CN106817904A - T细胞平衡基因表达、物质组合物及其使用方法 - Google Patents

T细胞平衡基因表达、物质组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明总体上涉及用于鉴定调节网络的多种组合物和多种方法，该调节网络调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡，例如，Th17细胞分化、维持和/或功能，并且涉及用于对在多种治疗和/或诊断适应症中调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡的调节网络进行探索的多种组合物和多种方法。本发明总体上还涉及鉴定和探索在多种治疗和/或诊断适应症中调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡的多种靶基因和/或多种靶基因产物。

Description

T细胞平衡基因表达、物质组合物及其使用方法
相关申请和引用参考
本申请要求2014年2月27日提交的美国临时专利申请61/945,641的优先权，将该专利申请通过引用并入本文。参考WO/2012/048265；WO/2014/145631；WO/2014/134351。前述申请、以及在其中或在审查程序期间引用的所有文献(“申请引用的文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、以及在本文引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用并入本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本发明的实践中采用。申请引用的文献、本文引用的文献、在本文中参考或引用的所有文献、以及被指明为通过引用并入本文的所有文献在如同当引用或参考时或在引用或参考的情况下每个单独文献被确切地且单独地完全地在本文中阐述并且被指明为通过引用并入的相同程度上而通过引用并入。
联邦资助说明
本发明是在以下拨款的政府支持下进行的：美国国立卫生研究院授予的先锋拨款(Pioneer Grant)DP1OD003958-01；美国国立卫生研究院授予的先锋拨款DP1OD003958-03；美国国立卫生研究院授予的基因组学科学精英中心拨款(Centers of Excellence inGenomics Science Grant)1P50HG006193-01；美国国家人类基因组研究所(NationalHuman Genome Research Institute)授予的拨款1P01HG005062-01；美国国立卫生研究院授予的拨款DP1OD003893；美国国立卫生研究院授予的拨款NS30843；美国国立卫生研究院授予的拨款NS045937；美国国立卫生研究院授予的拨款AI 73748；美国国立卫生研究院授予的拨款AI45757；美国国立卫生研究院授予的拨款P01AI056299以及纽约的美国国家多发性硬化症学会(National MS Society)授予的拨款RG2571。美国政府可以享有某些权利。
发明领域
本发明总体上涉及用于鉴定调节网络的多种组合物和多种方法，该调节网络调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡，例如，Th17细胞分化、维持和/或功能，并且涉及用于对在多种治疗和/或诊断适应症中调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡的调节网络进行探索的多种组合物和多种方法。本发明总体上还涉及鉴定和探索在多种治疗和/或诊断适应症中调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡的多种靶基因和/或多种靶基因产物。
发明背景
尽管其重要性，控制T细胞的平衡(包括天然T细胞的分化)的分子回路依然大部分是未知的。最近在哺乳动物细胞中重建调节网络的研究集中于短期应答并且依赖于基于扰动的途径，这些途径不能容易地应用于原代T细胞。因此，对于更好地理解调控、控制或以其他方式影响T细胞平衡(包括Th17细胞分化、维持和功能)的动态调节网络和用于在多种治疗和诊断方法中探索此网络的手段存在需要。本文中的引用并不预期为承认引用的任何内容是相关技术或现有技术；它也并不构成对引用的任何内容的内容或日期的任何承认。
发明概述
本发明具有许多实用性。本发明涉及并且包括药物发现方法和自其中的组合物；以及用于检测患者或受试者，并且因此确定哪种药物或药物组合可以提供关于病症或疾病或感染或感染状态的具体治疗或疗法的方法和自其中的组合物，这些患者或受试者可以或可以不响应于或者可以或可以不正在响应于具体治疗、疗法、化合物、药物或者药物或化合物组合；以及用于选择患者群体的方法和组合物(例如，通过对可以或可以不响应的或者可以或可以不正在响应的患者进行检测)，或涉及个性化治疗的方法和组合物—药物发现和对患者或受试者进行检测的组合，这些患者或受试者可以不响应于或不正在响应于具体治疗、疗法、化合物、药物或者药物或化合物组合(例如，通过就一个或多个个体而言，这样检测应答、不响应、响应或不响应的潜力，并且调整待给予的具体治疗、疗法、化合物、药物或者药物或化合物组，或给予通过该检测指示的治疗、疗法、化合物、药物或者药物或化合物组合)。
本发明提供了用于调控T细胞平衡(例如，Th17细胞分化、维持和功能)的组合物和方法，以及用于在多种治疗和诊断方法中探索此网络的手段。如本文所使用，术语“调控”包括上调或以其他方式增加一种或多种基因的表达，下调或以其他方式降低一种或多种基因的表达，抑制或以其他方式降低一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能，和/或增强或以其他方式增加一种或多种基因产物的表达、活性和/或功能。
如本文所使用，术语“调控T细胞平衡”包括调控多种T细胞相关功能和/或活性中任一项，包括通过非限制性举例的方式，控制或以其他方式影响调节T细胞分化的网络；控制或以其他方式影响调节T细胞维持(例如跨T细胞的寿命)的网络；控制或以其他方式影响调节T细胞功能的网络；控制或以其他方式影响调节辅助性T细胞(Th细胞)分化的网络；控制或以其他方式影响调节Th细胞维持(例如跨Th2细胞的寿命)的网络；控制或以其他方式影响调节Th细胞功能的网络；控制或以其他方式影响调节Th17细胞分化的网络；控制或以其他方式影响调节Th17细胞维持(例如跨Th17细胞的寿命)的网络；控制或以其他方式影响调节Th17细胞功能的网络；控制或以其他方式影响调节调节性T细胞(Treg)分化的网络；控制或以其他方式影响调节Treg细胞维持(例如跨Treg细胞的寿命)的网络；控制或以其他方式影响调节Treg细胞功能的网络；控制或以其他方式影响调节其他CD4+T细胞分化的网络；控制或以其他方式影响调节其他CD4+T细胞维持的网络；控制或以其他方式影响调节其他CD4+T细胞功能的网络；操纵或以其他方式影响T细胞的比率如，例如，操纵或以其他方式影响Th17细胞与其他T细胞类型如Treg或其他CD4+T细胞的比率；操纵或以其他方式影响不同类型的Th17细胞(例如，病原性Th17细胞和非病原性Th17细胞)的比率；操纵或以其他方式影响一种T细胞的至少一种功能或生物活性；操纵或以其他方式影响一种Th细胞的至少一种功能或生物活性；操纵或以其他方式影响一种Treg细胞的至少一种功能或生物活性；操纵或以其他方式影响一种Th17细胞的至少一种功能或生物活性；和/或操纵或以其他方式影响另一种CD4+T细胞的至少一种功能或生物活性。
本发明提供了调控T细胞平衡的T细胞调控剂。例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击多个T细胞类型之间(例如Th17和其他T细胞类型(例如调节性T细胞(Treg))之间)、和/或Th17活性和炎性潜能之间的一个或多个水平和/或平衡的方法。如本文所使用，术语如“Th17细胞”和/或“Th17表型”及其所有语法变型是指一种分化T辅助细胞，该细胞表达一种或多种选自下组的细胞因子，该组由以下各项组成：白细胞介素17A(IL-17A)、白细胞介素17F(IL-17F)、以及白细胞介素17A/F异二聚体(IL17-AF)。如本文所使用，术语如“Th1细胞”和/或“Th1表型”及其所有语法变型是指一种分化T辅助细胞，该细胞表达干扰素γ(IFNγ)。如本文所使用，术语如“Th2细胞”和/或“Th2表型”及其所有语法变型是指一种分化T辅助细胞，该细胞表达一种或多种选自下组的细胞因子，该组由以下各项组成：白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)和白细胞介素13(IL-13)。如本文所使用，术语如“Treg细胞”和/或“Treg表型”及其所有语法变型是指一种分化T细胞，该细胞表达Foxp3。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击多个Th17表型之间、和/或Th17活性和炎性潜能之间的水平和/或平衡的方法。合适的T细胞调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击多个Th17细胞类型之间(例如，病原性和非病原性Th17细胞之间)的水平和/或平衡的方法。例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击病原性和非病原性Th17活性之间的水平和/或平衡的方法。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个T细胞群例如在具有或没有特定病原性差别的情况下朝向Th17细胞分化、或在具有或没有特定病原性差别的情况下远离Th17细胞分化的方法。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个T细胞群例如朝向非Th17 T细胞亚群或远离非Th17细胞亚群分化的方法。例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来诱导T-细胞可塑性，即，将Th17细胞转变为一种不同亚型，或转变为一个新的状态的方法。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来诱导T细胞可塑性，例如，将Th17细胞转变为一种不同亚型，或转变为一个新的状态的方法。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来达到上述项的任何组合的方法。
在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的一种混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
这些T细胞调控剂被用来调控一种或多种靶基因的表达或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，这一种或多种靶基因已被鉴定为响应于Th17相关的扰动的基因。这些靶基因是例如通过使T细胞(例如，天然T细胞、部分分化的T细胞、分化的T细胞和/或其组合)与一种T细胞调控剂接触，并且监测对一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达的作用(如果有的话)来鉴定的。在一些实施例中，该一种或多种标签基因是选自本说明书的表1或表2中列出的那些。
在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表3中列出的那些的一种或多种Th17相关细胞因子或受体分子。在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表4中所示的那些的一种或多种Th17相关转录调节物。
在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表5中所示的那些的一种或多种Th17相关转录调节物。在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表6中列出的那些的一种或多种Th17相关受体分子。在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表7中列出的那些的一种或多种Th17相关激酶。在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表8中列出的那些的一种或多种Th17相关信号传导分子。在一些实施例中，该靶基因是选自本说明书的表9中列出的那些的一种或多种Th17相关受体分子。
在一些实施例中，该靶基因是涉及在诱导Th17分化中的一种或多种靶基因如，例如，IRF1、IRF8、IRF9、STAT2、STAT3、IRF7、STAT1、ZFP281、IFI35、REL、TBX21、FLI1、BATF、IRF4，在表5中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，AES、AHR、ARID5A、BATF、BCL11B、BCL3、CBFB、CBX4、CHD7、CITED2、CREB1、E2F4、EGR1、EGR2、ELL2、ETS1、ETS2、ETV6、EZH1、FLI1、FOXO1、GATA3、GATAD2B、HIF1A、ID2、IFI35、IKZF4、IRF1、IRF2、IRF3、IRF4、IRF7、IRF9、JMJD1C、JUN、LEF1、LRRFIP1、MAX、NCOA3、NFE2L2、NFIL3、NFKB1、NMI、NOTCH1、NR3C1、PHF21A、PML、PRDM1、REL、RELA、RUNX1、SAP18、SATB1、SMAD2、SMARCA4、SP100、SP4、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5B、STAT6、TFEB、TP53、TRIM24、和/或ZFP161，或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是涉及在Th17表型的起始和Th17 T细胞的扩增中的一种或多种靶基因如，例如，IRF8、STAT2、STAT3、IRF7、JUN、STAT5B、ZPF2981、CHD7、TBX21、FLI1、SATB1、RUNX1、BATF、RORC、SP4，在表5中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，AES、AHR、ARID3A、ARID5A、ARNTL、ASXL1、BATF、BCL11B、BCL3、BCL6、CBFB、CBX4、CDC5L、CEBPB、CHD7、CREB1、CREB3L2、CREM、E2F4、E2F8、EGR1、EGR2、ELK3、ELL2、ETS1、ETS2、ETV6、EZH1、FLI1、FOSL2、FOXJ2、FOXO1、FUS、HIF1A、HMGB2、ID1、ID2、IFI35、IKZF4、IRF3、IRF4、IRF7、IRF8、IRF9、JUN、JUNB、KAT2B、KLF10、KLF6、KLF9、LEF1、LRRFIP1、MAFF、MAX、MAZ、MINA、MTA3、MYC、MYST4、NCOA1、NCOA3、NFE2L2、NFIL3、NFKB1、NMI、NOTCH1、NR3C1、PHF21A、PML、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、RARA、RBPJ、RELA、RORA、RUNX1、SAP18、SATB1、SKI、SKIL、SMAD2、SMAD7、SMARCA4、SMOX、SP1、SP4、SS18、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUZ12、TBX21、TFEB、TLE1、TP53、TRIM24、TRIM28、TRPS1、VAV1、ZEB1、ZEB2、ZFP161、ZFP62、ZNF238、ZNF281、和/或ZNF703，或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是涉及在稳定Th17细胞和/或调控Th17相关的白细胞介素23(IL-23)信号传导中的一种或多种靶基因如，例如STAT2、STAT3、JUN、STAT5B、CHD7、SATB1、RUNX1、BATF、RORC、SP4IRF4，在表5中列出如与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，AES、AHR、ARID3A、ARID5A、ARNTL、ASXL1、ATF3、ATF4、BATF、BATF3、BCL11B、BCL3、BCL6、C21ORF66、CBFB、CBX4、CDC5L、CDYL、CEBPB、CHD7、CHMP1B、CIC、CITED2、CREB1、CREB3L2、CREM、CSDA、DDIT3、E2F1、E2F4、E2F8、EGR1、EGR2、ELK3、ELL2、ETS1、ETS2、EZH1、FLI1、FOSL2、FOXJ2、FOXO1、FUS、GATA3、GATAD2B、HCLS 1、HIF1A、ID1、ID2、IFI35、IKZF4、IRF3、IRF4、IRF7、IRF8、IRF9、JARID2、JMJD1C、JUN、JUNB、KAT2B、KLF10、KLF6、KLF7、KLF9、LASS4、LEF1、LRRFIP1、MAFF、MAX、MEN1、MINA、MTA3、MXI1、MYC、MYST4、NCOA1、NCOA3、NFE2L2、NFIL3、NFKB1、NMI、NOTCH1、NR3C1、PHF13、PHF21A、PML、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、RARA、RBPJ、REL、RELA、RNF11、RORA、RORC、RUNX1、RUNX2、SAP18、SAP30、SATB1、SERTAD1、SIRT2、SKI、SKIL、SMAD2、SMAD4、SMAD7、SMARCA4、SMOX、SP1、SP100、SP4、SS18、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUZ12、TBX21、TFEB、TGIF1、TLE1、TP53、TRIM24、TRPS1、TSC22D3、UBE2B、VAV1、VAX2、XBP1、ZEB1、ZEB2、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZNF238、ZNF281、ZNF703、ZNRF1、和/或ZNRF2，或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表6中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，FAS、CCR5、IL6ST、IL17RA、IL2RA、MYD88、CXCR5、PVR、IL15RA、IL12RB1、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表6中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，IL7R、ITGA3、IL1R1、CCR5、CCR6、ACVR2A、IL6ST、IL17RA、CCR8、DDR1、PROCR、IL2RA、IL12RB2、MYD88、PTPRJ、TNFRSF13B、CXCR3、IL1RN、CXCR5、CCR4、IL4R、IL2RB、TNFRSF12A、CXCR4、KLRD1、IRAK1BP1、PVR、IL12RB1、IL18R1、TRAF3、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表6中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，IL7R、ITGA3、IL1R1、FAS、CCR5、CCR6、ACVR2A、IL6ST、IL17RA、DDR1、PROCR、IL2RA、IL12RB2、MYD88、BMPR1A、PTPRJ、TNFRSF13B、CXCR3、IL1RN、CXCR5、CCR4、IL4R、IL2RB、TNFRSF12A、CXCR4、KLRD1、IRAK1BP1、PVR、IL15RA、TLR1、ACVR1B、IL12RB1、IL18R1、TRAF3、IFNGR1、PLAUR、IL21R、IL23R、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表7中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，EIF2AK2、DUSP22、HK2、RIPK1、RNASEL、TEC、MAP3K8、SGK1、PRKCQ、DUSP16、BMP2K、PIM2、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表7中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，PSTPIP1、PTPN1、ACP5、TXK、RIPK3、PTPRF、NEK4、PPME1、PHACTR2、HK2、GMFG、DAPP1、TEC、GMFB、PIM1、NEK6、ACVR2A、FES、CDK6、ZAK、DUSP14、SGK1、JAK3、ULK2、PTPRJ、SPHK1、TNK2、PCTK1、MAP4K3、TGFBR1、HK1、DDR1、BMP2K、DUSP10、ALPK2、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表7中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，PTPLA、PSTPIP1、TK1、PTEN、BPGM、DCK、PTPRS、PTPN18、MKNK2、PTPN1、PTPRE、SH2D1A、PLK2、DUSP6、CDC25B、SLK、MAP3K5、BMPR1A、ACP5、TXK、RIPK3、PPP3CA、PTPRF、PACSIN1、NEK4、PIP4K2A、PPME1、SRPK2、DUSP2、PHACTR2、DCLK1、PPP2R5A、RIPK1、GK、RNASEL、GMFG、STK4、HINT3、DAPP1、TEC、GMFB、PTPN6、RIPK2、PIM1、NEK6、ACVR2A、AURKB、FES、ACVR1B、CDK6、ZAK、VRK2、MAP3K8、DUSP14、SGK1、PRKCQ、JAK3、ULK2、HIPK2、PTPRJ、INPP1、TNK2、PCTK1、DUSP1、NUDT4、TGFBR1、PTP4A1、HK1、DUSP16、ANP32A、DDR1、ITK、WNK1、NAGK、STK38、BMP2K、BUB1、AAK1、SIK1、DUSP10、PRKCA、PIM2、STK17B、TK2、STK39、ALPK2、MST4、PHLPP1、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表8中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，HK2、CDKN1A、DUT、DUSP1、NADK、LIMK2、DUSP11、TAOK3、PRPS 1、PPP2R4、MKNK2、SGK1、BPGM、TEC、MAPK6、PTP4A2、PRPF4B、ACP1、CCRN4L、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表8中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，HK2、ZAP70、NEK6、DUSP14、SH2D1A、ITK、DUT、PPP1R11、DUSP1、PMVK、TK1、TAOK3、GMFG、PRPS1、SGK1、TXK、WNK1、DUSP19、TEC、RPS6KA1、PKM2、PRPF4B、ADRBK1、CKB、ULK2、PLK1、PPP2R5A、PLK2、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表8中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，ZAP70、PFKP、NEK6、DUSP14、SH2D1A、INPP5B、ITK、PFKL、PGK1、CDKN1A、DUT、PPP1R11、DUSP1、PMVK、PTPN22、PSPH、TK1、PGAM1、LIMK2、CLK1、DUSP11、TAOK3、RIOK2、GMFG、UCKL1、PRPS1、PPP2R4、MKNK2、DGKA、SGK1、TXK、WNK1、DUSP19、CHP、BPGM、PIP5K1A、TEC、MAP2K1、MAPK6、RPS6KA1、PTP4A2、PKM2、PRPF4B、ADRBK1、CKB、ACP1、ULK2、CCRN4L、PRKCH、PLK1、PPP2R5A、PLK2、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表9中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，CD200、CD40LG、CD24、CCND2、ADAM17、BSG、ITGAL、FAS、GPR65、SIGMAR1、CAP1、PLAUR、SRPRB、TRPV2、IL2RA、KDELR2、TNFRSF9、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表9中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，CTLA4、CD200、CD24、CD5L、CD9、IL2RB、CD53、CD74、CAST、CCR6、IL2RG、ITGAV、FAS、IL4R、PROCR、GPR65、TNFRSF18、RORA、IL1RN、RORC、CYSLTR1、PNRC2、LOC390243、ADAM10、TNFSF9、CD96、CD82、SLAMF7、CD27、PGRMC1、TRPV2、ADRBK1、TRAF6、IL2RA、THY1、IL12RB2、TNFRSF9、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是在表9中列出的如与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，CTLA4、TNFRSF4、CD44、PDCD1、CD200、CD247、CD24、CD5L、CCND2、CD9、IL2RB、CD53、CD74、ADAM17、BSG、CAST、CCR6、IL2RG、CD81、CD6、CD48、ITGAV、TFRC、ICAM2、ATP1B3、FAS、IL4R、CCR7、CD52、PROCR、GPR65、TNFRSF18、FCRL1、RORA、IL1RN、RORC、P2RX4、SSR2、PTPN22、SIGMAR1、CYSLTR1、LOC390243、ADAM10、TNFSF9、CD96、CAP1、CD82、SLAMF7、PLAUR、CD27、SIVA1、PGRMC1、SRPRB、TRPV2、NR1H2、ADRBK1、GABARAPL1、TRAF6、IL2RA、THY1、KDELR2、IL12RB2、TNFRSF9、SCARB1、IFNGR1、或其任何组合。
在一些实施例中，该靶基因是作为Th17细胞分化启动子的一种或多种靶基因。在一些实施例中，该靶基因是GPR65。在一些实施例中，该靶基因还是病原性Th17细胞分化的启动子并且选自下组，该组由以下各项组成：CD5L、DEC1、PLZP和TCF4。
在一些实施例中，该靶基因是作为病原性Th17细胞分化启动子的一种或多种靶基因。在一些实施例中，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：CD5L、DEC1、PLZP和TCF4。
选择所希望的基因或靶基因组合，并且在确定Th17分化和/或Th17维持期间所选择的一种或多种靶基因是否过表达或低表达之后，取决于所希望的分化、维持和/或功能结果使用一种适合的拮抗剂或激动剂。例如，对于被鉴定为Th17分化的正调节物的靶基因，使用与那些靶基因相互作用的一种拮抗剂使分化远离Th17表型转变，而使用与那些靶基因相互作用的一种激动剂使分化朝向Th17表型转变。对于被鉴定为Th17分化的负调节物的靶基因，使用与那些靶基因相互作用的一种拮抗剂使分化朝向Th17表型转变，而使用与那些靶基因相互作用的一种激动剂使分化远离Th17表型转变。例如，对于被鉴定为Th17维持的正调节物的靶基因，使用与那些靶基因相互作用的一种拮抗剂将降低具有Th17表型的细胞的数目，而使用与那些靶基因相互作用的一种激动剂将增加具有Th17表型的细胞的数目。对于被鉴定为Th17分化的负调节物的靶基因，使用与那些靶基因相互作用的一种拮抗剂将增加具有Th17表型的细胞的数目，而使用与那些靶基因相互作用的一种激动剂将降低具有Th17表型的细胞的数目。合适的T细胞调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
在一些实施例中，Th17分化的正调节物是选自以下项的一种靶基因：MINA、TRPS1、MYC、NKFB1、NOTCH、PML、POU2AF1、PROCR、RBPJ、SMARCA4、ZEB1、BATF、CCR5、CCR6、EGR1、EGR2、ETV6、FAS、IL12RB1、IL17RA、IL21R、IRF4、IRF8、ITGA3、及其组合。在一些实施例中，Th17分化的正调节物是选自以下项的一种靶基因：MINA、PML、POU2AF1、PROCR、SMARCA4、ZEB1、EGR2、CCR6、FAS及其组合。
在一些实施例中，Th17分化的负调节物是选自以下项的一种靶基因：SP4、ETS2、IKZF4、TSC22D3、IRF1及其组合。在一些实施例中，Th17分化的负调节物是选自以下项的一种靶基因：SP4、IKZF4、TSC22D3及其组合。
在一些实施例中，T细胞调控剂是一种可溶性Fas多肽或一种来源于FAS的多肽。在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂增强或以其他方式增加FAS在Th17细胞中的表达、活性和/或功能。如在本文所示，FAS在T细胞群中的表达诱导或以其他方式影响朝向Th17细胞分化。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种免疫应答，例如，一种自身免疫应答或一种炎症应答。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种感染性疾病或其他基于病原体的障碍。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽激动剂、肽激动剂、核酸激动剂、核酸配体、或小分子激动剂。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂抑制FAS的表达、活性和/或功能。在T细胞群中抑制FAS表达、活性和/或功能阻遏或以其他方式影响远离Th17细胞分化和/或诱导或以其他方式影响朝向调节性T细胞(Treg)并且朝向Th1细胞分化。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种免疫应答，例如，一种自身免疫应答或一种炎症应答。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗自身免疫疾病如银屑病、炎性肠病(IBD)、强直性脊柱炎、多发性硬化症、舍格林氏综合征、葡萄膜炎、以及类风湿关节炎、哮喘、系统性红斑狼疮、移植排斥(包括同种异体移植排斥)、及其组合。此外，Th17细胞的增强还可用于清除真菌感染以及细胞外病原体。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是表达另外的细胞因子的部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的一种混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂抑制CCR5的表达、活性和/或功能。在T细胞群中抑制CCR5表达、活性和/或功能阻遏或以其他方式影响远离Th17细胞分化和/或诱导或以其他方式影响朝向调节性T细胞(Treg)并且朝向Th1细胞分化。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种免疫应答，例如，一种自身免疫应答或一种炎症应答。在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种抑制物或中和剂。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的一种混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂抑制CCR6的表达、活性和/或功能。在T细胞群中抑制CCR6表达、活性和/或功能阻遏或以其他方式影响远离Th17细胞分化和/或诱导或以其他方式影响朝向调节性T细胞(Treg)并且朝向Th1细胞分化。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种免疫应答，例如，一种自身免疫应答或一种炎症应答。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的一种混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂抑制EGR1的表达、活性和/或功能。在T细胞群中抑制EGR1表达、活性和/或功能阻遏或以其他方式影响远离Th17细胞分化和/或诱导或以其他方式影响朝向调节性T细胞(Treg)并且朝向Th1细胞分化。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种免疫应答，例如，一种自身免疫应答或一种炎症应答。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的一种混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂抑制EGR2的表达、活性和/或功能。在T细胞群中抑制EGR2表达、活性和/或功能阻遏或以其他方式影响远离Th17细胞分化和/或诱导或以其他方式影响朝向调节性T细胞(Treg)并且朝向Th1细胞分化。在一些实施例中，这些T细胞调控剂有用于治疗一种免疫应答，例如，一种自身免疫应答或一种炎症应答。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和分化的T细胞的一种混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞和部分分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是部分分化的T细胞和分化的T细胞的混合物。在一些实施例中，这些T细胞是天然T细胞、部分分化的T细胞、和分化的T细胞的混合物。
例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击一个Th17细胞或多个细胞的群体的表型的方法，例如，通过影响一个天然T细胞或多个细胞的群体分化为一个病原性或非病原性Th17细胞或多个细胞的群体，通过引起一个病原性Th17细胞或多个细胞的群体转换为一个非病原性Th17细胞或多个T细胞的群体(例如，多个天然T细胞的、多个部分分化的T细胞的、多个分化的T细胞的及其组合的群体)，或通过引起一个非病原性Th17细胞或多个T细胞的群体(例如，多个天然T细胞的、多个部分分化的T细胞的、多个分化的T细胞的及其组合的群体)转换为一个病原性Th17细胞或多个细胞的群体。
在一些实施例中，本发明包括一种用于治疗涉及免疫应答的疾病或病症的药物发现方法，该免疫应答涉及靶基因的细胞群或组织中的T细胞平衡，该方法包括以下步骤：提供一种化合物或多种化合物(该一种或多种化合物有待针对其在所述疾病或病症的治疗中的功效而被筛选)，使所述化合物或所述多种化合物与所述细胞群或组织接触，检测靶基因的表达、活性和/或功能的第一水平，将检测到的水平与靶基因的水平对照进行比较，并且评估检测到的水平与对照水平之间的差异以确定由所述化合物或所述多种化合物引起的免疫应答。例如，该方法考虑了比较可以尤其作为被感染组织、发炎组织、健康组织、或其组织样品组合的组织样品。
在本发明的一个实施例中，本发明的无还原酶动物可以有利地用于以组织或细胞特异性方式调控T细胞平衡。此类动物可以用于上文描述的应用，在这些应用中有待研究T细胞平衡在产物/药物代谢、解毒、正常稳态或在疾病病因学中的作用。设想的是这个实施例还将允许在不存在代谢(例如，碳代谢)的情况下在那些组织或细胞中研究其他作用，如药物转运体介导的作用。因此，在本发明的另一方面中，本发明的动物可以用于调控任何以上细胞类型中的功能和抗体，以产生疾病模型或产品/药物发现模型或用于验证或评价T细胞平衡的功能的模型。
在另一个实施例中，该方法考虑了使用本发明的动物组织和/或自其衍生的细胞群作为用于研究以下事件/参数中的任何一者或多者的体外测定：(i)转运体在产品吸收和排出中的作用；(ii)由T细胞产生的产物代谢物的鉴定；(iii)评估候选产品是否是T细胞；或(iv)评价归因于T细胞平衡的药物/药物相互作用。
如本文所使用，术语“病原性”或“非病原性”不应被解释为暗示一种Th17细胞表型比另一种更令人希望。如在本文所述，存在如下例子，其中抑制对病原性Th17细胞的诱导或朝向该非病原性Th17表型调控Th17表型是令人希望的。同样，存在如下例子，其中抑制对非病原性Th17细胞的诱导或朝向该病原性Th17表型调控Th17表型是令人希望的。
如本文所使用，术语如“病原性Th17细胞”和/或“病原性Th17表型”及其所有语法变型是指Th17细胞，在TGF-β3的存在下诱导时，这些Th17细胞表达升高水平的选自以下项的一种或多种基因：Cxcl3、IL22、IL3、Ccl4、Gzmb、Lrmp、Ccl5、Casp1、Csf2、Ccl3、Tbx21、Icos、IL17r、Stat4、Lgals3和Lag，如相比于在TGF-β3-诱导的Th17细胞中的表达水平。如本文所使用，术语如“非病原性Th17细胞”和/或“非病原性Th17表型”及其所有语法变型是指Th17细胞，在TGF-β3的存在下诱导时，这些Th17细胞表达降低水平的选自以下项的一种或多种基因：IL6st、IL1rn、Ikzf3、Maf、Ahr、IL9和IL10，如相比于在TGF-β3-诱导的Th17细胞中的表达水平。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂增强或以其他方式增加在Th17细胞中蛋白C受体(PROCR，也称为EPCR或CD201)的表达、活性和/或功能。如在本文所示，PROCR在Th17细胞中的表达降低了这些Th17细胞的病原性，例如，通过将Th17细胞从病原性标签转换为非病原性标签。因此，PROCR和/或PROCR的这些激动剂有用于治疗多种适应症，特别是治疗异常免疫应答(例如在自身免疫疾病和/或炎性障碍中)。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽激动剂、肽激动剂、核酸激动剂、核酸配体、或小分子激动剂。
在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种药剂，该药剂抑制蛋白C受体(PROCR，也称为EPCR或CD201)的表达、活性和/或功能。对在Th17细胞中PROCR表达、活性和/或功能的抑制将非病原性Th17细胞转换为病原性Th17细胞。因此，这些PROCR拮抗剂有用于治疗多种适应症，例如，感染性疾病和/或其他基于病原体的障碍。在一些实施例中，该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，该T细胞调控剂是一种可溶性蛋白C受体(PROCR，也称为EPCR或CD201)多肽或一种衍生自PROCR的多肽。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法在一个细胞群中抑制Th17分化、维持和/或功能，和/或增加选自FOXP3、干扰素γ(IFN-γ)、GATA3、STAT4以及TBX21的一种或多种非Th17相关细胞因子、一种或多种非Th17相关受体分子、或多种非Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，该方法包括使一种T细胞与一种药剂接触，该药剂抑制以下项的表达、活性和/或功能：MINA、MYC、NKFB1、NOTCH、PML、POU2AF1、PROCR、RBPJ、SMARCA4、ZEB1、BATF、CCR5、CCR6、EGR1、EGR2、ETV6、FAS、IL12RB1、IL17RA、IL21R、IRF4、IRF8、ITGA3或其组合。在一些实施例中，该药剂抑制以下项中至少一种的表达、活性和/或功能：MINA、PML、POU2AF1、PROCR、SMARCA4、ZEB1、EGR2、CCR6、FAS或其组合。在一些实施例中，该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，该抗体是嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、或全人类单克隆抗体。在一些实施例中，该T细胞是一种天然T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的非Th17T细胞表型，例如，调节性T细胞(Treg)表型或另一种CD4+T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种部分分化的T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该部分分化的T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的非Th17 T细胞表型，例如，调节性T细胞(Treg)表型或另一种CD4+T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该Th17 T细胞的表型调控为和/或产生一种CD4+T细胞表型而不是一种Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该Th17 T细胞的表型调控为和/或产生在Th17 T细胞表型方面上的转变(例如，在病原性或非病原性Th17细胞表型之间)。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法在一个细胞群中抑制Th17分化和/或增加选自FOXP3、干扰素γ(IFN-γ)、GATA3、STAT4以及TBX21的一种或多种非Th17相关细胞因子、一种或多种非Th17相关受体分子、或非Th17相关转录因子的表达、活性和/或功能，该方法包括使一种T细胞与一种药剂接触，该药剂增强SP4、ETS2、IKZF4、TSC22D3、IRF1或其组合的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂增强SP4、IKZF4、TSC22D3或其组合中至少一项的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽激动剂、肽激动剂、核酸激动剂、核酸配体、或小分子激动剂。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，该T细胞是一种天然T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的非Th17 T细胞表型，例如，调节性T细胞(Treg)表型或另一种CD4+T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种部分分化的T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该部分分化的T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的非Th17 T细胞表型，例如，调节性T细胞(Treg)表型或另一种CD4+T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该Th17 T细胞的表型调控为和/或产生一种CD4+T细胞表型而不是一种Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该Th17 T细胞的表型调控为和/或产生在Th17 T细胞表型方面上的转变(例如，在病原性或非病原性Th17细胞表型之间)。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法在一个细胞群中增强Th17分化，增加选自白细胞介素17F(IL-17F)、白细胞介素17A(IL-17A)、STAT3、白细胞介素21(IL-21)和RAR相关孤儿受体C(RORC)的一种或多种Th17相关细胞因子、一种或多种Th17相关受体分子、或一种或多种Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，和/或降低选自FOXP3、干扰素γ(IFN-γ)、GATA3、STAT4和TBX21的一种或多种非Th17相关细胞因子、一种或多种Th17相关受体分子、或一种或多种非Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，该方法包括使一种T细胞与一种药剂接触，该药剂抑制SP4、ETS2、IKZF4、TSC22D3、IRF1或其组合的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂抑制SP4、IKZF4、TSC22D3或其组合中至少一项的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，该抗体是嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体或全人类单克隆抗体。在一些实施例中，该T细胞是一种天然T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种部分分化的T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该部分分化的T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种CD4+T细胞而不是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该非Th17 T细胞的表型调控为和/或产生一种Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该Th17 T细胞的表型调控为和/或产生在Th17 T细胞表型方面上的转变(例如，在病原性或非病原性Th17细胞表型之间)。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法在一个细胞群中增强Th17分化，增加选自白细胞介素17F(IL-17F)、白细胞介素17A(IL-17A)、STAT3、白细胞介素21(IL-21)和RAR相关孤儿受体C(RORC)的一种或多种Th17相关细胞因子、一种或多种Th17相关受体分子、和/或一种或多种Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，和/或降低选自FOXP3、干扰素γ(IFN-γ)、GATA3、STAT4和TBX21的一种或多种非Th17相关细胞因子、一种或多种Th17相关受体分子、或一种或多种非Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，该方法包括使一种T细胞与一种药剂接触，该药剂增强MINA、MYC、NKFB1、NOTCH、PML、POU2AF1、PROCR、RBPJ、SMARCA4、ZEB1、BATF、CCR5、CCR6、EGR1、EGR2、ETV6、FAS、IL12RB1、IL17RA、IL21R、IRF4、IRF8、ITGA3或其组合的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂增强以下项中至少一种的表达、活性和/或功能：MINA、PML、POU2AF1、PROCR、SMARCA4、ZEB1、EGR2、CCR6、FAS或其组合。在一些实施例中，该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽激动剂、肽激动剂、核酸激动剂、核酸配体、或小分子激动剂。在一些实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些实施例中，该抗体是嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、或全人类单克隆抗体。在一些实施例中，该药剂是以如下量给予的，该量足够抑制Foxp3、IFN-γ、GATA3、STAT4和/或TBX21的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该T细胞是一种天然T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种部分分化的T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该部分分化的T细胞的表型调控为和/或产生一种所希望的Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种CD4+T细胞而不是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该非Th17 T细胞的表型调控为和/或产生一种Th17 T细胞表型。在一些实施例中，该T细胞是一种Th17 T细胞，并且其中该药剂是以如下的量给予的，该量足够将该Th17 T细胞的表型调控为和/或产生在Th17 T细胞表型方面上的转变(例如，在病原性或非病原性Th17细胞表型之间)。
