutura de DSO e a segunda sonda tendo a estrutura de mDSO (sonda TD) é usada, a segunda porção de hibridização 3' da primeira sonda e a segunda porção de hibridização 5' da segunda sonda são posicionadas imediatamente adjacentes entre si quando as duas sondas são hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos. Então, a segunda porção de hibridização 3' da primeira sonda e a segunda porção de hibridização 5' da segunda sonda são ligadas. Quando a primeira sonda e a segunda sonda são hibridizadas com a sequência não alvo, somente suas primeiras porções de hibridização estão envolvidas na hibridização não específica mas suas segundas porções de hibridização cada uma forma uma fita única, não resultando em nenhuma ligação da primeira sonda e da segunda sonda (figura 6).
[0220] Como descrito acima, pode ser entendido que o par de sondas da primeira sonda tendo a estrutura de DSO e a segunda sonda que tem a estrutura de mDSO é completamente livre de resultados falsos-positivos na Detecção-alvo.
[0221] Após hibridização, a primeira sonda e a segunda sonda hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos são ligadas.
[0222] Uma vez que a ligação enzimática é o método preferencial de ligação covalente da primeira sonda e a segunda sonda, o termo "ligação" será usado ao longo do pedido de patente. Entretanto, o termo "ligação" é um termo geral e deve ser entendido incluir qualquer método de ligação covalente de ambas as sondas. Uma alternativa para a ligação enzimática é fotoligação como descrito na EP 0324616.
[0223] A ligação na presente invenção pode ser realizada de acordo com ambos os métodos alternativos: Em primeiro lugar, a ligação pode ser realizada por um método de ligação preenchedor de lacuna (Patente U.S. No. 6.004.826). A extremidade 3' de uma sonda estendida por polimerases de DNA é ligada à extremidade 5' de outra sonda. Em segundo lugar, a ligação pode ser realizada por um método de selagem de lacuna sem reações de extensão.
[0224] De acordo com uma modalidade preferencial, a ligação na presente invenção é realizada pela selagem de lacuna sem mais reações de extensão para unir a extremidade 3' de uma sonda à extremidade 5' de outra sonda.
[0225] As reações de ligação podem ser realizadas usando uma larga variedade de agentes de ligação, incluindo agentes de ligação enzimáticos e agentes de ligação não enzimáticos tais como agentes químicos e de fotoligação. Agentes químicos de ligação incluem, sem limitação, agentes de ativação, condensação e redução, tais como carbodi-imida, brometo de cianogênio (BrCN), N-cianoimidazol, imidazol, 1-metilimidazol/carbodi-imida/cstamina, ditiotreitol (DTT) e luz ultravioleta. A autoligação, isto é, ligação espontânea na ausência de um agente de ligação, está também dentro do escopo dos ensinamentos neste pedido. Protocolos detalhados de métodos de ligação química e as descrições de grupos reativos apropriados podem ser encontrados em Xu et al., Nucl. Acids Res., 27:875-81 (1999); Gryaznov e Letsinger, Nucl. Acids Res. 21:1403-08 (1993); Gryaznov et al., Nucl. Acids Res. 22:2366-69 (1994); Kanaya e Yanagawa, Biochemistry 25:7423-30 (1986); Luebke e Dervan, Nucl. Acids Res. 20:3005-09 (1992); Sievers e von Kiedrowski, Nature 369:221-24 (1994); Liu e Taylor, Nucl. Acids Res. 26:3300-04 (1999); Wang e Kool, Nucl. Acids Res. 22:2326-33 (1994)).
[0226] Fotoligação usando luz de um comprimento de onda apropriado como um agente de ligação também está dentro do escopo dos ensinamentos. Em certas modalidades, a fotoligação compreende sondas compreendendo análogos de nucleotídeos, incluindo mas não limitados a, 4-tiotimidina (s4T), 5-viniluracil e seus derivados, ou combinações dos mesmos. Em certas modalidades, o agente de ligação compreende: (a) luz na faixa de UV-A (aproximadamente 320 nm a aproximadamente 400 nm), a faixa de UV-B (aproximadamente 290 nm a aproximadamente 320 nm), ou combinações das mesmas, (b) luz com um comprimento de onda entre aproximadamente 300 nm e aproximadamente 375 nm, (c) luz com um comprimento de onda de aproximadamente 360 nm a aproximadamente 370 nm; (d) luz com um comprimento de onda de aproximadamente 364 nm a aproximadamente 368 nm, ou (e) luz com um comprimento de onda de aproximadamente 366 nm. Descrições de fotoligação podem ser encontradas em, entre outros lugares, Fujimoto et al., Nucl. Acid Symp. Ser. 42:39-40 (1999); Fujimoto et al., Nucl. Acids Res. Suppl. 1:185-86 (2001); Fujimoto et al., Nucl. Acids Suppl., 2:155-56 (2002); Liu e Taylor, Nucl. Acids Res. 26:3300-04 (1998).
[0227] De acordo com uma modalidade preferencial, a reação de ligação é realizada usando uma ligase, tal como ligase de bacteriófago T4, ligase de E. coli e ligase termoestável. Mais preferencialmente, a reação de ligação é realizada usando ligase termoestável incluindo Afu ligase, Taq ligase, Tfl ligase, Mth ligase, Tth ligase, Tth HB8 ligase, as espécies AK16D Thermus ligase, Ape ligase, LigTk ligase, Aae ligase, Rm ligase e Pfu ligase (Housby et al., Nucl. Acids Res. 28:e10 (2000); Tong et al., Nucl. Acids Res. 28:1447-54 (2000); Nakatani et al., Eur, J. Biochem. 269:650-56 (2002); Zirvi et al., Nucl. Acids Res. 27:e40 (1999); Sriskanda et al., Nucl. Acids Res. 11:2221-28 (2000)).
[0228] A ligação de internucleotídeos gerada por ligação inclui ligação fosfodiéster e outras ligações. Por exemplo, a ligação usando ligases geralmente produz ligações fosfodiéster. Métodos não enzimáticos de ligação podem formar outras ligações de internucleotídeo. Outras ligações de internucleotídeos incluem, sem limitação, a formação de ligação covalente entre grupos reativos apropriados tal como entre um grupo α-haloacil e um grupo fosfotioato para formar um grupo thiofosforilacetilamino, um grupo fosforotioato e tosilato ou iodeto para formar um 5'-fosforotioéster, e ligações pirofosfato.
[0229] Após reação de ligação, seu resultante então é desnaturado para separar da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0230] No presente método realizado em fase sólida, a primeira sonda ou a segunda sonda como uma sonda imobilizada é imobilizada na superfície do substrato sólido. Outra sonda como uma sonda mobilizada não é imobilizada.
[0231] Mais preferencialmente, no método realizado em fase sólida, a primeira sonda é imobilizada pela sua extremidade 5' na superfície de um substrato sólido e a segunda sonda não é imobilizada. Alternativamente, no método realizado em fase sólida, a segunda sonda é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície do substrato sólido e a primeira sonda não é imobilizada (figura 6).
[0232] Onde uma molécula de marcação única é usada na fase sólida, é preferencialmente posicionada sobre a sonda mobilizada (figura 7).
[0233] Quando as duas sondas são hibridizadas com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, não são ligadas entre si e a sonda mobilizada é separada da sonda imobilizada durante a desnaturação tal que nenhum sinal seja gerado.
[0234] Como tal, a etapa de desnaturação é um dos controles para detectar especificamente a sequência-alvo de ácidos nucleicos na presente invenção.
[0235] Finalmente, o sinal de marcação em uma ligação da primeira sonda e a segunda sonda é detectado para identificar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0236] De acordo com uma modalidade preferencial, o método de fase sólida pré-ajustado ainda compreende, antes da etapa (d), lavagem do resultante da etapa (c) para a remoção da sonda mobilizada não ligada com a sonda imobilizada.
[0237] De acordo com uma modalidade preferencial, o método compreende ainda a repetição das etapas (a) - (c) ou (a) - (d).
[0238] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada na etapa (a) é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada usando um iniciador de amplificação. Preferencialmente, o iniciador de amplificação tem a estrutura de oligonucleotídeo de hibridização dual (DSO) representada pela fórmula II geral.
[0239] A sequência-alvo pré-amplificada de ácidos nucleicos pode incluir uma sequência-alvo de ácidos nucleicos pré-amplificada em outro ambiente de reação (ou vaso de reação) que não um ambiente de reação (ou vaso de reação) para as etapas (a) - (c). Alternativamente, a sequência-alvo pré-amplificada de ácidos nucleicos pode ser obtida no mesmo ambiente de reação (ou vaso de reação) como um ambiente de reação (ou vaso de reação) para as etapas (a) - (c).
[0240] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácidos nucleicos, a primeira sonda compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas e a segunda sonda compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sondas.
[0241] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo, mais preferencialmente um SNP (polimorfismo de nucleotídeo único).
[0242] De acordo com uma modalidade preferencial, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da segunda sonda. IV. Processo de Detecção-alvo por Modificação de Sinal Fluorescente Dependendo da Hibridização em uma Fase Líquida ou em uma Fase Sólida
[0243] Ainda em um aspecto adicional desta invenção, é fornecido um método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0244] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é marcada com uma molécula repórter fluorescente na segunda porção de hibridização 5'; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[0245] em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos para induzir uma modificação na fluorescência da molécula repórter fluorescente; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única para não induzir modificação na fluorescência da molécula repórter fluorescente, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; e (b) detecção da fluorescência modifica-se tal que a modificação de fluorescência seja indicativa da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos.
[0246] Uma vez que a presente invenção utiliza os diferentes modelos de hibridização da segunda porção de hibridização 5' da sonda TD, as descrições comuns são omitidas a fim de evitar redundância excessiva levando à complexidade este Relatório Descritivo.
[0247] Foi revelado que um oligonucleotídeo marcado com o fluoróforo único gera a emissão de fluorescência diferente em estados de fita simples e de fita dupla (ver Patentes U.S. Nos., 7.348.141 e 7.537.886).
[0248] Encontramos que quando a sonda TD é marcada com uma molécula repórter fluorescente única na sua segunda porção de hibridização 5', uma intensidade de fluorescência diferente foi gerada dependendo da hibridização com sequências alvo ou não alvo de ácidos nucleicos.
[0249] A modificação na fluorescência do repórter fluorescente a ser detectada finalmente inclui a redução na fluorescência bem como o aumento na fluorescência. Os tipos de fluorescência na qual a modificação pode ser detectada incluem, mas não limitados a, intensidade da fluorescência, polarização da fluorescência, tempo de vida da fluorescência e rendimento de quantum da fluorescência. Ainda mais preferencialmente, a fluorescência a ser detectada é a intensidade da fluorescência da molécula repórter fluorescente.