在一些实施例中，本发明提供了一种鉴定与Th17分化相关的基因或遗传元件的方法，该方法包括：a)使T细胞与Th17分化的抑制物或增强Th17分化的药剂接触；并且b)鉴定由步骤(a)调控其表达的基因或遗传元件。在一些实施例中，该方法还包括c)扰动在步骤b)中鉴定的基因或遗传元件在T细胞中的表达，该细胞已经接触Th17分化的抑制物或增强Th17分化的药剂；并且d)鉴定由步骤(c)调控其表达的基因。在一些实施例中，Th17分化的抑制物是一种药剂，该药剂抑制MINA、MYC、NKFB1、NOTCH、PML、POU2AF1、PROCR、RBPJ、SMARCA4、ZEB1、BATF、CCR5、CCR6、EGR1、EGR2、ETV6、FAS、IL12RB1、IL17RA、IL21R、IRF4、IRF8、ITGA3或其组合的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂抑制以下项中至少一种的表达、活性和/或功能：MINA、PML、POU2AF1、PROCR、SMARCA4、ZEB1、EGR2、CCR6、FAS或其组合。在一些实施例中，Th17分化的抑制物是一种药剂，该药剂增强SP4、ETS2、IKZF4、TSC22D3、IRF1或其组合的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，该药剂增强SP4、IKZF4或TSC22D3中至少一种的表达、活性和/或功能。在一些实施例中，增强Th17分化的药剂是一种抑制SP4、ETS2、IKZF4、TSC22D3、IRF1或其组合的表达、活性和/或功能的药剂。在一些实施例中，其中增强Th17分化的药剂是一种增强MINA、MYC、NKFB1、NOTCH、PML、POU2AF1、PROCR、RBPJ、SMARCA4、ZEB1、BATF、CCR5、CCR6、EGR1、EGR2、ETV6、FAS、IL12RB1、IL17RA、IL21R、IRF4、IRF8、ITGA3或其组合的表达、活性和/或功能的药剂。在一些实施例中，该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽拮抗剂、肽拮抗剂、核酸拮抗剂、核酸配体、或小分子拮抗剂。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控Th17分化的诱导的方法，该方法包括使T细胞与一种药剂接触，该药剂调控以下项的表达、活性和/或功能：选自IRF1、IRF8、IRF9、STAT2、STAT3、IRF7、STAT1、ZFP281、IFI35、REL、TBX21、FLI1、BATF、IRF4的一种或多种靶基因或者一种或多种靶基因的一种或多种产物，在表5中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，AES、AHR、ARID5A、BATF、BCL11B、BCL3、CBFB、CBX4、CHD7、CITED2、CREB1、E2F4、EGR1、EGR2、ELL2、ETS1、ETS2、ETV6、EZH1、FLI1、FOXO1、GATA3、GATAD2B、HIF1A、ID2、IFI35、IKZF4、IRF1、IRF2、IRF3、IRF4、IRF7、IRF9、JMJD1C、JUN、LEF1、LRRFIP1、MAX、NCOA3、NFE2L2、NFIL3、NFKB1、NMI、NOTCH1、NR3C1、PHF21A、PML、PRDM1、REL、RELA、RUNX1、SAP18、SATB1、SMAD2、SMARCA4、SP100、SP4、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5B、STAT6、TFEB、TP53、TRIM24、和/或ZFP161，或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控Th17表型的起始和Th17 T细胞的扩增的方法，该方法包括使T细胞与一种药剂接触，该药剂调控以下项的表达、活性和/或功能：选自IRF8、STAT2、STAT3、IRF7、JUN、STAT5B、ZPF2981、CHD7、TBX21、FLI1、SATB1、RUNX1、BATF、RORC、SP4的一种或多种靶基因或者一种或多种靶基因的一种或多种产物，在表5中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，AES、AHR、ARID3A、ARID5A、ARNTL、ASXL1、BATF、BCL11B、BCL3、BCL6、CBFB、CBX4、CDC5L、CEBPB、CHD7、CREB1、CREB3L2、CREM、E2F4、E2F8、EGR1、EGR2、ELK3、ELL2、ETS1、ETS2、ETV6、EZH1、FLI1、FOSL2、FOXJ2、FOXO1、FUS、HIF1A、HMGB2、ID1、ID2、IFI35、IKZF4、IRF3、IRF4、IRF7、IRF8、IRF9、JUN、JUNB、KAT2B、KLF10、KLF6、KLF9、LEF1、LRRFIP1、MAFF、MAX、MAZ、MINA、MTA3、MYC、MYST4、NCOA1、NCOA3、NFE2L2、NFIL3、NFKB1、NMI、NOTCH1、NR3C1、PHF21A、PML、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、RARA、RBPJ、RELA、RORA、RUNX1、SAP18、SATB1、SKI、SKIL、SMAD2、SMAD7、SMARCA4、SMOX、SP1、SP4、SS18、STAT1、STAT2、STAT3、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUZ12、TBX21、TFEB、TLE1、TP53、TRIM24、TRIM28、TRPS1、VAV1、ZEB1、ZEB2、ZFP161、ZFP62、ZNF238、ZNF281、和/或ZNF703，或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控Th17细胞的稳定和/或调控Th17相关的白细胞介素23(IL-23)信号传导的方法，该方法包括将T细胞与一种药剂接触，该药剂调控以下项的表达、活性和/或功能：选自STAT2、STAT3、JUN、STAT5B、CHD7、SATB1、RUNX1、BATF、RORC、SP4IRF4的一种或多种靶基因或者一种或多种靶基因的一种或多种产物，在表5中列出作为与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种，例如，AES、AHR、ARID3A、ARID5A、ARNTL、ASXL1、ATF3、ATF4、BATF、BATF3、BCL11B、BCL3、BCL6、C21ORF66、CBFB、CBX4、CDC5L、CDYL、CEBPB、CHD7、CHMP1B、CIC、CITED2、CREB1、CREB3L2、CREM、CSDA、DDIT3、E2F1、E2F4、E2F8、EGR1、EGR2、ELK3、ELL2、ETS1、ETS2、EZH1、FLI1、FOSL2、FOXJ2、FOXO1、FUS、GATA3、GATAD2B、HCLS 1、HIF1A、ID1、ID2、IFI35、IKZF4、IRF3、IRF4、IRF7、IRF8、IRF9、JARID2、JMJD1C、JUN、JUNB、KAT2B、KLF10、KLF6、KLF7、KLF9、LASS4、LEF1、LRRFIP1、MAFF、MAX、MEN1、MINA、MTA3、MXI1、MYC、MYST4、NCOA1、NCOA3、NFE2L2、NFIL3、NFKB1、NMI、NOTCH1、NR3C1、PHF13、PHF21A、PML、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、RARA、RBPJ、REL、RELA、RNF11、RORA、RORC、RUNX1、RUNX2、SAP18、SAP30、SATB1、SERTAD1、SIRT2、SKI、SKIL、SMAD2、SMAD4、SMAD7、SMARCA4、SMOX、SP1、SP100、SP4、SS18、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6、SUZ12、TBX21、TFEB、TGIF1、TLE1、TP53、TRIM24、TRPS1、TSC22D3、UBE2B、VAV1、VAX2、XBP1、ZEB1、ZEB2、ZFP161、ZFP36L1、ZFP36L2、ZNF238、ZNF281、ZNF703、ZNRF1、和/或ZNRF2，或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表6中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，FAS、CCR5、IL6ST、IL17RA、IL2RA、MYD88、CXCR5、PVR、IL15RA、IL12RB1、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表6中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，IL7R、ITGA3、IL1R1、CCR5、CCR6、ACVR2A、IL6ST、IL17RA、CCR8、DDR1、PROCR、IL2RA、IL12RB2、MYD88、PTPRJ、TNFRSF13B、CXCR3、IL1RN、CXCR5、CCR4、IL4R、IL2RB、TNFRSF12A、CXCR4、KLRD1、IRAK1BP1、PVR、IL12RB1、IL18R1、TRAF3、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表6中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，IL7R、ITGA3、IL1R1、FAS、CCR5、CCR6、ACVR2A、IL6ST、IL17RA、DDR1、PROCR、IL2RA、IL12RB2、MYD88、BMPR1A、PTPRJ、TNFRSF13B、CXCR3、IL1RN、CXCR5、CCR4、IL4R、IL2RB、TNFRSF12A、CXCR4、KLRD1、IRAK1BP1、PVR、IL15RA、TLR1、ACVR1B、IL12RB1、IL18R1、TRAF3、IFNGR1、PLAUR、IL21R、IL23R、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表7中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，EIF2AK2、DUSP22、HK2、RIPK1、RNASEL、TEC、MAP3K8、SGK1、PRKCQ、DUSP16、BMP2K、PIM2、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表7中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，PSTPIP1、PTPN1、ACP5、TXK、RIPK3、PTPRF、NEK4、PPME1、PHACTR2、HK2、GMFG、DAPP1、TEC、GMFB、PIM1、NEK6、ACVR2A、FES、CDK6、ZAK、DUSP14、SGK1、JAK3、ULK2、PTPRJ、SPHK1、TNK2、PCTK1、MAP4K3、TGFBR1、HK1、DDR1、BMP2K、DUSP10、ALPK2、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表7中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，PTPLA、PSTPIP1、TK1、PTEN、BPGM、DCK、PTPRS、PTPN18、MKNK2、PTPN1、PTPRE、SH2D1A、PLK2、DUSP6、CDC25B、SLK、MAP3K5、BMPR1A、ACP5、TXK、RIPK3、PPP3CA、PTPRF、PACSIN1、NEK4、PIP4K2A、PPME1、SRPK2、DUSP2、PHACTR2、DCLK1、PPP2R5A、RIPK1、GK、RNASEL、GMFG、STK4、HINT3、DAPP1、TEC、GMFB、PTPN6、RIPK2、PIM1、NEK6、ACVR2A、AURKB、FES、ACVR1B、CDK6、ZAK、VRK2、MAP3K8、DUSP14、SGK1、PRKCQ、JAK3、ULK2、HIPK2、PTPRJ、INPP1、TNK2、PCTK1、DUSP1、NUDT4、TGFBR1、PTP4A1、HK1、DUSP16、ANP32A、DDR1、ITK、WNK1、NAGK、STK38、BMP2K、BUB1、AAK1、SIK1、DUSP10、PRKCA、PIM2、STK17B、TK2、STK39、ALPK2、MST4、PHLPP1、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表8中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，HK2、CDKN1A、DUT、DUSP1、NADK、LIMK2、DUSP11、TAOK3、PRPS1、PPP2R4、MKNK2、SGK1、BPGM、TEC、MAPK6、PTP4A2、PRPF4B、ACP1、CCRN4L、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表8中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，HK2、ZAP70、NEK6、DUSP14、SH2D1A、ITK、DUT、PPP1R11、DUSP1、PMVK、TK1、TAOK3、GMFG、PRPS1、SGK1、TXK、WNK1、DUSP19、TEC、RPS6KA1、PKM2、PRPF4B、ADRBK1、CKB、ULK2、PLK1、PPP2R5A、PLK2、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表8中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，ZAP70、PFKP、NEK6、DUSP14、SH2D1A、INPP5B、ITK、PFKL、PGK1、CDKN1A、DUT、PPP1R11、DUSP1、PMVK、PTPN22、PSPH、TK1、PGAM1、LIMK2、CLK1、DUSP11、TAOK3、RIOK2、GMFG、UCKL1、PRPS1、PPP2R4、MKNK2、DGKA、SGK1、TXK、WNK1、DUSP19、CHP、BPGM、PIP5K1A、TEC、MAP2K1、MAPK6、RPS6KA1、PTP4A2、PKM2、PRPF4B、ADRBK1、CKB、ACP1、ULK2、CCRN4L、PRKCH、PLK1、PPP2R5A、PLK2、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表9中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的早期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，CD200、CD40LG、CD24、CCND2、ADAM17、BSG、ITGAL、FAS、GPR65、SIGMAR1、CAP1、PLAUR、SRPRB、TRPV2、IL2RA、KDELR2、TNFRSF9、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表9中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的中期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，CTLA4、CD200、CD24、CD5L、CD9、IL2RB、CD53、CD74、CAST、CCR6、IL2RG、ITGAV、FAS、IL4R、PROCR、GPR65、TNFRSF18、RORA、IL1RN、RORC、CYSLTR1、PNRC2、LOC390243、ADAM10、TNFSF9、CD96、CD82、SLAMF7、CD27、PGRMC1、TRPV2、ADRBK1、TRAF6、IL2RA、THY1、IL12RB2、TNFRSF9、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种调控在表9中列出的作为与Th17分化、维持和/或功能的晚期阶段相关联的靶基因中的一种或多种的方法，这些靶基因是例如，CTLA4、TNFRSF4、CD44、PDCD1、CD200、CD247、CD24、CD5L、CCND2、CD9、IL2RB、CD53、CD74、ADAM17、BSG、CAST、CCR6、IL2RG、CD81、CD6、CD48、ITGAV、TFRC、ICAM2、ATP1B3、FAS、IL4R、CCR7、CD52、PROCR、GPR65、TNFRSF18、FCRL1、RORA、IL1RN、RORC、P2RX4、SSR2、PTPN22、SIGMAR1、CYSLTR1、LOC390243、ADAM10、TNFSF9、CD96、CAP1、CD82、SLAMF7、PLAUR、CD27、SIVA1、PGRMC1、SRPRB、TRPV2、NR1H2、ADRBK1、GABARAPL1、TRAF6、IL2RA、THY1、KDELR2、IL12RB2、TNFRSF9、SCARB1、IFNGR1、或其任何组合。
在一些实施例中，本发明提供了一种通过向受试者给予治疗有效量的蛋白C受体(PROCR)的抑制物而抑制对其有需要的该受试者体内的肿瘤生长的方法。在一些实施例中，PROCR的抑制物是抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。在一些实施例中，PROCR的抑制物是选自下组的一种或多种药剂，该组由以下各项组成：脂多糖；顺铂；纤维蛋白原；1,10-菲咯啉；5-N-乙基甲酰胺基腺苷；胱硫醚；水蛭素；磷脂；替加色罗α；VEGF；磷脂酰乙醇胺；丝氨酸；γ-羧基谷氨酸；钙；华法林；内毒素；姜黄素；脂质；以及一氧化氮。
在一些实施例中，本发明提供了一种诊断受试者体内的免疫应答的方法，该方法包括检测选自表1或表2列出的那些中的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并且将检测到的水平与标签基因或基因产物的表达、活性和/或功能的水平对照进行比较，其中检测到的水平与对照水平之间的差异指示该受试者体内免疫应答的存在。在一些实施例中，该免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该免疫应答是一种炎症应答，包括与自身免疫应答相关的一种或多种炎症应答和/或与传染性疾病或其他基于病原体的障碍相关的一种或多种炎症应答。
在一些实施例中，本发明提供了一种监测受试者体内的免疫应答的方法，该方法包括在第一时间点检测一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物(例如，选自在表1或表2中列出的那些中的一种或多种标签基因)的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物(例如，选自在表1或表2中列出的那些中的一种或多种标签基因)的表达、活性和/或功能的水平，并且将第一检测到的表达、活性和/或功能的水平与第二检测到的表达、活性和/或功能的水平进行比较，其中在第一和第二检测到的水平之间的变化指示在该受试者体内免疫应答的变化。在一些实施例中，该免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该免疫应答是炎症应答。
在一些实施例中，本发明提供了一种监测受试者体内免疫应答的方法，包括在一个第一时间点从该受试者分离一个T细胞群，确定在一个第一时间点该T细胞群内T细胞亚型的第一比率，在一个第二时间点从该受试者分离一个T细胞群，确定在一个第二时间点该T细胞群内T细胞亚型的第二比率，并且比较T细胞亚型的第一和第二比率，其中在该第一和第二检测的比率上的变化表示受试者体内免疫应答上的变化。在一些实施例中，该免疫应答是自身免疫应答。在一些实施例中，该免疫应答是炎症应答。
在一些实施例中，本发明提供了一种方法，该方法通过探索免疫学检验点的阻断而激活治疗免疫。生产性免疫应答的进展需要通过数个免疫学检验点。通过刺激性和抑制性信号的平衡调节免疫应答。免疫球蛋白超家族在免疫应答的这种协调中占据中心重要性，并且CD28/细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4):B7.1/B7.2受体/配体分组代表这些免疫调节物的原型实例(参见例如，科曼(Korman)AJ，佩格斯(Peggs)KS，艾利森(Allison)JP，“在癌症免疫疗法中的检验点阻断(Checkpoint blockade in cancer immunotherapy)”《免疫学进展》(Adv Immunol.)2006；90:297-339)。部分地，这些检验点的作用是来防范不想要的和有害的自主活性的可能性。虽然这是一种必需的功能(帮助预防自身免疫性)，但是它可以充当目的在于靶向自身恶性细胞的成功免疫疗法的一个障碍，这些自身恶性细胞大部分展示与它们所衍生的细胞相同阵列的表面分子。在一种疾病或障碍中免疫-检验点蛋白的表达可以异常调节，并且可以是一种重要的免疫抗性机制。目的在于克服这些外周耐受机制(特别是通过阻断这些抑制性检验点)的疗法提供产生治疗活性的潜力，无论作为单一疗法或与其他疗法协同作用。
因此，本发明涉及一种工程化T-细胞的方法(尤其是用于免疫疗法)，该方法包括调控T细胞平衡以灭活或以其他方式抑制在免疫检验点中涉及的至少一种基因或基因产物。
用于在本文提供的这些组合物和方法的任何中使用的一种或多种合适的T细胞调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。通过非限制性举例的方式，适合的T细胞调控剂或用于与一种或多种T细胞调控剂组合的药剂示于本说明书的表10中。
本领域的普通技术人员将理解，这些T细胞调控剂具有多种用途。例如，这些T细胞调控剂被用作如在本文描述的治疗剂。这些T细胞调控剂可以在筛选测定、诊断试剂盒中用作试剂或作为诊断工具，或者这些T细胞调控剂可以用于竞争测定以产生治疗性试剂。
在一个实施例中，本发明涉及一种对涉及T细胞平衡的免疫应答进行诊断、预测和/或分级的方法，该方法可以包括检测选自表1或表2的基因的一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平，并且将检测到的水平与标签基因或基因产物的表达、活性和/或功能的水平对照进行比较，其中检测到的水平与对照水平的差异指示该受试者体内免疫应答的存在。
在另一个实施例中，本发明涉及一种监测受试者体内的免疫应答的方法，该方法包括在第一时间点检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并且将第一检测到的表达、活性和/或功能的水平与第二检测到的表达、活性和/或功能的水平进行比较，其中第一和第二检测到的水平的变化指示在该受试者体内免疫应答的变化。
在又另一个实施例中，本发明涉及一种鉴定处于风险或正在遭受免疫应答的患者群体的方法，该方法可以包括检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在该患者群体中的表达、活性和/或功能的水平，并且比较表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在未处于风险或未正在遭受免疫应答的患者群体中的表达、活性和/或功能的水平，其中表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在这些患者群体中的表达、活性和/或功能的水平差异将该患者群体鉴定为处于风险或正在遭受免疫应答。
在仍另一个实施例中，本发明涉及一种用于监测经历针对异常免疫应答的治疗或疗法的受试者以确定该患者是否响应于该治疗或疗法的方法，该方法可以包括检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在不存在该治疗或疗法的情况下的表达、活性和/或功能的水平，并且比较表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在存在该治疗或疗法的情况下的表达、活性和/或功能的水平，其中表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在存在该治疗或疗法的情况下的表达、活性和/或功能的水平差异指示该患者是否响应于该治疗或疗法。
本发明还可以涉及一种调控T细胞平衡的方法，该方法可以包括使T细胞或T细胞群与一定量的T细胞调控剂接触，相比于在不存在该T细胞调控剂的情况下该T细胞或T细胞群的分化、维持和/或功能，该量足以通过改变Th17细胞、调节性T细胞(Treg)和其他T细胞亚群之间的平衡来修饰该T细胞或T细胞群的分化、维持和/或功能。
该免疫应答可以是自身免疫应答或炎症应答。该炎症应答可以与自身免疫应答、传染性疾病和/或基于病原体的障碍相关联。
这些标签基因可以是Th17相关基因。
该治疗或疗法可以是处于足以诱导朝向调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、或Treg和Th1细胞的组合分化的量的GPR65拮抗剂。该治疗或疗法可以是处于足以诱导T细胞朝向Th17细胞分化的量的、增强或增加GPR65表达的激动剂。该治疗或疗法可以对选自下组的靶基因具有特异性，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。该治疗或疗法可以是处于足以将Th17细胞从病原性标签转换为非病原性标签的量的靶基因拮抗剂，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。该治疗或疗法可以是处于足以将Th17细胞从非病原性标签转换为病原性标签的量的、增强或增加选自下组的靶基因的表达的激动剂，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
该T细胞调控剂可以是抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
这些T细胞可以是天然T细胞，部分分化的T细胞，分化的T细胞，天然T细胞和部分分化的T细胞的组合，天然T细胞和分化的T细胞的组合，部分分化的T细胞和分化的T细胞的组合，或天然T细胞、部分分化的T细胞和分化的T细胞的组合。
本发明还涉及如下方法，该方法增强细胞群中Th17分化，增加选自白细胞介素17F(IL-17F)、白细胞介素17A(IL-17A)、STAT3、白细胞介素21(IL-21)和RAR相关孤儿受体C(RORC)中的一种或多种Th17相关细胞因子或一种或多种Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，和/或降低选自FOXP3、干扰素γ(IFN-γ)、GATA3、STAT4和TBX21中的一种或多种非Th17相关细胞因子或非Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，该方法包括使T细胞与一种药剂接触，该药剂增强CD5L、DEC1、PLZP、TCF4或其组合的表达、活性和/或功能。该药剂可以增强CD5L、DEC1、PLZP、或TCF4中至少一种的表达、活性和/或功能。该药剂可以是抗体、可溶性多肽、多肽激动剂、肽激动剂、核酸激动剂、核酸配体、或小分子激动剂。该抗体可以是单克隆抗体或者嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体或全人类单克隆抗体。
本发明还涉及处于足以诱导朝向调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、或Treg和Th1细胞的组合分化的量的GPR65拮抗剂的用途；处于足以诱导T细胞朝向Th17细胞分化的量的、增强或增加GPR65表达的激动剂的用途；处于足以将Th17细胞从病原性标签转换为非病原性标签的量的靶基因拮抗剂的用途，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L；处于足以将Th17细胞从非病原性标签转换为病原性标签的量的、增强或增加选自下组的靶基因的表达的激动剂的用途，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L；以及T细胞调控剂用于治疗患者体内的异常免疫应答的用途。
因此，本发明的目的在于，在本发明中不涵盖任何先前已知的产品、制造该产品的过程、或使用该产品的方法，使得申请人保留和特此公开放弃任何先前已知的产品、过程、或方法的权利。进一步指出的是，在本发明的范围之内，本发明并不旨在涵盖任何产品、过程、或该产品的制造或使用该产品的方法，其不符合USPTO(35U.S.C.§112，第一段)或EPO(EPC的第83条)的书面说明和可实施性要求，使得申请人保留该权利和特此公开放弃任何此类主题的权利。
应注意，在本披露并且特别是在权利要求书和/或段落中，术语如“包括(comprise)”、“包括的(comprised)”、“包括了(comprising)”等等可具有在美国专利法中属于它的含义；例如，它们可以表示“包含(includes)”、“包含的(included)”、“包含了(including)”等等；并且这些术语如“基本上由……组成(consisting essentially of)”和“基本上由……组成(consists essentially of)”具有在美国专利法中归于它们的含义，例如，它们允许未被明确叙述的要素，但是排除在现有技术中发现或者影响本发明的基本或新颖特征的要素。在本文没有内容应解读为承诺。
这些和其他实施例披露于以下详细说明中，或者据其显而易见并且由其涵盖。
附图简要说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体提出。通过参考提出说明性实施例的以下详细说明，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些实施例中利用了本发明的原理，并且在这些附图中：
图1A到1E是一系列图表和说明，描绘了Th17分化的基因组范围时间表达谱。图1A描绘途径的概况。图1B-1和1B-2描绘了在Th17分化过程中的基因表达谱。显示了相对于对照激活的Th0细胞(右图，log2(比率))，在Th17极化条件(TGF-β1以及IL-6；左图，Z-标准化的每行)或Th17极化条件下，多种基因(行)在18个时间点(列)的差异性表达水平。这些基因被划分为20个簇(C1-C20，颜色条，右)。右：代表性簇中的基因在每个时间点(X轴)的平均表达(Y轴)和标准偏差(误差棒)。表示了簇尺寸(“n”)、简缩的功能性注释(“F”)、以及代表性基因(“M”)。图1C描绘了三个主要转录阶段。显示了每对时间点之间的相关矩阵(红色(相关尺度的右侧)：高；蓝色(相关尺度的左侧)：低)。图1D描绘了关键细胞因子和受体分子的转录谱。显示了在Th17极化条件下(TGF-β1以及IL-6；左图，Z-标准化的每行)每个基因(列)在18个时间点(行)中的每个处对比对照激活的Th0细胞的差异性表达水平(log2(比率))。
图2A到2G是一系列图表和说明，描绘了Th17分化的动态调节网络的模型。图2A描绘了计算分析的概况。图2B描绘了时间网络“快照”的示意图。显示了三个连续动画网络(顶部和矩阵列)，从调节物(A)至靶标(B、C和D)的三种可能相互作用，显示为边缘(顶部)和矩阵行(A→B–顶行；A→C-中间行；A→D–底行)。图2C描绘了18个网络“快照”。左：每行对应于发生在至少一个网络中的一个TF靶标相互作用；列对应于在每个时间点的网络。紫色条目：在那个网络中相互作用是活性的。这些网络是通过活性相互作用的相似性而进行聚簇(树状图，顶部)，形成三个时间上连续的簇(早期、中期、晚期，底部)。右：热点图表示所选调节物的边缘。图2D描绘了动态调节物活性。对于每个调节物(行)显示了在18个网络(列，左)的每个中的以及在通过收缩(箭头)获得的三个典型网络(中间)的每个中的靶基因的数目(通过其靶标最大数目标准化)。右：针对扰动选择的调节物(粉色)，已知的Th17调节物(灰色)，和横跨这三个典型网络的靶基因的最大数目(绿色，范围从0至250个靶标)。图2E-1、2E-2、和2E-3描绘了在每个网络的心脏处是其‘转录回路’，将活性TF连接至本身编码TF的靶基因。所示的转录因子回路(在这3个标准网络的每个中)是推断的网络的每个的部分，这些推断网络将转录调节物关联到本身编码转录调节物的靶标。黄色节点表示在相应时段过程中过表达(相比于Th0)的转录因子基因。边缘颜色反映支持调节相互作用的数据类型(图例)。
图3A、3B、3C和3D是一系列图表和说明，描绘了使用硅纳米线在Th17分化中的敲低筛选。图3A描绘了扰动候选物的无偏排名。显示了基于其针对扰动的排名从左至右排序的基因(列，最高排名是最左侧)。两个顶部矩阵：通过‘网络信息’(最顶部)和‘基因表达信息’排名的标准。紫色条目：基因具有特征(与特征强度成比例的强度；顶部五个特征是二元的)。条形图：排名得分。“受扰动的”行：深灰色:通过敲低随后高质量mRNA定量而成功扰动的基因；浅灰色：基因，其中试图进行敲低，但不能实现或维持足够的敲低或没有获得足够的重复；黑色：基因，其由敲除扰动或者针对其的敲除数据是可获得的。已知行：橙色条目：基因，该基因先前与Th17功能相关(该信息不会被用以对这些基因进行排名；图10A，10B)。图3B描绘了在垂直硅纳米线上培养的原代T细胞(伪彩色的紫色)的扫描电子显微照片。图3C描绘了通过硅纳米线的递送既不激活也不诱导天然T细胞的分化并且不影响它们对用抗-CD3/CD28进行的常规TCR刺激的应答。图3D描绘了通过在纳米线上递送的siRNA进行的有效敲低。显示了在引入极化细胞因子之后48小时在敲低后剩余的mRNA的％(通过qPCR，Y轴：相对于非靶向性siRNA对照的平均值±标准误差，n＝12，左侧黑色条)。在图3A和图3D，显示的候选调节物是在表5中列出的那些。在图3A中，这些候选调节物在x轴上列出并且按从左至右的顺序是RORC、SATB1、TRPS1、SMOX、RORA、ARID5A、ETV6、ARNTL、ETS1、UBE2B、BATF、STAT3、STAT1、STAT5A、NR3C1、STAT6、TRIM24、HIF1A、IRF4、IRF8、ETS2、JUN、RUNX1、FLI1、REL、SP4、EGR2、NFKB1、ZFP281、STAT4、RELA、TBX21、STAT5B、IRF7、STAT2、IRF3、XBP1、FOXO1、PRDM1、ATF4、IRF1、GATA3、EGR1、MYC、CREB1、IRF9、IRF2、FOXJ2、SMARCA4、TRP53、SUZ12、POU2AF1、CEBPB、ID2、CREM、MYST4、MXI1、RBPJ、CHD7、CREB3L2、VAX2、KLF10、SKI、ELK3、ZEB1、PML、SERTAD1、NOTCH1、LRRFIP1、AHR、1810007M14RIK、SAP30、ID1、ZFP238、VAV1、MINA、BATF3、CDYL、IKZF4、NCOA1、BCL3、JUNB、SS18、PHF13、MTA3、ASXL1、LASS4、SKIL、DDIT3、FOSL2、RUNX2、TLE1、ATF3、ELL2、AES、BCL11B、JARID2、KLF9、KAT2B、KLF6、E2F8、BCL6、ZNRF2、TSC22D3、KLF7、HMGB2、FUS、SIRT2、MAFF、CHMP1B、GATAD2B、SMAD7、ZFP703、ZNRF1、JMJD1C、ZFP36L2、TSC22D4、NFE2L2、RNF11、ARID3A、MEN1、RARA、CBX4、ZFP62、CIC、HCLS1、ZFP36L1、TGIF1。
图4A、4B、4C以及4D是一系列图表和说明，描绘了在Th17网络中偶联的并且相互拮抗的模块。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17 cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。图4A描述了在受扰动的基因对275-基因标签的冲击。显示了在48小时(连同在60小时IL-21r和IL-17ra KO)对39个因子(列)的敲低或敲除(KO)之后275个标签基因(行)表达上的变化。蓝色(倍数变化(log2)尺度的左侧):对调节物的扰动之后靶标的降低的表达(相比于非靶向性对照)；红色(倍数变化(log2)尺度的右侧):增加的表达；灰色:不显著；所有颜色(即，非灰色)条目是显著的(参见在实例1中的方法)。“受扰动的””(左):也作为调节物受扰动的标签基因(黑色条目)。在右侧表示的关键标签基因。图4B描绘了两个偶联的并且相对的模块。显示了联合Th17标签基因的‘正调节物’(蓝色节点，x-轴的左侧)、‘负调节物’(红色节点，x-轴的右侧)、Th17标签基因(灰色节点，底部)和其他CD4+T细胞的标签基因(灰色节点，顶部)的扰动网络。从节点A至B的蓝色边缘表明A的敲低下调B；红色边缘表明A的敲低上调B。浅灰色晕圈：先前不与Th17分化相关联的调节物。图4C描绘了敲低效应如何验证在网络模型中的边缘。文氏图：将图2a的原始模型中的因子的靶标集合(粉色圆圈)与在RNA-Seq实验中响应于该因子的敲低的基因集合(黄色圆圈)进行比较。在底部的条形图：显示了针对四个因子(X轴)的此重叠的显著性的-log10(P值)(Y轴，超几何检验)。用非参数秩和检验获得类似结果(曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)，参见在实例1中的方法)。红色虚线：P＝0.01。图4D描绘了全局敲低效应如何跨簇地一致。文氏图：将响应于RNA-Seq实验中的因子的敲低的基因集合(黄色圆圈)与图1b的20个簇中的每个(紫色圆圈)进行比较。预期‘Th17正’调节物的敲低阻遏诱导的簇中的基因，并且诱导受阻遏的簇中的基因(并且对于‘Th17负’调节物反之亦然)。热点图：通过以上测试，对于所显示的每个调节物敲低(行)和每个簇(列)是显著的重叠(非灰色条目)。红色(倍数富集尺度的右侧)：敲低时上调的倍数富集；蓝色(倍数富集尺度的左侧)：敲低时下调的倍数富集；在顶部行的橙色条目指示诱导的簇。
图5A、5B、5C、以及5D是一系列图表和说明，描绘了Mina、Fas、Pou2af1、以及Tsc22d3是影响Th17分化程序的关键新颖调节物。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory networkcontrolling Th17 cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。图5A-5D，左：显示了以不同枢转调节物(正方形节点)为中心的调节网络模型：(图5A)Mina，(图5B)Fas、(图5C)Pou2af1、以及(图5D)Tsc22d3。在每个网络中，显示了基于扰动(红色和蓝色虚线边缘)，TF结合(黑色实线边缘)，或者是两者(红色和蓝色实线边缘)的连接到枢转节点的靶标和调节物(圆形节点)。通过扰动枢转节点影响的基因被着色(蓝色：靶标因枢转节点的敲低而下调；红色：靶标被上调)。(图5A-5C，中间和右)在来自在有抗-CD3+抗-CD28、有或没有Th17极化细胞因子(TGF-β+IL-6)情况下的体外激活的相应KO小鼠的体外分化的细胞的在72h的培养上清液上，通过ELISA或流式微球分析(CBA)进行的细胞内染色和细胞因子测定。(图5D，中间)Tsc22d3的ChIP-Seq。显示了在Tsc22d3和Th17典型因子(X轴)的宿主之间的结合的基因(深灰色)或结合的区域(浅灰色)中的重叠的比例。所有结果是统计学显著的(P<10-6；参见在实例1中的方法)。
图6A、6B、6C、以及6D是一系列图表和说明，描绘了用TGF-β1和IL-6处理天然CD4+T-细胞三天诱导Th17细胞的分化。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17 celldifferentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。图6A描绘了时程实验的一个概况。天然T细胞分离自WT小鼠，并且用IL-6和TGF-β1处理。然后将微阵列用于在18个不同时间点测量全局mRNA水平(0.5小时-72小时，参见在实例1中的方法)。作为对照，使用了在相同的18个时间点收获的在Th0条件下的相同WT天然T细胞。对于最后四个时间点(48小时-72小时)，也对用IL-6、TGF-β1、和IL-23处理的细胞进行图谱绘制。图6B描绘了通过IL-6和TGF-β1极化条件产生Th17细胞。用TGF-β1和IL-6(右)分化的天然T细胞的FACS分析显示了针对产生IL-17的Th17 T细胞的富集；在Th0对照中未观察到这些细胞。图6C描绘了所获得的微阵列谱与来自天然T-细胞和分化的Th17细胞的公开数据的比较(威(Wei)等人，2009；兰米德(Langmead),B.、特拉普内尔(Trapnell),C.、波普(Pop).M.&扎尔茨贝格(Salzberg)，S.L.在基因组生物学(Genome Biol)第10卷R25(2009))。显示了18个谱(通过时间点排序的，X轴)中每个以及天然T细胞谱(蓝色)或分化的Th17谱(绿色)之间的皮尔逊相关系数(Y轴)。这些表达谱从天然-样状态(在t＝0.5小时，r2>0.8，p<10-10)逐渐转变为Th17分化状态(在t＝72小时，r2>0.65，p<10-10)。图6D描绘了关键细胞因子的表达。显示了如在18个时间点(X轴)中每个处在Th17极化(蓝色)条件和Th0对照(红色)条件下测量的针对关键Th17基因RORc(左)和IL-17a(中间)(均被诱导)以及针对细胞因子IFN-γ(在时程中不变)的mRNA水平(Y轴)。
图7是一系列图表，描绘了在Th17时程数据中差异性表达的基因的簇。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamicregulatory network controlling Th17 cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。对于图1b中20个簇的每个，显示了在Th17极化条件(蓝色)和Th0(红色)条件下在每个时间点(X轴)的平均表达水平(Y轴，±标准偏差，误差棒)。在顶部表示了簇尺寸(“n”)、简缩的功能注释(“F”)、以及代表性成员基因(“M”)。
图8A和8B是一系列图表，描绘了IL-23的转录作用。图8A描绘了关键基因的转录谱。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。显示了在Th17极化条件(蓝色)、Th0对照(红色)下，以及在将IL-23(在分化后48小时开始)添加至Th17极化条件之后(绿色)，三个关键基因(IL-22、RORc、IL-4)在每个时间点(X轴)的表达水平(Y轴)。图8B描绘了IL-23依赖性转录簇。显示了在IL-23r-/-时程数据(蓝色)中差异性表达基因的簇，这是与WT细胞相比，两者均用Th17极化细胞因子和IL23(红色)处理。对于每一个簇，显示了在敲除(蓝色))和野生型(红色)细胞中在每个时间点(X轴)的平均表达水平(Y轴，±标准偏差，误差棒)。在顶部表示了簇尺寸(“n”)、简缩的功能注释(“F”)、以及代表性成员基因(“M”)。
图9A和9B是一系列图表，描绘了在Th17分化过程中ROR-γt的预测的与验证的蛋白水平。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17 cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。图9A显示在Th17极化条件下沿着原始时程的RORγt mRNA水平，如用微阵列测量的(蓝色)。针对mRNA水平的S形拟合(绿色)被用作一种模型的输入(基于施万豪瑟B.等人.哺乳动物基因表达控制的全局定量(Global quantification of mammalian gene expressioncontrol).《自然》(Nature)473，337-342，doi:10.1038/nature10098(2011))，该模型预测在每个时间点的RORγt蛋白质水平(红色)。图9B描绘了所测量的ROR-γt蛋白水平(x轴)的分布，这是根据在Th17极化条件(蓝色)和Th0条件(红色)下在刺激后4、12、24、和48小时通过FACS分析测定的。
图10A和10B是一系列图表，描绘了用于对用来敲低的候选物进行排名的预测性特征。显示了针对不同的(图10A)基于网络的特征和(图10B)基于表达的特征(如在图3A中使用)，已知Th17因子的策划列表中的倍数富集(Y轴，在所有的情况下，p<10-3，超几何检验)。
图11A、11B、以及11C是一系列图表，描绘了T细胞(在10h敲低)的纳米线激活以及基于NW的敲低和所得表型的一致性。图11A描绘了纳米线如何不激活T细胞并且不干扰生理刺激。显示了在没有极化细胞因子(‘无细胞因子’)或在Th17极化细胞因子(‘TGF-β1+IL6’)的存在下，在生长于皮氏培养皿中(左)或在硅纳米线上(右)的T细胞中，在通过qPCR激活之后48小时测量的(Y轴，平均值和平均值标准误差)，针对关键基因的mRNA的水平(平均值±标准误差，n＝3)。图11B描绘了通过在纳米线上递送的siRNA进行的有效敲低。显示了在引入极化细胞因子之后10小时在敲低后剩余的mRNA的％(通过qPCR，Y轴：相对于非靶向性siRNA对照的平均值±标准误差，n＝12，左侧黑色条)。呈现的基因是针对转录谱分析选择的39个基因的超集。图11C.基于NW的敲低和所得表型的一致性。显示了在刺激后48小时，9个基因的基于NW的敲低(来自至少2个不同培养物)的三个不同实验的平均靶标转录物减少和表型变化(如通过IL-17f和IL-17a表达测量的)。浅蓝色条：敲低水平(相对于siRNA对照％剩余)；深灰色和浅绿色条：分别地，相对于siRNA对照，IL-17f和IL-17a的mRNA。
图12A和12B是一系列图表，描绘了使用富鲁达(Fluidigm)96x96基因表达芯片，针对每个纳米线递送敲低的纳米链表达谱的交叉验证。图12A描绘了在相同扰动下针对相同基因通过富鲁达(Y轴)以及纳米链(X轴)测量的表达水平的比较。如在实例1中描述的，将表达值相对于对照基因进行标准化。图12B描绘了富鲁达数据的分析如何重现以下划分：将靶向因子划分为具有正和负Th17调节物的两个模块。显示了显著响应于至少一种因子敲低(列)的85个基因标签(行)中82个基因的转录上的变化。
图13是一个图表，描绘了刺激后10小时至48小时之间Th17“功能”网络的重新布线。对于在10小时和48小时绘制的每个调节物，对“边缘”的百分比(即，基因A受基因B的扰动影响)进行计算，这些“边缘”出现在具有相同激活/阻遏逻辑的两个时间点(持续的)；仅出现在一个时间点(瞬时的)；或出现在具有不同的激活/阻遏逻辑的两个网络(跳动的(Flipped))。在持续的边缘，扰动效应(倍数变化)在至少一个时间点(参见实例1中的方法)必须显著，并且在其他时间点(使用1.25倍的更宽容截断值)一致(就激活/阻遏而言)。
图14是描绘了“易染色”网络基序的说明。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory networkcontrolling Th17 cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。使用‘易染色’网络基序分析以找到具有相同拓扑和相同节点以及边缘颜色的再现的亚网络。显示了四个显著富集的基序(p<0.05)。红色节点：正调节物；蓝色节点：负调节物；从A至B的红色边缘：A的敲低下调B；蓝色边缘：A的敲低上调B。使用FANMOD软件发现基序(韦尼克(Wernicke)，S.&拉希(Rasche)，F.FANMOD：快速网络基序检测的一个工具(FANMOD:a tool for fast network motif detection).《生物信息学》(Bioinformatics)22，1152-1153，doi:10.1093/bioinformatics/btl038(2006))。
图15A、15B、以及15C是一系列图表，描绘了纳米线递送敲低的RNA-seq分析。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。图15A描绘了敲低谱的相关性矩阵。显示了由敲低扰动的调节物的RNA-Seq谱(相对于NT siRNA对照的倍数变化)之间的斯皮尔曼(Spearman)排名相关系数。在任何样品中未显著差异性表达的基因从这些谱排除。图15B描绘了对不同CD4+T细胞谱系的已知标记基因的敲低作用。显示了在12个调节物(列)中每个的敲低之后，不同T细胞谱系(在右侧标记的)的典型基因(行)的表达水平。红/蓝：相比于非靶向性对照在敲低方面基因表达的增加/降低(参见在实例1中的方法)。仅显示了在至少一个敲低条件下显著差异性表达的基因。这些实验被分层聚簇，形成Th17-正调节物(左)和Th17-负调节物(右)的不同簇。图15C描绘了对T-调节性细胞标签的两个亚簇的敲低作用，这些簇如由伊尔(Hill)等人，该转录调节T细胞标签的Foxp3转录因子依赖性和非依赖性调节(Foxp3transcription-factor-dependent and-independent regulationof the regulatory T cell transcriptional signature).《免疫》(Immunity)27，786-800，doi:S1074-7613(07)00492-X[pii]10.1016/j.immuni.2007.09.010(2007)所定义。每个簇(在希尔(Hill)等人中注释为簇1和5)包括在Treg细胞中相比于常规T细胞过表达的基因。然而，簇1中的基因更相关于Foxp3并响应于Foxp3转导。相反地，簇1中的基因在Treg细胞中更直接响应于TCR和IL-2，并且更少响应于Foxp3。Th17-正调节物的敲低强烈诱导‘Foxp3’簇1中的基因的表达。这些敲低谱被分层聚簇，形成Th17-正调节物(左)和Th17-负调节物(右)的不同簇。红/蓝：相比于非靶向性对照在敲低方面基因表达的增加/降低(参见在实例1中的方法)。仅显示了在至少一个敲低条件下显著差异性表达的基因。
图16A、16B、16C、以及16D是一系列图表，描绘了使用流式细胞术和酶联免疫吸附测定(ELISA)对体外分化72h的敲除细胞中的细胞因子产生进行的定量。所示的所有流式细胞术图(除了Oct1)是至少3个重复的代表，并且所有ELISA数据具有至少3个重复。对于Oct1，仅可从重建小鼠获得有限量的细胞，对于流式细胞术和ELISA允许Oct1缺陷小鼠的仅2个重复。(图16A，左)在Th0对照下激活的Mina-/-T细胞是在图5A中显示的图表的对照。(图16A，右)Mina-/-和WT细胞的TNF分泌，如通过细胞计数珠粒测定测量的，该测定表明当相比于对照时Mina-/-细胞产生更多的TNF。图16B描绘了如通过流式细胞术所测量的对Pou2af1-/-和WT细胞针对IFN-γ和IL-1-17a的细胞内细胞因子染色。(图16C，左)对Fas-/-和WT细胞针对Foxp3和Il-17表达的流式细胞分析。(图16C，右)Fas-/-和WT细胞的IL-2和Tnf分泌，如由一种细胞因子珠粒测定ELISA所测量的。(图16D，左)对Oct1-/-和WT细胞针对IFN-γ和IL-1-17a的流式细胞术，显示了在Th0条件下Oct1缺陷小鼠的IFN-γ阳性细胞的增加。(图16D，右)Oct1-/-和WT细胞的Il-17a、IFN-γ、IL-2和TNF产生，如通过细胞因子ELISA和细胞计数珠粒测定所测量的。在ELISA图中的统计显著性表示为：*p<0.05，**p<0.01，并且***p<0.001。
图17A和17B是一系列说明，描绘了Zeb1、Smarca4、以及Sp4是影响Th17分化程序的关键新颖调节物。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17 celldifferentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。显示了以不同枢转调节物为中心的调节网络模型(正方形节点)：(图17A)Zeb1和Smarca4以及(图17B)Sp4。在每个网络中，显示了基于扰动(红色和蓝色虚线边缘)，TF结合(黑色实线边缘)，或者是两者(红色和蓝色实线边缘)的连接到枢转节点的靶标和调节物(圆形节点)。通过扰动枢转节点影响的基因被着色(红色：靶标由于枢转节点的敲低而被上调；蓝色：靶标被下调)。
图18是一个图表，描绘了与来自西奥法尼(Ciofani)等人(《细胞》(Cell)，2012)的ChIP-seq和RNA-seq数据的重叠。针对四个TF显示了倍数富集，这四个TF由西奥法尼(Ciofani)等人使用ChIP-seq和RNA-seq研究并且预测为三个网络模型(早期、中期(表示为“mid”)，和晚期)中的调节物。将这些结果相比于西奥法尼(Ciofani)等人的基于ChIP-seq的网络(蓝色)并且相比于它们的组合的ChIP-seq/RNA-seq网络(取1.5的得分截断值，如由这些作者描述的；红色)。在所有情况下，重叠(仅与ChIP-seq或与组合的ChIP-seq/RNA-seq网络)的p-值低于10-10(使用费希尔(Fisher)精确检验)，但该倍数富集在由一种因子结合并且受其敲除影响的基因上是特别高的(最具功能性的边缘)。
图19A、19B、19C、以及19D是一系列图表，描绘了PROCR在由TGF-β1与IL-6诱导的Th17细胞中被特异性诱导。图19A描绘了在Th0和Th17条件下在18个不同的时间点PROCR表达水平是如何通过该微阵列分析来评估的。图19B描绘了PROCR mRNA的动力学表达是如何通过在用TGF-β1和IL-6分化的Th17细胞中的定量RT-PCR分析来测量的。图19C描绘了如何在用每种细胞因子刺激之后72小时在不同T细胞亚群中通过定量RT-PCR分析来测量PROCRmRNA表达。图19D描绘了如何在用每种细胞因子刺激之后72小时在不同T细胞亚群中通过流式细胞术来检查PROCR蛋白表达。
图20A、20B、20C、以及20D是一系列图表，描绘了PROCR刺激和表达对于从Th17细胞产生细胞因子不是必需。图20A描绘了在激活的蛋白C(aPC，300nM)(PROCR的配体)的存在下，天然CD4+T细胞如何通过抗-CD3/抗-CD28刺激被分化成Th17细胞。在第3天，将细胞用PMA和伊屋诺霉素(Ionomycin)刺激4小时，针对IFN-γ和IL-17进行细胞内染色并且通过流式细胞术进行分析。图20B描绘了在第3和5天通过ELISA评估从用或不用激活的C蛋白(分别为aPC和Ctl)分化的Th17细胞(TGF-β+IL-6)的IL-17生产。图20C描绘了如何将天然CD4+T细胞在Th17条件(TGF-β+IL-6)下极化，用GFP对照逆转录病毒(Ctl RV)或PROCR表达逆转录病毒(PROCR RV)转导。通过流式细胞术来评估在GFP+细胞中IFN-γ和IL-17的细胞内表达。图20D描绘了在Th17条件下如何将来自EPCRδ/δ小鼠以及对照小鼠的天然CD4+T细胞用TGF-β1和IL-6极化。通过流式细胞术来评估IFN-γ和IL-17的细胞内表达。
图21A和21B是一系列图表，描绘了PROCR表达仅在Th17细胞上诱导共刺激分子的表达的轻微改变。图21A描绘了如何将天然CD4+T细胞在Th17条件(TGF-β+IL-6)下极化，用GFP对照逆转录病毒(Ctl GFP)或PROCR表达逆转录病毒(PROCR RV)转导；并且通过流式细胞术分析ICOS、CTLA-4、PD-1-1、Pdp以及Tim-3的表达。图21B描绘了在TGF-β1和IL-6的存在下，天然野生型(WT)或EPCRδ/δCD4+T细胞如何通过抗-CD3/抗-CD28刺激被分化成Th17细胞。通过流式细胞术来评估ICOS、CTLA-4、PD-1-1、Pdp和Tim-3的表达。
图22A、22B、以及22C是一系列图表，描绘了PROCR在非病原性Th17细胞中表达。图22A描绘了用TGF-β3+IL-6(病原性的)或TGF-β1+IL-6(非病原性)分化的Th17细胞的基因和比较它们在这两个子集中的表达水平。图22B和22C描绘了天然CD4+T细胞如何用TGF-β1和IL-6、TGF-β3和IL-6或IL-1β和IL-6进行分化并且PROCR表达如何通过(图22B)定量RT-PCR分析进行评估(图22C)和蛋白表达如何通过流式细胞术来确定。
图23A、23B、以及23C是一系列图表，描绘了PROCR刺激或表达削弱了Th17细胞中的一些病原性标签基因。图23A描绘了在激活的蛋白C(aPC)的存在下用TGFβ1和IL-6在体外分化3天的Th17细胞中的一些病原性标签基因的mRNA表达的定量RT-PCR分析。图23B描绘了在Th17条件下极化、用GFP对照逆转录病毒(对照RV)或PROCR表达逆转录病毒(PROCR RV)转导3天的天然CD4+T细胞中的一些病原性标签基因的mRNA表达的定量RT-PCR分析。图23C描绘了来自EPCRδ/δ小鼠和对照小鼠的、用TGFβ1和IL-6在体外分化3天的Th17细胞中的一些病原性标签基因的mRNA表达的定量RT-PCR分析。
图24A、24B、24C、以及24D是一系列图表，描绘了在用TGF-β1和IL-6极化的Th17条件下，Rorβt诱导PROCR表达。图24A描绘了Rorγt的ChIP-Seq。描绘了该PROCR基因组区域。图24B描绘了如何通过染色质免疫沉淀(ChIP)评估在Th17细胞中Rorβt与Procr启动子的结合。使用来自Th17细胞的消化的染色质和抗-Rorβt抗体执行ChIP。通过定量RT-PCR分析来分析DNA。图24C描绘了如何在TGF-β1和IL-6的Th17条件下并且在Th0条件下(没有细胞因子)将来自Rorγt-/-小鼠和对照小鼠的天然CD4+T细胞进行极化，并且在第3天通过流式细胞术对PROCR表达进行分析。图24D描绘了如何将在Th17条件下极化的天然CD4+T细胞用GFP对照逆转录病毒(Ctl RV)或Rorγt-表达逆转录病毒(Rorγt RV)转导3天。通过定量RT-PCR分析来测量PROCR mRNA表达，并且通过流式细胞术来评估PROCR蛋白表达。
图25A、25B、以及25C是一系列图表，描绘了IRF4和STAT3结合到Procr启动子并且诱导PROCR表达。图25A描绘了如何通过染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR来评估IRF4或STAT3与Procr启动子的结合。使用来自Th17细胞的消化的染色质和抗-IRF4或抗-STAT3抗体执行ChIP。通过定量RT-PCR分析来分析DNA。图25B描绘了如何将来自Cd4CreSTAT3fl/fl小鼠(STAT3KO)和对照小鼠(WT)的天然CD4+T细胞在有TGF-β1与IL-6的Th17条件下并且在没有细胞因子的Th0条件下极化。在第3天，通过定量PCR来确定PROCR表达。图25C描绘了如何将来自Cd4CreIRF4fl/fl小鼠和对照小鼠的天然CD4+T细胞在有TGF-β1与IL-6的Th17条件下并且在没有细胞因子的Th0条件下极化。在第3天，通过流式细胞术来确定PROCR表达。
图26A、26B、26C、以及26D是一系列图表和说明，描绘了PROCR缺乏加重EAE严重性。图26A描绘了分离自用MOG35-55免疫后21d的EAE小鼠的、表达IL-17和PROCR的CD4+T细胞的频率。图26B描绘了如何通过MOG35-55-特异性2D2细胞的过继性转移来诱导EAE，这些细胞用一种对照逆转录病毒(Ctl_GFP)或一种PROCR表达逆转录病毒(PROCR_RV)转导并分化成Th17细胞。显示了针对每个组的平均临床得分和汇总。结果是两个实验中之一的代表。图26C描绘了Rag1-/-小鼠如何用PROCR-缺陷(EPCRδ/δ→Rag1-/-)T细胞或WT T细胞(WT→Rag1-/-)重建并用MOG35-55免疫以诱导EAE。显示了针对每组的平均临床得分。结果是两个实验中之一的代表。图26D描绘了PROCR调节的示意性代表。Rorγt、IRF4、和STAT3诱导PROCR表达。激活的蛋白C与PROCR连接诱导病原性标签基因IL-3、CXCL3、CCL4和Pdp的下调以及EAE的降低的病原性。
图27A、27B、以及27C是一系列图表，描绘了FAS促进Th17分化。在IL-1β、IL-6和IL-23的存在下，来自野生型(WT)或FAS-缺陷(LPR)小鼠的天然CD4+T细胞通过抗-CD3/抗-CD28刺激被分化成Th17细胞。在第4天，将细胞用PMA和伊屋诺霉素刺激4小时(图27A)，针对IFN-γ和IL-17进行细胞内染色并且通过流式细胞术进行分析，并且(图27B)通过ELISA来评估IL-17产生。图27C描绘了如何提取RNA，并且通过定量PCR来确定IL17a和Il23r mRNA的表达。
图28A、28B、以及28C是一系列图表，描绘了FAS抑制Th1分化。在IL-12和抗-IL-4的存在下，来自野生型(WT)或FAS-缺陷(LPR)小鼠的天然CD4+T细胞通过抗-CD3/抗-CD28刺激被分化成Th1细胞。在第4天，将细胞用PMA和伊屋诺霉素刺激4小时(图28A)，针对IFN-γ和IL-17进行细胞内染色并且通过流式细胞术进行分析，并且(图28B)通过ELISA来评估IFN-γ产生。图28C描绘了如何提取RNA，并且通过定量PCR来确定Ifng mRNA的表达。
图29A和29B是一系列图表，描绘了FAS抑制Treg分化。在TGF-β的存在下，来自野生型(WT)或FAS-缺陷(LPR)小鼠的天然CD4+T细胞通过抗-CD3/抗-CD28刺激被分化成Treg。在第4天，将细胞用PMA和伊屋诺霉素刺激4小时(图29A)，针对IL-17和Foxp3进行细胞内染色并且通过流式细胞术进行分析，并且(图29B)通过ELISA来评估IL-10产生。
图30A和30B是一系列图表，描绘了FAS-缺陷小鼠是EAE抗性的。将野生型(WT)或FAS-缺陷(LPR)小鼠用CFA中的100μg MOG35-55皮下地免疫，并且通过静脉注射接受百日咳毒素以诱导EAE。图30A描绘了如所示的每组的平均临床得分±s.e.m.。图30B描绘了如何在第14天将CNS浸润性淋巴细胞进行分离，使用PMA和伊屋诺霉素重刺激4小时，并且针对IL-17、IFN-γ、和Foxp3进行细胞内染色。通过流式细胞术分析细胞。
图31A、31B、31C以及31D是一系列图表和说明，描绘了PROCR在Th17细胞上表达。图31A描绘了PROCR，其配体激活的C蛋白和信号衔接子PAR1的一个示意性代表。图31B描绘了天然CD4+T细胞在针对指定的T辅助细胞谱系的极化条件下如何分化。在第3天通过定量PCR来确定PROCR的表达。图31C描绘了如何将小鼠针对EAE进行免疫，在疾病的高峰处分离细胞，并且通过流式细胞术分析细胞因子产生(IL-17)和PROCR表达。图31D描绘了如何从WT和PROCRd/d小鼠分离天然和记忆细胞，并且用抗-CD3/CD28刺激。如所指定的，在Th17极化条件下培养天然细胞；在存在或不存在IL-23的情况下培养记忆细胞。在3天后，通过ELISA来分析上清液中的IL-17A水平。
图32A、32B、32C以及32D是一系列图表，描绘了PROCR和PD-1表达如何影响Th17病原性。图32A描绘了病原性和非病原性Th17细胞的标签基因。天然CD4+T细胞被分化成非病原性(TGFβ1+IL-6)或病原性(TGFβ3+IL-6或IL-β1+IL-6)Th17细胞，并且通过定量PCR来确定PROCR表达。图32B描绘了在存在或不存在aPC的情况下，在Th17极化条件下(TGFβ1+IL-6)，如何对天然WT或PROCRd/d CD4+T细胞进行刺激。在第3天确定3种病原性标签基因的定量表达。图32C描绘了如何将天然2D2 T细胞用编码PROCR的逆转录病毒或用对照(GFP)进行转导，在体外分化为Th17细胞，并且转移进入天然接收者。将小鼠针对EAE进行监测。图32D描绘了如何在体外将天然2D2 T细胞用TGFβ1+IL-6+IL-23分化成Th17细胞并且转移进入WT或PD-L1-/-接受者。将小鼠针对EAE进行监测。
图33A和33B是一系列图表，描绘了疲劳的T细胞富含PROCR表达。图33A描绘了如何分别对C57BL/6或BalbC小鼠植入B16黑色素瘤或CT26结肠癌细胞。将肿瘤浸润性淋巴细胞在肿瘤植入后3周进行分离，基于PD-1和Tim3表达进行分选，并针对PROCR表达使用实时PCR进行分析。从天然小鼠分选效应子记忆(CD44hiCD62Llo)CD8 T细胞。图33B)描绘了如所指出的，在不同时间点，如何通过FACS从急性(阿姆斯特朗(Armstrong))和慢性(克隆13)LCMV感染测量抗原特异性CD8 T细胞上的PROCR、PD-1-1和Tim3表达。
图34A、34B和34C是一系列图表，展示了CD5L在Th17细胞上的表达。
图35A、35B和35C是一系列说明和图表，描绘了CD5L缺乏如何不会改变Th17分化。
图36A和36B是一系列说明和图表，描绘了CD5L缺乏如何通过影响存活或稳定性来改变Th17记忆。
图37A和37B是一系列图表，描绘了CD5L缺乏如何导致更严重且持久的EAE与更高的Th17应答。
图38A、38B和38C是一系列说明和图表，描绘了CD5L的缺失如何将非病原性Th17细胞转化为病原性效应子Th17细胞。
图39A和39B是一系列图表，描绘了CD5L-缺陷Th17细胞(TGF-β+IL-6)如何发展病原性表型。
图40A和40B是一系列图表，描绘了IL17A表达在暴露于不同T细胞条件(Th0、T16、T36、B623和T)的GPR65敲除细胞中是降低的。
图41A、41B、41C、以及41D是一系列图表，描绘了暴露于不同T细胞条件(Th0、T16、T36、B623和T)的DEC1敲除细胞中的IL17A表达在非病原性条件(T16)下是未改变的，但是在病原性条件(T36、B623)下是降低的。
图42A和42B是一系列图表，描绘了暴露于不同T细胞条件(Th0、T16、T36、B623和T)的PLZP敲除细胞中的IL17A表达在非病原性条件(T16)下是未改变的，但是在病原性条件(T36、B623)下是降低的。
图43是一个图表，描绘了暴露于不同T细胞条件(Th0、T16、T36、B623和T)的TCF4敲除细胞中的IL17A表达在病原性条件B623下是降低的。
图44是一个图表，描绘了PROCR突变小鼠的B16肿瘤接种。将7周龄野生型或PROCR突变(EPCRδ)C57BL/6小鼠用5x105个B16F10黑色素瘤细胞进行接种。
图45A到45H显示了单细胞RNAseq将Cd5l鉴定为与Th17细胞病原性相关并且仅由非病原性Th17细胞表达的新颖调节物。从用TGFβ1+IL-6(A,B)、IL-1β+IL-6+IL-23(C)、TGFβ3+IL-6(D)分化的体外Th17细胞以及来自处于EAE峰值(得分＝3)的小鼠CNS的体内Th17细胞(D)分选单细胞。在D的所有图中对IL-17A.GFP+CD4+T细胞进行分选。(A)非病原性Th17细胞中的CD5L表达与病原性标签的相关性(李，阿瓦斯蒂(Lee,Awasthi)等人)。(B)CD5L表达的主成分分析，其中PC1的方向与病原性相关。(C，D)来自如所指出的条件的单细胞中的CD5L表达直方图。通过qPCR(E，F)和流式细胞术(G)验证体外CD5L表达。图45E、F、G显示了体外CD5L表达的验证。对天然T细胞(CD4+CD62L+CD44-CD25-)进行分选并且在存在如所指出的不同分化细胞因子的情况下通过板结合的抗-CD3和抗-CD28抗体激活。在48h(E)和72h(F)通过qPCR测量并且在48h(G)通过流式细胞术细胞内地测量CD5L表达；(F)在48h，将细胞从板中提起，洗涤并且在具有IL-23或PBS的新鲜培养基中重新铺板，并且再培养24h。图45H显示了体内CD5L表达的验证。通过MOG/CFA(皮下地，d1)与百日咳毒素(静脉内，d1和d3)免疫IL-17A.GFP报告小鼠。将处于疾病峰值(得分＝3)的小鼠处死，并且分别从CNS和脾分选CD4+GFP+和CD4+GFP-细胞。通过qPCR测量Cd5l和Il17a表达。所示的图是来自两个独立小鼠实验的技术重复的代表性数据。I.从天然小鼠的肠分选IL-17+(GFP+)和IL-17-(GFP-)CD4+细胞，并且通过纳米链测量RNA转录物的数目并且基于四种持家基因进行标准化。图是两个独立实验的汇总。
图46A到图46H显示了CD5L调节Th17细胞效应子功能。(A)将WT和CD5L-/-小鼠在第1天和第3天用40μg MOG/CFA与百日咳毒素注射(静脉内)免疫。如先前公开的(雅格，达尔达霍恩(Jager,Dardalhon)等人2009)，对EAE进行评分。上图是来自3个独立小鼠实验的聚池的结果；下图是代表性FACS图，显示了来自CD4T细胞的细胞因子产生，这些CD4T细胞是在用PMA/伊屋诺霉素重刺激4小时之后在免疫后第15天分离自CNS。汇总数据示于图50B中。图46B、C、D显示了对天然T细胞(CD4+CD62L+CD44-CD25-)进行分选，在存在TGFβ1和IL-6的情况下用板结合的抗-CD3/抗-CD28抗体激活48h。将细胞在存在布雷菲德菌素A的情况下用PMA/伊屋诺霉素重刺激4小时，并且使用FACS测量细胞因子产生(B)；将上清液用于IL-17和IL-10的ELISA分析(C)；并且直接从细胞中纯化RNA并且使其经受qPCR(D)。图46E、F显示了在48小时如在B中的分选并培养细胞，将细胞提起，洗涤并且重悬于没有细胞因子的新鲜培养基中再持续72h并且进行重刺激。通过FACS测量细胞因子产生(E)，并且通过qPCR量化mRNA(F)。图46G、H显示了直接离体地分选效应记忆T细胞(CD4+CD62L-CD44+)(G)或效应记忆Th17细胞(CD4+CD62L-CD44+RorγtGFP+)(H)并且用板结合的抗-CD3/抗-CD28抗体激活48小时。收获细胞，并且在存在布雷菲德菌素A的情况下用PMA/伊屋诺霉素培养4小时，并且经受FACS。数据代表至少3个独立的小鼠实验。
图47A到47F显示了CD5L是调节Th17细胞的病原性的主要开关。对天然WT或CD5L-/-2D2 T细胞进行分选，并且在存在经辐射APC的情况下用TGFβ1+IL-6分化(雅格，达尔达霍恩(Jager,Dardalhon)等人2009)。将细胞静置，并且用板结合的抗-CD3和抗-CD28抗体重新激活48h，并且静脉注射到WT宿主体内。(A)显示了分化之后并且体内转移之前2D2 T细胞的细胞因子谱的代表性FACS图。(B)接受小鼠的重量和EAE得分；(C)视神经(上面两个图)和CNS(下图)的代表性组织学。图是卢克索(Luxol)固蓝-苏木精和伊红染色。脱髓鞘由下图中CNS的髓磷脂的正常蓝色染色的损失指示。(D)在转移后第27天分离自CNS的WT和CD5L-/-2D2淋巴细胞的代表性细胞因子谱。对细胞以Va3.2+CD4+设门。所有数据代表3个独立小鼠实验。(E)对天然2D2WT或CD5L-/-T细胞进行分选并且将100,000个细胞转移到CD45.1WT宿主体内。然后在第二天用MOG/CFA免疫接受者。在免疫后第10天从引流LN中分离T细胞，并且如图46中描述的用PMA/伊屋诺霉素进行重刺激。代表性FACS图是以CD45.2+CD4+细胞设门并且这些代表性FACS图属于2个独立实验，每个实验使用四只小鼠。(F)如在图46E中的将天然T细胞用TGFβ1+IL-6分化并且使其经受RNA纯化和qPCR。数据是至少三个独立小鼠实验的汇总。
图48A到48J显示了CD5L将Th17细胞脂质组(lipidome)平衡从饱和的脂质转变为不饱和脂质，调控Rorγt配体可用性和功能。图48A、B显示了Th17细胞的脂质组分析。(A)在存在如所指出的细胞因子的情况下如在图46B中的分化WT和CD5L-/-天然T细胞。在96小时收获细胞和上清液并且使其经受MS/LC。进行三个独立的小鼠实验。示出的数据是在TGFβ1+IL-6条件下在WT与CD5L-/-之间具有至少1.5倍差异的经鉴定的每种代谢物的中值表达。(B)代表性代谢物(包括胆固醇酯和含PUFA的TAG种类)的表达。图48C、D、E、F-J显示了以下内容：(C)独立小鼠实验的代谢组学分析，在这些实验中在如所指出的不同细胞因子条件下分化T细胞并且在48h和96h收获。汇总代谢组学分析示于图52A中。(D,E)来自在如所指出的不同条件下的如A中描述的分化的Th17细胞的Rorγt ChIP。F-K.在用对照载体或Rorγt载体稳定转染的EL4细胞中进行双荧光素酶报告子测定。(F，G)在F和G中以0、25、50和100ng/孔共转染CD5L逆转录病毒载体。(H-J)无论何时指出单剂量时，都使用10μM的花生四烯酸(PUFA)或20μM的棕榈酸(SFA)，并且在滴定实验中，使用20μM、4μM和0.8μM的PUFA/SFA以及5μM、0.5μM和0.05μM的7,27-二羟基胆固醇。所有ChIP和荧光素酶测定代表至少3个独立的实验。
图49CD5L表达跨单细胞遵循促炎性/调节性模块两分法。显示了在48h在TGF-β1+IL-6条件下分化的细胞的PCA图(前两种PC)，其中每个细胞通过CD5L的表达排名得分进行着色(红色：高，蓝色：低)，并且第一种PC通过促炎性/调节性模块两分法进行标记。
图50A到50E PUFA和SFA可以调节Th17细胞功能并且促进Th17细胞的CD5L依赖性调节。(A)从WT或IL-23RGFP报告小鼠分选天然T细胞，用板结合的抗-CD3/抗-CD28激活并且用TGFβ1+IL-6分化48小时。在48h，将细胞在存在10uM花生四烯酸(PUFA)或20uM的棕榈酸(SFA)的情况下在新鲜培养基中用IL-23再培养48小时，并且收获用于PMA/伊屋诺霉素重刺激和FACS。在滴定实验中预先确定FFA的浓度(数据未示出)。(B)如在A中的，将来自WT和Rorc-/-小鼠的细胞进行分选、分化，并且用FFA处理。收获细胞用于RNA纯化和qPCR。(C)如在A中的，分化天然WT和CD5L-/-T细胞。然后将细胞提起，洗涤，并且在不添加细胞因子并且在存在对照或5uM的花生四烯酸(PUFA)的情况下在新鲜培养基中重新铺板。PMA/伊屋诺霉素重刺激之后测量T细胞的细胞因子谱。数据代表至少3个独立分化实验。DE.如在A中的，对天然T细胞进行分选并用TGFβ1+IL-6分化。在48h，然后将细胞提起，洗涤，并且在不添加细胞因子并且在存在对照或5uM花生四烯酸(PUFA)(针对CD5L-/-T细胞)和对照或25uM棕榈酸(SFA)(针对WT T细胞)的情况下在新鲜培养基中重新铺板。另外48小时后，收获细胞用于纳米链分析(D)或qPCR(E)。
图51A到51C PUFA和CD5L的作用模型。在分化期间(A)合成大量的Rorγt配体，从而限制PUFA/SFA的特异性冲击；然而，Th17细胞一旦分化(B,C)，由于葡萄糖代谢减少，配体合成便大幅降低，从而允许PUFA具有更加显著的作用。这种作用的程度取决于存在(B)还是不存在(C)CD5L，从而分别产生更少的或更多的病原性细胞。
图52A到52D显示了用EAE表征WT和CD5L-/-小鼠。如在图46A中的免疫小鼠。(A)免疫后15天，从CNS中分离淋巴细胞，并且直接染色，并且通过流式细胞术针对FoxP3的表达进行分析。(B)用PMA/伊屋诺霉素与布雷菲德菌素A将如A中的来自CNS的细胞重刺激4小时，并且通过流式细胞术针对细胞因子产生进行图谱绘制。(C)免疫之后10天从小鼠的腹股沟LN分离细胞。使用3H胸苷掺入测定来确定响应于MOG35-55肽的T细胞增殖；(D)收获来自C的上清液，通过ELISA确定IL-17的量。
图53A到53D显示了CD5L拮抗Th17细胞的病原性。如在图46中描述的，诱导被动EAE。简言之，从WT小鼠分选天然2D2细胞并且用IL-1β+IL-6+IL-23分化。在24h，将包含CD5L-GFP过表达-或对照-GFP构建体的逆转录病毒上清液用于感染激活的细胞。在感染后第3天分析CD5L的表达。在两组中50％的细胞表达GFP。(A)转移之前细胞因子谱的代表性流式细胞术分析；(B)转移之后重量损失曲线；(C)EAE得分；(D)来自转移后第30天的CNS的CD4+T细胞的细胞因子谱的代表性流式细胞术数据。
图54A到54D CD5L调节Th17细胞中的脂质代谢并且调控Rorγt功能。(A)如从Rorγt ChIP-seq中鉴定的，Il17、Il23r和Il10区域中的Rorγt结合位点(肖，优素福(Xiao,Yosef)等人2014)。顶行是同种型对照(红色)并且底行显示了来自抗-Rorγt抗体的RorγtChIP-seq结果(实验程序)。(B)如在图48E中的，Il23r的基因组区域中的Rorγt的ChIP-PCR。(C,D)如在图48G中的，在存在表达Cd5l的逆转录病毒载体的情况下相对于Il23r(C)和Il10(D)测量Rorγt转录活性。
详细说明
本发明总体上涉及用于鉴定控制T细胞平衡、T细胞分化、T细胞维持和/或T细胞功能的调节网络的组合物和方法，以及用于探索在多种治疗和/或诊断适应症中控制T细胞平衡、T细胞分化、T细胞维持和/或T细胞功能的调节网络的组合物和方法。
本发明提供了用于调控T细胞平衡的多种组合物和方法。本发明提供了调控T细胞平衡的T细胞调控剂。例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击多个T细胞类型之间(例如，Th17和其他T细胞类型(例如，调节性T细胞(Treg))之间)的水平和/或平衡的方法。例如，在一些实施例中，本发明提供了T细胞调控剂和使用这些T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击Th17活性和炎性潜能之间的水平和/或平衡的方法。如本文所使用，术语如“Th17细胞”和/或“Th17表型”及其所有语法变型是指一种分化T辅助细胞，该细胞表达一种或多种选自下组的细胞因子，该组由以下各项组成：白细胞介素17A(IL-17A)、白细胞介素17F(IL-17F)、以及白细胞介素17A/F异二聚体(IL17-AF)。如本文所使用，术语如“Th1细胞”和/或“Th1表型”及其所有语法变型是指一种分化T辅助细胞，该细胞表达干扰素γ(IFNγ)。如本文所使用，术语如“Th2细胞”和/或“Th2表型”及其所有语法变型是指一种分化T辅助细胞，该细胞表达一种或多种选自下组的细胞因子，该组由以下各项组成：白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)和白细胞介素13(IL-13)。如本文所使用，术语如“Treg细胞”和/或“Treg表型”及其所有语法变型是指一种分化T细胞，该细胞表达Foxp3。
这些组合物和方法使用T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击多个T细胞类型之间(例如，Th17及其他T细胞类型(例如，调节性T细胞(Treg))之间)的水平和/或平衡。
本发明提供了用于调控T细胞分化(例如，辅助性T细胞(Th细胞)分化)的方法和组合物。本发明提供了用于调控T细胞维持(例如，辅助性T细胞(Th细胞)维持)的方法和组合物。本发明提供了用于调控T细胞功能(例如，辅助性T细胞(Th细胞)功能)的方法和组合物。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来调节、影响或以其他方式冲击多个Th17细胞类型之间(例如，病原性和非病原性Th17细胞之间)的水平和/或平衡。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个T细胞群例如在具有或没有特定病原性差别的情况下朝向Th17细胞表型分化、或在具有或没有特定病原性差别的情况下远离Th17细胞表型分化。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个T细胞群例如在具有或没有特定病原性差别的情况下维持朝向Th17细胞表型、或在具有或没有特定病原性差别的情况下维持远离Th17细胞表型。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个Th17细胞群例如朝向病原性Th17细胞表型或远离病原性Th17细胞表型分化、或朝向非病原性Th17细胞表型或远离非病原性Th17细胞表型分化。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个Th17细胞群例如维持朝向病原性Th17细胞表型或远离病原性Th17细胞表型、或维持朝向非病原性Th17细胞表型或远离非病原性Th17细胞表型。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击一个T细胞群例如朝向一个非Th17 T细胞亚群或远离一个非Th17细胞亚群分化。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击T细胞群例如维持朝向非Th17 T细胞亚群或远离非Th17细胞亚群。
如本文所使用，术语如“病原性Th17细胞”和/或“病原性Th17表型”及其所有语法变型是指Th17细胞，在TGF-β3的存在下诱导时，这些Th17细胞表达升高水平的选自以下项的一种或多种基因：Cxcl3、IL22、IL3、Ccl4、Gzmb、Lrmp、Ccl5、Casp1、Csf2、Ccl3、Tbx21、Icos、IL17r、Stat4、Lgals3和Lag，如相比于在TGF-β3-诱导的Th17细胞中的表达水平。如本文所使用，术语如“非病原性Th17细胞”和/或“非病原性Th17表型”及其所有语法变型是指Th17细胞，在TGF-β3的存在下诱导时，这些Th17细胞表达降低水平的选自以下项的一种或多种基因：IL6st、IL1rn、Ikzf3、Maf、Ahr、IL9和IL10，如相比于在TGF-β3-诱导的Th17细胞中的表达水平。
这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击T细胞或T细胞群的功能和/或生物活性。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击辅助性T细胞或辅助性T细胞群的功能和/或生物活性。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击Th17细胞或Th17细胞群的功能和/或生物活性。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击非Th17 T细胞或非Th17 T细胞群(如，例如，Treg细胞或Treg细胞群、或另一种CD4+T细胞或CD4+T细胞群)的功能和/或生物活性。这些组合物和方法使用T细胞调控剂来影响或以其他方式冲击T细胞或T细胞群的可塑性(例如，通过将Th17细胞转变为一种不同亚型，或转变为一个新的状态)。
在本文提供的方法结合高时间分辨率的转录谱分析、新颖的计算算法、以及用于在原代T细胞中进行扰动的基于纳米线的创新性工具，以系统地衍生并且实验性地验证控制Th17分化的动态调节网络的模型。参见例如，优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17 celldifferentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981，其内容特此通过引用以其全文结合。该网络由具有新颖调节物的两个自我强化但相互拮抗的模块组成，其偶联作用对于维持Th17和其他CD4+T细胞亚群之间的水平和/或平衡可以是必需的。总的来说，71种调节物和1,266个基因之间的9,159种相互作用在至少一个网络上是有活性的；这71种中的46种是新颖的。在本文提供的实例鉴定和验证了39个调节因子(将它们嵌入一个综合时间网络内)并且揭示其组织原理，并且突出显示了用于控制Th17分化的新颖药物靶点。
“Th17-负”模块包括调节物例如SP4、ETS2、IKZF4、TSC22D3和/或IRF1。发现充当Th17细胞的一个定义的亚型的负调节物的转录因子Tsc22d3与关键Th17调节物共同定位在基因组上。“Th17正”模块包括调节物例如MINA、PML、POU2AF1、PROCR、SMARCA4、ZEB1、EGR2、CCR6、和/或FAS。发现对染色质调节物Mina的扰动上调Foxp3表达，发现对共激活子Pou2af1的扰动上调IFN-γ在受刺激的天然细胞中的产生，并且发现对TNF受体Fas的扰动上调IL-2在受刺激的天然细胞中的产生。所有三种因素还控制IL-17在Th17细胞中的产生。免疫系统的有效协调要求不同的促炎性和调节性CD4+辅助性T细胞群的谨慎平衡。其中，产生促炎性IL-17的Th17细胞在防御细胞外病原体上起关键作用，并且也已经被牵涉在诱导若干自身免疫疾病中(参见例如，贝特泰利(Bettelli)，E.、乌卡(Oukka)，M.&库克罗(Kuchroo)，V.K.免疫和自身免疫周期中的T(H)-17细胞(T(H)-17 cells in the circle of immunity andautoimmunity).《自然免疫学》(Nat Immunol)8，345-350，doi:10.1038/ni0407-345(2007))，这些自身免疫疾病包括例如银屑病、强直性脊柱炎、多发性硬化症以及炎性肠病。在体外通过细胞因子TGF-β1以及IL-6可以触发从天然T-细胞的Th17分化。虽然TGF-β1单独诱导Foxp3+调节T细胞(iTreg)(参见例如，周(Zhou)，L.等人.TGF-β-诱导的Foxp3通过拮抗RORgammat功能来抑制T(H)17细胞分化(TGF-beta-induced Foxp3inhibits T(H)17 celldifferentiation by antagonizing RORgammat function).《自然》(Nature)453，236-240，doi:nature06878[pii]10.1038/nature06878(2008))，IL-6的存在抑制iTreg并且诱导Th17分化(贝特泰利(Bettelli)等人，《自然免疫学》(Nat Immunol)2007)。
虽然TGF-β1对于Foxp3+诱导的Treg(iTreg)的诱导是所需要的，但IL-6的存在抑制iTreg的产生并且启动Th17分化程序。这导致了以下假设，病原性Th17细胞和Treg细胞之间存在互反关系(贝特泰利(Bettelli)等人，《自然免疫学》(Nat Immunol)2007)，这可能取决于互相拮抗的主要转录因子(TF)ROR-γt(在Th17细胞中)以及Foxp3(在Treg细胞中)之间的平衡(周(Zhou)等人，《自然》(Nature)2008)。其他细胞因子组合也已经显示出诱导ROR-γt以及分化成Th17细胞，具体地是TGF-β1和IL-21或IL-1β、TGF-β3+IL-6、IL-6、和IL-23(古尔埃斯齐(Ghoreschi)，K.等人。在不存在TGF-β信号传导的情况下病原性T(H)17细胞的产生(Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-betasignaling).《自然》(Nature)467，967-971，doi:10.1038/nature09447(2010))。最后，虽然许多细胞因子组合可以诱导Th17细胞，但暴露于IL-23对于稳定Th17表型和在Th17细胞中诱导病原效应子功能是关键的。
关于控制Th17细胞的调节网络大部分仍然是未知的(殴谢伊(O'Shea)，J.等人.信号转导和Th17细胞分化(Signal transduction and Th17cell differentiation).《微生物与感染》(Microbes Infect)11，599-611(2009)；周(Zhou)，L.&利特曼(Littman)，D.Th17细胞分化中的转录调节网络(Transcriptional regulatory networks in Th17 celldifferentiation).《当前免疫学观点》(Curr Opin Immunol)21，146-152(2009)。发育上，虽然TGF-β对于Th17和iTreg分化是所需要的，但不理解在它们之间如何实现平衡或IL-6如何偏向Th17分化(贝特泰利(Bettelli)等人，《自然免疫学》(Nat Immunol)2007)。功能上，不清楚Th17细胞的促炎状态如何通过免疫抑制细胞因子IL-10保持受控(殴谢伊(O'Shea)等人，《微生物与感染》(Microbes Infect)2009；周(Zhou)&利特曼(Littman)，《当前免疫学观点》(Curr Opin Immunol)2009)。最后，驱动Th17的发育的关键调节物和相互作用中的许多仍然是未知的(科恩(Korn)，T、贝特泰利(Bettelli)，E、乌卡(Oukka)，M.&库克罗(Kuchroo),V.K.IL-17和Th17细胞(IL-17 and Th17Cells).《免疫学年鉴》(Annu RevImmunol)27，485-517，doi:10.1146/annurev.immunol.021908.13271010.1146/annurev.immunol.021908.132710[pii](2009))。
最近的研究已经证明将系统谱分析与扰动联合用于解密哺乳动物调节回路的力量(power)(阿米特(Amit)，I.等人.对哺乳动物转录网络介导病原体应答的无偏重建(Unbiased reconstruction of a mammalian transcriptional network mediatingpathogen responses).《科学》(Science)326，257-263，doi:10.1126/science.1179050(2009)；诺韦尔什特恩(Novershtern)，N.等人.在人血细胞生成中密集互连的转录回路控制细胞状态(Densely interconnected transcriptional circuits control cellstates in human hematopoiesis).《细胞》(Cell)144，296309，doi:10.1016/j.cell.2011.01.004(2011)；利特瓦克(Litvak)，V.等人.C/EBPδ在区分瞬时和持续性TLR4-诱导的信号的调节回路中的功能(Function of C/EBPdelta in a regulatorycircuit that discriminates between transient and persistent TLR4-inducedsignals)。《自然免疫学》(Nat.Immunol.)10，437-443，doi:10.1038/ni.1721(2009)；铃木(Suzuki)，H.等人.在人类髓细胞性白血病细胞系中控制生长停滞和分化的转录网络(Thetranscriptional network that controls growth arrest and differentiation in ahuman myeloid leukemia cell line).《自然遗传学》(Nat Genet)41，553-562(2009)；阿米特(Amit)，I.、雷格夫(Regev)，A.&哈科恩(Hacohen)，N.发现该哺乳动物免疫系统的调调节回路的策略(Strategies to discover regulatory circuits of the mammalianimmune system).《免疫学自然评论》(Nature reviews.Immunology)11，873-880，doi:10.1038/nri3109(2011)；谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.描绘病毒-感测回路的TLR信号传导组分的系统发现(Systematic discovery of TLR signaling components delineatesviral-sensing circuits).《细胞》(Cell)147，853-867，doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011)；加伯(Garber)，M.等人.一种高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(A High-Throughput Chromatin ImmunoprecipitationApproach Reveals Principles of Dynamic Gene Regulation in Mammals).《分子细胞》(Molecular cell)，doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))。这些研究中的大多数依赖于假定一个“固定”网络的计算回路-重构算法。然而，Th17分化跨越几天，在此期间该调节网络的组分和布线可能变化。此外，天然T细胞和Th17细胞在体外通过不改变它们的表型或功能的传统方法不能有效地转染，因此限制了用于抑制基因表达的扰动策略的有效性。