[0250] A modificação na fluorescência do repórter fluorescente na hibridização com sequências alvo é dependente de vários fatores, tais como tipos e posições de marcações, como encontrado nas Patentes U.S. Nos., 7.348.141 e 7.537.886.
[0251] A molécula repórter fluorescente usada na presente invenção pode ser descrita com a referência a descrições indicadas acima. De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente é a molécula baseada de uma fluoresceína (ex., JOE, TET ou FAM), molécula baseada em rodamina (ex., TAMRA ou ROX) ou BODIPY530/550.
[0252] A molécula repórter fluorescente é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' que possui o maior potencial de discriminação na sonda TD de sequências alvo e não alvo. Como demonstrado ao longo do pedido de patente, o comportamento de hibridização da segunda porção de hibridização 5' é o fator mais determinante em sequências alvo distintivas das sequências não alvo.
[0253] A molécula repórter fluorescente é posicionada sobre a extremidade 5', extremidade 3' ou nucleotídeo interno da segunda porção de hibridização 5'. Mais preferencialmente, a molécula repórter fluorescente é posicionada sobre o nucleotídeo interno.
[0254] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter fluorescente é ligada ao resíduo uracila.
[0255] De acordo com uma modalidade preferencial, a modificação fluorescente é observada em uma temperatura predeterminada, ou ao longo de uma faixa de temperaturas.
[0256] De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador de sentido reverso e uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tal que a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD seja adicionalmente gerada para aumentar a modificação de fluorescência indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0257] De acordo com uma modalidade preferencial, a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso e uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tal que a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD seja amplificada por PCR para aumentar a modificação de fluorescência indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0258] Alternativamente, a sonda TD é adicionalmente marcada com uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter e o supressor é posicionado sobre a sonda TD para extinguir a fluorescência da molécula repórter quando a sonda TD ou a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD não estão envolvidas na hibridização com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0259] De acordo com uma modalidade preferencial, o supressor é posicionado sobre a sonda TD para extinguir a fluorescência da molécula repórter conformacionalmente quando a sonda TD ou a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD não estão envolvidas na hibridização com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0260] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula supressora é fluorescente e o sinal indicativo da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos a ser detectada é um sinal da molécula supressora fluorescente.
[0261] Onde a presente invenção é realizada em conjunto com o iniciador de sentido reverso ou o par de iniciadores, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde é preferencialmente uma polimerase termoestável sem atividade de exonuclease 5' a 3' incluindo o fragmento Stoffel da Taq polimerase (F C Lawyer et al., Genome Res. 2:275-287 (1993)) e formas de mutante de DNA polimerase de Thermus aquaticus, Thermus flavus ou Thermus thermophilus (Patente U.S. No. 5885813). Exemplos daquelas são: KOD (exo-) DNA polimerase (TOYOBO), Vent (exo-) DNA polimerase (NEB), Deep Vent (exo-) DNA polimerase (NEB), PlatinumTM Tfi Exo (-) DNA polimerase (Invitrogen), fragmento de DNA polimerase Amplitaq stoffel (ABI), Exo-Pfu DNA polimerase (Agilent).
[0262] O presente método também pode ser realizado usando polimerases termoestáveis com atividades de exonuclease 5' a 3'.
[0263] De acordo com uma modalidade preferencial, o presente método é realizado em uma fase líquida ou em uma fase sólida. Quando o presente método é realizado na fase sólida, a sonda TD é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície de um substrato sólido. V. Desenho e Preparação de Sonda Capaz de Sequências-Alvo Distintivas
[0264] Em outro aspecto desta invenção, é fornecido um método para permitir a uma molécula de sonda discriminar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos, que compreende as etapas de: (a) seleção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos; (b) desenho de uma sequência de uma molécula de sonda tendo (i) uma sequência de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, tais que a porção de separação intervenha na sequência de hibridização para formar três porções na molécula de sonda; e (c) determinação da posição da porção de separação na molécula de sonda para permitir a uma porção na direção 5' da porção de separação ter uma Tm mais baixa do que uma porção na direção 3' da porção de separação e permitir à porção de separação tera Tm mais baixa nas três porções, por meio disso fornecendo a molécula de sonda tendo três porções distintas com valores de Tm diferentes entre si em que (i) uma segunda porção de hibridização 5' da molécula de sonda tenha uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo, (ii) uma primeira porção de hibridização 3' da molécula de sonda tenha uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo; e (iii) a porção de separação da molécula de sonda entre a segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' compreenda pelo menos três bases universais; ea Tm da segunda porção de hibridização 5' seja mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tenha a Tm mais baixa nas três porções,
[0265] em que quando a molécula de sonda for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que quando a molécula de sonda for hibridizada com a sequência de ácidos nucleicos não alvo, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação formarão uma fita única, pelo qual a molécula de sonda permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[0266] O presente método é direcionado a fornecer uma nova abordagem para aumentar dramaticamente o poder de discriminação de sondas de sequências alvo. O presente método também pode ser expresso como um método para melhorar uma capacidade de discriminação de uma sonda para sequências alvo.
[0267] O presente método é realizado para preparar a sonda TD discutida acima. Por isso, no interesse de evitar redundância desnecessária, as descrições comuns entre eles não estão sendo repetidas mas são incorporadas nesta descrição do método como se fossem repetidas.
[0268] O presente método fornece uma nova estratégia para aumentar a capacidade de discriminação introduzindo novas características em sequências de oligonucleotídeo per se, que fornece novas sondas para mostrar comportamentos de hibridização diferentes com sequências alvo e não alvo.
[0269] É crítico no presente método desenhar uma sequência de uma molécula de sonda tendo (i) uma sequência de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, tais que a porção de separação intervenham na sequência de hibridização para formar três porções na molécula de sonda.
[0270] Nesta etapa, as linhas gerais estruturais do oligonucleotídeo são apresentadas para mostrar uma porção da extremidade 5'/porção separação/porção de extremidade 3' no oligonucleotídeo. Tanto porções de extremidade 5' como extremidade 3' transportam uma sequência de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo e são separadas pela porção de separação.
[0271] A etapa mais crítica na presente invenção deve determinar a posição da porção de separação na sonda para permitir a uma porção na direção 5' da porção de separação ter uma Tm mais baixa do que uma porção na direção 3' da porção de separação e permitir à porção de separação ter a Tm mais baixa nas três porções, por meio disso fornecendo um oligonucleotídeo que tem três porções distintas com valores de Tm diferentes entre si.
[0272] As novas características estruturais introduzidas em oligonucleotídeos pelo presente método são: (i) três porções distintas (segunda porção de hibridização 5', porção de separação e primeira porção de hibridização 3') em sequências de oligonucleotídeos; (ii) valores de Tm diferentes das três porções entre si; (iii) porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais entre a segunda porção de hibridização 5' e primeira porção de hibridização 3'; (iv) duas porções envolvidas na interação molecular com alvos na hibridização, que é separada em termos do evento de hibridização pela porção de separação; (v) valores de Tm após ordenar a primeira porção de hibridização 3', a segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação. Tais características estruturais asseguram a hibridização de sondas ocorrerem de maneiras distintamente diferentes com sequências alvo e não alvo, permitindo aumento dramático na especificidade de hibridização de sondas às suas sequências alvo. IV. Conjuntos de Detecção-alvo 1. Conjuntos de Detecção-alvo em uma Fase Líquida
[0273] No aspecto ainda adicional desta invenção, é fornecido um conjunto para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos, que compreende uma sonda distintiva alvo (sonda TD) tendo uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela fórmula geral I descrita acima para permitir a discriminação da sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[0274] Uma vez que o conjunto desta invenção é construído para realizar os métodos de detecção da presente invenção descrita acima, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar redundância excessiva levando à complexidade este Relatório Descritivo.
[0275] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem uma marcação ou um sistema de marcação interativa contendo uma pluralidade de marcações para gerar um sinal detectável.
[0276] Mais preferencialmente, o sistema de marcação interativa é um par de uma molécula repórter e uma molécula supressora posicionada sobre a sonda TD
[0277] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula repórter e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' ou a molécula repórter e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação.
[0278] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem uma da molécula repórter e da molécula supressora na sua segunda porção de hibridização 5' e outra na sua primeira porção de hibridização 3'.
[0279] De acordo com uma modalidade preferencial, em que o conjunto compreende ainda uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0280] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto compreende ainda uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e pelo menos um de um iniciador a montante a ser hibridizado com um sítio a jusante de um sítio hibridizado da sonda TD e um iniciador de sentido reverso.
[0281] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada por um iniciador de amplificação e o conjunto compreende ainda o iniciador de amplificação.
[0282] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas.
[0283] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas e o iniciador a montante compreende pelo menos dois tipos de iniciadores ou o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos de iniciadores.
[0284] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo.
[0285] De acordo com uma modalidade preferencial, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da sonda TD.
[0286] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' e o sítio bloqueador é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD. 2. Conjuntos de Detecção-alvo em uma Fase Sólida
[0287] Em outro aspecto desta invenção, é fornecido um conjunto para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos em uma fase sólida de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), que compreende: (a) a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície do substrato sólido; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0288] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD tem uma marcação que gera um sinal detectável e a marcação é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[0289] em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; e (b) o substrato sólido.
[0290] Uma vez que o conjunto desta invenção é construído para executar o método de detecção da presente invenção descrita acima, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar redundância excessiva que leva à complexidade deste Relatório Descritivo.
[0291] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação fluorescente, uma marcação interativa, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica. Mais preferencialmente, a marcação é o sistema de marcação interativa compreendendo um par de uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora e a sonda TD tem uma da molécula repórter e da molécula supressora em um sítio na segunda porção de hibridização 5' e outra em um sítio a não ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0292] De acordo com uma modalidade preferencial, a molécula supressora é posicionada em um sítio na segunda porção de hibridização 5' da sonda TD e a molécula repórter fluorescente é posicionada em um sítio a não ser digerido pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração de um sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhum sinal de fluorescência pelo qual o sinal fluorescente no substrato sólido é detectado para determinar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0293] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto compreende ainda uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0294] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas.
[0295] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo e a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da sonda TD.
[0296] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' e o sítio bloqueador é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD. 3. Conjuntos de Detecção-alvo Usando PCR
[0297] Ainda em outro aspecto desta invenção, é fornecido um conjunto para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e uma reação de polimerase em cadeia (PCR), que compreende: (a) a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (b) um par de iniciadores composto de dois iniciadores como iniciador a montante e um iniciador de sentido reverso cada um tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência- alvo de ácidos nucleicos;
[0298] em que a sonda TD é hibridizada com um sítio entre os dois iniciadores; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0299] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é duplamente marcada com uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter; a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5', ou a molécula repórter e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; A Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[0300] em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida por uma atividade de exonuclease 5' a 3' de uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[0301] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto compreende ainda uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0302] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada por um iniciador de amplificação e o conjunto compreende ainda o iniciador de amplificação.
[0303] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas, o iniciador de sentido direto compreende pelo menos dois tipos de iniciadores e o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos de iniciadores.
[0304] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo.
[0305] De acordo com uma modalidade preferencial, o iniciador de sentido direto, o iniciador de sentido reverso ou o iniciador de amplificação tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela fórmula II geral.
[0306] De acordo com uma modalidade preferencial, a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' e o sítio bloqueador é posicionado na primeira porção de hibridização 3'.
[0307] De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador da sonda TD é posicionado sobre a primeira porção de hibridização 3' da sonda TD. Mais preferencialmente, o sítio bloqueador da sonda TD é posicionado adjacente à extremidade 3' da porção de separação.
[0308] De acordo com uma modalidade preferencial, o sítio bloqueador compreende 1 a 10 bloqueadores. 4. Conjuntos para Detecção-alvo Usando Reação de Ligação
[0309] No aspecto adicional desta invenção, é fornecido um conjunto para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) por uma reação de ligação, que compreende: (a) uma primeira sonda tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um primeiro sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (b) uma segunda sonda tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um segundo sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos que é posicionada a montante do primeiro sítio;
[0310] em que pelo menos uma da primeira sonda e da segunda sonda tem uma marcação para gerar um sinal detectável; em que a segunda sonda é uma sonda TD; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0311] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada;
[0312] em que quando a segunda sonda for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' da segunda sonda serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos para permitir a ligação da primeira sonda e a segunda sonda; em que quando a segunda sonda for hibridizada com a sequência de ácidos nucleicos não alvo, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação da segunda sonda formarão uma fita única tal que a primeira sonda e a segunda sonda não sejam ligadas, pelo qual a segunda sonda permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos da sequência não alvo de ácidos nucleicos;
[0313] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto compreende ainda uma ligase para ligar-se à primeira sonda e a segunda sonda hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0314] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação radioativa, uma marcação fluorescente, uma marcação interativa, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica.
[0315] De acordo com uma modalidade preferencial, a marcação é o sistema de marcação interativa que compreende um par de uma molécula repórter e uma molécula supressora.
[0316] De acordo com uma modalidade preferencial, a primeira sonda tem uma estrutura de oligonucleotídeo específico dual (DSO) representada pela fórmula II geral.
[0317] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos usada é uma sequência de ácidos nucleicos pré-amplificada usando um iniciador de amplificação e o conjunto compreende ainda o iniciador de amplificação.
[0318] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto é usado para uma fase sólida; em que a primeira sonda é imobilizada pela sua extremidade 5' na superfície de um substrato sólido e a segunda sonda não é imobilizada.
[0319] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto é usado para uma fase sólida; em que a segunda sonda é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície do substrato sólido e a primeira sonda não é imobilizada.
[0320] De acordo com uma modalidade preferencial, a primeira sonda e a segunda sonda são posicionadas em posições imediatamente adjacentes entre si quando hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0321] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e a primeira sonda e a segunda sonda cada uma compreende pelo menos dois tipos de sondas.
[0322] De acordo com uma modalidade preferencial, a sequência- alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo.
[0323] De acordo com uma modalidade preferencial, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da segunda sonda. 5. Conjuntos para Detecção-alvo baseados em Hibridização
[0324] No aspecto ainda adicional desta invenção, é fornecido um conjunto para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), que compreende:
[0325] uma sonda distintiva alvo (sonda TD) tendo uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral para permitir a discriminação da sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I)
[0326] em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é marcada com uma molécula repórter fluorescente na segunda porção de hibridização 5'; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos para induzir uma modificação na fluorescência da molécula repórter fluorescente; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única para não induzir modificação na fluorescência da molécula repórter fluorescente, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos.
[0327] De acordo com uma modalidade preferencial, o conjunto compreende ainda um iniciador de sentido reverso e uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde para gerar adicionalmente a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD para aumentar a modificação de fluorescência indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0328] Preferencialmente, o conjunto compreende ainda um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso e uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde para amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD por PCR para aumentar a modificação de fluorescência indicativa da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos.
[0329] Alternativamente, a sonda TD é adicionalmente marcada com uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter, e o supressor é posicionado sobre a sonda TD para induzir uma autoextinção quando a sonda TD não está envolvida na hibridização com a sequência-alvo de ácidos nucleicos.
[0330] Onde o presente conjunto compreende o iniciador de sentido reverso ou o par de iniciadores, a polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde é preferencialmente uma polimerase termoestável sem atividade de exonuclease 5' a 3' incluindo fragmento Stoffel da Taq polimerase e formas mutantes da DNA polimerase de Thermus aquaticus, Thermus flavus ou Thermus thermophilus (Patente U.S. No. 5885813).
[0331] O presente conjunto está em uma fase líquida ou em uma fase sólida.
[0332] Todos os presentes conjuntos descritos acima podem incluir opcionalmente os reagentes necessários para realizar reações de amplificação alvo de PCR (por exemplo, reações de PCR), tais como tampões, cofatores de DNA polimerase, e desoxirribonucleotídeo-5- trifosfatos. Opcionalmente, os conjuntos também podem incluir várias moléculas de polinucleotídeo, transcriptase reversa, vários tampões e reagentes, e anticorpos que inibem a atividade de DNA polimerase. Os conjuntos também podem incluir os reagentes necessários para realizar reações de controle positivas e negativas. As quantidades ótimas de reagentes a serem usados em uma dada reação podem ser prontamente determinadas pelo versado tendo o benefício da corrente revelação. Os conjuntos, tipicamente, são adotados para conter os constituintes antes descritos em embalagem ou compartimentos separados.
[0333] As características e vantagens desta invenção serão resumidas como se segue: (a) A sonda TD tendo a estrutura de mDSO é hibridizada com a sequências alvo de ácidos nucleicos através de sua sequência total incluindo a segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3'. Sob condições da hibridização específica alvo da sonda TD, quando a sonda TD é hibridizada com sequências não alvo de ácidos nucleicos, sua primeira porção de hibridização 3' não se liga especificamente a sequências não alvo de ácidos nucleicos mas tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação não são hibridizadas com a sequência não alvo de ácidos nucleicos para formar uma fita única devido aos seus baixos valores de Tm.
[0334] Como tal, a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD exibe modelos de hibridização distintamente diferentes de cada uma das sequências alvo e não alvo de ácidos nucleicos, discriminando as sequências alvo de ácidos nucleicos das sequências não alvo de ácidos nucleicos com especificidade muito mais alta. (b) As aplicações de Detecção-alvo usando a sonda TD mostram especificidade alvo dramaticamente aumentada devido aos seguintes eventos de vigilância do alvo: Em primeiro lugar, a sonda TD tendo modelos de hibridização diferentes de cada uma das sequências alvo e não alvo de ácidos nucleicos como descrito acima é capaz de discriminação de sequências alvo de ácidos nucleicos das sequências não alvo de ácidos nucleicos com especificidade muito mais alta. Em segundo lugar, a ocorrência de reações enzimáticas sucessivas (reação ou ligação exonucleolítica) é determinada dependendo dos modelos de hibridização da sonda TD, elevando a especificidade alvo nos procedimentos de Detecção-alvo. (c) A capacidade de discriminação alvo da sonda TD por modelos de hibridização diferentes é adotada com sucesso em métodos de Detecção-alvo usando atividade de exonuclease 5' a 3', prevenindo completamente a geração de sinais falsos-positivos (resultados). Para ilustração, onde uma sonda convencional tendo uma marcação na sua porção da extremidade 5' é hibridizada com sequências não alvo na sua 5' porção, a porção 5' é digerida por atividade de exonuclease 5' a 3' para gerar sinais falsos-positivos. Improvavelmente, mesmo quando a sonda TD seja hibridizada com sequências não alvo, sua segunda porção de hibridização 5' não será hibridizada com sequências não alvo não para gerar nenhum sinal falso-positivo. (d) No método de PCR em tempo real para a detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos, a sonda TD com a molécula repórter e a molécula supressora todas posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5' ou cada uma posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação são mostradas prevenir excelentemente a ocorrência de sinais falsos. As tecnologias convencionais, tais como método de sonda TaqMan™ estão sofrendo de sinais falsos-positivos devido à ligação não específica das sondas marcadas, particularmente na detecção múltipla alvo. Entretanto, a presente invenção com sucesso supera tais problemas usando a sonda TD tendo a molécula repórter e a molécula supressora todas posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5'. Além disso, a sonda TD peculiarmente marcada dualmente como descrito acima permite à superação de faltas associadas à atividade de endonuclease 5' a 3' de polimerases que torna-se problemática dependendo dos tipos de polimerases e condições de reação. (e) O modelo de hibridização único da sonda TD também permite prevenir excelentemente sinais falsos-positivos em processos de Detecção-alvo usando atividade de ligação. Geralmente, métodos de Detecção-alvo usando a ligação de duas sondas (uma primeira sonda a montante e uma segunda sonda a jusante) demandam formas de fita dupla (dúplexes) de porções de extremidade adjacentes das duas sondas da ligação. No presente ensaio de ligação usando a sonda TD como uma segunda sonda, a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD forma uma forma de fita única quando a sonda TD é hibridizada com sequências não alvo, e por isso previne reações de ligação de não gerar nenhum sinal falso-positivo. (f) A sonda TD mostra especificidade excelente para discriminar uma variação de nucleotídeo única usando os modelos de hibridização diferentes da segunda porção de hibridização 5'. Mesmo que um nucleotídeo incompatível único esteja presente entre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD e uma sequência de ácidos nucleicos, a sonda TD é capaz de reconhecer a sequência como uma sequência não alvo e sua segunda porção de hibridização 5' forma uma fita única que não resulta em nenhum sinal falso-positivo. Especificamente, a sonda TD tem um poder de resolução plausível na detecção de SNP. (g) A sonda TD permite personificar sistemas de microarranjo para ensaio em fase sólida exato e de alto rendimento. Os sistemas de microarranjo convencionais usando sondas convencionais estão sofrendo de sinais falsos-positivos devido à hibridização não específica das sondas convencionais. Ao contrário, o presente ensaio em fase sólida usando a sonda TD em conjunto com atividade de exonuclease 5' a 3' (ou atividade de ligação) permite à detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos de uma maneira em tempo real bem como detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos de maneira mais exata e rápida.
[0335] A presente invenção será descrita agora em detalhes adicionais pelos exemplos. Seria óbvio para os versados na técnica que estes exemplos são destinados a serem mais concretamente ilustrativos e o escopo da presente invenção como apresentados nas reivindicações acrescentadas não é limitado a ou pelos exemplos. EXEMPLOS EXEMPLO 1: Avaliação de atividade de clivagem de uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' sobre a sonda incompatível da extremidade 5'
[0336] Examina-se se uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' pode clivar uma sonda tendo nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'.