在本文呈现的研究中通过以下解决了这些限制：结合转录谱分析、新颖的计算算法、以及基于纳米线的siRNA递送(沙列克(Shalek),A.K.等人.作为用于将生物分子递送到活细胞的通用平台的垂直硅纳米线(Vertical silicon nanowires as a universalplatform for delivering biomolecules into living cells).《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)107，1870-1875，doi:10.1073/pnas.0909350107(2010)(图1a)来构建和验证Th17分化的转录网络。在分化期间使用mRNA表达水平的全基因组谱，建立了控制Th17分化的动态调节回路的模型(自动鉴定25已知调节物并且指定控制该系统的46种新颖调节物)。使用硅纳米线将siRNA递送进入天然T细胞(沙列克(Shalek)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)2010)以然后扰动并且测量在分化期间在两个时间点上29种候选转录调节物和10种候选受体在一个代表性的基因标签上的转录作用。结合此数据，构建了该网络的一个综合验证模型。在具体实施例中，该回路包括12种压制或促进Th17发育的新颖的经过验证的调节物。将重构的模型组织化为两个偶联、拮抗、并且密集内连接的模块，这两个模块中一个促进该Th17程序并且另一个压制该Th17程序。该模型突出显示了12种新颖调节物，其功能进一步表征为在敲除小鼠中它们对全基因表达、DNA结合特征谱、或Th17分化的作用。在本文提供的研究证明了理解该Th17 T细胞亚群的发育的无偏的系统性和功能性途径。
在本文提供的方法结合高分辨率转录时程、重建调节网络的新颖的方法、和扰扰动T细胞的创新性纳米技术，以构建和验证Th17分化的一个网络模型。该模型由三个连续、密集内连接的网络组成，暗示了71种调节物(46种是新颖的)，并且提示在3个阶段中的实质性的重新布线。这71种调节物和与炎性肠病在遗传上相关的基因显著重叠(乔斯廷斯(Jostins)，L等人.宿主微生物相互作用塑造了炎性肠病的遗传架构(Host-microbeinteractions have shaped the genetic architecture of inflammatory boweldisease).《自然》(Nature)491，119-124，doi:10.1038/nature11582(2012))(71种的11种，p<10-9)。在这个模型的基础上，为127种推定调节物(80种是新颖的)系统性地排名，并且通过实验测试排名靠前的那些。
发现这些Th17调节物被组织化成两个紧密偶联、自我强化但相互拮抗的模块，其协调作用可以解释如何维持Th17、Treg、以及其他的效应T细胞亚群之间的平衡，以及如何实现Th17细胞的渐进式定向分化。在这两个模块内是被进一步表征的12种新颖因子(图4和5)，突出显示这些因子中的四种(其他是在图17A、17B中)。这种验证模型突出显示了正冲击或负冲击该Th17程序的至少12种新颖的调节物(图4和5)。值得注意地，这些和已知的调节物被组织为两个紧密偶联、自我强化和相互拮抗的模块，其协调作用可以解释如何维持Th17、Treg、以及其他的效应T细胞之间的平衡，以及在阻遏其他T细胞亚群分化的同时如何实现Th17细胞的渐进式定向分化。这12种调节物中的四个-Mina、Fas、Pou2af1、以及Tsc22d3–的功能被进一步验证并且被表征为承担来自相应的敲除小鼠或具有IP-Seq结合谱的T细胞的Th17分化。
这些T细胞调控剂被用来调控一种或多种靶基因的表达或一种或多种靶基因的一种或多种产物的表达，这一种或多种靶基因已被鉴定为响应于Th17相关的扰动的基因。这些靶基因是例如通过使T细胞(例如，天然T细胞、部分分化的T细胞、分化的T细胞和/或其组合)与T细胞调控剂接触，并且监测对一种或多种标签基因或一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达的作用(如果有的话)来鉴定的。在一些实施例中，该一种或多种标签基因是选自以下所示的表1或表2中列出的那些。
表1.标签基因
表2.标签基因的亚群
AHR HIF1A IRF4 REL
ARID5A ICOS IRF8 RORA
BATF ID2 ITGA3 RORC
CASP4 ID3 KLF6 SERPINB1
CASP6 IFNG KLRD1 SGK1
CCL20 IL10 LIF SKAP2
CCL4 IL10RA LTA SKI
CCR5 IL17A MAF SMOX
CCR6 IL17F MAFF SOCS3
CD24 IL17RA MINA STAT1
CD5L IL2 MYC STAT3
CD80 IL21 NFATC2 STAT4
CEBPB IL21R NFE2L2 TBX21
CLCF1 IL22 NFIL3 TGFBR1
CSF2 IL23R NOTCH1 TGIF1
CXCR3 IL24 NUDT4 TNFRSF25
EGR2 IL2RA PML TNFSF8
ELK3 IL7R POU2AF1 TRIM24
ETV6 IL9 PROCR TRPS1
FAS INHBA PSMB9 TSC22D3
FOXP3 IRF1 RBPJ ZFP36L1
GATA3
在一些实施例中，该靶基因是选自表3中列出的那些中的一种或多种Th17相关细胞因子或受体分子。在一些实施例中，该靶基因是选自表4中所示的那些中的一种或多种Th17相关转录调节物。
表3.Th17相关受体分子
ACVR1B CXCR4 IL6ST PROCR
ACVR2A CXCR5 IL7R PTPRJ
BMPR1A DDR1 IRAK1BP1 PVR
CCR4 FAS ITGA3 TLR1
CCR5 IL15RA KLRD1 TNFRSF12A
CCR6 IL18R1 MYD88 TNFRSF13B
CCR8 IL1RN PLAUR TRAF3
CXCR3
表4.Th17相关转录调节物
在一些实施例中，该靶基因是选自表5中所示的那些中的一种或多种Th17相关转录调节物。在一些实施例中，该靶基因是选自表6中列出的那些中的一种或多种Th17相关受体分子。在一些实施例中，该靶基因是选自表7中列出的那些中的一种或多种Th17相关激酶。在一些实施例中，该靶基因是选自表8中列出的那些中的一种或多种Th17相关信号传导分子。在一些实施例中，该靶基因是选自表9中列出的那些中的一种或多种Th17相关受体分子。
表5.候选调节物
表6.候选受体分子
表7.候选激酶
表8.来自单细胞分析的候选信号传导分子
表9.来自单细胞分析的候选受体分子
在这些新颖的‘Th17正’因子中的是锌指E-框结合同源框1Zeb1，它是早期诱导的并且在该Th17时程中持续(图17a)，类似于许多已知的关键Th17因子的表达。Zeb1敲低降低Th17标签细胞因子(包括IL-17A、IL-17F、和IL-21)和TF(包括Rbpj、Maff、和Mina)的表达和晚期诱导的细胞因子和受体分子基因的表达(p<10-4，簇C19)。它通过ROR-γt、Batf和Stat3结合在Th17细胞中，并且在来自Stat3敲除小鼠的细胞中被下调(图17a)。有趣的是，已知Zeb1与染色质因子Smarca4/Brg1相互作用以在上皮细胞中阻遏E-钙粘蛋白启动子并且诱导上皮-间充质过渡(桑切斯-替洛(Sánchez-Tilló)，E.等人.ZEB1阻遏E-钙粘蛋白并且通过募集SWI/SNF染色质重塑蛋白BRG1诱导EMT(ZEB1represses E-cadherin and inducesan EMT by recruiting the SWI/SNF chromatin-remodeling protein BRG1).《癌基因》(Oncogene)29，3490-3500，doi:10.1038/onc.2010.102(2010))。Smarca4在所有三网络模型中是一种调节物(图2d、e)并且是‘正模块'的一个成员(图4b)。虽然它在Th17时程中未差异性表达，它被Batf、Irf4和Stat3(Th17的正调节物)结合，但还被Gata3和Stat5(其他谱系的正调节物，图17a)结合。已知包含Smarca4的染色质重塑复合物置换核小体，并在IFN-γ启动子处重塑染色质并促进其在Th1细胞中表达(Zhang(张)，F.&布思比(Boothby)，M.T辅助类型1-特异性Brg1募集和定位在IFN-γ启动子处的核小体的重塑是Stat4依赖性的(Thelper type 1-specific Brg1recruitment and remodeling of nucleosomespositioned at the IFN-gamma promoter are Stat4dependent).《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)203，1493-1505，doi:10.1084/jem.20060066(2006))。在该IL-17a启动子的附近之中还存在潜在的Smarca4结合DNA序列(马蒂斯(Matys)，V.等人.TRANSFAC:转录调节，从模式至谱(TRANSFAC:transcriptional regulation,from patterns to profiles).《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)31，374-378(2003))。综合在一起，这提示了一个模型，其中通过可能与Zeb1相互作用的Smarca4进行的染色质重塑正调节Th17细胞并且对于IL-17表达是必不可少的。
相反地，在这些新颖的‘Th17负’因子中的是Sp4，一种早期诱导的基因，在该模型中预测为ROR-γt的一种调节物并且预测为ROR-γt、Batf、Irf4、Stat3和Smarca4的一个靶标(图17b)。Sp4敲低导致在48h处ROR-γt表达的增加，以及由Th17标签基因(包括IL-17、IL-21和Irf4)表达的增加所反映的一个总体更强和“更清晰的”Th17分化，并且导致其他CD4+细胞(包括Gata3、Foxp3以及Stat4)的标签基因表达的降低。
这些新颖的并且已知的调节因子协调作用以编排模块内以及模块间相互作用并且促进Th17细胞的渐进式分化，而限制抑制此亚群定向分化的模块,并且促进T细胞分化为其他T细胞亚群。例如，敲低Smarca4和Zeb1导致在Mina的降低(归因于Th17“正调节物”之间的全为正的相互作用)，而敲低Smarca4或Mina导致Tsc22d3 31表达的增加(归因于负的跨模块相互作用)。如使用RNAseq所示，这些作用延伸超过该网络中的调节因子的表达并且在全局范围影响Th17转录程序：例如敲低Mina对Th17分化网络从中期到晚期的进展具有实质性作用，因为它的受影响的下调基因中的一些与对应的时间簇显著重叠(p<10-5，例如，簇C9、C19)。对于负调节物Tsc22d3和Sp4观察到一个相反趋势。例如，转录调节物Sp4通过抑制细胞因子信号传导(C119；p<10-7)和造血(C120；p<10-3)簇(包括Ahr、Batf、ROR-γt等)来阻遏正分化的Th17细胞进入分化晚期。这些发现强调了大规模功能性扰动研究在理解本支配Th17分化的复杂分子回路的作用上的力量。
在最近的工作中，西奥法尼(Ciofani)等人(西奥法尼，M.等人.针对Th17细胞规格的一种验证调节网络(A Validated Regulatory Network for Th17CellSpecification).《细胞》(Cell)，doi:10.1016/j.cell.2012.09.016(2012))基于针对已知关键因素的ChIPSeq数据以及在野生型和敲除细胞中的转录谱对Th17调节物进行系统地排名。虽然它们的网络以已知核心Th17 TF为中心集，在本文呈现的这些互补途径扰动许多在生理有意义的背景中的基因。让人放心地是，它们的核心Th17网络显著与计算推断模型重叠(图18)。
这些正模块和负模块(图4和5)的布线揭示了该Th17程序的一些函数逻辑，但可能涉及直接和间接相互作用两者。该函数模型提供了针对解密与DNA结合谱的潜在物理相互作用(格拉斯马赫尔(Glasmacher)，E.等人.指导免疫特异性AP-1-IRF复合物的装配与功能的一种基因组调节元件(A Genomic Regulatory Element That Directs Assembly andFunction of Immune-Specific AP-1-IRF Complexes).《科学》(Science)，doi:10.1126/science.1228309(2012))或蛋白质-蛋白质相互作用(吴(Wu)，C、优素福(Yosef)，N.&塔尔哈默尔(Thalhamer)，T.SGK1激酶通过IL-23信号传导途径调节Th17细胞维持(SGK1kinaseregulates Th17 cells maintenance through IL-23 signaling pathway))的一个优异的起点。所鉴定的调节物对于调节Th17/Treg平衡以及对于将病原性Th17转换为非病原性Th17是引人注目的新靶。
用于选择标签基因的自动化程序
本发明还提供了确定在各种治疗和/或诊断适应症中有用的基因标签的方法。这些方法的目标是选择将提供关于感兴趣的过程的消息的基因一个小标签。基本概念是不同类型的信息可能引起整个基因组(>20k基因)的“空间”向相关基因的亚群的不同划分。这一策略被设计为最佳覆盖这些划分(考虑到对标签大小的约束)。例如，在这一策略的一些实施例中，存在两个类型的信息：(i)时间表达谱；以及(ii)功能性注释。第一信息来源将这些基因划分为多组共表达基因。该信息来源将这些基因划分为多组共功能基因。然后选择一小组的基因，使得存在所希望数目的来自每个组的代表，例如，来自每个共表达组的至少10个代表和来自每个共功能组的至少10个代表。使用多个来源的信息(并且因此旨在“覆盖”多个划分)的问题在计算机科学的理论中被称为集合-覆盖(Set-Cover)。虽然这个问题不能被最优地解决(由于它的NP-硬度)，但它可以近似到一个小因素内。在一些实施例中，所希望数目的来自每组的代表是一个或多个，至少2个、5个或更多个，10个或更多个，15个或更多个，20个或更多个，25个或更多个，30个或更多个，35个或更多个，40个或更多个，50个或更多个，60个或更多个，70个或更多个，80个或更多个，90个或更多个，或100个或更多个。
本途径的一个重要特征是，它可被给定该标签的大小(并且然后找出在该约束下它可能的最佳覆盖)；或覆盖的所希望水平(并且然后选择可以满足该覆盖需求的最小标签大小)。
这个程序的一个示例性实施例是选择275-基因标签(表1)，其组合若干标准来反映分化程序的尽可能多的方面。定义了以下需求：(1)该标签必须包括所有属于一个Th17微阵列标签的TF(比较于其他的CD4+T细胞，参见例如，威(Wei)等人于《免疫》(Immunity)第30卷155-167(2009))，参见本文描述的方法)；这些TF被包括为该网络中的调节物并且至少略微差异性表达；或者是强烈差异性表达；(2)它必须包括来自具有相似表达谱的基因的每个簇的至少10个代表；(3)它必须包含来自不同网络中的每个TF的预测靶标的至少5个代表；(4)它必须包括来自每个富集基因本体(GO)类别的最小数量的代表(在差异性表达的基因上计算)；并且(5)它必须包括与分化过程相关的约100个基因的手动装配列表，包括差异性表达细胞因子、受体分子和其他细胞表面分子。由于这些不同的标准可能产生实质性重叠，集合-覆盖(set-cover)算法被用来找出满足所有五个条件的基因的最小子集。在微阵列数据中表达没有显示出变化(实时或在处理之间)的18个基因被添加至这一列表。
标签基因的用途
本发明提供了用于多种诊断和/或治疗适应症的T细胞相关基因标签。例如，本发明提供了在多种诊断和/或治疗适应症中有用的Th17相关标签。在本发明的背景中“标签”包括但不限于核酸，连同其多态、突变、变体、修饰、亚基、片段、以及其他分析物或样品衍生的测量物。
示例性标签显示在表1和2中，并且在本文被统称为尤其“Th17相关基因”、“Th17相关的核酸”、“标签基因、”或“标签核酸”。
这些标签有用于如下方法，这些方法通过如下对受试者体内的免疫应答进行诊断、预测和/或分级：检测选自表1或表2中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平，并将检测到的水平与标签基因或基因产物表达、活性和/或功能的水平对照进行比较，其中检测到的水平和对照水平的差异表示该受试者体内免疫应答的存在。
这些标签有用于如下方法，这些方法通过如下来监测受试者体内免疫应答：在第一时间点检测选自在表1或表2中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测选自在表1或表2中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并且将第一检测到的表达、活性和/或功能的水平与第二检测到的表达、活性和/或功能的水平比较，其中在第一和第二检测到的水平上的变化表示在该受试者体内免疫应答上的变化。
这些标签有用于基于检测到的选自在表1或表2中列出的那些中的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平来鉴定处于风险或正在遭受免疫应答的患者群体的方法。这些标签也有用于监测经历针对一种或多种异常免疫应答的治疗和疗法的受试者以确定该治疗或疗法的有效性。这些标签也有用于监测经历针对一种或多种异常免疫应答的治疗和疗法的受试者以确定以确定患者是否应答于该治疗或疗法。这些标签也有用于选择或修饰有效于治疗、延迟进展或以其他方式改善一种异常免疫应答的症状的疗法和治疗。在本文提供的标签有用于选择处于具有促进选择治疗的准确度的疾病特定状态的一组患者。
本发明还包括具有结合到一种或多种标签核酸的检测试剂的试剂盒。还由本发明提供的是可以结合到一种或多种标签核酸的检测试剂(例如，寡核苷酸)的一个阵列。合适的检测试剂包括以试剂盒的形式包装在一起的特异性地识别一种或多种标签核酸(通过具有互补于这些标签核酸的一部分的同源核酸序列(如寡核苷酸序列))的核酸。这些寡核苷酸可以是这些标签基因的片段。例如这些寡核苷酸长度上可以是200、150、100、50、25、10或更少个核苷酸。该试剂盒可以包含在分开的容器中或与用于将它们结合到该基质的试剂、对照配制品(正和/或负)、和/或可检测标记如荧光素、绿色荧光蛋白、罗丹明、花青染料、亚历克萨染料、荧光素酶、放射性标记等等分开包装。用于进行该测定的说明书(例如，文字、胶带、VCR、CD-ROM等)可以包括在该试剂盒中。这种测定可例如是处于以下形式：Northern杂交或DNA芯片或夹心ELISA或如本领域中已知的任何其他方法。可替代地，该试剂盒包含包括一种或多种核酸序列的核酸底物阵列。
T细胞调控剂的用途
用于在本文提供的这些组合物和方法的任何中使用的一种或多种合适的T细胞调控剂包括抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。通过非限制性举例的方式，适合的T细胞调控剂或用于与一种或多种T细胞调控剂组合的药剂示于以下表10中。
表10.T细胞调控剂
应当理解的是，根据本发明给予治疗实体是与合适的载体、赋形剂、和被结合到配制品中以提供改进的转移、递送、耐受性等的其他药剂一起给予的。许多适当的配制品可以发现于所有药物化学家已知的处方集：《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmaceuticalSciences)(第15版，马克出版公司(Mack Publishing Company)，伊斯顿(1975))，特别是其中布劳格(Blaug)，西摩(Seymour)的第87章。这些配制品包括例如粉剂、糊剂、软膏、胶冻剂、蜡、油、脂质、含有脂质(阳离子或阴离子)的泡囊(例如LipofectinTM)、DNA轭合物、无水吸收糊剂、油包水和油包水乳剂、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半-固体凝胶、和包含碳蜡的半-固体混合物。任何上述混合物可以适合于根据本发明的治疗和疗法，条件是配制品中的活性成分未被该配制品灭活，并且该配制品与给药的途径是生理相容的且可忍受的。还参见鲍德里克(Baldrick)P.“药物赋形剂开发：临床前指导的需要(Pharmaceuticalexcipient development:the need for preclinical guidance)”.《调节毒理学与药理学》(Regul.Toxicol Pharmacol)32(2):210-8(2000)，王(Wang)W.“固体蛋白药物的冻干和开发(Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals)”.《国际药学期刊》(Int.J.Pharm.)203(1-2):1-60(2000)，查曼(Charman)WN“脂质、亲脂性药物、以及口服药物递送-一些应急概念(Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emerging concepts)”.《药物科学杂志》(J Pharm Sci.)89(8):967-78(2000)，鲍威尔(Powell)等人，“用于肠胃外配制品的赋形剂的概略”《PDA药物科学技术杂志》(PDAJ.Pharm Sci Technol.)52:238-311(1998)以及其中针对有关药物化学家熟知的配制品、赋形剂和载体的另外信息的引文。
本发明的包括一种T细胞调控剂的治疗配制品是用于治疗或减轻与免疫相关障碍或异常免疫应答相关联的症状。本发明还提供了治疗或减轻与免疫相关障碍或异常免疫应答相关联的症状的方法。一个治疗方案是通过使用标准方法来鉴定患有(或具有发展的风险)免疫相关障碍或异常免疫应答的受试者(例如，人类患者)来进行的。例如，T细胞调控剂在治疗自身免疫疾病和/或炎性障碍中是有用的治疗工具。在某些实施例中，设想T细胞调控剂调控(例如抑制、中和、或干扰)Th17 T细胞分化的用途是用于治疗自身免疫疾病和/或炎性障碍。在某些实施例中，考虑T细胞调控剂调控(例如，增强或促进)Th17 T细胞分化的用途是加强Th17应答，例如，对抗某些病原体和其他传染病。T细胞调控剂在不同的移植适应症中也是有用的治疗工具，例如，防止、延迟或以其他方式缓和一种移植物的移植排斥和/或延长其存活，而也已经证明在移植排斥的某些情况下，Th17细胞还可以起到重要作用。(参见例如，阿巴珍(Abadja)F、萨拉吉(Sarraj)B、安萨里(Ansari)MJ.，“T辅助17免疫在移植中的重要性(Significance of T helper17immunity in transplantation)”.《器官移植当前观点》(Curr Opin Organ Transplant).2012年2月；17(1):8-14.doi:10.1097/MOT.0b013e32834ef4e4)。T细胞调控剂在癌症和/或抗肿瘤免疫性中也是有用的治疗工具，因为在这些适应症中也牵涉Th17/Treg平衡。例如，一些研究已经表明，IL-23和Th17细胞在一些癌症(如通过非限制性举例的方式，结肠直肠癌)中起着作用。(参见例如，Ye(叶)J，里韦尔古德(Livergood)RS、彭(Peng)G.“人类Th17细胞在肿瘤免疫中的作用和调节(Therole and regulation of human Th17 cells in tumor immunity)”.《美国病理学杂志》(Am J Pathol.)2013年1月；182(1):10-20.doi:10.1016/j.ajpath.2012.08.041.电子版2012年11月14日)。T细胞调控剂也有用于具有遗传缺陷的展示异常Th17细胞生产的患者，例如，不会自然地产生Th17细胞的患者。
T细胞调控剂也有用于疫苗和/或作为针对自身免疫疾病、炎性障碍等的疫苗佐剂。用于治疗这些类型的障碍的佐剂的组合适合于与自身免疫性中涉及的来自靶向的自身抗原的多种多样的抗原(即自身抗原，例如髓磷脂碱性蛋白；炎性自身抗原例如淀粉样肽蛋白，或移植抗原例如同种抗原)组合使用。该抗原可以包括源自蛋白质的肽或多肽，连同以下各项中任一项的片段：糖类、蛋白质、多核苷酸或寡核苷酸、自身抗原、淀粉样肽蛋白、移植抗原、过敏原、或其他大分子组分。在一些情况下，超过一种抗原被包括在该抗原组合物中。
自身免疫疾病包括，例如，获得性免疫缺陷综合征(AIDS，它是具有自身免疫组分的一种病毒疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫阿狄森氏病、自身免疫溶血性贫血、自身免疫肝炎、自身免疫内耳疾病(AIED)、自身免疫淋巴组织增综合征(ALPS)、自身免疫血小板减少性紫癜(ATP)、贝切特氏病、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎；慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素疾病、波峰综合征、克罗恩病、迪戈斯病、皮肌炎-幼年、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格-巴二氏综合征、桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯蒂尔病)、幼年类风湿关节炎、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原发性血中丙球蛋白贫乏、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病性关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病(进行性系统性硬化症(PSS)，也称为系统性硬化症(SS))、舍格伦氏综合征、僵人综合征(stiffman syndrome)、系统性红斑狼疮、高安(Takayasu)动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、白癜风以及韦格纳氏肉芽肿病(Wegener'sgranulomatosis)。
在一些实施例中，T细胞调控剂有用于在受试者中治疗具有一种炎性组分的自身免疫疾病(如异常炎症应答)、延迟其进展、或另外改善其症状。在一些实施例中，T细胞调控剂有用于治疗已知与异常Th17应答(例如，异常IL-17产生)相关的一种自身免疫疾病，例如多发性硬化症(MS)、银屑病、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、葡萄膜炎、狼疮、强直性脊柱炎、以及类风湿性关节炎。
炎性障碍包括例如慢性和急性炎性障碍。炎性障碍的实例包括阿尔茨海默病、哮喘、特应性变态反应、过敏症、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血病、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病和呼吸机诱导肺损伤。
与这些免疫相关障碍相关联的症状包括例如炎症、发热、全身不适、发热、通常定位于发炎区域的疼痛、快速脉搏速率、关节疼或疼痛(关节疼痛)、快速呼吸或其他异常呼吸模式、寒战、错乱、定向障碍、烦乱、眩晕、咳嗽、呼吸困难、肺感染、心脏衰竭，呼吸衰竭，水肿、体重增加、粘脓性复发、恶病质、喘鸣、头痛、和腹型症状，如，例如腹痛、腹泻或便秘。
确定治疗的有效性是与用于诊断或治疗特定免疫相关障碍的任何已知方法相关联。该免疫相关障碍的一种或多种症状的缓解表明T细胞调控剂赋予临床益处。
如果实现多种实验室或临床目的中任一个，给予到患有免疫相关障碍或异常免疫应答的患者的T细胞调控剂被认为是成功的。例如，如果与该免疫相关障碍或异常免疫应答相关联的症状中一个或多个得以减轻、减少、抑制或不进展到一个另外的即更差的状态，则将一种T细胞调控剂给予至患者被认为是成功的。如果免疫相关障碍或异常免疫应答进入缓解或不进展到另外的即更差的状态，则将T细胞调控剂给予至患者被认为是成功。
治疗有效量的一种T细胞调控剂总体上涉及实现治疗目的所需的量。需要给予的量还将取决于该T细胞调控剂针对其特异性靶标的特异性，并且将还取决于所给予的T细胞调控剂从自由体积耗尽的速率,其他受试者经该自由体积被给药。
可以给予处于药物组合物形式的T细胞调控剂用于治疗多种疾病和障碍。提供了涉及制备此类组合物连同组分选择指导上的原则和考虑，例如，于《雷明顿：药物科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第19版(阿方索(Alfonso)R.真纳罗(Gennaro)等人编辑)麦克出版公司(Mack Pub.Co.))，伊斯顿，宾夕法尼亚州：1995；药物吸收增强：概念，可能性，限制，和趋势(Drug Absorption Enhancement:Concepts,Possibilities,Limitations,And Trends)，哈伍德学术出版社(Harwood AcademicPublishers)，兰霍恩(Langhorne)，宾夕法尼亚州，1994；以及肽和蛋白递送(《胃肠外科学上的进展》(Advances In Parenteral Sciences)，第4卷)，1991，M.德克尔(Dekker)，纽约。
当使用基于多肽的T细胞调控剂时，特异性地结合至该靶标并且保留治疗功能的最小片段是优选的。这类片段可以化学地合成和/或通过重组DNA技术产生。(参见，例如马拉斯科(Marasco)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，90：7889-7893(1993))。该配制品还可以含有对于正在治疗的具体特定适应症必要的一种以上的活性化合物，优选为具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些。可替代地，或另外地，该组合物可以包括增强其功能的一种药剂，如，例如一种细胞毒性剂、细胞因子、化学治疗剂、或生长抑制剂。此类分子适当地以有效于预期目的的量组合存在。
本发明包括一种治疗方法或药物发现方法或者配制或制备治疗的方法，所述方法包括本文讨论的方法或用途中的任一种。
本发明还涉及鉴定分子，有利地小分子或生物制剂，这些分子可以在抑制选自下组的一种或多种基因中的突变中的一种或多种中涉及，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。本发明考虑了筛选小分子或生物制剂的文库，以鉴定在压制或抑制体细胞突变的表达或在表型上改变细胞中涉及的化合物，这样使得在DEC1、PZLP、TCF4和CD5L中的一种或多种中具有突变的细胞表现得更加正常。
考虑了用于鉴定小分子或生物制剂的高通量筛选(HTS)，这些小分子或生物制剂在压制或抑制DEC1、PZLP、TCF4和CD5L中的一种或多种中的体细胞突变的表达中涉及。该方法的灵活性已经允许将生物学的众多不同领域与化学的同样各异的方面(palate)结合(参见例如，因格莱塞(Inglese)等人，《自然化学生物学》(Nature Chemical Biology)3，438-441(2007))。可以筛选出包含多于200,000种独特小分子的化学品文库的各异集合，以及天然产物文库。这包括例如针对结构多样性、多个治疗领域的集体覆盖、和在人类中的已知安全性和生物利用度所选择的非专利化合物的普雷斯蒂克(Prestwick)文库(1,120种化学品)，并且还考虑了由大部分FDA批准的药物的1,040个化合物-文库组成的NINDS定制收藏中心(NINDS Custom Collection)2(参见例如，美国专利号8,557,746)。
NIH的分子文库探针生产中心网络(Molecular Libraries Probe ProductionCenters Network，MLPCN)提供了通向成千上万的小分子(即可以被用作探测基础生物学并且增长我们对疾病的理解的工具的化学化合物)的入口。小分子可以帮助研究人员理解生物途径的纷繁难懂之处或者成为新颖治疗学的起点。博德研究所的探针研发中心(TheBroad Institute’s Probe Development Center，BIPDeC)是MLPCN的一部分并且提供了通向超过330,000种化合物的增长中文库的入口，这些化合物用于大规模筛选和药物化学。任何这些化合物都可以用于筛选在压制或抑制DEC1、PZLP、TCF4和CD5L中的一种或多种中的体细胞突变的表达中涉及的化合物。
如本文使用的短语“治疗有效量”是指药物、药剂、或化合物的提供希望的治疗效果的无毒但是有效的量。
如本文使用的“患者”是指正在接受医学治疗的或可以接受医学治疗的任何人。
“多态位点”是指与另一种多核苷酸的不同之处在于一个或多个单核苷酸变化的多核苷酸。
“体细胞突变”是指不是从亲本遗传而来并且也不传递给子代的遗传结构变化。
可以单独地或与另一种疗法结合实施根据本发明的疗法或治疗，并且可以在家里、医生的办公室、诊所、医院的门诊部、或医院提供。治疗通常在医院开始，这样使得医生可以密切地观察疗法的效果并且做出任何需要的调整。疗法的持续时间取决于患者的年龄和状况、心血管疾病的阶段、以及患者如何响应于治疗。另外，具有较大的患上心血管疾病风险的人(例如，遗传易感的人)可以接受预防性治疗，以抑制或延迟该疾病的症状。
按本领域的普通技术人员已知的方式制备本发明的药物，例如通过常规的溶解、冻干、混合、制粒或成型方法。本领域中熟知的用于制备配制品的方法发现于例如《雷明顿：药物科学与实践》(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，第20版，编辑A.R.真纳罗(Gennaro)，2000，利平科特·威廉姆斯&威尔金斯出版社(LippincottWilliams&Wilkins)，费城，以及《制药技术百科全书》(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology)，编辑J.斯沃布里克(Swarbrick)和J.C.博伊兰(Boylan)，1988-1999，马塞尔·德克尔出版社(Marcel Dekker)，纽约。
本发明药物的给予可以通过任何适合的产生有效治疗或抑制(例如，通过延迟)心血管疾病的发展的化合物浓度的手段。将化合物与适合的载体物质混合，该载体物质是例如保留与它一起给予的化合物的治疗特性的药学上可接受的赋形剂。一种示例性的药学上可接受的赋形剂是生理盐水。适合的载体物质通常以按重量计药物的总重量的1％-95％的量存在。可以按适于口服、经直肠、静脉内、肌内、皮下、吸入、经鼻、局部或经皮、阴道、或经眼给药的剂型来提供药物。因此，药物可以处于例如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液、凝胶(包括水凝胶)、糊剂、软膏剂、乳膏剂、硬膏剂、兽用顿服药(drench)、递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂、或气溶胶的形式。
为了确定根据本发明方法的患者的基因型，可能必要的是从该患者获得基因组DNA样品。可以从取自该患者的组织或细胞样品获得该基因组DNA样品。
组织样品可以包括但不限于头发(包括发根)、皮肤、口腔拭子、血液、或唾液。可以用鉴定编号或其他将样品与取该样品的个体患者关联的标记来对组织样品进行标记。样品的身份贯穿本发明的方法有利地保持不变，由此保证提取和分析期间样品的完整性和连续性。可替代地，可以按规则方式改变标记，该方式保证数据、和任何其他相关数据可以关联回获得该数据的患者。所需样品的量/大小是本领域的普通技术人员已知的。
通常，可以将组织样品放在容器中，该容器使用携带有对应于该患者的密码的编号系统进行标记。因此，可以容易地追踪到具体患者的基因型。
在本发明的一个实施例中，可以为医师提供取样装置和/或容器。取样装置有利地从个体患者中取一致且可重复的样品，同时避免组织的任何交叉污染。因此，源自个体患者的样品组织的大小和体积将是一致的。
根据本发明，从感兴趣患者的组织样品获得DNA样品。无论使用什么样的细胞或组织来源，必须获得足够量的细胞，以提供足够量的供分析的DNA。这个量应是已知的或者可以由本领域的普通技术人员容易地确定。
通过本领域的普通技术人员已知的技术从组织/细胞分离DNA(参见例如，美国专利号6,548,256和5,989,431；广田(Hirota)等人，Jinrui Idengaku Zasshi.1989年9月；34(3):217-23和约翰(John)等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res).1991年1月25日；19(2):408；将其披露通过引用以其全文而结合)。例如，可以使用蛋白酶K提取和乙醇沉淀从细胞或组织中纯化高分子量DNA。可以使用任何其他适合的本领域已知的方法从患者标本中提取DNA。
本发明的目的在于通过分析来自患者的DNA确定感兴趣的给定患者的基因型，以便鉴定携带与患上心血管疾病相关的本发明的特异性体细胞突变的患者。具体而言，该试剂盒可以具有引物或用于鉴定具体突变的其他DNA标记，这些具体突变是如但不限于选自下组的一种或多种基因，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
本领域中存在许多的用于确定患者的基因型以及用于鉴定或分析给定DNA样品是否包含具体体细胞突变的已知方法。用于确定基因型的任何方法都可以用于在本发明中确定基因型。此类方法包括但不限于扩增引物测序、DNA测序、荧光光谱学、基于荧光共振能量转移(或“FRET”)的杂交分析、高通量筛选、质谱学、核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)、RFLP分析以及尺寸色谱法(例如，毛细管或凝胶色谱法)，其全部是本领域的技术人员所熟知的。
本发明的方法(如全外显子组测序和靶向扩增子测序)在用于检测患者体内的体细胞突变的诊断试剂盒中具有商业应用。根据本发明的测试试剂盒可以包括任何例如根据本发明的全外显子组测序和靶向扩增子测序所必需的材料。在特别有利的实施例中，本发明的诊断可以包括针对本文披露的任何基因进行测试。该试剂盒进一步包括用于检测或测量本发明的序列的另外的工具(如试剂)，并且还理想地包括阳性和阴性对照。
本发明进一步涵盖根据本发明的探针，这些探针被固定在固体或柔性支持物上，如纸、尼龙或其他类型的膜、过滤器、芯片、载玻片、微芯片、微珠粒、或任何其他此类基质，其全部在本发明的范围内。这种形式的探针现在被称作“DNA芯片”。这些DNA芯片可以用于分析本发明的体细胞突变。本发明进一步涵盖核酸分子的阵列或微阵列，这些核酸分子基于本文描述的序列中的一个或多个。如本文使用的“阵列”或“微阵列”是指在固体或柔性支持物上合成的不同多核苷酸或寡核苷酸的阵列，该支持物是如纸、尼龙或其他类型的膜、过滤器、芯片、载玻片、或任何其他适合的固体支持物。在一个实施例中，根据美国专利号5,446,603、5,545,531、5,807,522、5,837,832、5,874,219、6,114,122、6,238,910、6,365,418、6,410,229、6,420,114、6,432,696、6,475,808和6,489,159以及PCT公开号WO 01/45843 A2中描述的方法和装置来制备和使用微阵列。
关于本发明的实例&技术
以下实例出于说明本发明的不同实施例的目的而给出并且并不意在以任何方式限制本发明。本发明实例连同在本文描述的方法目前代表优选的实施例，是示例性的，并且并不旨在限制本发明的范围。涵盖在如由权利要求书的范围所定义的本发明的精神内的在此的变化以及其他用途是本领域普通技术人员可以想到的。
在此方面，提及的是细胞并且还有用于在本发明中使用或就本发明而言的经突变的小鼠中的突变可以是通过CRISPR-Cas系统或表达Cas9的真核细胞或表达Cas-9的真核生物(如小鼠)。表达Cas9的真核细胞或真核生物(例如，小鼠)可以具有递送或给予至其中的指导RNA，藉此该RNA靶向座位并且诱导用于在本发明中使用或就本发明而言的所希望的突变。关于CRISPR-Cas系统、其组分、及这类组分的递送(包括方法、材料、递送载剂、载体、粒子、及其制造和使用(包括关于量和配制品))，以及表达Cas9的真核细胞、表达Cas-9的真核生物(如小鼠)的一般信息，都可用于本发明中或就本发明而言是有用的，参考：美国专利号8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418、8,895,308、8,932,814、8,945,839、8,906,616；美国专利公开案US 2014-0310830(美国申请序列号14/105,031)、US 2014-0287938 A1(美国申请序列号14/213,991)、US 2014-0273234 A1(美国申请序列号14/293,674)、US2014-0273232 A1(美国申请序列号14/290,575)、US2014-0273231(美国申请序列号14/259,420)、US 2014-0256046 A1(美国申请序列号14/226,274)、US 2014-0248702 A1(美国申请序列号14/258,458)、US 2014-0242700 A1(美国申请序列号14/222,930)、US 2014-0242699 A1(美国申请序列号14/183,512)、US 2014-0242664 A1(美国申请序列号14/104,990)、US 2014-0234972 A1(美国申请序列号14/183,471)、US 2014-0227787 A1(美国申请序列号14/256,912)、US 2014-0189896 A1(美国申请序列号14/105,035)、US 2014-0186958(美国申请序列号14/105,017)、US 2014-0186919A1(美国申请序列号14/104,977)、US 2014-0186843 A1(美国申请序列号14/104,900)、US2014-0179770 A1(美国申请序列号14/104,837)和US 2014-0179006 A1(美国申请序列号14/183,486)，US 2014-0170753(美国申请序列号14/183,429)；欧洲专利/专利申请：EP 2771 468(EP 13818570.7)、EP 2 764 103(EP 13824232.6)、和EP 2 784 162(EP14170383.5)；以及PCT专利公开案WO 2014/093661(PCT/US 2013/074743)、WO 2014/093694(PCT/US 2013/074790)、WO 2014/093595(PCT/US 2013/074611)、WO 2014/093718(PCT/US 2013/074825)、WO 2014/093709(PCT/US 2013/074812)、WO 2014/093622(PCT/US2013/074667)、WO 2014/093635(PCT/US 2013/074691)、WO 2014/093655(PCT/US 2013/074736)、WO 2014/093712(PCT/US 2013/074819)、WO 2014/093701(PCT/US 2013/074800)、WO 2014/018423(PCT/US 2013/051418)、WO 2014/204723(PCT/US 2014/041790)、WO 2014/204724(PCT/US 2014/041800)、WO 2014/204725(PCT/US 2014/041803)、WO 2014/204726(PCT/US 2014/041804)、WO 2014/204727(PCT/US 2014/041806)、WO 2014/204728(PCT/US 2014/041808)、WO 2014/204729(PCT/US 2014/041809)，以及：
使用CRISPR/Cas系统进行的多元基因组工程化(Multiplex genome engineeringusing CRISPR/Cas systems).丛(Cong)，L.、兰(Ran)，F.A.、科克斯(Cox)D.、林(Lin)，S.、巴雷德(Barretto)，R.、哈比卜(Habib)，N.、徐(Hsu)，P.D.、武(Wu)，X.、江(Jiang)，W.、马拉菲尼(Marraffini)，L.A.，&张(Zhang)，F.《科学》(Science)2月15日；339(6121):819-23(2013)；
使用CRISPR-Cas系统对细菌基因组进行RNA-指导的编辑(RNA-guided editingof bacterial genomes using CRISPR-Cas systems).江(Jiang)W.、比卡德(Bikard)D.、科克斯(Cox)D.、张(Zhang)F、马拉菲尼(Marraffini)LA.《自然生物技术》(NatBiotechnol)3月；31(3):233-9(2013)；
通过CRISPR/Cas-介导的基因组工程化在多基因中携带突变的小鼠的一步产生(One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering).王(Wang)H.、杨(Yang)H.、奇瓦里拉(Shivalila)CS.、多拉蒂(Dawlaty)MM.、程(Cheng)AW.、张(Zhang)F.、耶尼施(Jaenisch)R.《细胞》(Cell)5月9日；153(4):910-8(2013)；
哺乳动物内源转录和外遗传状态的光控制(Optical control of mammalianendogenous transcription and epigenetic states).科纳曼(Konermann)S、布里格姆(Brigham)MD、特里维诺(Trevino)AE、徐(Hsu)PD、海登里希(Heidenreich)M、丛(Cong)L、普莱特(Platt)RJ、斯科特(Scott)DA、丘奇(Church)GM、张(Zhang)F.《自然》(Nature).2013年8月22日；500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.电子版2013年8月23日；