[0337] Para examinar esta avaliação, o gene do oligonucleotídeo sintético de Staphylococcus aureus (SA) foi usado como molde. Cinco tipos diferentes de sondas marcadas dualmente foram usados e têm uma sequência compatível, nucleotídeo incompatível único, três nucleotídeos incompatíveis, seis nucleotídeos incompatíveis e nove nucleotídeos incompatíveis nas suas porções da extremidade 5', respectivamente. A sonda marcada dualmente tem 6-FAM (6- carboxifluoresceína) como uma molécula repórter fluorescente na sua extremidade 5' e Supressor Black Hole 1 (BHQ-1) como uma molécula supressora na sua porção da extremidade 3'. A sonda marcada dualmente é modificada pelo espaçador C3 na sua extremidade 3', tal que a sonda marcada dualmente não seja estendida.
[0338] Uma DNA polimerase tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' foi usada para reações exonucleolíticas 5' a 3' com sondas marcadas dualmente e o molde (S. aureus gene). Os sinais foram medidos na etapa de hibridização de cada ciclo.
[0339] As sequências do molde sintético e as sondas marcadas dualmente de S. aureus gene usado neste Exemplo são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACG CCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGA ATAATGTTG AATTTA-3' (SEQ ID NO:1) SA_P0 5'-[FAM]CATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3 espaçador]-3' (SEQ ID NO:2) SA_P1 5'-[FAM]CCATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3 espaçador]-3' (SEQ ID NO:3) SA_P3 5'-[FAM]TGCCATTCGGT[T(BHQ- 1)]TACGGCGTTGTTACC[C3 espaçador]-3' (SEQ ID NO:4) SA_P6 5'-[FAM]ACTTGCCATTCGGT[T(BHQ- 1)]TACGGCGTTGTTACC[C3 espaçador]-3' (SEQ ID NO:5) SA_P9 5'-[FAM]ACAACTTGCCATTCGGT[T(BHQ- 1)]TACGGCGTTGTTACC [C3 espaçador]-3' (SEQ ID NO:6) (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0340] A reação exonucleolítica foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 0,2 pmols do oligonucleotídeo sintético de S. aureus (SEQ ID NO: 1), 5 pmols da sonda marcada dualmente (SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 ou 6), e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 6 mM, 200 μM de dNTPs, e 2 unidades de DNA polimerase DiaStarTMTaq (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 20 segundos a 95°C, e por 60 segundos a 60°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de hibridização (60°C) de cada ciclo.
[0341] Como mostrado na figura 8, quando as sondas marcadas dualmente tendo a sequência compatível e nucleotídeo incompatível único nas suas porções de extremidade 5' foram usadas, os sinais fluorescentes para SA foram gerados (número 1 e 3). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente para SA foi observado no caso de utilização das sondas marcadas dualmente tendo pelo menos três nucleotídeos incompatíveis nas suas porções de extremidade 5' (número 5, 7 e 9). Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (número 2, 4, 6, 8 e 10).
[0342] Estes resultados indicam que a enzima tendo dose de atividade de exonuclease 5' a 3' não cliva a sonda tendo pelo menos três nucleotídeos incompatíveis na sua porção da extremidade 5'. EXEMPLO 2: Avaliação de uma sonda TD marcada dualmente para a discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos e uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0343] A sonda TD desta invenção foi avaliada se uma sonda TD marcada dualmente pode discriminar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0344] Em primeiro lugar, demonstramos se o sinal alvo-específico pode ser gerado pelos modelos de hibridização diferentes da sonda TD na sua segunda porção de hibridização 5'.
[0345] Para examinar esta avaliação, os oligonucleotídeos sintéticos dos genes de Staphylococcus aureus (SA) e Neisseria gonorrhoeae (NG) foram usados como moldes. Dois tipos diferentes de sondas TD de cada gene têm uma sequência compatível e uma sequência incompatível nas suas segundas porções de hibridização 5', respectivamente. A sonda TD marcada dualmente tem 6-FAM (6- carboxifluoresceína) como uma molécula repórter fluorescente na sua extremidade 5' e Supressor Black Hole 1 (BHQ-1) como uma molécula supressora na sua primeira porção de hibridização 3'. A sonda TD marcada dualmente é modificada pelo espaçador C3 na sua extremidade 3', tal que a sonda TD marcada dualmente não seja estendida.
[0346] Uma DNA polimerase tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' foi usada para reações exonucleolíticas 5' a 3' com a sonda TD marcada dualmente e o molde alvo (gene de S. aureus ou N. gonorrhoeae). Os sinais foram medidos na etapa de hibridização de cada ciclo. A. A geração de sinal alvo-específica de S. aureus gene usando uma sonda TD
[0347] As sequências do molde sintético e as sondas TD marcadas dualmente de S. aureus gene usado neste Exemplo são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGA ATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTG AATTTA-3' (SEQ ID NO:1) SA_TD_M 5'-[6-FAM]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(BHQ- 1)]ACGGCG TTGTTACC[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:7) SA_TD_m 5'-[6-FAM]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTT[T(BHQ- 1)]ACGGCG-TTGTTACC [espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:8)
[0348] A reação exonucleolítica foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 0,2 pmols do oligonucleotídeo sintético de S. aureus (SEQ ID NO: 1), 5 pmols da sonda TD marcada dualmente (SEQ ID NO: 7 ou 8), e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 6 mM, 200 μM de dNTPs, e 2 unidades de DNA polimerase DiaStarTMTaq (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 20 segundos a 95°C, e por 60 segundos a 60°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de hibridização (60°C) de cada ciclo.
[0349] Como mostrado na figura 9A, o sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos de SA foi gerada, quando a sonda TD marcada dualmente tendo a sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada (No. 1). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos de SA foi observado em caso da utilização da sonda TD marcada dualmente que tem a sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5' (No. 3). Não houve nenhum sinal a ausência do molde como um controle negativo (Nos. 2 e 4). B. A geração de sinal alvo-específica do gene de N. gonorrhoeae usando uma sonda TD
[0350] As sequências do molde sintético e as sondas TD marcadas dualmente do gene de N. gonorrhoeae usadas neste Exemplo são: NG_T100 5'- GAAATTATGCCCTTAAATATGCGAAACACGCCAATGAGGG GCATGATGCTTTCTTTTTGTT CTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3' (SEQ ID NO:9); NG_TD_M 5'-[6-FAM]AGCATCATGCIIIIIATTGGCGTG[T(BHQ- 1)]TTCGCAT ATTTAAG [espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:10); NG_TD_m 5'-[6-FAM]GATGCTGTATIIIIIATTGGCGTG[T(BHQ-1)] TTCGCATATTTAAG[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:11); (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0351] A reação exonucleolítica foi conduzida como o mesmo protocolo usado para S. aureus, exceto o molde (2 pmols de N. gonorrhoeae) e as sondas TD marcadas dualmente (SEQ ID NO: 10 ou 11).
[0352] Como mostrado na figura 9B, o sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos de NG foi gerada, quando a sonda TD marcada dualmente tendo a sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada (No. 1). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos de NG foi observado no caso de utilização da sonda TD marcada dualmente tendo a sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5' (No. 3). Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (Nos. 2 e 4).
[0353] Estes resultados mostraram a geração de sinal alvo da sonda TD dependendo da hibridização da sua segunda porção de hibridização 5', indicando que a sonda TD pode discriminar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos. EXEMPLO 3: Efeito de porções de extremidade 5' entre a sonda TD e a sonda convencional
[0354] Examina-se se a porção da extremidade 5' de uma sonda convencional tem o mesmo efeito de segunda porção de hibridização 5'de uma sonda TD.
[0355] Para este exame, usamos dois tipos diferentes de sondas TD; uma sonda TD tem uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5'e a outra tem três nucleotídeos incompatíveis na sua segunda porção de hibridização 5'. As sondas convencionais têm as mesmas sequências das sondas TD exceto desoxinosina.
[0356] O oligonucleotídeo sintético de Staphylococcus aureus (SA) foi usado como um molde. A sonda convencional e TD cada uma tem 6- FAM (6-carboxifluoresceína) como uma molécula repórter fluorescente na sua extremidade 5' e Supressor Black Hole 1 (BHQ-1) como uma molécula supressora na sua porção 3'. Todas as sondas são modificadas pelo espaçador C3 nas suas extremidades 3'.
[0357] Uma DNA polimerase tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' foi usada para reações exonucleolíticas 5' a 3' com a sonda TD marcada dualmente e o molde alvo (S. aureus).
[0358] As sequências do molde sintético e convencional marcadas dualmente e sondas TD de S. aureus gene usadas neste Exemplo são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAA CCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTG AATTTA-3' (SEQ ID NO:1) SA_TD_M 5'-[6-FAM]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(BHQ- 1)]ACGGCGT TG TTACC[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:7) SA_TD_m1 5'-[6- FAM]CACCTCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(BHQ1)]ACGGCGTTGTTACC[ espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:12) SA_Con_M 5'-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGGTT[T(BHQ- 1)]ACGGCG TTG TTACC[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:13) SA_Con_m1 5'-[6-FAM]CACCTCGTGGTCAATCATTCGGTT[T(BHQ- 1)]ACGGCGTTGTTACC[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:14) (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0359] A reação exonucleolítica foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 0,2 pmols do oligonucleotídeo sintético de S. aureus (SEQ ID NO: 1), 5 pmols da sonda marcada dualmente (SEQ ID NO: 7, 12, 13 ou 14), e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 6 mM, 200 μM de dNTPs, e 2 unidades de DNA polimerase DiaStarTMTaq (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 20 segundos a 95°C, e por 60 segundos a 60°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de hibridização (60°C) de cada ciclo.
[0360] Como mostrado na figura 10, o sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos foi gerada, quando a sonda TD marcada dualmente tendo a sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada (No. 1). De maneira interessante, no caso da sonda TD tendo três nucleotídeos incompatíveis na sua segunda porção de hibridização 5', nenhum sinal foi observado (No. 3). Ao contrário quando as sondas convencionais tendo três nucleotídeos incompatíveis bem como tendo a sequência compatível nas suas porções de extremidade 5' foram usadas (Nos. 5 e 7), os sinais foram gerados. Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (Nos. 2, 4, 6 e 8)
[0361] Estes resultados mostraram que em contraste com a sonda TD, a sonda convencional gerou o sinal falso-positivo na hibridização não específica. Por isso, pode ser entendido que uma sonda TD pode detectar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos sem sinais falsos- positivos. EXEMPLO 4: PCR em tempo real usando uma sonda TD para a detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos
[0362] Aplicamos a sonda TD na reação PCR em tempo real para a detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos com uma DNA polimerase tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
[0363] Para este pedido de patente, DNAs genômicos de Staphylococcus aureus e Neisseria gonorrhoeae foram extraídos de cada linhagem celular e usados. A sonda TD tem um uma sequência compatível ou incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'. Ambas de uma molécula repórter e uma molécula supressora foram posicionadas na segunda porção de hibridização 5' da sonda TD marcada dualmente. C. PCR em tempo real para detecção do gene de S. aureus Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de S. aureus é usada como um molde, as sequências dos iniciadores e as sondas TD marcadas dualmente usadas neste Exemplo são: SA_F 5'-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3' (SEQ ID NO:15) SA_R 5'-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT-3' (SEQ ID NO:16) SA_TD2_M 5'-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ- 1)]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCG TTG TTACC[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:17) SA_TD2_m 5'-[6-FAM]TGCCTTA[T(BHQ-1)]] AAIIIIICATTCGGTTTA CGGCG TTG TTACC[espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:18); (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0364] A reação PCR em tempo real foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 1 ng de S. aureus DNA genômico, 5 pmols da sonda TD marcada dualmente (SEQ ID NO: 17 ou 18), 10 pmols do iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 15), 10 pmols do iniciador de sentido reverso (SEQ ID NO: 16) e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 6 mM, 200 μM de dNTPs, e 2 unidades de DNA polimerase DiaStarTM Taq (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 20 segundos a 95°C, e por 60 segundos a 60°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de hibridização (60°C) de cada ciclo.
[0365] Como mostrado na figura 11A, o sinal alvo fluorescente do gene de S. aureus foi gerado quando a sonda TD marcada dualmente tendo a sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada (No. 1). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de S. aureus foi observado no caso de utilização da sonda TD marcada dualmente tendo a sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5' (No. 3), indicando que a molécula repórter e a molécula supressora posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' não foram separadas. Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (Nos. 2 e 4) D. PCR em tempo real para detecção do gene de N. gonorrhoeae
[0366] Quando a sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de N. gonorrhoeae é usada como um molde, as sequências dos iniciadores e as sondas TD marcadas dualmente usadas neste Exemplo são: NG_F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (SEQ ID NO:19) NG_R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (SEQ ID NO:20) NG_TD2_M 5'-[6-FAM]AGCATCA [T(BHQ- 1)]GCIIIIIATTGGCGTGTTTCGC ATA TTTAAG [espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:21); NG_TD2_m 5'-[6-FAM]GATGCTG[T(BHQ- 1)]ATIIIIIATTGGCGTGTTTCGCA TATTTAAG [espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:22); (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0367] A reação PCR em tempo real foi conduzida como o mesmo protocolo usado para S. aureus, exceto o molde (1 ng de N. gonorrhoeae), sondas TD marcadas dualmente (SEQ ID NOs: 21 e 22), e iniciadores (SEQ ID NOs: 19 e 20)
[0368] Como mostrado na figura 11B, o sinal alvo fluorescente do gene de N. gonorrhoeae gene foi gerado quando a sonda TD marcada dualmente tendo a sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada (No. 1). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos do gene de N. gonorrhoeae foi observada no caso de utilização da sonda TD marcada dualmente tendo a sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5' (No. 3), indicando que a molécula repórter e a molécula supressora posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' não foram separadas. Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (Nos. 2 e 4).
[0369] Estes resultados mostraram que a sonda TD que tem um sistema de marcação interativa na sua segunda porção de hibridização 5' pode ser usada em PCR em tempo real para discriminar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos. EXEMPLO 5: Discriminação da variação de nucleotídeo único usando uma sonda TD marcado dualmente na reação PCR em tempo real
[0370] Examina-se se uma sonda TD pode discriminar uma variação de nucleotídeo única em uma sequência de ácidos nucleicos.
[0371] Para este exame, a sonda TD tem uma sequência compatível ou um nucleotídeo incompatível único na sua segunda porção de hibridização 5'. Ambas de uma molécula repórter e uma molécula supressora foram posicionadas na sua segunda porção de hibridização 5' da sonda TD marcada dualmente.
[0372] DNA genômico de S. aureus é usado como um molde. As sequências dos iniciadores e as sondas TD marcadas dualmente usadas neste Exemplo são: SA_F 5'-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3' (SEQ ID NO:15) SA_R 5'-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT-3' (SEQ ID NO:16) SA_TD_S_M 5'-[6-FAM]TTCCG[T(BHQ-1)] GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC [Espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:23) SA_TD_S_m 5'-[6-FAM]TTCTG[T(BHQ-1)] GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[ Espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:24)
[0373] A reação PCR em tempo real foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 500 pg de DNA genômico de S. aureus, 5 pmols da sonda TD marcada dualmente (SEQ ID NO: 23 ou 24), 10 pmols do iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 15), 10 pmols do iniciador de sentido reverso (SEQ ID NO: 16) e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 6 mM, 200 μM de dNTPs, e 2 unidades de DNA polimerase DiaStarTMTaq (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 20 segundos a 95°C, e por 60 segundos a 63°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de hibridização (63°C) de cada ciclo.
[0374] Como mostrado na figura 12, o sinal fluorescente de S. aureus foi gerado quando a sonda TD marcada dualmente tendo uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada (No. 1). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente foi observado no caso de utilização da sonda TD marcada dualmente tendo um nucleotídeo único incompatível na sua segunda porção de hibridização 5' (No. 3). Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (Nos. 2 e 4).
[0375] Estes resultados mostraram o modelo de hibridização diferente da sonda TD mesmo dependendo da incompatibilidade de nucleotídeo única na sua segunda porção de hibridização 5'. Por isso, pode ser entendido que uma sonda TD tem alta especificidade para discriminar uma variação de nucleotídeo única incluindo SNP sem sinais falsos-positivos na reação PCR em tempo real. EXEMPLO 6: a Avaliação de uma sonda TD imobilizada em fase sólida usando uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'
[0376] Ainda avaliamos se uma sonda TD imobilizada pode discriminar uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos usando uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' em fase sólida.
[0377] Para examinar esta avaliação, o oligonucleotídeo sintético para o gene de Staphylococcus aureus (SA) foi usado como um molde. A sonda TD tem uma sequência compatível ou uma incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'. A sonda TD tem um Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente na sua primeira porção de hibridização 3', um Supressor Black Hole 2 (BHQ-2) como uma molécula supressora na sua extremidade 5' e poli(T)7 como um braço ligante. As sondas TD marcadas dualmente foram imobilizadas na superfície do substrato sólido usando um grupo amino (AminnoC7) na sua extremidade 3'. A DNA polimerase de Bst tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' foi usada para reações exonucleolíticas 5' a 3' .
[0378] As sequências do molde sintético e as sondas TD marcadas dualmente usadas neste Exemplo são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCG AATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3' (SEQ ID NO: 1) SA_TD1_Chip_M 5'-[BHQ2]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T (Quasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 25) SA_TD1_ChiP_m 5'-[BHQ-2]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTT[T (Quasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7] (SEQ ID NO: 26) (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0379] Lâminas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Coreia) foram usadas para a fabricação de dois tipos diferentes de sondas TD (SEQ ID NO: 25 e 26). As sondas TD dissolveram-se em tampão NSB de semeadura na concentração final de 20 μM foram impressas em lâminas NSB9 NHS com OmniGrid Accent Microarrayer (DIGILAB, US). Cada sonda TD foi semeada lado a lado em um formato 2x1 (pontos duplicados), e o microarranjo resultante foi incubado em uma câmara mantida em umidade de ~85% durante a noite. As lâminas então foram lavadas em uma solução de tampões contendo 2xSSPE (cloreto de sódio 0,3 M, hidrogeno fosfato de sódio 0,02 M e EDTA 2,0 mM), pH 7,4 e SDS 7,0 mM a 37°C por 10 min para remover a sonda TD não especificamente ligada e enxaguadas com água destilada. Então, as lâminas funcionalizadas por DNA foram secas usando centrífuga de lâmina e armazenadas em escuro a 4°C até uso.
[0380] A reação exonucleolítica foi conduzida na superfície da lâmina funcionalizada por DNA no volume final de 30 μl contendo 10 pmols de oligonucleotídeo sintético de SA (SEQ ID NO: 1), e 3 μl de tampão de reação 10x, 0,6 μl de 10 mM cada um de dNTPs, 2 unidades de DNA polimerase Bst (NEB, EUA). A mistura inteira foi aplicada a uma câmara montada na superfície da lâmina de vidro NSB na qual as sondas TD foram interligadas. A lâmina foi colocada no bloco in situ em um termociclador (Genepro B4I, China). A reação exonucleolítica foi realizada por 30 min a 50°C e parada por lavagem a 95°C por 1 min com água destilada. A aquisição de imagem foi realizada pelo uso do Digitalizador Confocal a laser, Axon GenePix4100A (Molecular Devices, US) com varredura em 5 μm de resolução por pixel. A intensidade de fluorescência foi analisada pelo uso do programa de análise de microarranjo quantitativo, o programa GenePix pro5.1 (Molecular Devices, US). A intensidade de fluorescência foi expressa como pontos médios após subtrações da referência local. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[0381] Como mostrado na Figura 13, o sinal fluorescente de S. aureus foi gerado quando a sonda TD marcada dualmente tendo a sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada com o molde (SA_TD1_Chip_M, RFU 65472,0±4,2). Por outro lado, nenhum sinal fluorescente de S. aureus foi observado no caso de utilização da sonda TD marcada dualmente tendo a sequência incompatível na sua segunda porção de hibridização 5' (SA_TD1_Chip_m, RFU 3227,0 ±17,0). Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (SA_TD1_Chip_M, RFU 2798.0 ±4,2 ou SA_TD1_Chip_m, RFU 3077.0 ±9,9).
[0382] Estes resultados mostraram que a sonda TD imobilizada pode ser aplicada para ensaios de microarranjo para discriminar a sequências alvo de ácidos nucleicos das sequências não alvo de ácidos nucleicos. EXEMPLO 7: Efeito da segunda porção de hibridização 5' de sondas TD imobilizadas
[0383] Examina-se as sondas TD imobilizadas podem eliminar sinais falsos-positivos em fase sólida pelo efeito da segunda porção de hibridização 5'.
[0384] Para este exame, o gene do oligonucleotídeo sintético de Staphylococcus aureus (SA) foi usado como um molde. A sonda TD tem uma sequência compatível ou três nucleotídeos incompatíveis na sua segunda porção de hibridização 5'. As sondas convencionais têm as mesmas sequências das sondas TD exceto desoxinosina. As sondas TD e convencionais têm Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente na sua primeira porção de hibridização 3', Supressor Black Hole 2 (BHQ-2) como uma molécula supressora na sua extremidade 5' e poli (T)7 como um braço ligante. As sondas marcadas dualmente foram imobilizadas na superfície do substrato sólido usando um grupo amino (AminnoC7) nas suas extremidades 3'. A DNA polimerase de Bst tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' foi usada para reações exonucleolíticas 5' a 3' .