通过RNA指导的CRISPR Cas9进行的双切以用于增强的基因组编辑特异性(DoubleNicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、林(Lin)，CY.、古滕伯格(Gootenberg)，JS.、科纳曼(Konermann)，S.、特里维诺(Trevino)，AE.、斯科特(Scott)，DA.、井上(Inoue)，A.、马托巴(Matoba)，S.、张(Zhang)，Y.，&张(Zhang)，F.《细胞》(Cell)8月28日.pii:S0092-8674(13)01015-5.(2013)；
RNA指导的Cas9核酸酶的DNA靶向特异性(DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases).徐(Hsu)，P.、斯科特(Scott)，D.、温斯坦(Weinstein)，J.、兰(Ran)，FA.、科纳曼(Konermann)，S.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、李(Li)，Y.、法恩(Fine)，E.、吴(Wu)，X.、沙勒姆(Shalem)，O.、克拉迪克(Cradick)，TJ.、马拉菲尼(Marraffini)，LA.、包(Bao)，G.，&张(Zhang)，F.《自然生物技术》(Nat Biotechnol)doi:10.1038/nbt.2647(2013)；
使用CRISPR-Cas9系统进行的基因组工程化(Genome engineering using theCRISPR-Cas9system).兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、赖特(Wright)，J.、阿格瓦拉(Agarwala)，V.、斯科特(Scott)，DA.、张(Zhang)，F.《自然工具》(Nature Protocols)十一月；8(11):2281-308.(2013)；
在人类细胞中基因组规模CRISPR-Cas9敲除筛选(Genome-Scale CRISPR-Cas9Knockout Screening in Human Cells).沙勒姆(Shalem)，O.、桑耶纳(Sanjana)，NE.、哈尔特宁(Hartenian)，E.、史(Shi)，X.、斯科特(Scott)，DA.、迈克尔森(Mikkelson)，T.、赫克尔(Heckl)，D.、埃伯特(Ebert)，BL.、罗特(Root)，DE.、登奇(Doench)，JG.、张(Zhang)，F.《科学》(Science)12月12日.(2013).[电子版先于印刷版]；
在与指导RNA和靶DNA复合物中的cas9的晶体结构(Crystal structure of cas9in complex with guide RNA and target DNA).尼施玛素(Nishimasu)，H.、兰(Ran)，FA.、徐(Hsu)，PD.、科纳曼(Konermann)，S.、舍哈塔(Shehata)，SI.、多米耶(Dohmae)，N.、石谷(Ishitani)，R.、张(Zhang)，F.、努尔基(Nureki)，O.《细胞》(Cell)2月27日.(2014).156(5):935-49；
在哺乳动物细胞中CRISPR内切核酸酶Cas9的基因组宽结合(Genome-widebinding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells).吴(Wu)X.、斯科特(Scott)DA.、凯里兹(Kriz)AJ.、邱(Chiu)AC.、徐(Hsu)PD.、达东(Dadon)DB.、程(Cheng)AW.、特里维诺(Trevino)AE.、科纳曼(Konermann)S.、陈(Chen)S.、耶尼施(Jaenisch)R.、张(Zhang)F.、夏普(Sharp)PA.《自然生物技术》(Nat Biotechnol.)(2014)4月20日.doi:10.1038/nbt.2889，
用于基因组编辑和癌模造的CRISPR-Cas9敲入小鼠(CRISPR-Cas9Knockin Micefor Genome Editing and Cancer Modeling)，普莱特(Platt)等人，《细胞》(Cell)159(2):440-455(2014)DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014，
用于基因组工程化的CRISPR-Cas9的开发与应用(Development andApplications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering)，徐(Hsu)等人，《细胞》(Cell)157，1262-1278(2014年6月5日)(徐2014)，
使用CRISPR/Cas9系统在人类细胞中进行遗传筛选(Genetic screens in humancells using the CRISPR/Cas9system)，王(Wang)等人，《科学》(Science).2014年1月3日；343(6166):80–84.doi:10.1126/science.1246981，
用于CRISPR-Cas9介导的基因失活的高活性sgRNA的合理设计(Rational designof highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation)，多恩奇(Doench)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)，在线公开于2014年9月3日；doi:10.1038/nbt.3026，以及
使用CRISPR-Cas9在哺乳动物脑中的基因功能的体内探询(In vivointerrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9)，斯维希(Swiech)等人，《自然生物技术》(Nature Biotechnology)；在线公开于2014年10月19日；doi:10.1038/nbt.3055，每个参考文件都通过引用而并入本文。
本发明涉及一种高通量单细胞RNA-Seq和/或靶向核酸谱分析(例如，测序、定量逆转录聚合酶链式反应等)，在其中来自不同细胞的RNA被单独地标记，从而允许产生单文库同时保留每个读数的细胞身份。在此方面，2014年9月9日提交的美国临时专利申请序列号62/048,227(将其披露通过引用而结合)的技术可以在本发明中使用或就本发明而言来使用。使用分子条形码技术和基于乳液的微流体技术的组合，来高通量地分离、裂解、条形码化、以及从单独的细胞中制备核酸。亚纳升的微流体装置(例如，以聚二甲基硅氧烷制造)使乳液滴反向。这些液滴被用于共封装核酸与条形码化的捕获珠粒。例如，每个珠粒都被独特地条形码化，这样使得每滴及其内容物都是可区别的。核酸可以来自本领域中已知的任何来源，例如像来自单细胞、一对细胞、细胞裂解液、或溶液的那些。当细胞被封装在液滴中时，它被裂解。为了将单细胞和条形码化的珠粒按照泊松统计加载到这些液滴中，需要1000亿到1000万个这样的珠粒来条形码化约10,000-100,000个细胞。在此方面，可以存在一种单细胞测序文库，该文库可以包括：将一个独特地条形码化的mRNA捕获微珠粒与单细胞在直径为75-125μm的乳液滴中合并；裂解该细胞，以使得其RNA是通过杂交在RNA捕获微珠粒上可捕获的；在该乳液滴内或外进行逆转录，以将该细胞的mRNA转化为共价地连接到mRNA捕获微珠粒上的第一链cDNA；将来自所有细胞的cDNA附着的微珠粒聚池；并且制备单综合RNA-Seq文库并对其测序。因此，就本发明的实践而言或在本发明的实践中设想的是，可以存在一种用于制备独特地条形码化的mRNA捕获微珠粒的方法，这些微珠粒具有适于微流体装置的独特条形码和直径，该方法可以包括：1)以聚裂(pool-and-split)方式在珠粒的表面上进行反向亚磷酰胺合成，这样使得在每个合成循环中，这些珠粒被分割成用四种典型核苷酸之一(T、C、G、或A)或长两个或更多个碱基的独特寡核苷酸进行的四种反应；2)将这个过程重复大量的次数，至少六次，并且最佳地多于十二次，这样使得在后者中，在聚池中的每个珠粒的表面上存在多于1600万个独特条形码。(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC206447)。同样地，在本发明中或就本发明而言，可以存在一种用于经由微流体系统产生单细胞测序文库的仪器，该仪器可以包括：油-表面活性剂入口，其可以包括过滤器和载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；分析物入口，其可以包括过滤器和载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；mRNA捕获微珠粒和裂解试剂入口，其可以包括过滤器和载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；所述载流通道具有在其中以可调或预定的流速流动的载流；其中每个所述载流通道在接点处合并；并且所述接点被连接至混合器上，该混合器包含滴出口。类似地，就本发明的实践而言或在本发明的实践中，可以存在一种用于产生单细胞测序文库的方法，该方法可以包括：将一个独特地条形码化的RNA捕获微珠粒与单细胞在直径为125μm的乳液滴中合并，裂解该细胞，由此将该RNA捕获在RNA捕获微珠粒上；在液滴破裂并且收集微珠粒之后或在乳液滴内进行逆转录，以将该细胞的RNA转化为共价地连接到RNA捕获微珠粒上的第一链cDNA；将来自所有细胞的cDNA附着的微珠粒聚池；并且制备单综合RNA-Seq文库并对其测序；并且，乳液滴可以在50μm-210μm之间。在另外的实施例中，在该方法中，mRNA捕获微珠粒的直径是从10μm至95μm。因此，本发明的实践包括制备独特地条形码化的mRNA捕获微珠粒，这些微珠粒具有适于微流体装置的独特条形码和直径，所述制备可以包括：1)以聚裂方式在珠粒的表面上进行反向亚磷酰胺合成，这样使得在每个合成循环中，这些珠粒被分割成用四种典型核苷酸之一(T、C、G、或A)进行的四种反应；2)将这个过程重复大量的次数，至少六次，并且最佳地多于十二次，这样使得在后者中，在聚池中的每个珠粒的表面上存在多于1600万个独特条形码。共价键可以是聚乙二醇。mRNA捕获微珠粒的直径可以是从10μm至95μm。因此，就本发明的实践而言或在本发明的实践中还设想的是，可以存在一种用于制备独特地条形码化的mRNA捕获微珠粒的方法，这些微珠粒具有适于微流体装置的独特条形码和直径，该方法可以包括：1)以聚裂方式在珠粒的表面上进行反向亚磷酰胺合成，这样使得在每个合成循环中，这些珠粒被分割成用四种典型核苷酸之一(T、C、G、或A)进行的四种反应；2)将这个过程重复大量的次数，至少六次，并且最佳地多于十二次，这样使得在后者中，在聚池中的每个珠粒的表面上存在多于1600万个独特条形码。并且，mRNA捕获微珠粒的直径可以是从10μm至95μm。另外，就在本发明的实践中而言，可以存在一种用于经由微流体系统产生综合单细胞测序文库的仪器，该仪器可以包括：油-表面活性剂入口，其可以包括过滤器和两个载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；分析物入口，其可以包括过滤器和两个载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；mRNA捕获微珠粒和裂解溶剂入口，其可以包括载流通道；所述载流通道具有在其中以可调且预定的流速流动的载流；其中每个所述载流通道在接点处合并；并且所述接点被连接至夹断液滴的收缩、接着是混合器上，该混合器连接至滴出口上。分析物可以包括化学试剂、遗传扰动的细胞、蛋白质、药物、抗体、酶、核酸、细胞器(像线粒体或细胞核)、细胞或其任何组合。在该仪器的实施例中，分析物是细胞。在另外的实施例中，细胞是脑细胞。在该仪器的实施例中，裂解试剂可以包括阴离子表面活性剂(如月桂酰基肌氨酸钠)、或离液盐(如硫氰酸胍)。过滤器可以包括方形PDMS柱；例如，其中细胞通道上的过滤器具有范围在125μm-135μm之间的侧面的这样的柱，并且柱之间的间隔是70mm-100mm。油-表面活性剂入口上的过滤器可以包括两个尺寸的方形柱；一种柱具有范围在75μm-100μm之间的侧面并且它们之间的间隔为25μm-30μm，并且另一种柱具有范围在40μm-50μm之间的侧面和10μm-15μm的间隔。该仪器可以包括电阻器，例如长度为7000μm-9000μm、宽度为50μm-75μm并且深度为100mm-150mm的蛇形电阻器。该仪器可以具有长度为8000μm-12,000μm(针对油-表面活性剂入口)、5000-7000(针对分析物(细胞)入口)、和900μm-1200μm(针对微珠粒和裂解剂入口)的通道；和/或全部的宽度为125mm-250mm，并且深度为100mm-150mm的通道。细胞通道的宽度可以是125μm-250μm并且深度是100μm-150μm。该仪器可以包括长度为7000μm-9000μm，并且宽度为110μm-140μm，每150μm具有35-45o zig-zig的混合器。混合器的宽度可以是约125μm。油-表面活性剂可以是PEG嵌段聚合物，如BIORADTMQX200产液滴油(BIORADTMQX200Droplet GenerationOil)。载流可以是水-甘油混合物。在本发明的实践中或就本发明而言，混合物可以包括用以下要素的组合装饰的多个微珠粒：珠粒特异性寡核苷酸条形码；另外的寡核苷酸条形码序列，其在单独的珠粒上的寡核苷酸之间变化，并且可以因此用于区分或帮助鉴定那些单独的寡核苷酸分子；另外的寡核苷酸序列，其产生用于下游分子-生物反应的底物，如寡-dT(用于成熟mRNA的逆转录)、特异序列(用于捕获转录组的特异部分，或引发DNA聚合酶和类似酶)、或随机序列(用于遍及转录组或基因组来引发)。任何单独的微珠粒的表面上的单独的寡核苷酸分子都可以包含这些要素中的所有三种，并且第三种要素可以包括寡-dT和引物序列两者。混合物可以包括多个微珠粒，其中所述微珠粒可以包括以下要素：至少一个珠粒特异性寡核苷酸条形码；至少一个另外的标识符寡核苷酸条形码序列，其在单独的珠粒上的寡核苷酸之间变化，并且由此有助于珠粒特异性寡核苷酸分子的鉴定和；任选地至少一个另外的寡核苷酸序列，其为下游分子-生物反应提供底物。混合物可以包括至少一个寡核苷酸序列，其为下游分子-生物反应提供底物。在另外的实施例中，下游分子生物反应是用于成熟mRNA的逆转录；捕获转录组的特异部分，引发DNA聚合酶和/或类似酶；或遍及转录组或基因组来引发。该混合物可以包括一个或多个另外的寡核苷酸序列，其可以包括寡-dT序列。该混合物可以进一步包括另外的寡核苷酸序列，其可以包括引物序列。该混合物可以进一步包括另外的寡核苷酸序列，其可以包括寡-dT序列和引物序列。可以采用的标记物质的实例包括本领域的普通技术人员已知的标记物质，如荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质、以及放射性物质。具体的实例包括放射性同位素(例如，32P、14C、125I、3H、和131I)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮、荧光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微过氧化物酶、生物素、以及钌。在生物素被用作标记物质的情况下，优选地，添加生物素标记的抗体之后，进一步添加与酶(例如，过氧化物酶)结合的链霉亲和素。有利地，该标记是荧光标记。荧光标记的实例包括但不限于阿托(Atto)染料，4-乙酰胺基-4'-异硫氰酸芪-2,2'二磺酸；吖啶和衍生物：吖啶，吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄(Brilliant Yellow)；香豆素和衍生物；香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，Coumarin120)，7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Coumaran 151)；花菁染料；标记红(cyanosine)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'5”-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)-4-甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸；4,4'-二异硫氰酸基二氢-茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红和衍生物；曙红，异硫氰酸曙红，赤藓红和衍生物；赤藓红B，赤藓红，异硫氰酸盐；胡米胺(ethidium)；荧光素和衍生物；5-羧基荧光素(FAM)，5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)，2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素，荧光素，异硫氰酸荧光素，QFITC,(XRITC)；荧光胺；IR144；IR1446；异硫氰酸孔雀绿；4-甲基伞形酮邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘和衍生物：芘，芘丁酸酯，琥珀酰亚胺基1-芘；丁酸盐(酯)量子点；活性红4(Cibacron.TM.亮红(Brilliant Red)3B-A)罗丹明和衍生物：6-羧基-X-罗丹明(ROX)，6-羧基罗丹明(R6G)，丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明(Rhod)，罗丹明B，罗丹明123，罗丹明X异硫氰酸盐，磺基罗丹明B，磺基罗丹明101，磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)；核黄素；玫红酸；铽螯合物衍生物；Cy3；Cy5；Cy5.5；Cy7；IRD 700；IRD 800；拉霍亚蓝(La Jolta Blue)；酞菁；以及萘菁。荧光标记可以是荧光蛋白，如蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或任何光可转化蛋白。比色标记、生物发光标记和/或化学发光标记可以进一步完成标记。标记可以进一步包括杂交复合物中的分子之间的能量传递(通过扰动分析、淬灭)，或供体与受体分子之间的电子传递，其中的后者可以通过双链匹配杂交复合物来协助。荧光标记可以是苝或terrylen。在替代方案中，荧光标记可以是荧光条形码。有利地，该标记可以是光敏的，其中该标记是光激活的和/或光切割一个或多个接头以释放分子负荷物。光激活的分子负荷物可以是主要捕光复合物(LHCII)。在另一个实施例中，荧光标记可以诱导自由基形成。有利地，可以按动态方式独特地标记试剂(参见例如，2012年9月21日提交的美国临时专利申请序列号61/703,884)。这些独特标记实质上至少部分地是核酸，并且可以通过顺序地将两个或更多个可检测寡核苷酸标签附着至彼此来产生，并且每个独特标记可以与单独的试剂相关联。可检测寡核苷酸标签可以是如下寡核苷酸，该寡核苷酸可以通过对其核苷酸序列测序和/或通过检测它可以附着的非核酸可检测部分来检测。寡核苷酸标签可以是借助其核苷酸序列，或借助附着至寡核苷酸的非核酸可检测的部分(如但不限于荧光团)，或借助其核苷酸序列和非核酸可检测部分的组合可检测的。可检测寡核苷酸标签可以包括一个或多个非寡核苷酸可检测部分。可检测部分的实例可以包括但不限于荧光团、微粒子(包括量子点)(恩波多克勒(Empodocles)等人，《自然》(Nature)399:126-130，1999)、金奈米粒子(赖克特(Reichert)等人，《分析化学》(Anal.Chem.)72:6025-6029，2000)、微珠粒(拉科斯特(Lacoste)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)97(17):9461-9466，2000)、生物素、DNP(二硝基苯)、海藻糖、地高辛、半抗原、以及本领域的普通技术人员已知的其他可检测部分。在一些实施例中，这些可检测部分可以是量子点。用于检测此类部分的方法描述于本文中和/或是本领域中已知的。因此，可检测寡核苷酸标签可以是但不限于可以包括独特核苷酸序列的寡核苷酸、可以包括可检测部分的寡核苷酸、以及可以包括独特核苷酸序列和可检测部分两者的寡核苷酸。独特标记可以通过顺序地将两个或更多个可检测寡核苷酸标签附着至彼此来产生。可检测标签可以存在或被提供于多个可检测标签中。可以使用相同或不同的多个标签，因为每个可检测标签的来源可以是独特标记的一部分。换言之，可以将多个标签再分为亚群，并且可以将单亚群用作每个标签的来源。一个或多个其他种类可以与这些标签相关联。具体而言，可以将由裂解的细胞释放的核酸连接到一个或多个标签上。这些可以包括例如染色体DNA、RNA转录物、tRNA、mRNA、线粒体DNA等。除对标签本身测序之外，还可以对此类核酸测序，这可以给出关于这些细胞的核酸谱的信息，这些细胞可以与这些标签相关联，或者对应的液滴或细胞所暴露的条件。
本发明因此可以涉及通过使用作为油包水乳剂的由微流体装置产生的单分散水性液滴来将试剂高通量且高分辨率地递送到单独的乳液滴中，或者可以关于其来实践，这些乳液滴可以包含细胞、细胞器、核酸、蛋白质等。这些液滴被携带在流动的油相中并且通过表面活性剂稳定化。在一个方面，将单细胞或单细胞器或单分子(蛋白质、RNA、DNA)封装进来自水性溶液/分散体的均匀液滴中。在相关方面，可以用多种细胞或多种分子代替单细胞或单分子。体积范围从1pL至10nL的水性液滴充当单独的反应器。可以单轮地对液滴中的104至105个单细胞进行处理和分析。为了利用微液滴进行快速的大规模化学品筛选或复杂的生物文库鉴定，必须在优选条件(例如，混合比、浓度、和组合顺序)下产生和组合不同种类的微液滴，每种包含特定的感兴趣的化学化合物或生物探针、细胞或分子条形码。将来自单独的入口微流体通道的每个种类的液滴引入主微流体通道中的汇合点处。优选地，故意地这样选择液滴体积，使得一个种类大于其他种类并且以不同的速度(通常比其他种类慢)在载流中运动，如在美国公开号US 2007/0195127和国际公开号WO 2007/089541中所披露的，将其各自通过引用以其全文而并入本文。这样选择通道宽度和长度，使得较快种类的液滴赶上最慢的种类。通道的尺寸约束阻止运动较快的液滴越过运动较慢的液滴，使得一连串液滴进入合并区。在将不同类型的种类添加到反应中之前，多步骤化学反应、生化反应、或分析检测化学通常需要固定的反应时间。通过以两个、三个或更多个汇合点(各自具有单独的合并点)将该过程重复多次实现多步骤反应。当来自入口通道的液滴的频率与优化比率匹配并且将种类的体积匹配为在组合的液滴中提供优化的反应条件时，实现高效且精确的反应和反应分析。可以通过改变包含液滴的液体的流动来在本发明的流体系统内对流体液滴进行筛选或分选。例如，在一组实施例中，可以通过将围绕流体液滴的液体引导进第一通道、第二通道等来对该流体液滴进行操纵或分选。在另一组实施例中，可以控制流体系统内的(例如，不同通道内的或通道的不同部分内的)压力以便引导流体液滴的流动。例如，可以将液滴引导朝向通道接点(包括用于进一步引导流动的多个选项)(例如，在限定任选的下游流动通道中，引导朝向分支、或分叉)。可以控制任选的下游流动通道中一个或多个内的压力，以便将液滴选择性地引导进通道之一中，并且压力变化可以受连续液滴到达接点所需的时间指令的影响，这样使得可以独立地控制每个连续液滴的下游流径。在一种安排中，储液器的膨胀和/或收缩可以用于操纵或分选流体液滴进入通道，例如通过引起包含该流体液滴的液体的导向运动。在另一种安排中，可以将储液器的膨胀和/或收缩与其他流动控制装置和方法组合，例如如在本文中描述的。能够引起储液器膨胀和/或收缩的装置的非限制性实例包括活塞。用于使用微流体通道处理液滴的关键要素包括：(1)产生具有正确体积的液滴，(2)以正确的频率产生液滴以及(3)按这样一种方式将样品液滴的第一流与样品液滴的第二流汇集在一起，该方式使得样品液滴的第一流的频率与样品液滴的第二流的频率匹配。优选地，按这样一种方式将样品液滴流与预制的文库液滴流汇集在一起，该方式使得文库液滴的频率与样品液滴的频率匹配。用于以固定频率产生具有均匀体积的液滴的方法是本领域中熟知的。一种方法是使用分散相流体和不互混载流的流体动力学聚焦来产生液滴，如美国公开号US 2005/0172476和国际公开号WO 2004/002627中所披露的。令人希望的是引入在汇合处的种类之一是预制的液滴文库，其中该文库包含多种反应条件，例如，文库可以包含处于一系列浓度的被封装为用于筛选其对细胞或酶的作用的单独文库元素的多种不同化合物，可替代地文库可以由被封装为用于靶向扩增一批座位的不同文库元素的多个不同引物对构成，可替代地文库可以包含被封装为用于进行多种结合测定的不同文库元素的多种不同的抗体种类。通过使用驱动流体将一批预制文库液滴推出小瓶来实现将反应条件文库引入到基板上。驱动流体是连续流体。驱动流体可以包括与载流(例如，氟碳油)相同的物质。例如，如果由十皮升的液滴组成的文库被驱动流体以10,000皮升/秒的速率驱动进微流体基板上的入口通道中，则标称地，预期液滴进入汇合点的频率是1000/秒。然而，在实践中，用缓慢排出的油在它们之间包装液滴。随时间，载流从文库液滴中排出，并且液滴的数量密度(数量/mL)增加。因而，驱动流体的简单固定的输注速率并没有提供液滴进入基板中的微流体通道中的均匀引入速率。此外，文库与文库之间的平均文库液滴体积的变化导致汇合点处的液滴引入频率偏移。因此，由样品变化和排油造成的液滴缺乏一致性提供了有待解决的另一个问题。例如，如果预期标称液滴体积在文库中是10皮升，但是文库与文库之间从9至11皮升变化，则10,000皮升/秒的输注速率将标称地产生频率从900至1,100液滴/秒的范围。简言之，样品与样品之间的在芯片上制作的液滴的分散相的组成的变化、文库液滴的数量密度随时间增加的趋势以及文库与文库之间的平均液滴体积变化严重地限制了通过简单地使用固定的输注速率而使液滴的频率可以可靠地在汇合处匹配的程度。另外，这些限制也对体积可以可重复地组合的程度具有影响。与泵流速精确度的典型变化和通道尺寸的变化结合，没有在轮与轮的基础上进行补偿的手段的系统严重地受限。上述事实不仅说明了有待解决的问题，而且展示了对于对微流体通道内的微液滴进行微流体控制的瞬时调节的方法的需要。必须开发一种或多种表面活性剂和油的组合，以便协助液滴的产生、存储和操作，以维持各异文库的每个液滴内的独特的化学/生物化学/生物学环境。因此，表面活性剂和油组合必须(1)在成滴过程和后续收集和储存期间相对于不受控制的聚并使液滴稳定化，(2)使向油相的任何液滴内容物的和/或液滴之间的运输最小化，以及(3)维持每个液滴的内容物的化学和生物惰性(例如，被封装的内容物在油-水界面处不吸附或不反应，并且对液滴中的生物或化学成分没有不利影响)。除对液滴文库功能和稳定性的要求之外，油包表面活性剂溶液必须与和平台相关的流体物理学和材料相结合。具体地，油溶液必须不会使用于构建微流体芯片的材料膨胀、溶解、或降解，并且油的物理特性(例如，粘度、沸点等)必须适于平台的流动和操作条件。在没有表面活性剂的情况下形成于油中的液滴是不稳定的从而允许聚并，所以必须将表面活性剂溶解于用作乳剂文库的连续相的油中。表面活性剂分子是两亲性的--分子的一部分是油溶性的，并且分子的一部分是水溶性的。当在微流体芯片的喷嘴处(例如在本文描述的入口模块中)形成水-油界面时，溶解于油相中的表面活性剂分子吸附到该界面上。分子的亲水部分留在液滴的内部，并且分子的亲氟部分修饰液滴的外部。当界面被表面活性剂填充时，液滴的表面张力降低，所以乳剂的稳定性得到改善。除使液滴稳定化免于聚并之外，表面活性剂对于每个液滴的内容物而言应该是惰性的，并且表面活性剂不应该促进被封装组分向油或其他液滴的运输。液滴文库可以由以单批地聚池在一起的许多文库元素构成(参见例如，美国专利公开号2010002241)。文库的从单文库元素至1015或更多个文库元素的复杂性可以变化。每个文库元素可以是处于固定浓度的一种或多种给定组分。元件可以是但不限于细胞、细胞器、病毒、细菌、酵母、珠粒、氨基酸、蛋白质、多肽、核酸、多核苷酸或小分子化学化合物。元件可以包含标识符，如标记。术语“液滴文库(droplet library)”或“液滴文库(dropletlibraries)”在本文中也被称为“乳剂文库(emulsion library)”或“乳剂文库(emulsionlibraries)”。这些术语贯穿本说明书可互换地使用。细胞文库元素可以包括但不限于杂交瘤、B-细胞、原代细胞、培养的细胞系、癌细胞、干细胞、获得自组织的细胞、或任何其他细胞类型。通过将从一至成千上万的多个细胞封装在单独的液滴中来制备细胞文库元素。被封装细胞的数目通常由细胞的数量密度和液滴的体积通过泊松统计给出。然而，在一些情况下，数目偏离泊松统计，如在埃德(Edd)等人，“将单细胞受控地封装进单分散皮升滴中(Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitredrops)”.《芯片实验室》(Lab Chip)，8(8):1262-1264，2008中描述的。细胞的离散性允许用多种细胞变体(全部存在于单个起始介质中)大规模地制备文库，并且然后该介质被分解成包含至多一个细胞的单独的液滴胶囊。然后将这些单独的液滴胶囊组合或聚池，以形成由独特的文库元素组成的文库。继封装之后，或在一些实施例中在封装以后，细胞分裂产生克隆性文库元素。基于珠粒的文库元素可以包含给定类型的一种或多种珠粒，并且还可以包含其他试剂，如抗体、酶或其他蛋白质。在所有文库元素包含不同类型的珠粒但包含相同的周围介质的情况下，这些文库元素可以全部制备自单一起始流体或具有多种起始流体。在从一批变体(如经基因组修饰的酵母或细菌细胞)大规模地制备细胞文库的情况下，这些文库元素将制备自多种起始流体。通常令人希望的是当以被工程化为产生蛋白质变体的多种细胞或酵母或细菌起始时，每个液滴恰好具有一个细胞，并且仅有几个液滴包含多于一个细胞。在一些情况下，可以实现远离泊松统计的变化，以便提供增强的液滴加载，这样使得更多的液滴中的每个液滴恰好具有一个细胞，并且存在空液滴或包含多于一个细胞的液滴的极少例外。液滴文库的实例是具有不同内容物的液滴集合，范围从珠粒、细胞、小分子、DNA、引物、抗体。更小的液滴可以是大约毫微微升(fL)体积的液滴，尤其是用液滴分配器考虑这些体积。体积范围可以从约5至约600fL。更大的液滴的尺寸范围从大致0.5微米至500微米(以直径计)，这对应于约1皮升至1纳升。然而，液滴可以小至5微米并且大至500微米。优选地，液滴小于100微米，以直径计约1微米至约100微米。最优选的尺寸是约20至40微米(以直径计)(10至100皮升)。液滴文库的经检查的优选特性包括渗透压平衡、均匀的尺寸、和尺寸范围。本发明的乳剂文库内的液滴可以被包含在不互混油内，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂。在一些实施例中，不互混氟碳油内的含氟表面活性剂可以是由一个或多个全氟化聚醚(PFPE)嵌段和一个或多个聚乙二醇(PEG)嵌段组成的嵌段共聚物。在其他实施例中，含氟表面活性剂是由通过酰胺连接基团共价地结合到两个PFPE嵌段上的PEG中心嵌段组成的三嵌段共聚物。含氟表面活性剂(类似于文库中液滴的均匀尺寸)的存在对于维持液滴的稳定性和完整性而言是关键的，并且对于文库内的液滴用于本文描述的各种生物和化学测定的后续使用而言也是至关重要的。在本文更加详细地描述了可以用于本发明的液滴文库中的流体(例如，水性流体、不互混油等)和其他表面活性剂。本发明因此可以涉及一种乳剂文库，该文库可以包括不互混油(例如，氟碳油)内的多个水性液滴，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，其中每个液滴的尺寸是均匀的并且可以包括相同的水性流体并且可以包括不同的文库元素。本发明还提供了一种用于形成乳剂文库的方法，该方法可以包括提供单水性流体，该流体可以包括不同文库元素；将每个文库元素封装进不互混氟碳油内的水性液滴中，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，其中每个液滴的尺寸是均匀的并且可以包括相同的水性流体并且可以包括不同的文库元素；并且将不互混氟碳油内的水性液滴聚池，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，由此形成乳剂文库。例如，在一种类型的乳剂文库中，可以将所有不同类型的元件(例如，细胞或珠粒)聚池在包含于相同介质中的单个来源中。初步聚池之后，然后将细胞或珠粒封装在液滴中，以产生液滴文库，其中具有不同类型的珠粒或细胞的每个液滴是不同的文库元素。初始溶液的稀释使得能够进行封装过程。在一些实施例中，形成的液滴将包含单细胞或珠粒或将不包含任何东西，即是空的。在其他实施例中，形成的液滴将包含多个拷贝的文库元素。正在被封装的细胞或珠粒通常是相同类型的细胞或珠粒的变体。在另一个实例中，乳剂文库可以包括不互混氟碳油内的多个水性液滴，其中可以将单分子封装，这样使得对于产生的每20-60个液滴(例如，20、25、30、35、40、45、50、55、60个液滴，或之间的任何整数)而言，单分子被包含在液滴内。可以通过将包含分子的溶液稀释到使得能够封装单分子的这样一个低浓度来封装单分子。在一个具体实例中，在孵育两小时之后，以20fM的浓度封装LacZ质粒DNA，这样使得在40个液滴中存在约一个基因，其中每秒以10kHz制备10μm的液滴。这些文库的形成依赖于有限稀释。
本发明还提供了一种乳剂文库，该文库可以包括氟碳油内的至少第一水性液滴和至少第二水性液滴，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，其中该至少第一和该至少第二液滴的尺寸是均匀的并且包括不同的水性流体和不同的文库元素。本发明还提供了一种用于形成乳剂文库的方法，该方法可以包括提供至少第一水性流体，其可以包括元素的至少第一文库；提供至少第二水性流体，其可以包括元素的至少第二文库；将所述至少第一文库的每个元素封装进不互混氟碳油内的至少第一水性液滴中，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂；将所述至少第二文库的每个元素封装进不互混氟碳油内的至少第二水性液滴中，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，其中该至少第一和该至少第二液滴的尺寸是均匀的并且可以包括不同的水性流体和不同的文库元素；并且将不互混氟碳油内的至少第一水性液滴和至少第二水性液滴聚池，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，由此形成乳剂文库。本领域的技术人员应意识到本发明的方法和系统就如本文披露的细胞、突变等而言并不是优选地实践的，而是无需将本发明限于任何具体类型的样品，并且本发明的方法和系统可以与任何类型的有机、无机、或生物分子一起使用(参见例如，美国专利公开号20120122714)。在具体实施例中，样品可以包括核酸靶分子。核酸分子可以是合成的或者源自天然存在的来源。在一个实施例中，核酸分子可以分离自包含多种其他组分(如蛋白质、脂质和非模板核酸)的生物样品。核酸靶分子可以获得自任何细胞材料，获得自动物、植物、细菌、真菌、或任何其他细胞生物体。在某些实施例中，核酸靶分子可以获得自单细胞。用于在本发明中使用的生物样品可以包括病毒粒子或制剂。核酸靶分子可以直接从生物体获得或者从获得自生物体的生物样品获得，例如从血液、尿液、脑脊液、精液、唾液、痰、粪便以及组织。任何组织或体液标本都可以用作用于在本发明中使用的核酸的来源。核酸靶分子还可以分离自培养的细胞，如原代细胞培养物或细胞系。可以用病毒或其他细胞内病原体感染获得靶核酸的细胞或组织。样品还可以是从生物标本中提取的总RNA、cDNA文库、病毒DNA、或基因组DNA。通常，核酸可以通过多种技术从生物样品中提取，如由马尼亚蒂斯(Maniatis)等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，冷泉港，纽约，第280-281页(1982)描述的那些技术。核酸分子可以是单链的、双链的、或具有单链区的双链的(例如，茎结构和环结构)。典型地可以将获得自生物样品的核酸片段化，以产生分析用的适合的片段。可以使用多种机械的、化学的和/或酶的方法将靶核酸片段化或剪切到希望的长度。可以经由声处理(例如Covaris法)，短时暴露于DNA酶，或使用一种或多种限制性内切酶的混合物、或转座酶或切口酶来随机地剪切DNA。可以通过短时暴露于RNA酶，热加镁，或通过剪切来将RNA片段化。可以将RNA转化为cDNA。如果采用片段化处理，则可以在片段化处理之前或之后将RNA转化为cDNA。在一个实施例中，通过声处理将来自生物样品的核酸片段化。在另一个实施例中，通过水力剪切(hydroshear)仪将核酸片段化。通常，单独的核酸靶分子可以是从约40个碱基至约40kb。核酸分子可以是单链的、双链的、或具有单链区的双链的(例如，茎结构和环结构)。可以在存在洗涤剂或表面活性剂的情况下将如本文描述的生物样品均质化或分级。洗涤剂在缓冲液中的浓度可以是约0.05％至约10.0％。洗涤剂的浓度可以达到洗涤剂在溶液中仍可溶的量。在一个实施例中，洗涤剂的浓度在0.1％至约2％之间。洗涤剂(特别是非变性的温和洗涤剂)可以用于溶解样品。洗涤剂可以是离子型的或非离子型的。非离子型洗涤剂的实例包括triton如TritonTMX系列(TritonTMX-100t-Oct-C6H4--(OCH2--CH2)xOH，x＝9-10，TritonTMX-100R，TritonTMX-114x＝7-8)，辛基葡糖苷，聚氧乙烯(9)十二烷基醚，洋地黄皂苷，IGEPALTMCA630辛基苯基聚乙二醇，正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(βOG)，正十二烷基-β，TweenTM.20聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯，TweenTM80聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯，聚多卡醇，正十二烷基β-D-麦芽苷(DDM)，NP-40壬基苯基聚乙二醇，C12E8(八乙二醇正十二烷基单醚)，六乙二醇单正十四烷基醚(C14E06)，辛基-β-硫代吡喃葡萄糖苷(辛基硫代葡萄糖苷，OTG)，Emulgen，以及聚氧乙烯10月桂基醚(C12E10)。离子型洗涤剂(阴离子型或阳离子型)的实例包括脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸钠(SDS)、N-月桂酰肌氨酸、以及十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。两性离子试剂也可以用于本发明的纯化方案中，如Chaps，两性离子3-14、和3-[(3-胆酰胺丙基)二甲铵基]-1-丙烷磺酸盐。还考虑了可以在有或没有另一种洗涤剂或表面活性剂的情况下添加脲。裂解或均质化溶液可以进一步包含其他试剂，如还原剂。此类还原剂的实例包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、DTE、GSH、半胱氨酸、半胱胺、三羧乙基膦(TCEP)、或亚硫酸盐。可以对核酸的大小进行选择，以便除去非常短的片段或非常长的片段。可以使用本领域已知的任何适合的方法将核酸片段分割为可以包括希望的数目的片段的部分。限制每个片段的片段大小的适合的方法是本领域中已知的。在本发明的不同实施例中，片段大小被限为在约10与约100Kb之间或更长。本发明中的或就本发明而言的样品可以包括单独的靶蛋白、蛋白复合物、具有翻译修饰的蛋白、以及蛋白/核酸复合物。蛋白靶标包括肽，并且还包括酶、激素、结构部件(如病毒壳体蛋白)、以及抗体。蛋白靶标可以是合成的或者源自天然存在的来源。本发明的蛋白靶标可以分离自包含多种其他组分(包括脂质、非模板核酸、和核酸)的生物样品。蛋白靶标可以从动物、细菌、真菌、细胞生物体、和单细胞获得。蛋白靶标可以直接从生物体获得或者从获得自该生物体的生物样品获得，包括体液(如血液、尿液、脑脊液、精液)、唾液、痰、粪便以及组织。蛋白靶标还可以从细胞和组织裂解液以及生物化学部分获得。单独的蛋白是分离的多肽链。蛋白复合物包括两条或多肽链。样品可以包括具有翻译后修饰的蛋白质，这些翻译后修饰包括但不限于磷酸化作用、甲硫氨酸氧化、脱酰胺作用、糖基化作用、泛素化作用、氨甲酰化作用、s-羧甲基化作用、乙酰化作用、以及甲基化作用。蛋白/核酸复合物包括交联的或稳定的蛋白-核酸复合物。使用本领域已知的方法进行单独的蛋白、蛋白复合物、具有翻译修饰的蛋白、和蛋白/核酸复合物的提取或分离。