[0385] As sequências do molde sintético e o TD marcado dualmente e sondas convencionais usadas neste Exemplo são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACC GAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTG AATTTA-3' (SEQ ID NO: 1) SA_TD1_Chip_M 5'-[BHQ2]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T (Quasar570)]ACGGCGTTGTTACC TTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 25) SA_TD1_ChiP_m1 5'-[BHQ-2]CACCTCGTGGIIIIICATTCGGTT[T (Quasar570)]ACGGCGTTGTTACC TTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 27) SA_Con_Chip_M 5'- [BHQ-2]CATTCCGTGGTCAATCATTCGGTT[T (Quasar570)]ACGGCGTTGTTACC TTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 28) SA_Con_Chip_m1 5'- [BHQ-2]CACCTCGTGGTCAATCATTCGGTT[T (Quasar570)]ACGGCGTTGTTACC TTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 29) (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0386] As lâminas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Coreia) foram usadas para a fabricação das sondas (SEQ ID NOs: 25, 27, 28 e 29). Cada sonda dissolvida em tampão NSB de semeadura na concentração final de 20 μM foi impressa no NSB9 NHS lâmina com OmniGrid Accent Microarrayer (DIGILAB, US). Cada sonda foi semeada lado a lado em um formato 2x1 (pontos duplicados), e o microarranjo resultante foi incubado em uma câmara mantida na umidade de ~85% durante a noite. As lâminas então foram lavadas em uma solução de tampões contendo 2xSSPE (cloreto de sódio 0,3 M, hidrogeno fosfato de sódio 0,02 M e EDTA 2,0 mM), pH 7,4 e SDS 7,0 mM a 37°C por 10 min para remover as sondas não especificamente ligadas e enxaguadas com água destilada. Então as lâminas funcionalizadas por DNA foram secas usando centrífuga de lâmina e armazenadas no escuro a 4°C até uso.
[0387] A reação exonucleolítica foi conduzida na superfície da lâmina funcionalizada por DNA no volume final de 30 μl contendo 10 pmols de oligonucleotídeo sintético de SA (SEQ ID NO: 1), e 3 μl de tampão de reação 10x, 0,6 μl de 10 mM cada um de dNTPs, 2 unidades de DNA polimerase Bst (NEB, EUA). A mistura inteira foi aplicada a uma câmara montada na superfície da lâmina de vidro NSB na qual as sondas foram interligadas. A lâmina foi colocada no bloco in situ em um termociclador (Genepro B4I, China). A reação exonucleolítica foi realizada por 30 min a 50°C e parada por lavagem a 95°C por 1 min com água destilada. A aquisição de imagem foi realizada pelo uso do Digitalizador Confocal a laser, Axon GenePix4100A (Molecular Devices, US) com varredura em 5 μm de resolução por pixel. A intensidade de fluorescência foi analisada pelo uso do programa de análise de microarranjo quantitativo, programa GenePix pro5.1 (Molecular Devices, US). A intensidade de fluorescência foi expressa como pontos médios após subtrações da referência local. Cada ponto foi duplicado para o teste da reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[0388] Como mostrado na figura 14, o sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos de SA foi gerada quando a sonda TD imobilizada marcada dualmente tendo uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada com o molde (SA_TD1_Chip_M, RFU: 65467,0±5,7). Em caso da utilização da sonda TD tendo três nucleotídeos incompatíveis na sua segunda porção de hibridização 5', nenhum sinal foi observado (SA_TD1_Chip_m1, RFU: 6679,5 ±222,7). Por outro lado, os sinais foram gerados quando as sondas convencionais tendo três nucleotídeos incompatíveis (SA_Con_Chip_m1, RFU: 65464,0±5,7) bem como tendo a sequência compatível (SA_Con_Chip_M, RFU: 65464,5±6,4) foram usados. Não houve nenhum sinal na ausência do molde como um controle negativo (SA_TD1_Chip_M, RFU: 2716,5 ±12,0) (SA_TD1_Chip_m1, RFU: 2810,5 ±14,8) (SA_Con_Chip_m1, RFU: 3216,5 ±41,7) (SA_Con_Chip_M, RFU: 2749,5 ±19,1)
[0389] Estes resultados mostraram que em contraste com a sonda TD imobilizada, a sonda convencional imobilizada gerou o sinal falso- positivo na hibridização não específica. Por isso, pode ser entendido que as sondas TD imobilizadas podem detectar a sequências alvo de ácidos nucleicos sem sinais falsos-positivos. EXEMPLO 8: Detecção de sequências alvo de ácidos nucleicos usando sondas TD marcadas únicas imobilizadas na superfície do substrato sólido
[0390] Ainda aplicamos sondas TD marcadas únicas para a detecção das sequências alvo de ácidos nucleicos na fase sólida.
[0391] Para este pedido de patente, o gene do oligonucleotídeo sintético de Staphylococcus aureus (SA) foi usado como um molde. Uma sonda TD tem uma sequência compatível ou uma incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'. A sonda TD tem 6-FAM ou 6- TAMRA (6-Carboxitetrametilrodamina) como uma molécula repórter fluorescente na sua extremidade 5' e poli (T)7 como um braço ligante. A sonda TD marcada única foi imobilizada na superfície do substrato sólido usando um grupo amino (AminnoC7) na sua extremidade 3'. Bst ou Taq polimerase tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3' foram usadas para reações exonucleolíticas 5' a 3' . E. Geração de sinal realizando reação exonucleolítica
[0392] As sequências do molde sintético e sondas TD marcadas únicas usadas nesta reação são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTA AACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTG AATTTA-3' (SEQ ID NO:1) SA_TD2_Chip_M 5'-[6-FAM]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGC GTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO:30) SA_TD2_Chip_m 5'-[6-FAM]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTTT ACGGCGTTGTTACCTTTTT [AminoC7]-3‘ (SEQ ID NO:31) (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0393] As lâminas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Coreia) foram usadas para a fabricação das sondas (SEQ ID NOs: 30 e 31). Cada sonda dissolvida em tampão NSB de semeadura na concentração final de 20 μM foi impressa na lâmina NSB9 NHS com OmniGrid Accent Microarrayer (DIGILAB, US). Cada sonda foi semeada lado a lado em um formato 2x1 (pontos duplicados), e o microarranjo resultante foi incubado em uma câmara mantida na umidade de ~85% durante a noite. As lâminas então foram lavadas em uma solução de tampões contendo 2xSSPE (cloreto de sódio 0,3 M, hidrogeno fosfato de sódio 0,02 M e EDTA 2,0 mM), pH 7,4 e SDS 7,0 mM a 37°C por 10 min para remover as sondas não especificamente ligadas e enxaguadas com água destilada. Então as lâminas funcionalizadas por DNA foram secas usando centrífuga de lâmina e armazenadas no escuro a 4°C até uso.
[0394] A reação exonucleolítica foi conduzida na superfície da lâmina funcionalizada por DNA no volume final de 30 μl contendo 10 pmols de oligonucleotídeo sintético de SA (SEQ ID NO: 1), e 3 μl de tampão de reação 10x, 50 μM de cada um de dNTPs, 2 unidades de DNA polimerase Bst. A mistura inteira foi aplicada a uma câmara montada na superfície da lâmina de vidro NSB na qual as sondas foram interligadas. A lâmina foi colocada no bloco in situ de um termociclador (Genepro B4I, China). A reação exonucleolítica foi realizada por 30 min a 50°C e parada por lavagem a 95°C por 1 min com água destilada. A aquisição de imagem foi realizada pelo uso do Digitalizador Confocal a laser, Axon GenePix4300A (Molecular Devices, EUA) com varredura em 5 μm de resolução por pixel. A intensidade de fluorescência foi analisada pelo uso do programa de análise de microarranjo quantitativo, programa GenePix (Molecular Devices, EUA). A intensidade de fluorescência foi expressa como pontos médios após subtrações da referência local. Cada ponto foi duplicado para o teste da reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados. F. Geração de sinal realizando reação exonucleolítica cíclica
[0395] As sequências do molde sintético e sondas TD marcadas únicas usadas nesta reação são: SA_T70 5'-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTA AACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTG AATTTA-3' (SEQ ID NO:1) SA_TD2_Chip_M_2 5'-[6-TAMRA]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGT TTACG GCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3‘ (SEQ ID NO:32) SA_TD2_Chip_m_2 5'-[6-TAMRA]TGCCTTATAAI IIIICA TTCGGTTTACGGCGTTG TTACCTTTTT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO:33) (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0396] As lâminas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Coreia) foram usadas para a fabricação das sondas (SEQ ID NOs: 32 e 33). Cada sonda dissolvida em tampão NSB de semeadura na concentração final de 20 μM foi impressa na lâmina NSB9 NHS com OmniGrid Accent Microarrayer (DIGILAB, US). Cada sonda foi semeada lado a lado em um formato 2x1 (pontos duplicados), e o microarranjo resultante foi incubado em uma câmara mantida na umidade de ~85% durante a noite. As lâminas então foram lavadas em uma solução de tampões contendo 2xSSPE (cloreto de sódio 0,3 M, hidrogeno fosfato de sódio 0,02 M e EDTA 2,0 mM), pH 7,4 e SDS 7,0 mM a 37°C por 10 min para remover as sondas não especificamente ligadas e enxaguadas com água destilada. Então as lâminas funcionalizadas por DNA foram secas usando centrífuga de lâmina e armazenadas no escuro a 4°C até uso.
[0397] A reação exonucleolítica cíclica foi conduzida na superfície da lâmina funcionalizada por DNA no volume final de 30 μl contendo 10 pmols de oligonucleotídeo sintético de SA (SEQ ID NO: 1), e 3 μl de tampão de reação 10x (MgCl2 5 mM), 50 μM de cada um de dNTPs, 2 unidades de Taq DNA polimerase (Solgent, Coreia). A mistura inteira foi aplicada a uma câmara montada na superfície da lâmina de vidro NSB na qual as sondas foram interligadas. A lâmina foi colocada no bloco in situ em um termociclador (Genepro B4I, China). A termociclagem foi realizada como se segue: desnaturação por 2 min a 95°C e um ciclo (5, 10, 20, 30, 40 ou 50 ciclos) de 95°C por 20 segundos e 55°C por 20 segundos. A aquisição de imagem foi realizada pelo uso do Digitalizador Confocal a laser, Axon GenePix4100A (Molecular Devices, EUA) com varredura em 5 μm de resolução por pixel. A intensidade de fluorescência foi analisada pelo uso do programa de análise de microarranjo quantitativo, programa GenePix (Molecular Devices, EUA). A intensidade de fluorescência foi expressa como pontos médios após subtrações da referência local. Cada ponto foi duplicado para o teste da reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[0398] Em caso da reação exonucleolítica, quando a sonda TD marcada única imobilizada tendo uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada com o molde, o sinal fluorescente no substrato sólido foi finalmente eliminado. Em caso da reação exonucleolítica cíclica, a intensidade fluorescente no substrato sólido foi reduzida dependendo do número de ciclos. EXEMPLO 9: Detecção de uma variação de nucleotídeo único usando uma sonda TD e ligase em fase sólida
[0399] Examina-se uma sonda TD pode discriminar uma variação de nucleotídeo único em uma sequência de ácidos nucleicos por uma reação de ligase na fase sólida.