本发明可以因此涉及形成样品液滴。这些液滴是由不互混载流围绕的水性液滴。形成此类液滴的方法示于例如林克(Link)等人(美国专利申请号2008/0014589、2008/0003142、和2010/0137163)、斯托内(Stone)等人(美国专利号7,708,949和美国专利申请号2010/0172803)、安德森(Anderson)等人(美国专利号7,041,481和作为RE41,780的再发行的)以及飞雨科技公司(Raindance Technologies Inc.)的欧洲公开号EP 2047910中，将其各自的内容通过引用以其全文而并入本文。本发明可以涉及用于在高通量微流体系统内操纵液滴的系统和方法。微流体液滴封装分化细胞。该细胞被裂解并且其mRNA被杂交到捕获珠粒上，该捕获珠粒在表面上包含条形码化的寡dT引物，所有引物都在该液滴内。条形码经由柔性多原子接头(像PEG)附着至该捕获珠粒上。在优选实施例中，将液滴通过添加含氟表面活性剂(像全氟辛醇)而破碎，洗涤，并且收集。然后进行逆转录(RT)反应，以将每个细胞的mRNA转化为第一链cDNA，该第一链cDNA不仅被独特地条形码化，而且被共价地连接到mRNA捕获珠粒上。随后，使用用于制备RNA-Seq文库的常规文库制备方案修正经由模板转换反应的通用引物。由于来自任何给定细胞的所有mRNA都被独特地条形码化，对单文库测序并且然后通过计算机解析，以确定哪些mRNA来自哪个细胞。以此方式，通过单测序轮次，可以同时获得成千上万(或更多)的可分辨的转录组。寡核苷酸序列可以产生在珠粒表面上。在这些循环期间，将珠粒从合成柱上去除，聚池，并且按质量计等分成四个相等的部分；然后将这些珠粒等分部分放在单独的合成柱中并且与dG、dC、dT、或dA亚磷酰胺反应。在其他实例中，使用更大长度的二核苷酸、三核苷酸、或寡核苷酸；在其他实例中，用基因特异性寡核苷酸代替寡-dT尾，以引发特异性靶标(单数的或复数的)，即用于捕获所有或特异性RNA的任何长度的随机序列。对于总数412＝16,777,216个独特条形码序列，将这个过程重复12次。在这些循环完成之后，在所有珠粒上进行8个循环的简并寡核苷酸合成，随后进行30个循环的dT添加。在其他实施例中，简并合成被省略，缩短(少于8个循环)，或延长(多于8个循环)；在其他实施例中，用基因特异性引物(单个靶标或许多靶标)或简并序列代替30个循环的dT添加。上述微流体系统被视为本发明的试剂递送系统微流体文库打印机或液滴文库打印系统。形成作为样品流体的液滴，该样品流体从包含裂解试剂和条形码的液滴发生器通过包含油的微流体出口通道流向接点。按需要将加载的试剂乳剂的限定体积(对应于液滴的限定数目)分配进载流的流动流中。样品流体可以典型地包括水性缓冲溶液，如超纯水(例如，通过例如柱色谱法获得的18兆欧电阻率超纯水)、10mM Tris HCl和1mM EDTA(TE)缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)或乙酸盐缓冲液。可以使用与核酸分子生理相容的任何流体或缓冲液。载流可以包括与样品流体不互混的载流。载流可以是非极性溶剂、癸烷(例如，十四烷或十六烷)、氟碳油、硅油、惰性油(如烃)、或另一种油(例如，矿物油)。载流可以包含一种或多种添加剂，如降低表面张力的试剂(表面活性剂)。表面活性剂可以包括Tween、Span、含氟表面活性剂、以及相对于水在油中可溶的其他试剂。在一些应用中，通过向样品流体中添加第二表面活性剂来改善性能。表面活性剂可以帮助控制或优化液滴尺寸、流动和一致性，例如通过减小将液滴挤出或注入进交叉通道中所需的剪切力。这可以影响液滴体积和周期性，或液滴断开进入交叉通道中的速率或频率。此外，表面活性剂可以用于稳定化氟化油中的水性乳剂免于聚并。液滴可以由表面活性剂围绕，该表面活性剂通过降低水油界面处的表面张力而使液滴稳定化。可以添加到载流中的优选表面活性剂包括但不限于以下表面活性剂，如基于脱水山梨糖醇的羧酸酯(例如，“Span”表面活性剂，Fluka Chemika公司)，包括脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Span 20)、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯(Span 40)、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Span 60)和脱水山梨糖醇单油酸酯(Span 80)；以及全氟化聚醚(例如，杜邦(DuPont)Krytox 157 FSL、FSM、和/或FSH)。可以使用的非离子型表面活性剂的其他非限制性实例包括聚氧乙烯化烷基酚例如，壬基酚、对十二烷基酚、和二壬基酚)、聚氧乙烯化直链醇、聚氧乙烯化聚丙二醇、聚氧乙烯化硫醇、长链羧酸酯(例如，天然脂肪酸、丙二醇、山梨糖醇的甘油和聚甘油酯、聚氧乙烯化山梨糖醇酯、聚乙二醇酯等)以及烷醇胺(例如，二乙醇胺-脂肪酸缩合物和异丙醇胺-脂肪酸缩合物)。在一些情况下，用于经由微流体系统产生单细胞测序文库的仪器提供了体积驱动的流动，其中随时间注入恒定的体积。流体通道中的压力随注入速率和通道尺寸而变化。在一个实施例中，该装置提供了油/表面活性剂入口；分析物入口；过滤器，mRNA捕获微珠粒和裂解试剂入口；载流通道，其连接这些入口；电阻器；夹断液滴的收缩；混合器；以及液滴出口。在实施例中，本发明提供了一种用于经由微流体系统产生单细胞测序文库的仪器，该仪器可以包括：油-表面活性剂入口，其可以包括过滤器和载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；分析物入口，其可以包括过滤器和载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；mRNA捕获微珠粒和裂解试剂入口，其可以包括过滤器和载流通道，其中所述载流通道可以进一步包括电阻器；所述载流通道具有在其中以可调或预定的流速流动的载流；其中每个所述载流通道在接点处合并；并且所述接点被连接至混合器上，该混合器包含滴出口。因此，设想了一种用于经由微流体系统、针对单细胞RNA-seq的微流体流动方案产生单细胞测序文库的仪器。两个通道(一个携带细胞悬浮液，并且另一个携带独特地条形码化的mRNA捕获珠粒、裂解缓冲液和文库制备试剂)在接点处相遇并且立即以每滴一个细胞和一个珠粒的速率被共封装进惰性载油中。在每滴中，使用珠粒的条形码标记的寡核苷酸作为cDNA模板，将每个mRNA用独特的细胞特异性标识符进行标记。本发明还涵盖小鼠和人类细胞混合物的Drop-Seq文库的用途。可以使载流流动通过出口通道，这样使得载流中的表面活性剂覆盖通道壁的表面。可以通过使全氟化聚醚杜邦Krytox 157 FSL、FSM、或FSH与氢氧化铵水溶液在挥发性氟化溶剂中反应来制备含氟表面活性剂。可以用旋转蒸发器去除溶剂以及残留的水和氨水。然后可以将表面活性剂溶解(例如，2.5wt％)于氟化油(例如，Flourinert(3M))中，这然后充当载流。启动样品流体储器以产生统治(regent)液滴是基于经由按需功能的动态试剂递送(例如，组合条形码技术)的概念。这种按需特征可以通过多种技术能力之一来提供，以便释放多个递送液滴至一个原始液滴，如本文描述的。通过本披露和本文引用的文献以及本领域的知识，制定流速、通道长度、和通道几何学；以及建立包含随机或指定试剂组合的液滴在熟练人员的范畴内，这些液滴可以按需产生并且与包含感兴趣的样品/细胞/底物的“反应室”液滴合并。通过将多种独特标签掺入另外的液滴中并且将这些标签与被设计成对原始液滴具有特异性的固体支持物连接，可以对原始液滴所暴露的条件进行编码和记录。例如，可以将核酸标签顺序地连接，以产生反映条件及其顺序的序列。可替代地，可以将标签独立地添加、附到固体支持物上。可以用于通过生物信息学记录信息的动态标记系统的非限制性实例可以发现于2012年9月21日和2012年11月29日提交的标题为“用于独特标记试剂的组合物和方法(Compositions and Methods for Unique Labeling of Agents)”的美国临时专利申请。以此方式，两个或更多个液滴可以暴露于多种不同条件，其中每次一个液滴暴露于一种条件，向该液滴(各自连接在一起)中或向与该液滴相关的独特固体支持物中添加编码该条件的核酸，这样使得即使稍后将具有不同历史的液滴组合，这些液滴中每者的条件仍可通过不同的核酸获得。用于评价对暴露于多种条件的响应的方法的非限制性实例可以发现于2012年9月21日提交的标题为“用于液滴标记的系统和方法(Systems and Methods forDroplet Tagging)”的美国临时专利申请。因此，在本发明中或就本发明而言，设想的是可以独立于感兴趣的各种化合物(药物、小分子、siRNA、CRISPR指导RNA、试剂等)的受控递送或与其一致地动态地产生分子条形码(例如，DNA寡核苷酸、荧光团等)。例如，可以在一个喷嘴阵列中产生独特的分子条形码，同时可以通过另一个喷嘴阵列产生单独的化合物或化合物组合。然后可以将感兴趣的条形码/化合物与包含细胞的液滴合并。保存计算机日志文件形式的电子记录，以便将递送的条形码与递送的一种或多种下游试剂相关联。这种方法使得有可能有效地筛选大的细胞群，用于如单细胞药物筛选、调节途径的受控扰动等的应用。所披露发明的装置和技术有助于努力进行需要在单细胞(或单分子)水平上并且以成本有效方式进行数据分解的研究。本发明设想了通过使用作为油包水乳剂的在微流体芯片上逐个产生的单分散水性液滴来将试剂高通量且高分辨率地递送到单独的乳液滴中，这些乳液滴可以包含细胞、核酸、蛋白质等。能够在生命周期实验过程中动态地追踪单独的细胞和液滴治疗/组合，并且具有按需产生乳液滴文库的能力与通过所披露的一种或多种方法进一步操纵液滴的功能是有利的。在本发明的实践中，可以动态地追踪液滴并且创建基于单细胞环境中的液滴部署和应用历史。根据本发明的所披露实施例，经由动态索引策略并且按受控方式进行液滴产生和部署。可以按每秒几千个液滴的高效率对微液滴进行处理、分析和分选，从而提供允许在疾病的生物机制细胞模型中，或在生物化学、或药理学测定中快速筛选数以百万计的不同的化合物、生物探针、蛋白质或细胞的强大平台。考虑了多种生物测定以及生物合成。考虑了聚合酶链式反应(PCR)(参见例如，美国专利公开号20120219947)。本发明的方法可以用于合并进行任何类型的化学反应或任何类型的生物测定用的样品流体。可以在液滴中合并用于进行扩增反应的样品流体。扩增是指产生核酸序列的另外的拷贝，并且通常使用聚合酶链式反应或本领域熟知的其他技术来进行(例如，迪芬巴赫(Dieffenbach)和戴乌科斯尔(Dveksler)，《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer,aLaboratory Manual)，冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)，普莱恩维尤，纽约[1995])。扩增反应可以是本领域已知的扩增核酸分子的任何扩增反应，如聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应、聚合酶链式反应-单链构象多态性、连接酶链式反应(巴拉尼(Barany)F.(1991)PNAS 88:189-193；巴拉尼F.(1991)PCR方法与应用(PCR Methods andApplications)1:5-16)、连接酶检测反应(巴拉尼F.(1991)PNAS 88:189-193)、链置换扩增限制性片段长度多态性、基于转录的扩增系统、基于核酸序列的扩增、滚环扩增、以及超支化滚环扩增。在某些实施例中，扩增反应是聚合酶链式反应。聚合酶链式反应(PCR)是指K.B.穆利斯(Mullis)(美国专利号4,683,195和4,683,202，通过引用而特此结合)的用于在不进行克隆或纯化的情况下增加靶序列区段在基因组DNA混合物中的浓度的方法。用于扩增靶序列的过程包括向包含希望的靶序列的DNA混合物中引入过量的寡核苷酸引物，随后在存在DNA聚合酶的情况下对精确序列进行热循环。这些引物与双链靶序列的其对应的链互补。为了实现扩增，将引物退火到靶分子内的其互补序列上。退火之后，将引物用聚合酶延伸，以便形成一对新的互补链。可以将变性、引物退火和聚合酶延伸步骤重复许多次(即，变性、退火和延伸构成一个循环；可以存在许多个循环)，以获得高浓度的希望的靶序列的经扩增区段。希望的靶序列的经扩增区段的长度是由引物相对于彼此的相对位置决定的，并且因此，这个长度是可控的参数。用于在液滴中进行PCR的方法示于例如林克(Link)等人(美国专利申请号2008/0014589、2008/0003142、和2010/0137163)、安德森(Anderson)等人(美国专利号7,041,481和作为RE41,780的再发行的)以及飞雨科技公司的欧洲公开号EP2047910中，将其各自的内容通过引用以其全文而并入本文。第一样品流体包含核酸模板。如上描述的形成第一样品流体的液滴。那些液滴将包括核酸模板。在某些实施例中，液滴将仅包括单核酸模板，并且因此可以进行数字PCR。第二样品流体包含用于PCR反应的试剂。此类试剂通常包括Taq聚合酶，类型A、C、G和T生物脱氧核苷酸，氯化镁，以及正向引物和反向引物，全部悬浮于水性缓冲液内。第二流体还包括用于检测经扩增靶核酸的可检测地标记的探针，其细节在下文讨论。试剂在两种样品流体之间的这种类型的分段并不是唯一的可能性。在一些实例中，第一样品流体将包括一些或所有PCR所需的试剂，而第二样品流体将包含剩余的PCR所需的试剂连同检测探针。可以通过多种方法来制备引物，包括但不限于克隆适当的序列以及使用本领域中熟知的方法的直接化学合成(纳朗(Narang)等人，《酶学方法》(Methods Enzymol.)，68:90(1979)；布朗(Brown)等人，《酶学方法》，68:109(1979))。引物还可以获得自商业来源，如操纵子科技公司(Operon Technologies)、阿莫仙法玛西亚生物技术公司(Amersham Pharmacia Biotech)、西格玛公司(Sigma)、以及生命技术公司(Life Technologies)。引物可以具有相同的解链温度。可以在5’端或3’端延长或缩短引物的长度，以产生具有希望的解链温度的引物。而且，可以这样设计每个引物对的退火位置，使得这些引物对的序列和长度产生希望的解链温度。用于确定小于25个碱基对的引物的解链温度的最简单的等式是华莱士法则(Td＝2(A+T)+4(G+C))。计算机程序也可以用于设计引物，包括但不限于阵列设计软件(Arrayit公司)、用于遗传分析的寡核苷酸探针序列设计软件(奥林巴斯光学工业株式会社(Olympus Optical Co.))、NetPrimer、以及来自日立软件工程公司(Hitachi Software Engineering)的DNAsis。使用软件程序(如可获得自英杰公司(Invitrogen Corp.)的Oligo Design)计算每个引物的TM(解链或退火温度)。
然后根据上文描述的本发明的方法使包含核酸的液滴与第二流体中的PCR试剂合并，从而产生包括Taq聚合酶、类型A、C、G和T的脱氧核苷酸、氯化镁、正向引物和反向引物、可检测地标记的探针、以及该靶核酸的液滴。一旦已经产生混合的液滴，便对液滴进行热循环，从而扩增每个液滴中的靶核酸。可以使液滴流动通过加热与冷却线之间的蜿蜒路径中的通道，以便控制液滴中的核酸。可以调整通道的宽度和深度，以设置每个温度下的停留时间，其可以被控制在不到1秒与数分钟之间的任何处。三个温度区可以用于扩增反应。控制这三个温度区，以使得双链核酸变性(高温区)、引物退火(低温区)、和单链核酸扩增以产生双链核酸(中间温度区)。这些区内的温度落入本领域中熟知的用于进行PCR反应的范围内。参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人(《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第3版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，冷泉港，纽约，2001)。可以将这三个温度区控制为具有如下温度：95℃(TH)、55℃(TL)、72℃(TM)。使制备好的样品液滴以受控速率流动通过通道。在热循环之前，样品液滴首先穿过预变性区(TH)。初始预热是用以保证样品液滴内的核酸在热循环之前已经成功变性的扩展区。对预热区的需要以及所需的变性时长依赖于有待在反应中使用的化学。使样品穿入到大约95℃的高温区中，在这里样品在称作变性的过程中首先被分离为单链DNA。然后使样品流到大约55℃的低温区中，在这里进行杂交过程，在此期间使引物退火到样品的互补序列上。最后，随着样品流动通过大约72℃的第三中等温度区，当引物通过耐热酶沿着DNA的单链延伸时，发生聚合酶过程。当它们流动通过通道时，当液滴穿过每个热循环时，核酸经历相同的热循环和化学反应。可通过扩展热区而容易地改变装置中的循环总数。当它穿过完整热装置的N个扩增循环时，样品经历相同的热循环和化学反应。在其他方面，将温度区控制为达到用于PCR反应的两个单独的温度区。在某些实施例中，将这两个温度区控制为具有如下温度：95℃(TH)和60℃(TL)。在进入热循环之前，使样品液滴任选地流动通过初始预热区。预热区对于激活用的一些化学而言可以是重要的，并且对于保证液滴中的双链核酸在热循环反应开始之前已完全变性而言也可以是重要的。在示例性实施例中，预热停留长度使得对液滴在较高温度下预热大约10分钟。样品继续进入大约95℃的高温区中，在这里样品在称作变性的过程中首先被分离为单链DNA。然后使样品流动通过装置到大约60℃的低温区中，在这里进行杂交过程，在此期间使引物退火到样品的互补序列上。最后，当引物通过耐热酶沿着DNA的单链延伸时，发生聚合酶过程。当它穿过完整装置的每个热循环时，样品经历相同的热循环和化学反应。可通过扩展块长和管件而容易地改变装置中的循环总数。扩增之后，可以使液滴流到检测模块中，用于检测扩增产物。可以使用本领域已知的任何方法来单独地分析和检测液滴，如检测报告子的存在或量。通常，检测模块与一个或多个检测仪器是联通的。检测仪器可以是光学或电学检测器或其组合。适合的检测仪器的实例包括光波导、显微镜、二极管、光刺激装置(例如，激光器)、光电倍增管、和处理器(例如，计算机和软件)、及其组合，其配合以检测代表特征、标记、或报告子的信号，以及以确定和指导测量或分选模块处的分选作用。检测液滴中的扩增产物的检测模块和方法的另外的描述示于林克(Link)等人(美国专利申请号2008/0014589、2008/0003142、和2010/0137163)以及飞雨科技公司的欧洲公开号EP 2047910中。
测定的实例还是ELISA测定(参见例如，美国专利公开号20100022414)。本发明提供了另一种乳剂文库，该文库可以包括不互混氟碳油内的多个水性液滴，该油可以包括至少一种含氟表面活性剂，其中每个液滴的尺寸是均匀的并且可以包括至少第一抗体、和连接到至少第二抗体上的单元素，其中所述第一和第二抗体是不同的。在一个实例中，每个文库元素可以包括不同的珠粒，其中每个珠粒附着到多个抗体上并且珠粒被封装在溶液中的包含不同抗体的液滴内。然后可以允许这些抗体形成“ELISA三明治”，可以将其洗涤和制备用于ELISA测定。另外，液滴的这些内容物可以被改变成对包含于其中的抗体具有特异性，以将测定的结果最大化。单细胞测定也被考虑为本发明的一部分(关于微流体用于测定单独细胞的应用概述，参见例如瑞安(Ryan)等人，《生物微流体》(Biomicrofluidics)5，021501(2011))。单细胞测定可以被考虑为一项实验，当可以精确地控制单独细胞与其环境的相互作用或该细胞可以在检查中与功能或特性分离时，该实验量化该细胞的该功能或特性。单细胞测定的研究和发展在很大程度上以如下概念为基础，即遗传变异引起疾病并且小的细胞亚群代表疾病起源。测定从细胞分泌的化合物、亚细胞组分、细胞-细胞或细胞药物相互作用的方法以及模式化单独细胞的方法也被考虑在本发明内。
这些和其他技术可以用于本发明的实践中或就本发明的实践而言来采用。
实例1：材料和方法
简言之，在18个时间点(0.5小时至72天)在Th17条件(IL-6，TGF-β1)或对照(Th0)下使用昂飞公司(Affymetrix)微阵列HT_MG-430A测量基因表达谱。差异性表达的基因是使用四种推断方法的共有部分而检测的，并且使用k-均值与自动衍生的k对这些基因进行聚簇。通过寻找在调节物的推定靶标(例如，基于ChIPseq)与靶基因的簇(使用四个聚簇方案)之间的显著(p<5*10-5和倍数富集>1.5)重叠来推断时序调节相互作用。扰动的候选物是使用基于网络和基于表达的特征而字典式排序的。使用SiNW针对siRNA递送进行扰动。以下更详细地描述了这些方法。
小鼠：C57BL/6野生型(wt)，Mt-/-、Irf1-/-、Fas-/-、Irf4fl/fl和Cd4Cre小鼠获得自杰克逊实验室(Jackson Laboratory)(巴尔港，缅因州)。Stat1-/-和129/Sv对照小鼠购自泰康利公司(Taconic)(哈得逊(Hudson)，纽约)。IL-12rβ1-/-小鼠是由来自拉什大学医学中心(Rush University Medical Center)的帕汗·卡里帕达(Pahan Kalipada)博士提供的。IL-17Ra-/-小鼠是由来自路易斯安那州立大学/匹兹堡大学(Louisiana StateUniversity/University of Pittsburgh)的杰伊·科尔斯(Jay Kolls)博士提供的。Irf8fl/fl小鼠是由来自美国国立卫生研究院的大里惠子(Keiko Ozato)博士提供的。使Irf4fl/fl和Irf8fl/fl小鼠都与Cd4Cre小鼠杂交，以产生Cd4CrexIrf4fl/fl和Cd4CrexIrf8fl/fl小鼠。所有动物都容纳并且维持在波士顿的哈佛医学研究所(Harvard Institute ofMedicine)的常规无病原体设施中，MA(IUCAC方案：0311-031-14(VKK)和0609-058015(AR))。所有实验是根据由哈佛医学学校(波士顿，MA)的哈佛医学院动物常务委员会(Harvard Medical Area Standing Committee on Animals)概述的指南进行的。此外，来自Mina-/-小鼠的脾是由来自圣裘德儿童研究医院(St.Jude Children’s ResearchHospital)(IACUC方案：453)的马克·比克斯(Mark Bix)博士提供的。Pou2af1-/-小鼠获得自罗伯特·罗德(Robert Roeder)博士的实验室(金姆(Kim)，U.等人.B-细胞-特异性转录辅激活子OCA-B/OBF-1/Bob-1对于免疫球蛋白同种型的正常产生是必需的(The B-cell-specific transcription coactivator OCA-B/OBF-1/Bob-1is essential for normalproduction of immunoglobulin isotypes).《自然》(Nature)383，542-547，doi:10.1038/383542a0(1996))。野生型和Oct1-/-胎儿肝脏是在E12.5日获得并且移植到如先前描述的经亚致死辐照的Rag1-/-小鼠体内(王(Wang)，V.E.、唐坦(Tantin)，D.、陈(Chen)，J.&夏普(Sharp)，P.A.在Oct-1-缺陷小鼠中的B细胞发育和免疫球蛋白转录(B cell developmentand immunoglobulin transcription in Oct-1-deficient mice).《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)101，2005-2010，doi:10.1073/pnas.0307304101(2004))(IACUC方案：11-09003)。
在皮氏培养皿中进行细胞分选和体外T-细胞分化：将Cd4+T细胞使用抗-CD4微珠从脾和淋巴结进行纯化(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech))，然后在室温下在有1％FCS的PBS中用抗-Cd4-PerCP、抗-Cd62l-APC、以及抗-Cd44-PE抗体(所有都属生物传奇公司(Biolegend)，加利福尼亚州)染色20分钟。
使用BD FACSAria细胞分选仪对天然Cd4+Cd62l高Cd44低T细胞进行分选。将分选的细胞在存在细胞因子的情况下用板结合的抗-Cd3(2μg/ml)以及抗-Cd28(2μg/ml)激活。对于Th17分化：2ng/mL rhTGF-β1(美天旎公司(Miltenyi Biotec))、25ng/mL rmIl-6(美天旎公司(Miltenyi Biotec))、20ng/ml rmIl-23(美天旎公司(Miltenyi Biotec))、以及20ng/ml rmIL-β1(美天旎公司(Miltenyi Biotec))。将细胞培养0.5-72小时并且收获用于RNA，细胞内细胞因子染色，以及流式细胞术。
流式细胞术和细胞内细胞因子染色(ICC)：将分选的天然T细胞在通过用抗体染色检测之前用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(50ng/ml，西格玛-奥德里奇(Sigma-aldrich)，MO)、伊屋诺霉素(1μg/ml，西格玛-奥德里奇，MO)以及含有莫能星(Golgistop)(BD生物科学公司(BD Biosciences))的一种蛋白质运输抑制物刺激四小时。将表面标记在室温下在有1％FCS的PBS中染色20分钟，然后随后将细胞固定在Cytoperm/Cytofix(BD生物科学公司)中，用透化/洗涤缓冲液(Perm/Wash Buffer)(BD生物科学公司)透化并且用生物传奇公司(Biolegend)轭合抗体即布瑞安紫罗兰(Brillian Violet)650TM抗小鼠IFN-γ(XMG1.2)和别藻蓝素–抗-IL-17A(TC 11-18H10.1)染色，稀释于如所说明的透化/洗涤缓冲液(贝特泰利(Bettelli)，E.等人.用于产生病原性效应子TH17和调节性T细胞的互惠发展途径(Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogeniceffector TH17 and regulatory T cells).《自然》(Nature)441，235-238(2006))(图5，图16)。为了测量RORγt蛋白表达的时程，使用了一种藻红蛋白轭合的抗-类视黄醇相关的孤儿受体Y(B2D)，也来自e生物科学公司(eBiosciences)(图16)。用于来自敲除小鼠的细胞的FOXP3染色是由e生物科学公司(eBiosciences)根据它们的“针对细胞内(核)蛋白质的一步方案(Onestep protocol for intracellular(nuclear)proteins)”用FOXP3染色试剂盒(00-5523-00)进行的。使用FACS Calibur或LSR II(都属BD生物科学公司)收集数据，然后使用流式Jo软件(Flow Jo software)(Treestar)分析(阿瓦斯蒂(Awasthi)，A.等人.白细胞介素27在产生白细胞介素10-产生抗炎T细胞上的主导功能(A dominant function forinterleukin27in generating interleukin 10-producing anti-inflammatory Tcells).《自然免疫学》(Nature immunology)8，1380-1389，doi:10.1038/ni1541(2007)；阿瓦斯蒂(Awasthi)，A.等人.切缘:IL-23受体gfp报告基因小鼠揭示IL-17-产生细胞的不同群体(Cutting edge:IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinctpopulations of IL-17-producing cells).《免疫学杂志》(J Immunol)182，5904-5908，doi:10.4049/jimmunol.0900732(2009))。
使用酶联免疫吸附测定(ELISA)对细胞因子分泌的定量：如上所述培养来自敲除小鼠和其野生型对照的天然T细胞，在72h之后收集它们的上清液，并且根据制造商的说明书，通过ELISA(来自BD生物科学公司的用于IL-17和IL-10的抗体)或通过用于指定的细胞因子的细胞计数珠粒阵列(BD生物科学公司)测定细胞因子浓度(图5，图16)。
微阵列数据：天然T细胞分离自WT小鼠，并且用IL6和TGF-β1处理。使用昂飞公司(Affymetrix)微阵列HT_MG-430A在18个不同时间点测量所得mRNA水平(0.5h–72h；图1b)。此外，在五个时间点(50–72h)对最初用IL-6，TGF-β1处理并且在48小时之后添加IL-23的细胞进行图谱绘制。作为对照，使用了在Th0条件下刺激的时间-和培养-匹配的WT天然T细胞。在十八个时间点中八个(1小时、2小时、10小时、20小时、30小时、42小时、52小时、60小时)处以高再现性(r2>0.98)测量生物重复品。为了进一步确认，将分化时程与Th17细胞和天然T细胞的公开微阵列数据进行比较(威(Wei)，G.等人于《免疫》(Immunity).第30卷155-167(2009))(图6c)。在另外一个数据集中，天然T细胞分离自WT和Il23r-/-小鼠，并且用IL-6，TGF-β1以及IL-23处理，并且在四个不同时间点(49小时、54小时、65小时、72小时)进行图谱绘制。使用RMA算法随后分位数标准化来预处理表达数据(赖希(Reich)，M.等人.基因模式2.0(GenePattern 2.0).《自然遗传学》(Nature genetics)38，500-501，doi:10.1038/ng0506-500(2006))。
检测差异性表达的基因：使用四种方法发现差异性表达的基因(比较于Th0对照)：(1)倍数变化。在至少两个时间点过程中需要2倍变化(向上或向下)。(2)多项式拟合。使用了被设计以鉴定在时程数据上的差异性表达的EDGE软件(斯托里(Storey)，J.、箫(Xiao)，W.、利克(Leek)，J.、汤普金斯(Tompkins)，R.&戴维斯(Davis)，R.于《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)第102卷12837(2005)；利克(Leek)，J.T.、蒙森(Monsen)，E.、达布尼(Dabney)，A.R.&斯托里(Storey)，J.D.EDGE：差异性基因表达的提取和分析(EDGE:extraction and analysis of differential gene expression).《生物信息学》(Bioinformatics)22，507-508，doi:10.1093/bioinformatics/btk005(2006))，阈值为q-值≤0.01。(3)S形拟合。使用了类似于EDGE而用S形函数代替多项式的一种算法，这对于时程基因表达数据建模常常是更充足的(切奇克(Chechik)，G.&科勒(Koller)，D.应答于环境变化的基因表达的定时(Timing of gene expression responses to environmentalchanges).《计算生物学杂志》(J Comput Biol)16，279-290，doi:10.1089/cmb.2008.13TT10.1089/cmb.2008.13TT[pii](2009))。阈值为q-值≤0.01。(4)使用ANOVA。通过如下对基因表达进行建模：时间(仅使用其中存在多于一个重复的时间点)和处理(“TGF-β1+IL-6”或“Th0”)。该模型独立地考虑到每个变量，连同它们的相互作用。报告了其中指定具有超过0.01的FDR阈值的处理参数或相互作用参数的p-值的情况。
总的来说，观察到这些方法之间的实质重叠(任何方法对之间82％的平均值)。基因的差异性表达得分被定义为检测到它的测试的数目。作为差异性表达的基因，报告了具有>3的差异性表达得分的情况。
对于Il23r-/-时程(相比于WT T细胞)，使用方法1.3(上文)。在此，使用1.5的倍数变化截断值，并且报告了由至少两个测试检测到的基因。
聚簇：基于它们的时程表达数据，考虑了对差异性表达的基因进行分组的若干方式：(1)对于每个时间点，定义了两个组：相对于Th0细胞(a)过表达的所有基因以及(b)低表达的所有基因(参见下文)；(2)对于每个时间点，比较于以前的时间点，定义了两个组：(a)诱导的所有基因以及(b)受阻遏的所有基因；(3)仅使用Th17极化条件的K-均值聚簇。使用了最小的k，使得簇内相似性(具有簇重心的平均皮尔逊相关)对于所有簇高于0.75；以及(4)使用Th0和Th17谱的浓度的K均值聚簇。
对于方法(1，2)，为了决定是否要包括一个基因，考虑了其原始mRNA表达谱(Th0，Th17)和其作为S形函数的近似值(切奇克(Chechik)，G.&科勒(Koller)，D.应答于环境变化的基因表达的定时(Timing of gene expression responses to environmentalchanges).《计算生物学杂志》(J Comput Biol)16，279-290，doi:10.1089/cmb.2008.13TT10.1089/cmb.2008.13TT[pii](2009))(因此过滤瞬态波动)。需要倍数变化水平(相比于Th0(方法1)或先前时间点(方法2))超过定义为以下三个值的最小值的截断值：(1)1.7；(2)跨所有时间点的倍数变化的直方图的平均+std；或(3)跨所有时间点的最大倍数变化。用方法4获得呈现在图1b中的簇。
调节网络推断：Th17分化的潜在调节物通过以下进行鉴别：计算它们的推定靶标和根据上文方法1-4分组的差异性表达基因的集合之间的重叠。装配了来自若干来源的调节物-靶标关联：(1)298个转录调节物的体内DNA结合谱(典型地在其他细胞中测量的)(林哈特(Linhart),C.、霍尔珀林(Halperin)，Y.&沙米尔(Shamir)，R.转录因子和微小RNA基序发现:阿玛迪斯平台和后生动物靶集合的纲要(Transcription factor and microRNAmotif discovery:the Amadeus platform and a compendium of metazoan targetsets).《基因组研究》(Genome research)18，1180-1189，doi:10.1101/gr.076117.108(2008)；郑(Zheng)，G.等人.ITFP：哺乳动物转录因子的整合平台(ITFP:an integratedplatform of mammalian transcription factors).《生物信息学》(Bioinformatics)24，2416-2417，doi:10.1093/bioinformatics/btn439(2008)；威尔逊(Wilson)，N.K.等人.血液干细胞/祖细胞中的组合转录控制：十个主要转录调节物的全基因组分析(Combinatorial transcriptional control in blood stem/progenitor cells:genome-wide analysis of ten major transcriptional regulators).《细胞干细胞》(Cell StemCell)7，532-544，doi:S1934-5909(10)00440-6[pii]10.1016/j.stem.2010.07.016(2010)；拉赫曼(Lachmann)，A.等人，于《生物信息学》(Bioinformatics)卷26 2438-2444(2010)；利伯索恩(Liberzon)，A.等人.分子标签数据库(Molecular signaturesdatabase)(MSigDB)3.0.《生物信息学》(Bioinformatics)27，1739-1740，doi:10.1093/bioinformatics/btr260(2011)；江(Jiang)，C.、宣(Xuan)，Z.、赵(Zhao)，F.&张(Zhang)，M.TRED：转录调节元件数据库、新的条目和其他发展(TRED:a transcriptionalregulatory element database，new entries and other development).《核酸研究》(Nucleic Acids Res)35，D137-140(2007))；(2)对11种调节蛋白的敲除的转录应答(阿瓦斯蒂(Awasthi)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol)2009；施拉姆尔(Schraml)，B.U.等人.AP-1转录因子Batf控制T(H)17分化(The AP-1transcription factor Batf controls T(H)17differentiation).《自然》(Nature)460，405-409，doi:nature08114[pii]10.1038/nature08114(2009)；施(Shi)，L.Z.等人.HIF1α-依赖性糖酵解途径协调一个代谢检验点用于TH17和Treg细胞的分化(HIF1alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates ametabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells).《实验医学杂志》(The Journal of experimental medicine)208，1367-1376，doi:10.1084/jem.20110278(2011)；杨(Yang)，X.P.等人.通过STAT3和STAT5的直接的互相作用对编码IL-17的基因座的相对调节(Opposing regulation of the locus encoding IL-17through direct，reciprocal actions of STAT3and STAT5).《自然免疫学》(Natureimmunology)12，247-254，doi:10.1038/ni.1995(2011)；杜兰特(Durant)，L.等人.转录因子STAT3的不同靶标促进T细胞病原性和稳态(Diverse Targets of the TranscriptionFactor STAT3Contribute to T Cell Pathogenicity and Homeostasis).《免疫》(Immunity)32，605-615，doi:10.1016/j.immuni.2010.05.003(2010)；扎克斯(Jux),B、卡多(Kadow)，S.&埃塞尔(Esser)，C.郎罕氏细胞成熟和接触过敏性在芳基烃受体-无效小鼠中受损(Langerhans cell maturation and contact hypersensitivity are impairedin aryl hydrocarbon receptor-null mice).《免疫学杂志》(Journal of immunology)(巴尔的摩，Md.:1950)182，6709-6717，doi:10.4049/jimmunol.0713344(2009)；阿米特(Amit)，I.等人.介导病原体应答的一种哺乳动物转录网络的无偏重建(Unbiasedreconstruction of a mammalian transcriptional network mediating pathogenresponses).《科学》(Science)326，257-263，doi:10.1126/science.1179050(2009)；肖(Xiao)，S.等人.通过增强TGF-β-驱动的Smad3信号传导和抑制IL-6和IL-23受体表达，视黄酸增加Foxp3+调节T细胞并且抑制Th17细胞的发育(Retinoic acid increases Foxp3+regulatory T cells and inhibits development of Th17 cells by enhancing TGF-beta-driven Smad3 signaling and inhibiting IL-6 and IL-23 receptorexpression).《免疫学杂志》(J Immunol)181，2277-2284，doi:181/4/2277[pii](2008))；(3)通过应用Ontogenet算法获得的另外的潜在相互作用(约基奇(Jojic)等人，在审议中；调节模型可获得于:来自小鼠ImmGen联盟的数据(2010年1月发布(横(Heng)，T.S.&佩因特(Painter)，M.W.免疫学基因组项目:在免疫细胞中基因表达的网络(The ImmunologicalGenome Project:networks of gene expression in immune cells).《自然免疫学》(Nature immunology)9，1091-1094，doi:10.1038/ni1008-1091(2008))，它包括来自小鼠的先天的和适应性免疫系统的159个细胞亚群的484个微阵列样品；(4)在启动子区域中顺式调节元件富集的统计分析(爱尔康(Elkon)，R.、林哈特(Linhart)，C.、沙兰(Sharan)，R.、沙米尔(Shamir)，R.&夏伊洛(Shiloh)，Y.于《基因组研究》(Genome Research)第13卷773-780(2003)；奥达巴西欧格陆(Odabasioglu)，A.、塞利克(Celik)，M.&皮莱吉(Pileggi)，L.T.1997IEEE/ACM国际计算机辅助设计会议学报(Proceedings of the 1997IEEE/ACMinternational conference on Computer-aided design)58-65(IEEE计算机学会，圣何塞(SanJose)，加利福尼亚州，美国，1997))；以及(5)IPA软件的TF富集模块。对于数据库中的每一TF，使用费希尔精确检验(Fisher’s exact test)对其推定靶标和以上定义的组中每个之间的重叠的统计显著性进行计算。包括其中p<5*10-5和的倍数富集>1.5的情况。
基于其对应调节物和靶节点的表达谱，该调节网络中的每个边缘被指定一个时间戳。对于靶节点，考虑了相对于先前时间点，基因被差异性表达或显著地诱导或阻遏的时间点(类似于以上分组方法1和2)。调节物节点被定义为在给定时间点“不存在”，如果：(i)相比于Th0它被低表达；或(ii)该表达较低(时间上最大值的<20％)，并且相比于Th0基因未被过表达；或，(iii)时间上直到这时，该基因不会被表达超过100的最小表达值。作为另外的限制，使用来自施万豪瑟B.等人的模型(哺乳动物基因表达控制的全局定量(Global quantification of mammalian gene expression control).《自然》(Nature)473，337-342，doi:10.1038/nature10098(2011))和使用用于时间表达谱的连续表示的S形拟合(切奇克(Chechik)&科勒(Koller)，《计算生物学杂志》(J Comput Biol)2009)，以及用于估计蛋白质半衰期的ProtParam软件((威尔金斯)，M.R.等人.ExPASy服务器中的蛋白鉴定和分析工具(Protein identification and analysis tools in theExPASy server).《分子生物学方法》(Methods Mol.Biol.)112，531-552(1999))估算蛋白表达水平。需要的是在一个给定时间点，所预测蛋白水平不小于在该时程中取得的最大值之下的1.7倍，并且不小于该Th0水平之下的1.7倍。指定到基于时间-点特异性分组(以上分组方法1和2)推断的边缘的定时被局限于该特定时间点。举例来说，如果一个边缘是基于在1小时处诱导的基因集合中的富集而推断(分组方法#2)，则它将被指定为“1小时”时间戳。如果这个相同边缘被另外测试揭示的话，它可以仅具有另外的时间戳。
纳米链标签基因的选择：选择275-基因标签(表1)组合若干标准来反映分化程序的尽可能多的方面。定义了以下需求：(1)该标签必须包括所有属于一个Th17微阵列标签的TF(比较于其他的CD4+T细胞(威(Wei)等人于《免疫》(Immunity)第30卷155-167(2009))，参见本文描述的方法)；其在该网络中被包括为调节物并且具有>1的差异性表达得分；或者是强烈差异性表达(差异性表达得分＝4)；(2)它必须包括来自具有相似表达谱的基因的每个簇的至少10个代表(使用以上聚簇方法(4))；(3)它必须包含来自不同网络中的每个TF的预测靶标的至少5个代表；(4)它必须包括来自每个富集基因本体(GO)类别的最小数量的代表(横跨所有差异性表达的基因计算)；并且(5)它必须包括与分化过程相关的约100个基因的手动装配列表，包括差异性表达细胞因子、受体分子和其他细胞表面分子。由于这些不同的标准可能产生实质性重叠，集合-覆盖(set-cover)算法被用来找出满足所有五个条件的基因的最小子集。在微阵列数据中表达没有显示出变化(实时或在处理之间)的18个基因被添加至这一列表。
85-基因标签(用于富鲁达BioMark qPCR测定)是275-基因标签的子集，被选择以包括所讨论的所有关键调节物和细胞因子。10个控制基因(2900064A13RIK，API5、CAND1、CSNK1A1、EIF3E、EIF3H、FIP1L1、GOLGA3、HSBP1、KHDRBS1、MED24、MKLN1、PCBP2、SLC6A6、SUFU、TMED7、UBE3A，ZFP410)被添加至这一列表。
选择扰动靶标：一种无偏方法被用来对Th17分化的候选调节物-转录因子或染色质修饰基因排名。此排名是基于以下标签：(a)编码该调节物的基因是否属于该Th17微阵列标签(比较于其他的CD4+T细胞(威(Wei)等人于《免疫》(Immunity)第30卷155-167(2009))，参见本文描述的方法)；(b)是否预测该调节物靶向关键Th17分子(IL-17、lL-21、IL23r、以及ROR-γt)；(c)基于扰动和来自IPA软件的物理结合数据是否检测到该调节物；(d)使用至少10个靶基因的一个截断值，该调节物是否被包括在该网络中；(e)编码该调节物的基因在Th17时程中是否被显著诱导。认为仅其中该诱导发生在4小时后的情况排除非特异性命中；(f)编码该调节物的基因是否应答于前面研究中的Th17相关扰动而差异性表达。对于该标准，对扰动的Th17细胞中转录效应的数据库进行装配，包括：Batf的敲除(施拉姆尔(Schraml)等人，《自然》(Nature)2009)、ROR-γt(肖(Xiao)等人，未公开)，Hif1a(施(Shi)等人，《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)(2011))、Stat3和Stat5(杨(Yang)等人，《自然免疫学》(Nature Immunol)(2011)；杜兰特(Durant)，L.等人于第32卷605-615(2010)、Tbx21(阿瓦斯蒂(Awasthi)等人，未公开)，IL23r(这项研究)、和Ahr(扎克斯(Jux)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)2009))。也包括了来自Th17对地高辛的应答的数据(嗄(Huh)，J.R.等人.地高辛及其衍生物通过拮抗RORgammat活性压制TH17细胞分化(Digoxin and its derivativessuppress TH17 cell differentiation by antagonizing RORgammat activity).《自然》(Nature)472，486-490，doi:10.1038/nature09978(2011))和常山酮(松德鲁德(Sundrud)，M.S.等人.常山酮通过激活氨基酸饥饿应答而抑制TH17细胞分化(Halofuginone inhibitsTH17 cell differentiation by activating the amino acid starvation response).《科学》(Science)(纽约，N.Y.)324，1334-1338，doi:10.1126/science.1172638(2009))，连同如从ChIP-seq数据推断的ROR-γt直接结合的信息(肖(Xiao)等人，未公开)。对公开的表达数据集的分析是在本文所述的方法中描述。对于每个调节物，对出现为显著击中(上/下调或结合)的情况的数目进行计数；对于具有2至3个命中(分位数10箱(bin)中3至7)的调节物，则指定1的得分；对于具有超过3个命中(分位数8-10)的调节物，指定2的得分(另外指定0的得分)；以及(g)该基因在该Th17时程中的差异性表达得分。
将调节物根据以下顺序由以上特征而字典式排序：a，b，c，d，(e和f的总和)，g，即根据a的第一分选,然后根据b断绝关系，以此类推。至少一个时间点过程中不过度表达的基因被排除在外。作为一个例外，预测的具有另外的外部验证(特征f)的调节物(特征d)被保留。为了验证此排名，使用一种监督式测试：对先前与Th17分化相关的74种调节物进行人工注释。所有的这些特征针对这些调节物是高度特异的(p<10-3)。此外，使用监督式学习方法(朴素贝叶斯(Naive Bayes))，这些特征提供良好的针对注释调节物的预测能力(71％的准确度，使用5-倍交叉验证)，并且所得排名与非监督式字典式排序高度相关(斯皮尔曼相关>0.86)。
这个策略是适于蛋白受体排名为此，特征c被排除并且剩余的“蛋白水平”特征(b和d)被替换为以下定义：(b)在Th17时程中对应的配体是否被诱导；以及(d)使用至少5种靶向性转录调节物的一个截断值，该受体是否被包括为该网络中的一个靶标。
使用硅纳米线的基因敲低：制备4x4mm硅纳米线(NW)基质并且涂覆以3μL的在96孔组织培养板中的四种siGENOME siRNA(Dharmcon)的50μM池，如先前所描述的(沙列克(Shalek)，A.K.等人.作为用于将生物分子递送到活细胞的通用平台的垂直硅纳米线(Vertical silicon nanowires as a universal platform for deliveringbiomolecules into living cells).《美国国家科学院院刊》(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America)107，1870-1875，doi:10.1073/pnas.0909350107(2010))。简言之，将150,000天然T细胞接种于在10μL的完全培养基中的siRNA-混合NW上并且在添加完全培养基之前置于一种细胞培养孵育器(37℃，5％CO2)中沉降45分钟。将这些样品保持不干扰24小时以允许靶转录物敲低。然后，根据制造商的建议，在Th17极化条件下(TGF-β1和IL-6，如上文)，将siRNA-转染的T细胞用αCd3/Cd28dynabead(英杰公司(Invitrogen))激活。激活后10或48小时，从每个孔去除培养基，并且在补充有2-巯基乙醇(按体积计1:100)的20μL缓冲液TCL(凯杰(Qiagen))中裂解之前将样品轻轻地用100μL的PBS洗涤。在将mRNA在Turbocapture板(凯杰公司(Qiagen))上收获和使用Sensiscript RT酶(凯杰公司(Qiagen))转化成cDNA之后，qRT-PCR被用来验证相对于如先前描述的8-12个非靶向性siRNA对照样品的敲低水平和表型变化(谢弗里耶(Chevrier)，N.等人.TLR信号传导组分的系统发现描绘了病毒-感测回路(Systematicdiscovery of TLR signaling components delineates viral-sensing circuits).《细胞》(Cell)147，853-867，doi:10.1016/j.cell.2011.10.022(2011))。靶mRNA的60％的降低被用作敲低阈值。在每个敲低实验中，每个单独的siRNA池以一式四份运行；每个siRNA以至少三个分开的实验进行测试(图11)。
扰动测定中的mRNA测量：n计数器系统，完全呈现在盖斯(Geiss)等人(盖斯(Geiss)，G.K.等人.用颜色编码探针对对基因表达进行的直接多路测量(Directmultiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs).SI.《自然生物技术》(Nature Biotechnology)26，317-325，doi:10.1038/nbt1385(2008))，被用来测量构建以检测如以上所述选择的总计293个基因的定制代码集(CodeSet)。富鲁达BioMark HD系统(Fluidigm BioMark HD system)还可以用来测量96个基因的更小集合。最后，RNA-Seq被用来跟进并且验证这些扰动中的12个。
使用了构建以检测如以上所述选择的总计293个基因的定制代码集，包括在该时程中表达保持未受影响的18个对照基因。鉴于衍生自每个NW敲低的输入mRNA的不足，根据制造商的建议，通过将5μL的TaqMan PreAmp预混液(英杰公司(Invitrogen))和1μL的聚池混合引物(各500nM，参见表S6.1的引物序列)添加到5μL的来自验证的敲低的cDNA中，进行纳米链-代码集特异性的，14周期特异性靶扩增(STA)方案。在扩增之后，将5μL的扩增cDNA产物在95℃下熔融2分钟，在冰上快速冷却，并且然后在65℃与该代码集杂交16小时。最后，遵循制造商的指示，将杂交样品装入n计数器预备站并且使用n计数器数字式分析仪对产物计数进行定量。对在扩增后太过浓缩的样品进行稀释，并且再运行。使用整个脾的连续稀释(1:1、1:4、1:16、和1:64，pre-STA)和Th17极化cDNA来控制不同量的起始输入材料的作用并且检查样品扩增中的偏差。