[0400] Para este exame, uma primeira sonda tendo estrutura de DSO tem Quasar570 como uma molécula repórter na sua extremidade 5' e é usada como uma sonda mobilizada. A sonda TD como uma segunda sonda tem uma sequência compatível ou um nucleotídeo incompatível único na sua segunda porção de hibridização 5'. A sonda TD tem poli (T)7 como um braço ligante. A sonda TD foi imobilizada na superfície do substrato sólido usando um grupo amino (AminnoC7) na sua extremidade 3'. O oligonucleotídeo sintético para o gene de Staphylococcus aureus (SA) foi usado como um molde. Ampligase DNA Ligase Termoestável foi usada para ligação.
[0401] As sequências do molde sintético e a primeira e a segunda sonda (TD) usadas neste Exemplo são: SA_T110: '- TGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATT GA CCACGGAATGAATAATGTTGAA TTTATCGCTATCAACACAGACGGTCAAGCTTTAAACTTATCTAAAG- 3' (SEQ ID NO:34) SA_TD_Chip_S_M: 5'-TTCCGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTT ACCTTTTT [AminoC7]-3' (SEQ ID NO:35) SA_TD_Chip_S_m: '- TTCTGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCT TTTT[AminoC7]- 3' (SEQ ID NO:36) SA_Chip_DSO: 5'- [Quasar570]ACCGTCTGTGTTGATAGCGA TAAIIIIIACATTATTCA -3' (SEQ ID NO:37) (A letra sublinhada e em negrito indica o nucleotídeo de incompatibilidade.)
[0402] As lâminas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Coreia) foram usadas para a fabricação das sondas TD (SEQ ID NOs: 35 e 36). Cada sonda dissolvida em tampão NSB de semeadura na concentração final de 20 μM foi impressa na lâmina NSB9 NHS com OmniGrid Accent Microarrayer (DIGILAB, US). Cada sonda foi semeada lado a lado em um formato 2x1 (pontos duplicados), e o microarranjo resultante foi incubado em uma câmara mantida na umidade de ~85% durante a noite. As lâminas então foram lavadas em uma solução de tampões contendo 2xSSPE (cloreto de sódio 0,3 M, hidrogeno fosfato de sódio 0,02 M e EDTA 2,0 mM), pH 7,4 e SDS 7,0 mM a 37°C por 10 min para remover as sondas não especificamente ligadas e enxaguadas com água destilada. Então as lâminas funcionalizadas por DNA foram secas usando centrífuga de lâmina e armazenadas no escuro a 4°C até uso.
[0403] A reação de ligase foi conduzida na superfície da lâmina funcionalizada por DNA no volume final de 30 μl contendo 10 pmols de molde sintético de SA (SEQ ID NO: 34), 5 pmols da primeira sonda (SEQ ID NO: 37) e 3 μl de tampão de reação Ampligase 10x contendo Tris- HCl 20 mM (pH 8,3), KCl 25 mM, MgCl2 10 mM, NAD 0,5 mM, e Triton® X-100 0,01%, 0,2 μl de DNA Ligase Ampligase Termoestável (5 U/μl) (Epicentre Biotechnologies, EUA). A mistura inteira foi aplicada a uma câmara montada na superfície da lâmina de vidro NSB na qual as sondas foram interligadas. A reação foi realizada como se segue: a hibridização do ácido nucleico alvo, a primeira sonda e a sonda TD imobilizada foram executadas a 45°C por 5 min e a reação de ligase foram ainda executadas por 30 min a 65°C. A reação foi parada e a desnaturação foi realizada por lavagem a 95°C por 2 min com água destilada. A aquisição de imagem foi realizada pelo uso do Digitalizador Confocal a laser, Axon GenePix4100A (Molecular Devices, EUA) com varredura em 5 μm de resolução por pixel. A intensidade de fluorescência foi analisada pelo uso do programa de análise de microarranjo quantitativo, programa GenePix (Molecular Devices, EUA). A intensidade de fluorescência foi expressa como pontos médios após subtrações da referência local. Cada ponto foi duplicado para o teste da reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.
[0404] O sinal fluorescente da sequência-alvo de ácidos nucleicos de SA foi gerado quando a sonda TD tendo uma sequência compatível na sua segunda porção de hibridização 5' foi usada como a segunda sonda com molde. Em caso de utilização da sonda TD tendo nucleotídeo incompatível único na sua segunda porção de hibridização 5' como a segunda sonda, nenhum sinal foi observado. Estes resultados demonstram que a nossa reação de ligação permite à detecção de uma variação de nucleotídeo única. EXEMPLO 10: Detecção da sequência-alvo de ácidos nucleicos pela fluorescência modifica-se na hibridização da segunda porção de hibridização 5' da sonda TD
[0405] Examina-se se uma sonda TD tendo uma molécula fluorescente na sua segunda porção de hibridização 5' pode ser aplicada para uma Detecção-alvo baseada na modificação de sinal fluorescente dependendo da hibridização da porção marcada.
[0406] Para este pedido de patente, DNA genômico de Staphylococcus aureus foi usado como um molde. A sonda TD tem uma sequência compatível ou incompatível na sua segunda porção de hibridização 5'. A molécula fluorescente foi ligada ao nucleotídeo interno da segunda porção de hibridização 5' da sonda TD. Uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde não tendo atividade de exonuclease 5' a 3' foi usada para a amplificação alvo.
[0407] As sequências dos iniciadores e as sondas TD único marcadas usadas neste Exemplo são: SA_F 5'-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3' (SEQ ID NO:15) SA_R 5'-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT-3' (SEQ ID NO:16) SA_TD3_M 5'-CATTCCG[T(FAM)]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCG TTGTTACC [Espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:38) SA_TD3_m 5'-TGCCTTA[T(FAM)]] AAIIIIICATTCGGTTTACGGCG TTGTTACC[Espaçador C3]-3' (SEQ ID NO:39); (Letras sublinhadas e em negrito indicam os nucleotídeos incompatíveis.)
[0408] A reação PCR em tempo real foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 1 ng de DNA genômico de S. aureus, 5 pmols da sonda TD marcada única (SEQ ID NO: 38 ou 39), 10 pmols do iniciador de sentido direto (SEQ ID NO: 15), 10 pmols do iniciador de sentido reverso (SEQ ID NO: 16), 2 μl de tampão de Stoffel 10X [contendo Tris- HCl 100 mM (pH 8,3) e KCl 100 mM], 200 μM de cada um dos quatro dNTPs (dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 5 mM de MgCl2 e 1 unidade de AmpliTaq® DNA polimerase, Fragmento Stoffel (Applied BioSystems, US); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 2 min a 95°C e submetida a 40 ciclos de 20 segundos a 95°C, por 30 segundos a 55°C, e por 10 segundos a 72°C. A detecção do sinal gerado foi realizada na etapa de hibridização (55°C) de cada ciclo.
[0409] Nossos resultados experimentais abordam que a sonda TD permite detectar sequências alvo com discriminação pela medida da modificação fluorescente de uma molécula de marcação única dependendo da hibridização da segunda porção de hibridização 5'.
[0410] Tendo descrito uma modalidade preferencial da presente invenção, deve ser entendido que as variantes e modificações da mesma que estão incluídas no espírito da invenção podem ficar evidentes para os versados nesta técnica, e o escopo desta invenção deve ser determinado pelas reivindicações acrescentadas e seus equivalentes.

Claims (34)

1. Sonda distintiva alvo (sonda TD), caracterizada pelo fato de que apresenta uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral para permitir à discriminação de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de uma sequência não alvo de ácidos nucleicos: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I) em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; o comprimento da segunda porção de hibridização 5' é de 3-15 nucleotídeos, o comprimento da primeira porção de hibridização 3' é de 15-60 nucleotídeos e a primeira porção de hibridização 3' é maior do que a segunda porção de hibridização 5'; a sonda TD tem uma única marcação ou um sistema de marcação interativo contendo uma pluralidade de marcações para gerar um sinal detectável; a única marcação é uma única marcação química, uma única marcação enzimática, uma única marcação fluorescente, uma única marcação luminescente, uma única marcação quimioluminescente ou uma única marcação metálica; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência de ácidos nucleicos não alvo, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação formarão uma fita única, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; em que a marcação única está posicionada na segunda porção de hibridização 5' da sonda TD; em que quando a sonda TD tem uma única marcação em sua segunda porção de hibridização 5', a sonda TD compreende um ligante em sua extremidade 3' para imobilização da sonda TD na superfície de um substrato sólido; em que o sistema de marcação interativa compreende uma molécula repórter e uma molécula supressora e (i) a molécula repórter e a molécula supressora estão todas posicionadas na segunda porção de hibridização 5'; (ii) a molécula repórter e a molécula inibidora, cada uma, está posicionada em cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e da porção de separação; ou (iii) a molécula repórter e a molécula supressora, cada uma, está posicionada em cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3'.
2. Sonda de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a porção de separação é 3-10 nucleotídeos em comprimento.
3. Método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I) em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é duplamente marcada com uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter; pelo menos uma da molécula repórter fluorescente e da molécula supressora é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5'; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; o comprimento da segunda porção de hibridização 5' é de 3-15 nucleotídeos, o comprimento da primeira porção de hibridização 3' é de 15-60 nucleotídeos e a primeira porção de hibridização 3' é maior do que a segunda porção de hibridização 5'; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que (i) a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora estão todas posicionadas na segunda porção de hibridização de 5'; (ii) a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora, cada uma, está posicionada em cada porção diferente da segunda porção de hibridização de 5' e da porção de separação; ou (iii) a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora, cada uma, está posicionada em cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e da primeira porção de hibridização 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida por uma enzima tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) contato do resultante da etapa (a) à enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração de um sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhum sinal de fluorescência; e (c) detecção do sinal de fluorescência, tal que o sinal de fluorescência gerado por digestão na segunda porção de hibridização 5' seja indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador a montante a ser hibridizado com um sítio a jusante de um sítio hibridizado da sonda TD e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tal que o iniciador a montante seja estendido pela polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde na etapa (b).
6. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador de sentido reverso e a enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' é uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo atividade de exonuclease 5' a 3' tal que a etapa (b) produza a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD por uma reação de extensão do iniciador de sentido reverso pela polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde.
7. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c) com desnaturação entre ciclos de repetição.
8. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas.
9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas e o iniciador a montante compreende pelo menos dois tipos de iniciadores ou o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos de iniciadores.
10. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da sonda TD, e a sonda TD apresenta uma sequência correspondente à variação de nucleotídeos em sua segunda porção de hibridização de 5'.
11. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e o sítio bloqueador é posicionado na primeira porção de hibridização 3' da sonda TD.
12. Método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos em uma fase sólida de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície do substrato sólido; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I) em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD tem uma marcação que gera um sinal detectável ou um sistema de marcação interativo contendo uma pluralidade de marcações gerando um sinal detectável e a marcação é posicionada sobre a segunda porção de hibridização 5' da sonda TD; a marcação é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação fluorescente, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; o comprimento da segunda porção de hibridização 5' é de 3-15 nucleotídeos, o comprimento da primeira porção de hibridização 3' é de 15-60 nucleotídeos e a primeira porção de hibridização 3' é maior do que a segunda porção de hibridização 5'; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) contato do resultante da etapa (a) à enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para liberar a marcação da sonda TD, resultando em uma modificação de sinal na sonda TD imobilizada no substrato sólido; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhuma modificação de sinal na sonda TD imobilizada no substrato sólido; pelo qual a modificação de sinal no substrato sólido é detectada para determinar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos; e (c) detecção da modificação de sinal no substrato sólido, tal que a modificação de sinal por digestão na segunda porção de hibridização 5' seja indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o marcador é uma molécula repórter fluorescente e a mudança de sinal é a diminuição ou eliminação de sinais fluorescentes no substrato sólido.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o sistema de marcação interativa compreende um par de uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora e a sonda TD tem uma da molécula repórter e da molécula supressora em um sítio na segunda porção de hibridização 5' a ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e outra em um sítio a não ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a molécula supressora é posicionada em um sítio na segunda porção de hibridização 5' da sonda TD a ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e a molécula repórter fluorescente é posicionada em um sítio a não ser digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3'; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, sua segunda porção de hibridização 5' será digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração de um sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3', não resultando em nenhum sinal de fluorescência; pelo qual o sinal fluorescente no substrato sólido é detectado para determinar a presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a repetição das etapas (a) - (b) ou (a) - (c) com desnaturação entre ciclos de repetição.
17. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas.
18. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da sonda TD, e a sonda TD apresenta uma sequência correspondente à variação de nucleotídeos em sua segunda porção de hibridização de 5'.
19. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a sonda TD tem um sítio bloqueador contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotídeo resistente à clivagem pela enzima tendo atividade de exonuclease 5' a 3' e o sítio bloqueador é posicionado na primeira porção de hibridização 3' da sonda TD.
20. Método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) e uma reação de polimerase em cadeia (PCR), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) preparação de uma mistura de PCR que contém (i) a sequência-alvo de ácidos nucleicos, (ii) a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos, (iii) um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso cada um tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos, e (iv) uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tendo uma atividade de exonuclease 5' a 3'; em que a sonda TD é hibridizada com um sítio entre os dois iniciadores; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I) em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é duplamente marcada com uma molécula repórter fluorescente e uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter; a molécula repórter fluorescente e a molécula supressora todas são posicionadas sobre a segunda porção de hibridização 5', ou a molécula repórter e a molécula supressora cada uma é posicionada sobre cada porção diferente da segunda porção de hibridização 5' e a porção de separação; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; A Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; o comprimento da segunda porção de hibridização 5' é de 3-15 nucleotídeos, o comprimento da primeira porção de hibridização 3' é de 15-60 nucleotídeos e a primeira porção de hibridização 3' é maior do que a segunda porção de hibridização 5'; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos e a segunda porção de hibridização 5' será digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única tal que a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) amplificação da sequência-alvo de ácidos nucleicos usando a mistura de PCR pela execução de pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador, em que os dois iniciadores são estendidos por uma atividade de polimerase da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde para amplificar a sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde para separar a molécula repórter fluorescente da molécula supressora na sonda TD, resultando em geração de um sinal de fluorescência; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, a segunda porção de hibridização 5' não seja digerida pela atividade de exonuclease 5' a 3' da polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tal que a molécula repórter fluorescente não seja separada da molécula supressora na sonda TD, não resultando em nenhum sinal de fluorescência; e (c) detecção do sinal de fluorescência, tal que o sinal de fluorescência gerado seja indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos, a sonda TD compreende pelo menos dois tipos de sondas, o iniciador de sentido direto compreende pelo menos dois tipos de iniciadores e o iniciador de sentido reverso compreende pelo menos dois tipos de iniciadores.
22. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da sonda TD, e a sonda TD apresenta uma sequência correspondente à variação de nucleotídeos em sua segunda porção de hibridização de 5'.
23. Método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD) por uma reação de ligação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com uma primeira sonda tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um primeiro sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos e uma segunda sonda tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar a um segundo sítio da sequência-alvo de ácidos nucleicos que é posicionada a montante do primeiro sítio; em que pelo menos uma da primeira sonda e da segunda sonda tem uma marcação para gerar um sinal detectável e a marcação é uma marcação química, uma marcação enzimática, uma marcação fluorescente, uma marcação luminescente, uma marcação quimioluminescente ou uma marcação metálica; em que a segunda sonda é uma sonda TD; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I) em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; o comprimento da segunda porção de hibridização 5' é de 3-15 nucleotídeos, o comprimento da primeira porção de hibridização 3' é de 15-60 nucleotídeos e a primeira porção de hibridização 3' é maior do que a segunda porção de hibridização 5'; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a segunda sonda for hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' da segunda sonda serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos para permitir a ligação da primeira sonda e a segunda sonda; em que quando a segunda sonda for hibridizada com a sequência de ácidos nucleicos não alvo, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a porção de separação da segunda sonda formarão uma fita única tal que a primeira sonda e a segunda sonda não sejam ligadas, pelo qual a segunda sonda permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; (b) ligação da primeira sonda e da segunda sonda hibridizada com a sequência-alvo de ácidos nucleicos tal que uma sonda ligada seja produzida; (c) desnaturação do resultante da etapa (b); (d) detecção do sinal de marcação na sonda ligada, tal que o sinal seja indicativo da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a marcação é o sistema de marcação interativa compreendendo um par de uma molécula repórter e uma molécula supressora.
25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a primeira sonda tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual (DSO) representada pela seguinte fórmula II geral: 5'-Xp-Yq-Zr-3' (II) em que, Xp representa uma primeira porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo; Yq representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Zr representa uma segunda porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar ao ácido nucleico alvo; p, q e r representam o número de nucleotídeos, e X, Y e Z são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da primeira porção de hibridização 5' é mais alta do que aquela da segunda porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação separa a primeira porção de hibridização 5' da segunda porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização ao ácido nucleico alvo, pelo qual a especificidade de hibridização do oligonucleotídeo é determinada duplamente por primeira porção de hibridização 5' e a segunda porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total do oligonucleotídeo seja aumentada.
26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a repetição das etapas (a) - (c) ou (a) - (d).
27. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que é realizado em uma fase sólida; em que a primeira sonda é imobilizada pela sua extremidade 5' na superfície de um substrato sólido e a segunda sonda não é imobilizada.
28. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que é realizado em uma fase sólida; em que a segunda sonda é imobilizada pela sua extremidade 3' na superfície do substrato sólido e a primeira sonda não é imobilizada.
29. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende pelo menos dois tipos de sequências de ácidos nucleicos e a primeira sonda e a segunda sonda cada uma compreende pelo menos dois tipos de sondas.
30. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a sequência-alvo de ácidos nucleicos compreende uma variação de nucleotídeo, a variação de nucleotídeo na sequência-alvo de ácidos nucleicos está presente em um sítio em oposição à segunda porção de hibridização 5' da sonda TD, e a sonda TD apresenta uma sequência correspondente à variação de nucleotídeos em sua segunda porção de hibridização de 5'.
31. Método para detecção de uma sequência-alvo de ácidos nucleicos de DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos usando uma sonda distintiva alvo (sonda TD), caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) hibridização da sequência-alvo de ácidos nucleicos com a sonda TD tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; em que a sonda TD tem uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dual modificada (mDSO) representada pela seguinte fórmula I geral: 5'-X'p-Y'q-Z'r-3' (I) em que, X'p representa uma segunda porção de hibridização 5' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; Y'q representa uma porção de separação compreendendo pelo menos três bases universais, Z'r representa uma primeira porção de hibridização 3' tendo uma sequência nucleotídica de hibridização complementar à sequência-alvo de ácidos nucleicos; a sonda TD é marcada com uma molécula repórter fluorescente na segunda porção de hibridização 5'; p, q e r representam o número de nucleotídeos; e X', Y' e Z' são desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos; a Tm da segunda porção de hibridização 5' é mais baixa do que aquela da primeira porção de hibridização 3' e a porção de separação tem a Tm mais baixa nas três porções de X'p, Y'q e Z'r; o comprimento da segunda porção de hibridização 5' é de 3-15 nucleotídeos, o comprimento da primeira porção de hibridização 3' é de 15-60 nucleotídeos e a primeira porção de hibridização 3' é maior do que a segunda porção de hibridização 5'; a porção de separação separa a segunda porção de hibridização 5' da primeira porção de hibridização 3' em termos de eventos de hibridização à sequência-alvo de ácidos nucleicos, pelo qual a especificidade de hibridização da sonda TD é determinada duplamente pela segunda porção de hibridização 5' e a primeira porção de hibridização 3' tal que a especificidade de hibridização total da sonda TD seja aumentada; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência- alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' quanto a primeira porção de hibridização 3' serão hibridizadas com a sequência-alvo de ácidos nucleicos para induzir uma modificação na fluorescência da molécula repórter fluorescente; em que quando a sonda TD for hibridizada com a sequência não alvo de ácidos nucleicos, tanto a segunda porção de hibridização 5' como a porção de separação formarão uma fita única para não induzir modificação na fluorescência da molécula repórter fluorescente, pelo qual a sonda TD permite discriminar a sequência-alvo de ácidos nucleicos de sequência não alvo de ácidos nucleicos; e (b) detecção da modificação de fluorescência, tal que a modificação de fluorescência é indicativa da presença da sequência- alvo de ácidos nucleicos.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um iniciador de sentido reverso e uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tal que a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD seja adicionalmente gerada para aumentar a modificação de fluorescência indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) é realizada usando a sonda TD em conjunto com um par de iniciadores composto de dois iniciadores como um iniciador de sentido direto e um iniciador de sentido reverso e uma polimerase de ácidos nucleicos dependente de molde tal que a sequência-alvo de ácidos nucleicos hibridizável com a sonda TD seja amplificada por PCR para aumentar a modificação de fluorescência indicativa da presença da sequência-alvo de ácidos nucleicos.
34. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a sonda TD é adicionalmente marcada com uma molécula supressora capaz de extinguir a fluorescência da molécula repórter.
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