纳米链n计数器数据分析：对于每个样品，将计数值除以被指定到在该微阵列数据(总共18个基因)中未显示出变化(实时或处理之间)的对照基因集合的计数的总和。对于每种条件，计算变化倍数比率，比较于用非靶向性(NT)siRNA处理的至少三个不同的对照样品。然后将所有的配对比较的结果(即针对该条件和B对照(NT)样品的A重复的A x B对)一起聚池：需要一半以上的配对比较中以相同方向(上/下调节)的实质性倍数变化(高于阈值t)。该阈值t被确定为最大{d1，d2}，其中d1是所有的匹配NT样品对之间的绝对对数倍数变化方面的平均值+std(即，形成相同批次和相同时间点；d1＝1.66)，并且其中d2是由18个对照基因所示的绝对对数倍数变化方面的平均值+1.645乘以标准偏差(分别针对每个比较来确定，通过取所有18x A x B值；对应于p＝0.05，正态性假定下)。忽略其中标准化之前NT和敲低样品具有低计数(<100)的所有配对比较。
一个置换检验被用于评价预测的网络模型(图2)和在纳米链n计数器中测量的敲低效应(图4，图10)之间的重叠。针对每个TF计算两个指数，其中所预测的靶是可用的：(i)特异性–受相应的敲低影响的预测靶标的百分比(仅考虑通过n计数器测量的基因)，和(ii)灵敏度-在模型中也是其预测靶标的、受给定的TF敲低影响的基因的百分比。为了避免圆形度，单独基于敲除在原始网络中预测的靶基因从这个分析排除。将所得到的值(平均，分别13.5％和24.8％)合并为F-得分(特异性和敏感性的调和平均值)。然后在500个随机化数据集中重复计算F-得分，其中对该敲低结果矩阵中的靶基因标记进行改组。报告的经验p-值是：
P＝(1+#具有相等的更好F-得分的随机化数据集)/(1+#随机化数据集)
富鲁达BioMark HD上的mRNA测量：制备来自验证的敲低的cDNA来用于富鲁达BioMark HD定量。简言之，将5μL的TaqMan PreAmp预混液(英杰公司(Invitrogen))，1μL的聚池混合引物(各500nM，参见表S6.1的引物)，以及1.5μL的水添加到2.5μL的敲低验证的cDNA，并且根据制造商的建议进行14周期的STA。在STA之后，进行外切核酸酶I消化(新英格兰生物系统(New England Biosystems))以通过添加0.8μL外切核酸酶I，0.4μL外切核酸酶I反应缓冲液和2.8μL水到每个样品中，随后涡旋，离心并且将样品加热至37℃持续30分钟来去除未结合的引物。在15分钟的80℃热灭活后，将扩增的样品在缓冲液TE中1:5稀释。然后使用爱娃·格林(EvaGreen)和96x96基因表达芯片(富鲁达BioMark HD)对扩增的经验证的敲低和全脾和Th17连续稀释对照(1:1、1:4、1:16、和1:64，pre-STA)进行分析(黛尔巴(Dalerba)，P.等人.在人结肠肿瘤中转录异质性的单细胞解剖(Single-cell dissectionof transcriptional heterogeneity in human colon tumors).《自然生物技术》(NatBiotechnol)29，1120-1127，doi:10.1038/nbt.2038(2011))。
富鲁达数据分析：对于每个样品，将Ct值从指定到四个管家基因的集合的Ct值的几何平均值减去。对于每种条件，计算倍数变化比率，比较于用非靶向性(NT)siRNA处理的至少三个不同的对照样品。然后将所有的配对比较的结果(即针对该条件和B对照(NT)样品的A重复的AxB对)一起聚池：需要一半以上的配对比较中以相同方向(上/下调节)的标准化Ct值之间的实质性差异(高于阈值)。阈值t被确定为最大{log2(1.5),d1(b),d2}，其中d1(b)是所有的匹配NT样品对之间的平均值+std(以δ)(即，来自相同批次和相同时间点)，在所有基因上以表达分位数b(1<＝b<＝10)。d2是由10个对照基因(来自纳米链标签的4个管家基因加上6个对照基因)所示的平均值+1.645乘以标准偏差(以δ)；对于每个比较通过取所有10xAxB值分别测定d2；对应于p＝0.05，正态性假定下)。忽略其中标准化之前NT和敲低样品具有低计数(Ct<21(考虑到扩增，本截断值对应于35的常规Ct截断值))的所有配对比较。
使用RNA-Seq的mRNA测量：根据制造商的建议，使用NEBNext mRNA第二链合成模块(新英格兰生物实验室)将来自NW-介导的敲低的经验证的单链cDNA被转化成双链DNA。然后将样品使用0.9x SPRI珠粒(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))进行清洁。使用Nextera XT DNA样品制备型试剂盒(亿明达公司(Illumina)制备文库，量化，聚池，并且然后在Hi-5Seq 2500(亿明达公司)上将其测序为平均深度20M读数。
RNA-seq数据分析：建立基于UCSC已知基因转录组的领结(Bowtie)指数(藤田(Fujita)，P.A.等人.UCSC基因组浏览器数据库：更新2011(The UCSC Genome Browserdatabase:update 2011).《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)39，D876-882，doi:10.1093/nar/gkq963(2011))，并且使用领结(Bowtie)将配对末端读数与这个指数直接对齐(兰米德(Langmead),B.、特拉普内尔(Trapnell),C.、波普(Pop).M.&扎尔茨贝格(Salzberg)，S.L.短DNA序列超快和记忆有效地对准到人类基因组(Ultrafast and memory-efficientalignment of short DNA sequences to the human genome).《基因组生物学》(GenomeBiol)10，R25，doi:10.1186/gb-2009-10-3-r25(2009))。接着，在这些对齐上以默认参数运行RSEM v1.11(里(Li)，B.&杜威(Dewey)，C.N.RSEM：在有或没有参照基因组的情况下来自RNA-Seq数据的准确转录定量(RSEM:accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome).《BMC生物信息学》(BMCBioinformatics)12，323，doi:10.1186/1471-2105-12-323(2011))来评估表达水平。对于各基因，将RSEM的基因水平表达估计(τ)乘以1,000,000以获得转录物/百万(TPM)评估。使用分位数标准化以进一步标准化每个批次的样品中的TPM值。对于每种条件，计算倍数变化比率，比较于用非靶向性(NT)siRNA处理的至少两个不同的对照样品。然后将所有的配对比较的结果(即针对该条件和B对照(NT)样品的A重复的AxB对)一起聚池：需要一半以上的配对比较中以相同方向(上/下调节)的TPM值之间的显著差异。显著性截断值t被确定为最大{log2(1.5),d1(b)}，其中d1(b)是所有的匹配NT样品对之间的在对数倍数比率方面的平均值+1.645*std(即，来自相同批次和相同时间点)，在所有基因上以表达分位数b(1<＝b<＝20)。忽略其中NT和敲低样品具有低计数(TPM<10)的所有配对比较。为了避免归因于低表达值的假倍数水平，一个小常数被添加到这些表达值，该小常数被设定为在相应批次中所有TPM值的第1分位数(10个中的)的值。
一个超几何检验被用于评价预测的网络模型(图2)和通过RNA-seq测量的敲低效应(图4d)之间的重叠。作为背景，使用在微阵列数据中出现的所有基因(并且因此20个有可能包括在该网络中)。作为另外的测试，使用了威尔科克森-曼-惠特尼秩和检验(Wilcoxon-Mann-Whitney rank-sum test)，比较注释集合中的基因与整个集合的基因(的绝对对数倍数变化(使用如前所述的相同背景)。秩和检验不需要设定一个显著性阈值；而是，考虑所有基因的倍数变化值。秩和检验产生的p值比在超几何检验中的更低(即，更显著)，并且因此，在图4c中，仅报告了更严格的(超几何)p值。
使用ChIP-seq的Tsc22d3DNA结合谱分析：使用来自艾碧康的抗体，如先前所述进行针对Tsc22d3的ChIP-seq(拉姆(Ram)，O.等人.在人类细胞中由全基因组位置分析覆盖的染色质调节物的组合模式化(Combinatorial Patterning of Chromatin RegulatorsUncovered by Genome-wide Location Analysis in Human Cells).《细胞》(Cell)147，1628-1639(2011))。如先前所述进行对此数据的分析(拉姆(Ram)，O.等人.在人类细胞中由全基因组位置分析覆盖的染色质调节物的组合模式化(Combinatorial Patterning ofChromatin Regulators Uncovered by Genome-wide Location Analysis in HumanCells).《细胞》(Cell)147，1628-1639(2011))，并且是详述于本文描述的这些方法中。
Tsc22d3ChIP-seq数据的分析：使用领结(Bowtie)将ChIP-seq读数与小鼠基因组的NCBI构造37(NCBI Build 37)(UCSC mm9)进行对齐(兰米德(Langmead),B.、特拉普内尔(Trapnell),C.、波普(Pop).M.&扎尔茨贝格(Salzberg)，S.L.在《基因组生物学》(GenomeBiol)第10卷R25(2009))。以10-8的p值截断使用MACS检测富集的结合区(峰)(张(Zhang)，Y.等人.在《基因组生物学》(Genome Biol)第9卷R137(2008))。如果峰落入接近于其5'端(从转录起始位点的10kb上游和1kb下游)或在该基因内的话，将该峰与一个基因相关联。使用针对基因的坐标的RefSeq转录物注释。
评估ChIP-seq峰与注释基因组区域的重叠。如果区域A在从峰B的顶点50bp的距离内的话(如通过MACS所确定的)，确定的是域A与峰B重叠。所使用的区域包括：(i)来自全体数据库(Ensemble database)的调节特征注释(弗里斯克(Flicek)，P.等人.Ensembl 2011.《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)39，D800-806，doi:10.1093/nar/gkq1064(2011))；(ii)由阿里根奴(Oregano)算法发现的21个调节性特征(史密斯(Smith)，R.L.等人.在IL-12β和IL-23R基因中的多态性与英国同期组群中银屑病的早期起始相关(Polymorphisms in theIL-12beta and IL-23R genes are associated with psoriasis of early onset in aUK cohort).《皮肤病学研究杂志》(J Invest Dermatol)128，1325-1327，doi:5701140[pii]10.1038/sj.jid.5701140(2008))；(iii)由multiz30way算法注释的保守区域(考虑了在此具有multiz30way得分>0.7的区域)；(iv)由RepeatMasker注释的重复区域；(v)推定的启动子区域-取RefSeq中注释的转录物的10kb上游和1kb下游(普鲁伊特(Pruitt)，K.D.、塔图索瓦(Tatusova)，T.&玛格勒特(Maglott)，D.R.NCBI参考序列(RefSeq)：基因组、转录物和蛋白质的策划非冗余序列数据库(NCBI reference sequences(RefSeq):a curatednon-redundant sequence database of genomes，transcripts and proteins).《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)35，D61-65，doi:10.1093/nar/gkl842(2007))；(vi)基因本体注释RefSeq；(vii)3’近侧区域(取到3’末端的1kb上游和5kb下游)；(viii)在Th17细胞中富集组蛋白标记H3K4me3和H3K27me3的区域(威(Wei)，G.等人于《免疫》(Immunity)第30卷155-167(2009))；(ix)富集以下项的区域：Stat3和Stat5的结合(杨(Yang)，X.P.等人.通过STAT3和STAT5的直接的互相作用对编码IL-17的基因座的相对调节(Opposing regulationof the locus encoding IL-17through direct，reciprocal actions of STAT3andSTAT5).《自然免疫学》(Nat.Immunol.)12，247-254，doi:10.1038/ni.1995(2011))、Irf4和Batf(格拉斯马赫尔(Glasmacher),E.等人.指导免疫特异性AP-1-IRF复合物的装配与功能的一种基因组调节元件(A Genomic Regulatory Element That Directs Assembly andFunction of Immune-Specific AP-1-IRF Complexes).《科学》(Science)，doi:10.1126/science.1228309(2012))，和在Th17细胞中的RORγt(肖(Xiao)等人，未公开)，以及在iTreg中的Foxp3(肖(Xiao)等人，未公开)。
对于峰“x”的每个集合和基因组区域“y”的每个集合，二项式p值被用来评估它们在基因组中的重叠,如麦克林(Mclean)，C.Y.等人，于《自然生物技术》(Naturebiotechnology)第28卷nbt.1630-1639(2010)中所述。命中的数目被定义为与y重叠的x峰的数目。在集合(i)-(vii)中的背景概率被设定为该区域的总长度(以bp计)除以该基因组的总长度。在集合(viii)—(ix)中的背景概率被设定为该区域的总长度除以注释的基因组区域的总长度：这包括注释的调节区域(如在集合i和ii中定义的)，注释为邻近于基因的区域(使用来自集合v-vii的定义)，在Th17细胞中携带组蛋白标记(使用来自集合viii的定义)，或在Th17细胞中由转录调节物结合(使用来自集合ix的定义)。
对于这些转录调节物(集合ix)，也包括另外的“基因水平”测试：在此使用超几何p-值，对该集合的结合基因之间的重叠进行评估。使用类似的测试来评估这些结合的基因和在Tsc22d3敲低中差异性表达的基因之间的重叠。
用第二峰调用软件(斯克里普丘(Scripture))(格特曼(Guttman)，M.等人于《自然生物技术》(Nature biotechnology)第28卷503-510(2010)；加伯(Garber),M.等人.高通量染色质免疫沉淀方法揭示哺乳动物中动态基因调节的原理(A High-ThroughputChromatin Immunoprecipitation Approach Reveals Principles of Dynamic GeneRegulation in Mammals).《分子细胞》(Molecular cell)，doi:10.1016/j.molcel.2012.07.030(2012))重复该分析，并且在所有以上测试中获得一致的结果。确切地说，就共占用的结合位点而言以及就常见靶基因而言观察到相似水平的与所测试的Th17因子的重叠。
估算模块之间的单色相互作用的统计显著性：在图4b中的功能网络由两个模块组成：正模块和负模块。计算两个指数：(1)模块内指数：相同模块的成员之间的正边缘的百分比(即，敲低/敲除方面的下调)；以及(2)模块间指数：负的相同模块的成员之间的负边缘的百分比。将该网络改组1,000次，同时维持节点的出度(即，外出边缘的数目)和边缘信号(正/负)，并且重新计算这两个指数。使用t-检验计算报告的p值。
使用文献微阵列数据用于衍生Th17标签以及用于鉴定响应于Th17相关扰动的基因：为了限定Th17标签基因，从威(Wei)等人于《免疫》(Immunity)，第30卷155-167(2009)下载并且分析基因表达数据，并且将数据使用RMA算法来预处理，随后使用23GenePattern套件的表达文件创建器(ExpressionFileCreator)模块中的默认参数而分位数标准化(赖希(Reich)，M.等人.基因模式2.0.《自然遗传学》(Nat.Genet.)38，500-501，doi:10.1038/ng0506-500(2006))。此数据包括自Th17、Th1、Th2、iTreg、nTreg、以及天然CD4+T细胞的重复微阵列测量。对于每个基因，使用单侧t-检验评价它在Th17细胞中相比于所有其他细胞亚群是否被过表达。保留了具有<0.05的p-值的所有情况。作为一个另外的过滤步骤，需要的是在Th17细胞中的基因的表达水平至少1.25倍高于其在所有其他细胞亚群中的表达。为了避免归因于低表达值的假倍数水平，一个小常数(c＝50)被添加到这些表达值。
为了定义响应于公开的Th17相关扰动的基因，下载并且分析来自若干来源的基因表达数据，其提供在不同条件下的Th17细胞的转录谱(以上列出的)。如以上对这些数据集进行预处理。为了发现在给定条件下差异性表达的基因(相比于其对应的对照)，计算在该情况下和对照条件下每个探针集的表达水平之间的倍数变化。为了避免归因于低表达值的假倍数水平，如上的一个小常数被添加到这些表达值。仅报告了如下情况，其中超过50％的所有可能情况-对照比较高于1.5倍变化的截断值。作为一个另外的过滤器，当重复是可获得的时，如上计算Z-得分并且仅报告具有相对应的p值<0.05的情况。
基因：列于以下表11中的缩写在本文用于鉴定在整个披露中使用的基因，包括但不局限于在本说明书的表1-9中所示的那些。
表11.基因缩写，Entrez ID号以及简要说明
用于纳米链STA和qRT-PCR/富鲁达的引物和siRNA序列：表S6.1呈现了用于富鲁达/qRT-PCR实验和纳米链n计数器(nCounter)基因表达谱分析的各正向和反向引物的序列。表S6.2呈现用于敲低分析的RNAi的序列。
表S6.1.引物序列
表S6.2.RNAi序列
实例2：Th17分化的转录时程
天然CD4+T-细胞分化为Th17细胞是使用TGF-β1和IL-6诱导的，并且在沿着在天然CD4+T-细胞分化为Th17细胞过程中的72小时时程的十八个时间点使用微阵列测量转录谱，该分化是通过将抗炎症细胞因子TGF-β1和促炎细胞因子IL-1-6组合来诱导的(图1、图6A、图6B和图6C，参见在实例1中的方法)。作为对照，测量不添加分化细胞因子的情况下激活的细胞的mRNA谱(Th0)。将在Th17分化过程中特异性差异性表达的1,291个基因通过将这些Th17分化细胞与对照细胞比较(参见在实例1中的方法)来鉴别，并且将其划分为显示不同时间谱的20个共表达簇(k-均值聚簇，参见在实例1中的方法，图1b和图7)。使用这些簇来表征该应答并且重建一个调节网络模型，如以下所描述的(图2a)。
转录和分化的三个主要的波：随着细胞从天然样状态(t＝0.5小时)转变为Th17(t＝72小时；图1c和图6c)存在三个转录阶段：早期(高达4小时)、中期(4-20小时)、和晚期(20-72小时)。每个分别对应于分化阶段(科恩(Korn)等人，《免疫学年度评论》(Annu RevImmunol)2009)：(1)诱导，(2)表型起始和扩增，以及(3)稳定和IL-23信号传导。
早期阶段的特征是免疫应答途径(例如，IL-6和TGF-β信号传导；图1d)的瞬时诱导(例如，簇C5，图1b)。第一转变点(t＝4小时)特点是ROR-γt表达水平的显著增加，该表达水平在更早的时间点是检测不到的。第二转变(t＝20小时)伴随着细胞因子表达上的显著变化，其中强化Th17表型的Th17标签细胞因子(例如，IL-17)被诱导并且属于其他T细胞谱系的其他细胞因子(例如，IFN-γ)伴随性减少。
一些早期诱导的基因展示持续表达(例如，簇C10，图1b)；这些富集了在本文也称为转录因子(TF)的转录调节物(TR)，包括关键Th17因子Stat3、Irf4和Batf，以及细胞因子和受体分子IL-21、Lif、以及Il2ra。
向中期阶段的转变(t＝4小时)特点是ROR-γt(主要TF；图6d)和另外12个TF(簇C20，图1b)的诱导，所述两者对于Th17分化而言都是已知(例如，Ahr)且新颖的(例如，Trps1)。在4小时的时间点，ROR-γt(Th17分化的主要TF)的表达显著增加(图6d)–标志着分化表型的积聚的开始(‘中期阶段’)–并且在该时程的整个剩下部分中保持升高。另外12个因子显示了类似的模式(簇8C20，图1b)。这些包括Ahr和Rbpj，连同之前未描述为在Th17分化中具有作用的多个因子(例如，Etv6和Trps1)。总的来说，在4和20小时之间诱导的585个基因差异性表达，并且基本上不同于早期应答基因(图1b；例如，簇C20、C14、以及C1)。
在转变到晚期阶段(t＝20小时)过程中，Th17标签细胞因子的mRNA(例如，IL-17a，IL-9；簇C19)被诱导，而阻遏了标志其他T细胞谱系的细胞因子(例如，IFN-γ和IL-4)的mRNA。也诱导了来自IL-10家族的调节性细胞因子(IL-10，IL-24)，可能作为一个涉及‘病原性’或‘非病原性’Th17细胞的出现的自我限制机制(李(Lee)等人，病原性Th17细胞的诱导和分子标签(Induction and Molecular Signature of Pathogenic Th17 Cells)，《自然免疫学》(Nature Immunol)13，991-999；doi:10.1038/ni.2416)。48小时左右，这些细胞诱导IL23r(数据未示出)，这在晚期阶段起着重要作用(图8A、8B)。
在激活后20和42小时之间(即，在诱导ROR-γt表达之后开始的16小时)，相比于Th0在821个基因的表达方面存在一个实质性变化，这些基因包括许多主要细胞因子(例如簇C19，图1b)。Th17相关的炎性细胞因子(包括IL-17a、IL-24、IL-9和淋巴毒素αLTA)的表达(艾尔亚曼(Elyaman)，W.等人.Notch受体和Smad3信号传导在白细胞介素-9-产生T细胞的诱导中协作(Notch receptors and Smad3 signaling cooperate in the induction ofinterleukin-9-producing T cells).《免疫》(Immunity)36,623-634,doi:10.1016/j.immuni.2012.01.020(2012))被强烈地诱导(图1d)，而其他细胞因子和趋化因子被阻遏或保持在其低基础水平(簇C8和C15，图1b和图7)。这些包括表征其他T辅助细胞类型的细胞因子，例如IL-2(Th17分化抑制物)、IL-4(Th2)、以及IFN-γ(Th1)，以及其他(Csf1、Tnfsf9/4和Ccl3)。最后，也诱导了来自IL-10家族的调节性细胞因子(IL-10、IL-24)，可能作为一个自我限制机制。因此，该20小时时间点对于所提出的‘病原性’与‘非病原性’/调节性Th17细胞的出现可能是决定性的(李(Lee)等人，《自然免疫》(Nature Immunol)2012)。
在剩余时程(>48小时)中差异性表达的1,055个基因的大部分表达变化是轻微的，发生在20-42小时时间段过程中响应的基因中(图1，例如，簇C18、C19、和C20)，并且典型地继续相同的轨迹(向上或向下)。在大部分强烈地晚期诱导的基因中的是TF Hif1a，先前显示其通过与ROR-γt的相互作用而增强Th17发育(丹格(Dang)，E.V.等人.通过缺氧诱导因子1控制T(H)17/T(reg)平衡(Control of T(H)17/T(reg)balance by hypoxia-induciblefactor1).《细胞》(Cell)146，772-784，doi:10.1016/j.cell.2011.07.033(2011))。在最晚的时间点(72小时)过度表达的基因富集了凋亡功能(p<10-6)，这与原代培养物中的Th17细胞的受限存活一致，并且包括Th2细胞因子IL-4(图8a)，表明在TGF-β1+IL6处理下，这些细胞可能具有较不稳定的表型。
对IL-23r mRNA表达的诱导的峰值发生在48小时，并且在这个时间点，开始看见在细胞表面上的IL-23r蛋白(数据未示出)。该晚期阶段应答部分取决于IL-23，如当比较用TGF-β1+IL-6与TGF-β1+IL-6+IL-23刺激的细胞之间、或WT和用TGF-β1+IL-6+IL-23处理的IL-23r-/-细胞之间的时间转录谱观察到的(图8)。例如，在IL-23r-缺陷性Th17细胞中，IL-17ra、IL-1r1、IL-21r、ROR-γt、以及Hif1a的表达减少，并且IL-4表达增加。在IL-23r-/-细胞中的上调基因富集了其他CD4+T细胞亚群，表明在不存在IL-23信号传导的情况下，这些细胞开始脱分化，因此进一步支持了假设：IL-23可以在稳定分化Th17细胞的表型方面具有作用。
实例3：对动态调节相互作用的推断
不希望受任何一种理论的束缚，假设的是，这些簇(图1b)中每个涵盖共享在相关时间点有活性的调节物的基因。为了预测这些调节物，装配来自公开的基因组谱的调节物-靶标关联的一般网络(林哈特(Linhart)，C.、霍尔珀林(Halperin)，Y.&沙米尔(Shamir)，R.转录因子和微小RNA基序发现：阿玛迪斯平台和后生动物靶集合的纲要(Transcriptionfactor and microRNA motif discovery:the Amadeus platform and a compendium ofmetazoan target sets).《基因组研究》(Genome research)18，1180-1189，doi:10.1101/gr.076117.108(2008)；郑(Zheng)，G.等人.ITFP：哺乳动物转录因子的整合平台(ITFP:anintegrated platform of mammalian transcription factors).《生物信息学》(Bioinformatics)24，2416-2417，doi:10.1093/bioinformatics/btn439(2008)；威尔逊(Wilson)，N.K.等人.血液干细胞/祖细胞中的组合转录控制：十个主要转录调节物的全基因组分析(Combinatorial transcriptional control in blood stem/progenitorcells:genome-wide analysis of ten major transcriptional regulators).《细胞干细胞》(Cell Stem Cell)7，532-544，doi:10.1016/j.stem.2010.07.016(2010)；拉赫曼(Lachmann)，A.等人，于《生物信息学》(Bioinformatics)卷26 2438-2444(2010)；利伯索恩(Liberzon)，A.等人.分子标签数据库(Molecular signatures database)(MSigDB)3.0.《生物信息学》(Bioinformatics)27，1739-1740，doi:10.1093/bioinformatics/btr260(2011)；江(Jiang)，C.、宣(Xuan)，Z.、赵(Zhao)，F.&张(Zhang)，M.TRED：转录调节元件数据库、新的条目和其他发展(TRED:a transcriptional regulatory element database，newentries and other development).《核酸研究》(Nucleic Acids Res)35，D137-140(2007)；爱尔康(Elkon)，R.、林哈特(Linhart)，C.、沙兰(Sharan)，R.、沙米尔(Shamir)，R.&夏伊洛(Shiloh)，Y.于《基因组研究》(Genome Research)卷13 773-780(2003)；横(Heng)，T.S.&佩因特(Painter)，M.W.免疫学基因组项目:在免疫细胞中基因表达的网络(TheImmunological Genome Project:networks of gene expression in immune cells).《自然免疫学》(Nat.Immunol.)9，1091-1094，doi:10.1038/ni1008-1091(2008))(图2a，参见实例1中的方法)。
如下装配来自公开的基因组谱的调节物-靶标关联的一般网络：298个调节物的体内蛋白质-DNA结合谱(林哈特(Linhart)，C.、霍尔珀林(Halperin)，Y.&沙米尔(Shamir)，R.转录因子和微小RNA基序发现：阿玛迪斯平台和后生动物靶集合的纲要(Transcriptionfactor and microRNA motif discovery:the Amadeus platform and a compendium ofmetazoan target sets).《基因组研究》(Genome research)18，1180-1189，doi:10.1101/gr.076117.108(2008)；郑(Zheng)，G.等人.ITFP：哺乳动物转录因子的整合平台(ITFP:anintegrated platform of mammalian transcription factors).《生物信息学》(Bioinformatics)24，2416-2417，doi:10.1093/bioinformatics/btn439(2008)；威尔逊(Wilson)，N.K.等人.血液干细胞/祖细胞中的组合转录控制：十个主要转录调节物的全基因组分析(Combinatorial transcriptional control in blood stem/progenitorcells:genome-wide analysis of ten major transcriptional regulators).《细胞干细胞》(Cell Stem Cell)7，532-544，doi:10.1016/j.stem.2010.07.016(2010)；拉赫曼(Lachmann)，A.等人，于《生物信息学》(Bioinformatics)卷262438-2444(2010)；利伯索恩(Liberzon)，A.等人.分子标签数据库(Molecular signatures database)(MSigDB)3.0.《生物信息学》(Bioinformatics)27，1739-1740，doi:10.1093/bioinformatics/btr260(2011)；江(Jiang)，C.、宣(Xuan)，Z.、赵(Zhao)，F.&张(Zhang)，M.TRED：转录调节元件数据库、新的条目和其他发展(TRED:a transcriptional regulatory element database，newentries and other development).《核酸研究》(Nucleic Acids Res)35，D137-140(2007)，在每个基因的启动子中评分的825个DNA顺式调节元件(爱尔康(Elkon)，R.、林哈特(Linhart)，C.、沙兰(Sharan)，R.、沙米尔(Shamir)，R.&夏伊洛(Shiloh)，Y.对控制人类细胞中的细胞周期的转录调节物进行全基因组计算机鉴定(Genome-wide in silicoidentification of transcriptional regulators controlling the cell cycle inhuman cells).《基因组研究》(Genome research)13，773-780，doi:10.1101/gr.947203(2003))，对敲除11种调节蛋白的转录应答，以及从跨159个免疫细胞类型的共表达模式推断的调节关系(横(Heng)，T.S.&佩因特(Painter)，M.W.免疫学基因组项目：在免疫细胞中基因表达的网络(The Immunological Genome Project:networks of gene expressionin immune cells)。《自然免疫学》(Nat.Immunol.)9，1091-1094，doi:10.1038/ni1008-1091(2008))(参见实例1中的方法)。虽然未在Th17细胞中测量大多数的蛋白质-DNA结合谱，在Th17细胞中多种关键TF的DNA-结合谱，包括Irf4和Batf(格拉斯马赫尔(Glasmacher)，E.等人.指导免疫特异性AP-1-IRF复合物的装配与功能的一种基因组调节元件(A Genomic Regulatory Element That Directs Assembly and Function ofImmune-Specific AP-1-IRF Complexes).《科学》(Science)，doi:10.1126/science.1228309(2012))，Stat3和Stat5(杨(Yang)，X.P.等人.通过STAT3和STAT5的直接的互相作用对编码IL-17的基因座的相对调节(Opposing regulation of the locusencoding IL-17through direct,reciprocal actions of STAT3and STAT5).《自然免疫学》(Nat.Immunol.)12，247-254，doi:10.1038/ni.1995(2011))，和Rorc(肖(Xiao)等人，未公开)已经被包括在内。
然后将调节物与来自其推定靶标的集合的基因连接，只要也存在调节物的推定靶标和基因的簇之间的显著重叠(参见在实例1中的方法)。由于不同调节物在不同时间起作用，一种调节物和其靶标之间的连接可以仅在某一时间窗口中具有活性。为了确定此窗口，每个边缘被一个时间戳标记，该时间戳指示何时该靶基因被调节(基于其表达谱)和何时该调节物节点以足够水平被表达(基于其mRNA水平和推断的蛋白水平(施万豪瑟B.哺乳动物基因表达控制的全局定量(Global quantification ofmammalian gene expression control).《自然》(Nature)473，337-342，doi:10.1038/nature10098(2011))；参见在实例1中的方法)。对于靶基因，考虑了如下时间点，其中该靶基因相比于Th0状况被差异性表达或相比于Th17时程中的以上时间点被诱导或阻遏。对于该调节物节点，仅包括如下时间点，其中该调节物相对于该Th0状况被充分表达并且不被阻遏。为此，调节物的预测蛋白表达水平是使用最近提出的模型从其mRNA水平推断(施万豪瑟B.哺乳动物基因表达控制的全局定量(Global quantification ofmammalian gene expression control).《自然》(Nature)473，337-342，doi:10.1038/nature10098(2011))(参见实例1中的方法)。以此方式，网络‘快照’是针对18个时间点中每个而衍生的(图2b-d)。总的来说，在至少一个网络中推断了71个调节物和1,266个基因之间的9,159个相互作用。
在分化过程中的实质性调节重新布线：活性因子和相互作用从一个网络到下一个而变化。绝大部分的相互作用仅在一些时间窗口是有活性的(图2c)，甚至对于参与所有网络的调节物(例如，Batf)而言。基于活性相互作用上的相似性，鉴定了三个网络类别(图2c)，对应于三个分化阶段(图2d)。在每个阶段中的所有网络收缩为一个模型，导致三个连续网络模型(图9A，9B)。在这些调节物中，33个在所有这些网络中是有活性的(例如许多已知的主要调节物，如Batf1、Irf4、以及Stat3)，而18个仅在一个网络中是有活性的(例如在早期网络中的Stat1和Irf1；在晚期网络中的ROR-γt)。的确，虽然ROR-γt mRNA水平是在约4h诱导的，ROR-γt蛋白水平在大约20h增加并且随着时间进一步升高，与该模型一致(图9)。
在每个网络中密集互连的转录回路：在每个网络的心脏处是其’转录回路’，将活性TF连接至本身编码TF的靶基因。例如，在早期应答网络中的转录回路将预测充当调节物的48个因子连接至在第一个四小时过程中自身转录物被上调或下调的72个因子(这个模型的子集显示于图2e中)。该回路自动突出了先前牵涉在免疫信号传导和Th17分化中的许多TF，作为正或负调节物，包括Stat家族成员，负的(Stat1，Stat5)和正的(Stat3)，开拓因子Batf，TGF-β信号传导靶向的TF(Smad2、Runx1、以及Irf7)，通过TCR信号传导靶向的若干TF(Rel、Nfkb1、和Jun)，以及若干干扰素调节因子(Irf4和Irf1)，这些均被定位为调节物和定位为强烈地诱导的靶基因。此外，鉴定了未先前描述在Th17分化中具有作用的34种调节物(例如，Sp4、Egr2、以及Smarca4)。总的来说，该回路是密集互连的(诺韦尔什特恩(Novershtern)等人，细胞(Cell)2011)，48种调节物中16种本身被转录控制(例如，Stat1、Irf1、Irf4、Batf)。这提示反馈回路，其中一些可以是自动调节的(例如，对于Irf4、Stat3和Stat1)。
如在早期网络中，中期和晚期转录回路中的64个TF之间存在实质交叉调节，其包括主要的Th17调节物，如ROR-γt、Irf4、Batf、Stat3、以及Hif1a(图2e)。
对用于系统扰动的新颖调节物的排名：除了已知的Th17调节物，该网络包括几十种新颖因子作为预测的调节物(图2d)，诱导的靶基因，或者两者(图2E)。它还包含作为诱导的靶标的受体基因，这些基因是先前在Th17细胞中已知的(例如，IL-1R1、IL-17RA)和新颖的(例如，Fas、Itga3)。这提示相比于现有知识的实质性另外的复杂性，但必须被系统地测试以验证每个候选物的作用和表征每个候选物的功能。
将候选调节物针对扰动进行排名(图2a、3a，参见在实例1中的方法)，通过反映调节作用(图3a，“网络信息”)和作为靶标的作用(图3a，“基因表达信息”)的特征来引导。
为此，一种得分方案被设计成针对扰动对候选调节物进行排名(图2a和3a，图10，方法)，这是通过蛋白活性(作为一种调节物节点参与，图3a，“网络信息”)和mRNA水平(作为一个靶标在表达上的变化，图3a，“基因表达信息”；方法)来引导。在每个标准下，一些特征被认为用于选择基因来进行扰乱(参见在实例1中的方法)。在“网络信息””中，考虑了该基因是否充当该网络中的调节物，用于此预测作用的该类型的实验支持，以及它是否被预测为靶向关键Th17基因。在“基因表达信息”中，考虑了在该时程数据中(偏好诱导的基因)，在IL23R敲除下，或在Th17细胞中扰动的公开数据中(例如，Batf敲除(施拉姆尔(Schraml)，B.U.等人，于《自然》(Nature)卷46 0405-409(2009))；参见针对完全列表的方法)编码基因的mRNA水平上的变化；并且考虑了基因在Th17细胞中是否被更高地表达，这是相比于其他的CD 4+亚群，基于全基因组表达谱(威(Wei)，G.等人于《免疫》(Immunity)卷30 155-167(2009))。
相比于其他的(例如，在时程数据上的差异性表达)，这些基因被计算地排序以强调某些特征(例如，关键Th17基因的预测调节物)。类似的方案被用来对受体蛋白进行排名(参见在实例1中的方法)。支持它们的质量，最高排名的因子富集(p<10-3)手动策划的Th17调节物(图10)，并且与通过监督式方法了解的排名良好相关(斯皮尔曼(Spearman)r>0.86)(参见实例1中的方法)。选择65个基因用于扰动：52种调节物和13种受体。这些包括靠前的44个调节物和靠前的9个受体中大多数(排除几个熟知的Th17基因和/或敲除数据已经存在的那些)，连同另外的代表性低排名因子。
实例4：原代T细胞的基于纳米线的扰动
虽然对来自缺失关键因子敲除小鼠的天然CD4+T细胞的应答的测试是一种有力的策略，它仍局限于小鼠品系的可用性或产生者的能力。在未受刺激的原代小鼠T细胞中，基于病毒或基于转染的siRNA递送已几乎不可能，因为它改变了分化或细胞活力(达尔达霍恩(Dardalhon)，V.等人.原代T细胞中的慢病毒介导的基因转移被一个中央DNA翼增强(Lentivirus-mediated gene transfer in primary T cells is enhanced by acentral DNA flap)《基因治疗》(Gene therap)8，190-198(2001)；麦克马努斯(Mc Manus)，M.等人.在T淋巴细胞中小干扰RNA介导的基因沉默(Small interfering RNA-mediatedgene silencing in T lymphocytes).《免疫学杂志》(Journalof Immunology)169，5754(2002))。因此，使用基于硅纳米线(NW)的新的递送技术(a new delivery technologybased on silicon nanowires(NWs))(沙列克(Shalek)等人，《美国国家科学院院刊》(ProcNatl Acad Sci U.S.A.)2010；沙列克(Shalek)，A.K.等人.纳米线介导的递送使得能够功能性整合原代免疫细胞：应用到慢性淋巴细胞性白血病的分析(Nanowire-MediatedDelivery Enables Functional Interrogation of Primary Immune Cells:Applicationto the Analysis of Chronic Lymphocytic Leukemia).《纳米通讯》(Nano Lett.)12，6498-6504，doi:10.1021/nl3042917(2012))，将其进行优化以有效地(>95％)将siRNA递送到天然T细胞而不激活它们(图3b和c)(沙列克(Shalek)等人，《纳米通讯》2012)。
最近，证实NW能够有效地穿透哺乳动物细胞的膜，并且以微创的非激活方式递送宽范围的外源分子(沙列克(Shalek)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)2010；沙列克(Shalek)等人，《纳米通讯》(Nano Lett.)2012)。具体地，将NW-T细胞界面(图3b)进行优化以便有效地(>95％)将siRNA递送到天然鼠类T细胞。这个递送既不激活也不诱导天然T细胞的分化并且不影响它们对用抗-CD3/CD28进行的常规TCR刺激的应答(图3c)(沙列克(Shalek)等人，《纳米通讯》(Nano Lett.)2012)。重要的是，尽管快速细胞增殖，抗-CD3/CD28激活之前并且甚至高达48h之后，NW-递送的siRNA产生实质性的靶转录物敲低(图3d)。
然后尝试用NW介导的siRNA递送扰动60个基因，并且针对34个基因实现有效敲低(在激活后48小时剩余<60％转录物)(图3d和图11，表S6.2)。针对七个其他基因获得敲除小鼠，其中两个(Irf8和Il17ra)也在该敲低集合中。总之，65个选择的基因中39个被成功扰动-29种调节物和10种受体-包括先前不与Th17分化相关的21个基因。
基于纳米线的筛选验证Th17网络中的39种调节物：在两个时间点将扰动对基因表达的作用进行图谱绘制。在分化开始之后10小时，在诱导ROR-γt之后不久(图6)对扰动中28个进行图谱绘制，并且当该Th17表型变得更确定时，在48小时对所有扰动进行图谱绘制(图1b)。在60小时也对扰动中的两个(Il17ra和Il21r敲除)进行图谱绘制。
具体地，使用纳米链n计数器系统测量在激活后48小时扰动对275个标签基因的表达的影响(还在60小时测量Il17ra和Il21r敲除)。
以计算来选择这些标签基因以覆盖分化过程的尽可能多的方面(参见在实例1中的方法)：它们包括大多数差异性表达的细胞因子、TF、和细胞表面分子，连同来自每个簇的代表(图1b)，富集功能，以及各网络中的预测靶标。为了验证，使用富鲁达BioMark系统对85个基因的标签进行图谱绘制，获得高度可重现的结果(图12)。
以计算来选择用于表达分析的标签基因以覆盖分化过程的尽可能多的方面(参见在实例1中的方法)。它们包括大部分的差异性表达的细胞因子、TF、和细胞表面基因，连同来自每个表达簇的代表性基因(图1b)，富集的生物功能，以及每个网络中的调节物的预测靶标。重要地，由于该标签包括编码扰动的调节物的大部分基因，可以确定它们之间的联系(图4a，“扰乱的”)，包括反馈和前馈环。
通过比较于未差异性表达的非靶向性siRNA和18个对照基因，对扰动对标签基因的影响的统计显著性进行评分(参见在实例1中的方法，图4a，所有非灰色条目都是显著的)。所测试的调节物中26种的扰动在48小时时间点对至少25个标签基因的表达具有显著作用(具有任何应答的标签基因的10％)。平均起来，一个扰动影响40个基因，并且80％的标签基因受至少一种调节物的影响。支持该原始网络模型(图2)，受调节物的敲低影响的基因和其预测靶标之间存在显著重叠(p≤0.01，置换检验；参见在实例1中的方法)。
为了研究该网络的动力学，使用富鲁达Biomark系统来测量这些扰动中的28个在10小时处(在ROR-γt诱导之后不久)的作用。发现在10小时以及48小时处，30％的功能性相互作用以相同的激活/阻遏逻辑存在，而其余部分仅存在于一个时间点(图13)。这与原始模型中的重新布线的程度一致(图2b)。
每当可能，每个调节物的功能被分类为对于Th17分化是正或负的。确切地说，在该48小时时间点处，这些调节物中22个的扰动显著减弱IL-17A或IL-17F表达(‘Th17正调节物’，图4b，蓝色)，并且另五个的扰动显著增加IL-17水平(‘Th17负调节物’，图4b，红色)。这些强正或强负调节物中的12种先前不与Th17细胞相关联(图4b，在蓝色和红色节点附近的浅灰色晕圈)。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。接着，关注这些强正和强负调节物在Th17表型的发育上的作用。
在Th17网络中的两个偶联拮抗回路：通过其对Th17标签基因(例如IL17A、IL17F，图4b，灰色节点，底部)的作用来表征每种调节物，发现在48小时处该网络被组织化成两个拮抗模块：具有22个‘Th17正因子’(图4b，蓝色节点：9种新颖的)的模块，其扰动降低Th17标签基因(图4b，灰色节点，底部)的表达，以及具有5个‘Th17负因子’(图4b，红色节点：3种新颖的)的模块，其扰动具有相反作用。这些图的彩色版本可以发现于优素福(Yosef)等人，“控制Th17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling Th17cell differentiation)，《自然》(Nature)，第496卷：461-468(2013)/doi:10.1038/nature11981。这些模块中每个通过其成员之间的正的、自我加强相互作用而紧密内部联系(内部模块边缘的70％)，而大部分(88％)模块间相互作用是负的。这个统计学上显著的组织(经验p值<10-3；参见在实例1中的方法，图14)让人联想到在酵母中的遗传回路中先前观察到的(塞格雷(Segrè)，D.、迪露娜(Deluna)，A.、丘奇(Church)，G.M.&凯西毅(Kishony)，R.在酵母代谢上的模块式异位显性(Modular epistasis in yeast metabolism)《自然遗传学》(Nat.Genet.)37，77-83，doi:10.1038/ng1489(2005)；法勒(Peleg)，T.、优素福(Yosef)，N.、鲁平(Ruppin)，E.&沙兰(Sharan)，R.在酵母菌中敲除无网络推断作用(Network-free inference of knockout effects in yeast).《PLoS计算生物学》(PLoSComput Biol)6,e1000635,doi:10.1371/journal.pcbi.1000635(2010))。在10小时，相同的调节物不会产生这个明显模式(p>0.5)，这表明在此点，该网络仍然是可塑的。
这两个拮抗模块可以在维持Th17和其他T细胞亚群之间的平衡和在对Th17细胞的促炎状态的自我限制上起关键作用。的确，扰动Th17正因子也诱导其他T细胞亚群的标签基因(例如，Gata3，图4b，灰色节点，顶部)，而扰动Th17负因子压制它们(例如，Foxp3、Gata3、Stat4、以及Tbx21)。
实例5：新颖因子的验证和表征
本文呈现的研究集中在这些正或负因子中12种的作用上(包括12种新颖的因子中的11种，这些因子不与Th17细胞相关；图4b，浅灰色晕圈)。在扰动每个因子后使用RNA-Seq以测试其预测靶标(图2)是否被扰动影响(图4c，文氏图(Venn diagram)，顶部)。发现存在于两个数据集中的因子中三种(Egr2、Irf8、和Sp4)的高显著重叠(p<10-5)，并且发现针对第四种(Smarca4)的界线显著重叠，验证在该网络中的边缘的质量。
接着，将12种因子中每种指定为‘Th17正’或‘Th17负’是通过将响应于因子敲低(于RNA-Seq中)的基因的集合与20个簇中每个进行比较来评估(图1b)。与原始定义一致，‘Th17正’调节物的敲低下调在以其他方式诱导的簇中的基因，并且上调在以其他方式阻遏或未诱导的簇中的基因(并且对于‘Th17负’调节物反之亦然；图4d和图15a，b)。受正或负调节物影响的这些基因还与由关键CD4+转录调节物结合的那些显著重叠(例如，Foxp3(马尔松(Marson)，A.等人.在T细胞刺激过程中的Foxp3占据和关键靶基因调节(Foxp3occupancyand regulation of key target genes during T cell stimulation).《自然》(Nature)445，931-935，doi:10.1038/nature05478(2007)；郑(Zheng)，Y.等人.在发育中的和成熟的调节性T细胞中的Foxp3靶基因的全基因组分析(Genome-wide analysis of Foxp3 targetgenes in developing and mature regulatory T cells).《自然》(Nature)445，936-940，doi:10.1038/nature05563(2007))，Batf、Irf4和ROR-γt(格拉斯马赫尔(Glasmacher),E.等人.指导免疫特异性AP-1-IRF复合物的装配与功能的一种基因组调节元件(A GenomicRegulatory Element That Directs Assembly and Function of Immune-Specific AP-1-IRF Complexes).《科学》(Science)(纽约，NY)，doi:10.1126/science.1228309(2012)；西奥法尼(Ciofani),M.等人.针对Th17细胞规格的一种验证调节网络(A ValidatedRegulatory Network for Th17 Cell Specification).《细胞》(Cell)，doi:10.1016/j.cell.2012.09.016(2012))，肖(Xiao)等人，未公布的数据)。例如，在敲低‘Th17-正’调节物Mina之后下调的基因在晚期诱导的簇(例如，C19、C20)中是高度富集的(p<10-6)。相反地，在相同的晚期诱导簇中的基因在‘Th17负’调节物Sp4敲低之后变得甚至更被上调。
Mina促进Th17程序并且抑制Foxp3程序：Mina(来自十文字(jumonji)C(JmjC)家族的染色质调节物)的敲低阻遏标签Th17细胞因子和TF的表达(例如ROR-γt、Batf、Irf4)以及晚期诱导的基因(簇C9、C19；p<10-5)的表达，同时增加Foxp3(Treg细胞的主要TF)的表达。在Th17分化期间Mina被强烈地诱导(簇C7)，在IL23r-/-Th17细胞中被下调，并且在该模型(图5a)中是Batf(格拉斯马赫尔(Glasmacher)，E.等人.指导免疫特异性AP-1-IRF复合物的装配与功能的一种基因组调节元件(A Genomic Regulatory Element That DirectsAssembly and Function of Immune-Specific AP-1-IRF Complexes).科学(Science),doi:10.1126/science.1228309(2012))、ROR-γt(格拉斯马赫尔(Glasmacher)等人，《科学》(Science)2012)、以及Myc的预测靶标。Mina通过与TF NFAT相互作用和阻遏IL-4启动子显示出压制Th2偏倚(冈元(Okamoto)，M.等人.Mina，即一种Il4阻遏物，控制T辅助细胞类型2偏倚(Mina,an Il4repressor,controls T helper type 2bias).《自然免疫学》(Nat.Immunol.)10，872-879，doi:10.1038/ni.1747(2009))。然而，在这些细胞中，Mina敲低不会诱导Th2基因，表明经由Mina、Batf和ROR-γt之间的正反馈环路的替代作用模式(图5a，左)。与这种模型一致，在来自ROR-γt-敲除小鼠的Th17细胞中Mina表达被降低，并且通过ChIP-seq发现Mina启动子被ROR-γt结合(数据未示出)。最后，在Treg细胞中通过Mina敲低诱导的基因与Foxp3结合的那些(马尔松(Marson)等人，《自然》(Nature)2007；郑(Zheng)等人，自然(Nature)2007)(P<10-25)以及先前在Treg细胞中与Foxp3活性关联的一个簇(伊尔(Hill)等人，调节性T细胞转录标签的Foxp3转录因子依赖性和非依赖性调节(Foxp3transcription-factor-dependent and-independent regulation of theregulatory T cell transcriptional signature).《免疫》(Immunity)27，786-800，doi:S10747613(07)00492-X[pii]10.1016/j.immuni.2007.09.010(2007))显著重叠(图15c)。当比较于先前定义的Treg细胞转录标签(相比于常规T细胞，(伊尔(Hill)，J.A.等人.调节性T细胞转录标签的Foxp3转录因子依赖性和非依赖性调节(Foxp3transcription-factor-dependent and-independent regulation of the regulatory T cell transcriptionalsignature).《免疫》(Immunity)27，786-800，doi:10.1016/j.immuni.2007.09.010(2007)))，在一个簇中富集在Mina敲低中诱导的基因，该簇紧密地与FoxP3的功能活性关联。相反地，在Treg细胞中在Mina敲低中下调的基因更直接响应于TCR和IL-2并且更少响应于Foxp3(图15c)。
为了进一步分析Mina的作用，在来自Mina-/-小鼠的天然T细胞分化之后对IL-17a和Foxp3表达进行测量。相比于野生型(WT)细胞，Mina-/-细胞具有减少的IL-17a和增加的Foxp3，如通过细胞内染色检测的(图5a)。对相应上清液进行的细胞因子分析确认了在IL-17a产生上的减少以及IFN-γ(图5a)和TNF-α(图16a)上的增加。在Th17分化条件下，Mina的缺失导致IL-17表达上的减少和FoxP3上的增加，如通过细胞内染色所检测的(图5a)。对来自这些分化的培养物的上清液进行的细胞因子分析证实了IL-17产生上的减少，而在IFNγ(图5a)和TNFα(图16a)上有相称的增加。
Treg/Th17细胞之间的互反关系已经被很好描述(科恩(Korn)，T.等人.IL-21引发一个可替代途径以诱导促炎T(H)17细胞.《自然》(Nature)448,484-487,doi:10.1038/nature05970(2007))，并且假定这是通过ROR-γt/Foxp3TF的直接结合实现的。然而，该分析表明调节物Mina对介导这一过程的关键作用。这表明了一个模型，其中由ROR-γt和Batf诱导的Mina促进ROR-γt的转录，同时压制对Foxp3的诱导，因此通过有利于快速Th17分化而影响互反Treg/Th17平衡(科恩(Korn)等人，《自然》(Nature)2007))。
Fas促进Th17程序并压制IFN-γ表达：Fas，即TNF受体超家族成员6，是另一种Th17正调节物(图5b)。Fas在早期被诱导，并且在该模型中是Stat3和Batf的靶标。Fas敲低阻遏关键Th17基因(例如，IL-17a、IL-17f、Hif1a、Irf4、和Rbpj)的和诱导的簇C14的表达，并且促进Th1相关基因的表达，这些Th1相关基因包括IFN-γ受体1和Klrd1(Cd94；通过RNA-Seq，图4，图5b，和图15)。Fas和Fas-配体缺陷小鼠耐受对自身免疫脑脊髓炎(EAE)的诱导(瓦尔德纳(Waldner)，H.、索贝尔(Sobel)，R.A.、霍华德(Howard)，E.&库克罗(Kuchroo),V.K.Fas-以及Fas L-缺陷小鼠耐受对自身免疫免疫脑脊髓炎的诱导(Fas-and FasL-deficient mice are resistant to induction of autoimmune encephalomyelitis).《免疫学杂志》(J Immunol)159，3100-3103(1997))，但在IFN-γ或Th1应答上不具有缺陷。从未研究过这种现象下潜在的机制。
为探索这点，对来自Fas-/-小鼠的T细胞(图5b和16c)进行分化。与该敲低分析一致，IL-17a的表达被强烈阻遏，并且IFN-γ的产生在Th17和Th0极化条件两者下被强烈增加(图5b)。这些结果表明除了是一种死亡受体，Fas在控制Th1/Th17平衡上可以起重要作用，并且Fas-/-小鼠可以耐受归因于缺乏Th17细胞的EAE。
Pou2af1促进Th17程序并压制IL-2表达：敲低Pou2af1(OBF1)强烈减少Th17基因(图5c)和中期-和晚期-诱导的基因(簇C19和C20，p<10-7)的表达，同时增加其他CD4+亚群(例如，Foxp3、Stat4、Gata3)的标签和在未诱导的簇(簇C2和C16p<10-9)中的基因的调节物的表达。尚未探索Pou2af1在T细胞分化中的作用(泰特尔(Teitell)，M.A.B细胞发育和功能的OCA-B调节(OCA-B regulation of B-cell development and function).《免疫学趋势》(Trends Immunol)24，546-553(2003))。为了研究它的作用，将来自Pou2af1-/-小鼠的T细胞进行分化(图5c，图16b)。相比于WT细胞，IL-17a产生被强烈阻遏。有趣的是，在去极化(Th0)的条件下，在Pou2af1-/-T细胞中IL-2的产生被强烈增加。因此，通过阻断IL-2的产生，Pou2af1可以促进Th17分化(Th17细胞的一种已知内源阻遏物)(劳伦斯(Laurence)，A.等人.经由STAT5的白细胞介素-2信号传导约束T辅助17细胞产生(Interleukin-2signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation).《免疫》(Immunity)26，371-381，doi:S10747613(07)00176-8[pii]10.1016/j.immuni.2007.02.009(2007))。Pou2af1充当TFs OCT1或OCT2的转录共激活因子(泰特尔(Teitell)，《免疫学趋势》(TrendsImmunol.)2003)。在Oct1-缺陷细胞中IL-17a的产生也被强烈阻遏(图16d)，表明Pou2af1通过这个辅因子可发挥其效应中的一些。
TSC22d3可以限制Th17分化和促炎功能：TSC22结构域家族蛋白3(Tsc22d3)的敲低增加Th17细胞因子(IL-17a，IL-21)和TF(ROR-γt，Rbpj，Batf)的表达，并且减少Foxp3表达。先前在巨噬细胞中的研究已经显示Tsc22d3表达被糖皮质激素和IL-10刺激，并且Tsc22d3表达在巨噬细胞的抗炎和免疫抑制作用上起关键作用(崔(Choi)，S.-J.等人.Tsc-22通过与Smad4关联而增强TGF-β信号传导并且诱导红系细胞分化(Tsc-22 enhances TGF-beta signaling by associating with Smad4 and induces erythroid celldifferentiation).《分子与细胞生物化学》(Mol.Cell.Biochem.)271，23-28(2005))。在Th17细胞中的Tsc22d3敲低增加IL-10的表达和增加增强其产生的其他关键基因的表达(图5d)。虽然已经显示IL-10产生(科恩(Korn)等人，《自然》(Nature)2007；彼得斯(Peters)，A.、李(Lee)，Y.&库克罗(Kuchroo)，V.K.Th17细胞的许多面(The many faces of Th17cells).当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)《免疫学杂志》(J Immunol.)23，702-706，doi:10.1016/j.coi.2011.08.007(2011)；乔杜里(Chaudhry)，A.等人.需要调节性T细胞中的白细胞介素-10信号传导用于抑制Th17细胞介导的炎症(Interleukin-10 signaling inregulatory T cells is required for suppression of Th17 cell-mediatedinflammation).《免疫》(Immunity)34，566-578，doi:10.1016/j.immuni.2011.03.018(2011))导致Th17细胞在自身免疫性上更少的病原性，IL-10和IL-17a的共生产可以是对清除在粘膜位点的某些感染像金黄色葡萄球菌的指定应答(杰林斯基(Zielinski)，C.E.等人.病原体诱导的人类TH17细胞产生IFN-γ或IL-10并且通过IL-1β来调节(Pathogen-induced human TH17 cells produce IFN-γor IL-10 and are regulated by Il-1β).《自然》(Nature)484，514-518，doi:10.1038/nature10957(2012))。这表明了一个模型，其中Tsc22d3是用于诱导一种Th17细胞亚型的负反馈环路的部分，该Th17细胞亚型共产生IL-17和IL-10并且限制了它们的促炎能力。在其他应答于类固醇地塞米松细胞中Tsc22d3被诱导(京(Jing)，Y.等人.对地塞米松在中国仓鼠卵巢细胞培养物中和缓细胞死亡的影响的机理性研究(A mechanistic study on the effect of dexamethasone in moderatingcell death in Chinese Hamster Ovary cell cultures).《生物技术进展》(BiotechnolProg)28，490-496，doi:10.1002/btpr.747(2012))，其阻遏Th17分化和ROR-γt表达(胡(Hu)，M.、罗(Luo)，Y.L.、赖(Lai)，W.Y.&陈(Chen)，P.F.[地塞米松对哮喘小鼠中Th17细胞因子白细胞介素17的细胞内表达的影响(Effects of dexamethasone on intracellularexpression of Th17 cytokine interleukin 17 in asthmatic mice)].《南方医科大学学报》(Nan Fang Yi Ke Da Tarjan Tarjan Bao)29，1185-1188(2009))。因此，Tsc22d3可以介导类固醇的这种作用。
为了进一步表征Tsc22d3的作用，ChIP-seq被用来测量其在Th17细胞中Tsc22d3的DNA-结合谱并且在Tsc22d3敲低后使用RNA-Seq以测量其功能性影响。在Tsc22d3的功能和物理靶标之间存在一个显著重叠(P<0.01，例如IL-21、Irf4；参见在实例1中的方法)。例如，Tsc22d3邻近地结合到IL-21和Irf4，它们也在Tsc22d3敲低中变得被上调。此外，这些Tsc22d3结合位点与主要Th17因子的那些显著重叠，包括Batf、Stat3、Irf4、以及ROR-γt(>5倍富集；图5d，并且参见在实例1中的方法)。这表明了一个模型，其中作为与Th17正调节物在结合位点上竞争的转录阻遏物，Tsc22d3发挥其Th17负功能，类似于先前在CD4+调节上的发现(西奥法尼(Ciofani)等人，《细胞》(Cell)2012；杨(Yang)，X.P.等人.通过STAT3和STAT5的直接的互相作用对编码IL-17的基因座的相对调节(Opposing regulation of thelocus encoding IL-17 through direct,reciprocal actions of STAT3 and STAT5).《自然免疫学》(Nat.Immunol.)12，247-254，doi:10.1038/ni.1995(2011))。
实例6：蛋白C受体(PROCR)调节Th17细胞的病原性表型
Th17细胞(一种最近鉴定的T细胞亚群)已经牵涉在驱动炎性自身免疫应答连同介导针对某些细胞外病原体的保护性应答中。基于多种因子如分子标签，Th17细胞被分类为病原性或非病原性。(参见例如，李(Lee)等人，“病原性Th17细胞的诱导和分子标签(Induction and molecular signature of pathogenic Th17 cells)”，《自然免疫学》(Nature Immunology)，第13卷(10)：991-999以及在线方法)。[000251]应当注意的是，如本文使用的术语“病原性”或“非病原性”不应被解释为暗示一种Th17细胞表型比另一种更令人希望。如将在本文所述的，存在如下例子，其中抑制对病原性Th17细胞的诱导或调控Th17表型朝向非病原性Th17表型或朝向另一种T细胞表型是令人希望的。同样，存在如下例子，其中抑制对非病原性Th17细胞的诱导或调控Th17表型朝向病原性Th17表型或朝向另一种T细胞表型是令人希望的。例如，病原性Th17细胞被认为在免疫应答如自身免疫和/或炎症中涉及。因此，在治疗或以其他方式改善免疫相关障碍(例如自身免疫疾病或炎性障碍)的症状的治疗策略中，抑制病原性Th17细胞朝向非病原性Th17细胞或朝向另一种T细胞表型分化或者以其他方式降低Th17 T细胞朝向非病原性Th17细胞或朝向另一种T细胞表型的平衡是令人希望的。在另一个实例中，取决于感染，在感染性疾病和其他基于病原体的疾病中建立一种保护性免疫应答方面，非病原性或病原性Th17细胞被认为是令人希望的。因此，在治疗或以其他方式改善免疫相关障碍(如传染性疾病)的症状的治疗策略中，抑制非病原性Th17细胞朝向病原性Th17细胞或朝向另一种T细胞表型分化或者以其他方式降低Th17 T细胞朝向病原性Th17细胞或朝向另一种T细胞表型的平衡(或反之亦然)是令人希望的。
当表现出一种不同的病原性标签时，Th17细胞被认为是病原性的，其中相比于TGF-β1-诱导的Th17细胞，在TGF-β3-诱导的Th17细胞中，以下基因中的一种或多种或这些基因的产物被上调：Cxcl3、Il22、Il3、Ccl4、Gzmb、Lrmp、Ccl5、Casp1、Csf2、Ccl3、Tbx21、Icos、Il7r、Stat4、Lgals3或Lag3。当表现出一种不同的非病原性标签时，Th17细胞被认为是非病原性的，其中相比于TGF-β1-诱导的Th17细胞，在TGF-β3-诱导的Th17细胞中，以下基因中的一种或多种或这些基因的产物被下调：Il6st、Il1rn、lkzf3、Maf、Ahr、Il9或Il10。
进行对发育中的Th17细胞的时间微阵列分析以鉴定细胞表面分子，这些细胞表面分子在Th17细胞中被差异性表达并且调节Th17细胞的发育。PROCR被鉴定为一种受体，该受体在Th17细胞中被差异性表达并且发现其表达被Th17-特异性转录调节物调节。
蛋白C受体(PROCR；也称为EPCR或CD201)主要表达于内皮细胞、CD8+树突细胞上，并且还被报道在其他造血和基质细胞中表达到更低水平。它结合到激活的蛋白C连同因子VII/VIIa和因子Xa，并且显示出具有多样的生物功能，包括抗凝、细胞保护、抗凋亡和抗炎活性。然而，在这些研究之前，尚未探索在T细胞中PROCR的功能。
分析在Th17细胞中PROCR和其配体激活的C蛋白的生物功能，并且发现它降低了被鉴定为Th17细胞的一部分病原性标签的基因中的一些的表达。此外，在Th17细胞中的PROCR表达降低了Th17细胞的病原性并且改善了用于人多发性硬化症的小鼠模型中的疾病。
这些结果意味着PROCR通过其一种或多种配体的结合充当Th17细胞的病原性的一个调节基因。因此可以设想的是对这条通路的调节可能被开发用于炎性和自身免疫疾病的治疗途径。
这些研究是第一个描述了PROCR的Th17-特异性表达及其在减少自身免疫Th17病原性上的作用。因此，通过抗体或其他激动剂激活PROCR被用作免疫应答(例如炎性自身免疫障碍)方面的一种治疗策略。此外，通过抗体或其他抑制物阻断PROCR可能被开发以增大针对某些传染因子和病原体的保护性Th17应答。
PROCR在Th17细胞中表达：膜受体PROCR(蛋白C受体；也称为EPCR或CD201)存在于上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性细胞、嗜酸性细胞、以及天然杀伤细胞上，但其在T细胞上表达先前未报告(格里芬(Griffin)JH、祖科维奇(Zlokovic)BV、莫斯尼尔(Mosnier)LO.2012.蛋白C抗凝血剂和细胞保护性通路(Protein C anticoagulant andcytoprotective pathways).《国际血液学杂志》(Int J Hematol)95：333-45)。然而，本文描述的Th17细胞的详细转录组学分析已经鉴定PROCR为Th17细胞分化的重要节点(优素福(Yosef)N、沙列克(Shalek)AK、高布洛米(Gaublomme)JT、金(Jin)H、李(Lee)Y、阿瓦斯蒂(Awasthi)A、吴(Wu)C、卡瓦兹(Karwacz)K、肖(Xiao)S、乔戈利(Jorgolli)M、根能斯特(Gennert)D、萨提佳(Satija)R、沙卡亚(Shakya)A、陆(Lu)DY、特龙贝塔(Trombetta)JJ、皮莱(Pillai)MR、拉特克利夫(Ratcliffe)PJ、科尔曼(Coleman)ML、比克斯(Bix)M、唐坦(Tantin)D、帕克(Park)H、库克罗(Kuchroo)VK、雷格夫(Regev)A.2013.控制TH17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling TH17 celldifferentiation).《自然》(Nature)496：461-8)。PROCR与CD1/MHC分子共享结构同源性并且结合激活的蛋白C(aPC)连同凝血因子VII和γδT细胞的Vγ4Vδ5TCR。由于其短的胞质尾区，PROCR不直接发信号，而是通过与G-蛋白偶联受体PAR1关联发信号(图30a)；(格里芬(Griffin)等人，《国际血液学杂志》(Int J Hematol)95：333-45(2012)))。为了分析PROCR在Th亚群上的表达，将CD4+T细胞在极化条件下进行体外分化，并且确定PROCR表达。如通过Th17细胞的网络分析指出的，高水平的PROCR可以在Th17条件下分化的细胞中检测到(图31b)。为了研究在免疫应答过程中PROCR在Th17细胞上的表达，将小鼠用MOG/CFA免疫以诱导EAE。PROCR不表达于脾和淋巴结中的T细胞上。相反，它可以在浸润CNS的Th17细胞上检测到(图31c)。这些数据表明PROCR在Th17细胞上在体外和在体内表达，其中它很大程度上局限于浸润靶器官的T细胞。为了调研在Th17细胞中PROCR的功能，设计研究使用来自一个PROCR亚等位基因突变体(PROCRd/d)的T细胞以测试PROCR的缺失如何影响IL-17产生。PROCR缺乏引起早期胚胎致死性(胎龄10.5)(顾(Gu)JM、克劳利(Crawley)JT、费雷尔(Ferrell)G、张(Zhang)F、李(Li)W、艾斯蒙(Esmon)NL、艾斯蒙(Esmon)CT.2002.在小鼠中的内皮细胞蛋白C受体基因的破坏引起胎盘血栓形成和早期胚胎致死性(Disruption of theendothelial cell protein C receptor gene in mice causes placental thrombosisand early embryonic lethality).《生物化学期刊》(J Biol Chem)277:43335-43)，而PROCR的亚等位基因表达(保留仅少量(<10％的野生型)的PROCR)足以完全消除致死性并且小鼠通常在稳定状态条件下发育(卡斯特里诺(Castellino)FJ、梁(Liang)Z、沃尔基尔(Volkir)SP、霍尔博姆(Haalboom)E、马丁(Martin)JA、桑多瓦尔-库珀(Sandoval-Cooper)MJ、罗斯(Rosen)ED.2002.严重缺乏内皮蛋白C受体基因的小鼠通常发展、存活、以及繁殖，并且在激发之后不存在增强的动脉血栓形成(Mice with a severe deficiency of theendothelial protein C receptor gene develop，survive，and reproduce normally，and do not present with enhanced arterial thrombosis after challenge).《血栓形成和止血杂志》(Thromb Haemost)88:462-72)。当在一个模型中针对败血性休克进行激发，PROCRd/d小鼠相比于WT小鼠显示受损的存活(易威奇(Iwaki)T、克鲁兹(Cruz)DT、马丁(Martin)JA、卡斯特里诺(Castellino)FJ.2005.在小鼠中内皮蛋白C受体在脂多糖诱导的内毒素血症中的心脏保护作用(A cardioprotective role for the endothelialprotein C receptor in lipopolysaccharide-induced endotoxemia in the mouse).《血液》(Blood)105：2364-71)。在Th17条件下分化的天然CD4+PROCRd/d T细胞相比于WT天然CD4+T细胞产生更少IL-17(图31d)。用IL-23培养的效应子记忆PROCRd/d T细胞相比WT记忆T细胞产生更多IL-17。因此，类似于PD-1，PROCR促进由天然CD4T细胞产生Th17细胞，但是抑制Th17效应T细胞的功能。
在肿瘤模型中PROCR的敲低分析：图44是描绘PROCR突变小鼠的B16肿瘤接种的一个图表。将7周龄野生型或PROCR突变(EPCRδ)C57BL/6小鼠用5x105个B16F10黑色素瘤细胞进行接种。如在图44中所示，PROCR的抑制减慢肿瘤生长。因此，抑制PROCR有用于阻碍肿瘤生长以及其他用于治疗癌症的治疗应用。
PD-1和PROCR影响Th17病原性：Th17细胞是非常多相的并且Th17亚群的病原性取决于其分化过程中的细胞因子环境而不同(杰林斯基(Zielinski)CE、米尔(Mele)F、艾森布伦纳(Aschenbrenner)D、雅罗塞伊(Jarrossay)D、龙基(Ronchi)F、加托诺(Gattorno)M、蒙蒂塞利(Monticelli)S、兰扎韦基亚(Lanzavecchia)A、赛尔洛士托(Sallusto)F.2012.病原体-诱导的人类TH17细胞产生IFN-γ或IL-10并且通过IL-1β来调节(Pathogen-inducedhuman TH17 cells produce IFN-gamma or IL-10 and are regulated by Il-1beta).《自然》(Nature)484：514-8；李(Lee)Y、阿瓦斯蒂(Awasthi)A、优素福(Yosef)N、奎塔纳E(Quintana)FJ、彼得斯(Peters)A、肖(Xiao)S、克莱因埃维特菲尔德(Kleinewietfeld)M、昆德尔(Kunder)S、索贝尔(Sobel)RA、雷格夫(Regev)A、库克罗(Kuchroo)V.2012.病原性Th17细胞的诱导和分子标签(Induction and molecular signature of pathogenic Th17cells).《自然免疫学新闻报导》(Nat Immunol In press)；以及古尔埃斯齐(Ghoreschi)K、劳伦斯(Laurence)A、杨(Yang)XP、天泰(Tato)CM、麦克赫亚(McGeachy)MJ、康凯尔(Konkel)JE、拉莫斯(Ramos)HL、伟(Wei)L、戴维森(Davidson)TS、布拉度科斯(Bouladoux)N、格兰杰(Grainger)JR、陈(Chen)Q、菅野(Kanno)Y、沃特福德(Watford)WT、孙(Sun)HW、埃贝尔(Eberl)G、舍瓦奇(Shevach)EM、拜耳卡德(Belkaid)Y、瓜(Cua)DJ、陈(Chen)W、殴谢伊(O’Shea)JJ.2010.在不存在TGF-β信号传导的情况下病原性T(H)17细胞的产生(Generationof pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling).《自然》(Nature)467：967-71)。除了细胞因子环境，若干共刺激途径已经牵涉在调节T辅助亚群(包括Th17细胞)的分化和功能中。CTLA-4-B7相互作用抑制Th17分化(莹(Ying)H、杨(Yang)L、乔(Qiao)G、李(Li)Z、张(Zhang)L、银(Yin)F、谢(Xie)D、张(Zhang)J.2010.切割边缘：CTLA-4--B7相互作用抑制Th17细胞分化(Cutting edge:CTLA-4--B7interaction suppressesTh17 cell differentiation).《免疫杂志》(J Immunol)185：1375-8)。此外，本文所描述的工作揭示了ICOS在Th17细胞维持中起到关键作用(保桂特(Bauquet)AT、金(Jin)H、帕特森(Paterson)AM、密兹杜尔费尔(Mitsdoerffer)M、霍(Ho)IC、夏普(Sharpe)AH、库克罗(Kuchroo)VK.2009.共刺激分子ICOS调节c-Maf和IL-21在毛囊T辅助细胞和TH-17细胞的发育中的表达(The costimulatory molecule ICOS regulates the expression of c-Mafand IL-21 in the development of follicular T helper cells and TH-17 cells).《自然免疫学》(Nat Immunol)10:167-75)。
基于对本文的病原性与非病原性Th17细胞的详细基因组分析，已经确定限定自身免疫疾病中的病原性与非病原性效应子Th17细胞的分子标签(李(Lee)Y、阿瓦斯蒂(Awasthi)A、优素福(Yosef)N、奎塔纳E(Quintana)FJ、彼得斯(Peters)A、肖(Xiao)S、克莱因埃维特菲尔德(Kleinewietfeld)M、昆德尔(Kunder)S、索贝尔(Sobel)RA、雷格夫(Regev)A、库克罗(Kuchroo)V.2012.病原性Th17细胞的诱导和分子标签(Induction andmolecular signature of pathogenic Th17 cells).《自然免疫学新闻报导》(NatImmunol In press))。有趣的是，PROCR是针对非病原性Th17细胞的标签的部分，并且在非病原性亚群中其表达被高度增加(图32a)。此外，PROCR似乎在调节Th17病原性方面发挥功能性作用，因为其配体aPC对PROCR的接合诱导一些非病原性标签基因，而来自PROCRd/d小鼠的Th17细胞表现出这些基因降低的表达(图32b)。为了研究在自身免疫的体内模型中，PROCR是否也可影响Th17细胞的病原性，使用针对EAE的过继性转移模型。为了诱导疾病，在Th17条件下将MOG-特异性2D2 TCR转基因T细胞进行分化，并且然后转移至天然的接受者。如在图32c所示，PROCR在Th17细胞上强加的过表达改善疾病，证实PROCR驱动病原性细胞朝向非病原性Th17细胞转化。此外，发现PD1:PD-L1相互作用限制效应子Th17细胞在体内的病原性。当将MOG35-55-特异的(2D2)Th17效应子细胞转移到WT与PD-L1-/-小鼠中，PD-1-L1-/-接受者迅速发展EAE的病征(早在转移后第5天)，并且EAE严重性明显增高，其中由于在PD-L1-/-接受者中发病率的快速发作，大多数实验需要被终止(图32d)。CNS浸润细胞的数目在PD-L1-/-接受者中显著增加，其中相比于WT小鼠，在PD-L1-/-接受者中的2D2+IL-17+百分数更大。因此PD-1和PROCR两者似乎控制效应子Th17细胞的病原性。
若干共抑制分子已经在抗原持久性过程中牵涉在T细胞功能障碍中。具体地，PD-1和Tim-3在癌症和慢性病毒感染(例如人类中的HIV、HCV和小鼠中的LCMV)中具有广泛意义。在小鼠和人类中的自身反应性T细胞应答特征是降低抑制性分子的表达。在自身免疫环境中诱导T细胞功能障碍的能力可以是临床上有益的。响应于克帕松(Copaxone)治疗的MS患者显示出PROCR和PD-L1的显著升高的表达水平。先前已经证实了增加Tim-3表达和促进T细胞耗尽提供了限制T细胞的脑炎原性(encephalitogenecity)的能力并且降低EAE严重性(兰加查里(Rangachari)M、朱(Zhu)C、萨库西(Sakuishi)K、肖(Xiao)S、卡曼(Karman)J、陈(Chen)A、安金(Angin)M、维克哈姆(Wakeham)A、格林菲尔德(Greenfield)EA、索贝尔(Sobel)RA、奥卡达(Okada)H、麦克金农(McKinnon)PJ、马克(Mak)TW、阿多(Addo)MM、安德森(Anderson)AC、库克罗(Kuchroo)VK.2012.Bat3通过阻遏Tim-3-介导的细胞死亡和耗尽而促进T细胞应答和自身免疫(Bat3 promotes T cell responses and autoimmunity byrepressing Tim-3-mediated cell death and exhaustion).《自然方法》(Nat Methods)18:1394-400)。因此，设计研究来确定该新颖的抑制分子PROCR是否也可在T细胞耗尽中起作用，该抑制分子PROCR选择性地富集在Th17细胞中。发现PROCR被表达于疲劳的肿瘤浸润淋巴细胞中，这些淋巴细胞表达PD-1和Tim-3两者(图33a)。与这个观察一致，发现在慢性LCMV感染过程中在抗原特异性的疲劳的CD8 T细胞中PROCR最是富集(图33b)。虽然在慢性病毒感染和肿瘤免疫中T细胞耗尽是有害的，对耗尽的诱导可以在控制潜在病原性效应子细胞方面起有益作用，这些效应子细胞引起自身免疫疾病。调节PD-1和PROCR的表达和/或功能可能提供途径来在控制自身免疫性方面完成这个任务。
实例7：在Th细胞分化方面的Fas
Fas，也称为Fas R、CD95、APO-1、TNFRSF6，是TNF受体超家族的一个成员。FasL的结合导致FAS三聚体，这些FAS三聚体结合FADD(死亡结构域)，该FADD激活半胱天冬酶-8并导致细胞凋亡。Fas也表现出独立于凋亡的作用，如在肝脏细胞中与Akt、STAT3以及NF-κB的相互作用，和在癌症细胞与NF-κB和MAPK途径的相互作用。
Lpr小鼠对于Fas(转座子内含子1)是负显性的，产生一种功能性敲除(KO)。这些小鼠表现出淋巴细胞增生性疾病(lpr)；LN的>25倍的年龄依赖性大小增加，脾；Thy1+B220+CD4-CD8-TCRa/b+T细胞的膨胀。这些小鼠产生自发的抗-dsDNA Ab，全身性自身免疫性，这使得它们成为系统性红斑狼疮(SLE)的一个模型，但这些小鼠耐受实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)。Gld小鼠对于FasL是负显性的。Fas flox小鼠(是CD4Cre-/CD19Cre-/CD4Cre-CD19Cre-/Lck Cre-Fasflox)不表现出淋巴组织增生且不表现出Thy1+B220+CD4-CD8-TCRa/b+T细胞的膨胀。这些小鼠表现出进行性淋巴细胞减少、炎性肺纤维化、以及消耗综合征。Fas flox小鼠(是Mx Cre+聚(IC)-Fasflox)表现出lpr表型。Fas flox小鼠(是MOGCre-Fasflox)是EAE抗性的。Fas flox小鼠(是LysMCre-Fasflox)表现出淋巴组织增生以及肾小球肾炎。
虽然Fas(CD95)已经被鉴定为一种介导凋亡的受体，本文此的数据清楚地表明，Fas对于Th17分化和EAE发展是重要的。本文的数据证实了Fas-缺陷小鼠在Th17细胞分化方面具有缺陷并且优先分化成Th1以及Treg细胞。在Fas-缺陷小鼠中Treg细胞的膨胀和Th17细胞的抑制可能对EAE方面的疾病抗性负责。
Fas-缺陷细胞的分化为Th17细胞的能力受损，并且当在Th17条件下在体外培养时，它们产生显著更低水平的IL-17(IL-1β+IL-6+IL-23)。此外，它们展现了降低水平的IL-23R，这对于Th17细胞是关键的，因为对于Th17稳定性和病原性需要IL-23。相比之下，Fas抑制IFN-γ产生和Th1分化，因为来源于Fas-缺陷小鼠的细胞分泌显著更高水平的IFN-γ。类似地，Fas-缺陷细胞更容易地分化为Foxp3+Treg并且分泌更高水平的Treg效应子细胞因子IL-10。因此，似乎Fas压制分化成Treg和IFN-γ-产生型Th1细胞，同时促进Th17分化。因此，在炎性自身免疫障碍(如EAE)中，通过改变T辅助细胞中的平衡远离保护性Treg和远离IFN-γ-产生型Th1细胞而朝向病原性Th17细胞，Fas似乎促进疾病进展。
实例8：在Th17病原性状态调控中靶向CD5L
CD5L(CD5抗原样；AIM(巨噬细胞的凋亡抑制物))已被鉴定为Th17病原性状态的新颖调节物。CD5L是属于巨噬细胞清除剂受体富含半胱氨酸结构域超家族的54-kD蛋白；其他家族成员包括CD5、CD6、CD36、MARCO等。CD5L是通过巨噬细胞和脂肪细胞来表达的并且通过CD36掺入到细胞中(黒川(Kurokawa)J.等人，2010)。CD5L可以通过RXR/LXR的激活来诱导(威莱多尔(Valledor)AF等人，2004)并且抑制脂质诱导的胸腺细胞和巨噬细胞的凋亡。CD5L涉及肥胖症相关自身抗体产生(新井(Arai)S等人，2013),并且在脂质代谢中发挥一定作用。CD5L促进脂肪细胞中的脂类分解，潜在预防肥胖症发作(宫崎(Miyazaki)T等人，2011)并且通过抑制脂肪酸合酶来抑制从头脂质合成(黒川(Kurokawa)J.等人，2010)。
图34A-34C是一系列图表，展示了CD5L在Th17细胞上的表达。图35A-35C是一系列说明和图表，描绘了CD5L缺乏如何不会改变Th17分化。图36A-36C是一系列说明和图表，描绘了CD5L缺乏如何通过影响存活或稳定性来改变Th17记忆。
图37A-37B是一系列图表，描绘了CD5L缺乏如何导致更严重且持久的EAE与更高的Th17应答。图38A-38C是一系列说明和图表，描绘了CD5L的缺失如何将非病原性Th17细胞转化为病原性效应子Th17细胞。图39A-39B是一系列图表，描绘了CD5L-缺陷Th17细胞(TGF-β+IL-6)如何发展为病原性表型。
实例9：功能性Th17数据的单细胞分析
可以用于治疗和/或诊断用途的靶基因的单细胞分析允许鉴定基因，这些基因在群体水平下不能被鉴定或者在群体水平下作为适合的靶基因不是显而易见的。
单细胞RNA测序提供了表征不同亚型的Th17细胞并且更好地理解在其异质性和可塑性下的调节机制的独特机会。具体地而言，本文描述的这些研究被设计来鉴定Th17细胞体外和体内的亚群，并且来映射发挥作用的潜在不同机制。这些结果提供了在自身免疫疾病的治疗中治疗相关性潜力的重要机制性的见解。
使用微流体技术(富鲁达C1)用于制备单细胞mRNA SMART-Seq文库，在两个时间点(48h和96h进入分化过程)，在病原性和非病原性极化条件下，将分化的Th17细胞(一次96个细胞)进行体外图谱绘制。此外，在用实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE；多发性硬化症的小鼠模型)进行免疫的小鼠的疾病峰值下，将分离自中枢神经系统和淋巴结的Th17细胞进行图谱绘制。然后开发计算流程用于处理并且分析得到的数据集(总共约1000种细胞)。这些结果提供了在单细胞水平下所观察到的表达模式、表达方式(即标绘基因是如何跨群体表达的图谱)、以及可变性(即基因的表达水平调控如何严格)的来源以及功能含义方面的有利点。
例如，发现标签细胞因子IL-17A表现出在细胞的体外转录组中可变性的最高水平之一。这种变化与细胞无监督分割成亚群呈强烈相关，该无监督分割跨越潜在病原性细胞(高水平的IL-17A和低水平的免疫抑制细胞因子，像IL-10)至非病原性细胞(相反的表达谱)之间的谱。
表征两种极端状态的特定基因提供了吸引人的靶基因并且包括通过之前的、群体水平方法没有检测到的候选物(优素福(Yosef)，N.等人，控制TH17细胞分化的动态调节网络(Dynamic regulatory network controlling TH17cell differentiation.)《自然》(Nature)496,461-468,doi:10.1038/nature11981(2013))。为了鉴定最有希望的靶基因，开发将单细胞RNA-seq结果与信息的多个其他来源(例如，转录因子结合)组合的基因优化方案。然后进一步使用对应的敲除小鼠分析高排名靶标。
以下提供了诱导各种T细胞表型的单细胞分析方法和条件：
条件Th0：将细胞用CD3/CD28激活，而作为对照没有向介质添加细胞因子
条件T16：CD3/CD28激活+TGFβ1+Il6添加到介质中以产生非病原性Th17条件
条件T36：CD3/CD28激活+TGFβ3+IL6添加到介质中以产生病原性Th17条件
条件B623：CD3/CD28激活+IL1β+IL6+IL23添加到介质中以产生病原性Th17条件
条件T：CD3/CD28激活+TGFβ1添加到介质中以产生Treg条件
在条件Th0下，激活细胞的增殖，但是这些细胞没有朝特定结果受到影响。在条件T16、T36和B623下，如上所指出的，该激活的、增殖的细胞朝特定Th17细胞结果而受到影响。同样，如在此使用的术语“病原性”或“非病原性”不应被解释为暗示一种Th17细胞表型比其他表型是更令人希望的。它们被用于暗示具有不同鉴定特征的不同Th17细胞表型。
在本文描述的研究中使用以下方法：小鼠：C57BL/6野生型，CD4-/-(2663)。小鼠获得自杰克逊实验室。IL-17A–GFP小鼠来自百奥赛图公司(Biocytogen)。另外，杨力(YangLi)提供了来自GPR65-/-小鼠的脾和淋巴结。ZBTB32-/-小鼠获得自皮埃尔·保罗·潘多尔菲实验室。细胞分选和体外T-细胞分化：将Cd4+T细胞使用抗-CD4微珠从脾和淋巴结进行纯化(美天旎生物科技公司(Miltenyi Biotech))，然后在室温下在具有1％FCS的PBS中用抗-CD4-PerCP、抗-CD62l-APC、以及抗-CD44-PE抗体(所有都属生物传奇公司(Biolegend))染色20分钟。使用BD FACSAria细胞分选仪对天然CD4+CD62l高CD44低T细胞进行分选。将分选的细胞在存在细胞因子的情况下用板结合的抗-CD3(2μg ml-1)以及抗-CD28(2μg ml-1)激活。针对TH17分化，使用以下试剂：2ng/ml重组人类TGF-β1和重组人类TGF-β3(美天旎(Miltenyi Biotec))、25ng/ml重组小鼠IL-6(美天旎)、20ng/ml重组小鼠IL-23(R&D生物系统公司(R&D Biosystems))和20ng/ml重组小鼠IL-1β(美天旎)。将细胞培养48-96 h并且收集RNA，细胞内细胞因子染色，原位杂交。
CyTOF和流式细胞术：EAE的主动诱导和疾病分析：针对EAE的主动诱导，通过皮下注射CFA中的100μg MOG(35-55)(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)(SEQ ID NO:1395)对小鼠进行免疫，然后在第0天和第2天经腹腔内接受200ng百日咳毒素(李斯特生物实验室(ListBiological Laboratory))。根据以下标准，针对EAE的经典和非典型迹象的发展，监测小鼠并且每日指定分数：0，没有疾病；1，降低的尾调或轻微的平衡缺陷；2，后肢无力、部分瘫痪或引起自发性摔倒的严重平衡缺陷；3，完全后肢瘫痪或妨碍行走的非常严重的平衡缺陷；4，前后肢瘫痪或无法移动体重到不同的位置；5，濒死状态(盖尔(ger)，A.，达尔达霍恩(Dardalhon)，V.，索贝尔(Sobel)，R.A，百特利(Bettelli)，E.和库克罗(Kuchroo)，V.K.，Th1、Th17、和Th9效应细胞诱导具有不同病理表型的实验性自身免疫脑脊髓炎(Th1,Th17,and Th9 effector cells induce experimental autoimmune encephalomyelitis withdifferent pathological phenotypes)，《免疫学杂志》(Journal of immunology)183,7169-7177,doi:10.4049/jimmunol.0901906(2009))。
在疾病峰值下从EAE小鼠分离T细胞：在疾病峰值下，从引流淋巴结和CNS收集小鼠T细胞。为了从CNS中分离，通过心脏的左心室用冷PBS对小鼠进行灌注。用PBS，通过液体静压力，将脑和脊髓冲出。将CNS组织用锋利的刀片切碎，并且在37℃下，用胶原酶D(2.5mg/ml；罗氏诊断公司(Roche Diagnostics))和DNA酶I(1mg/ml；西格玛公司(Sigma))消化20min。将单核细胞通过使组织穿过细胞过滤网(70μm)、随后通过Percoll梯度(37％和70％)离心来进行分离。在去除单核细胞之后，将淋巴细胞进行洗涤，染色并且针对CD3(生物传奇公司)、CD4(生物传奇公司)、7AAD和IL17a-GFP或FOXP3-GFP进行分选。
全转录组扩增：细胞裂解和SMART-Seq(姆斯科尔博(amskold)，D.等人，来自单细胞水平的RNA以及单独的循环肿瘤细胞的全长mRNA-Seq(Full-length mRNA-Seq fromsingle-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells)，自然生物技术(Nature Biotechnology)30，777-782(2012))全转录组扩增(WTA)是在C1芯片上使用C1单细胞自动制备系统(C1系统)使用SMARTer超低RNA试剂盒(SMARTer Ultra Low RNA Kit)进行，以用于亿明达测序(Clontech)，其中具有以下改变：
细胞裂解混合物:
组成 母液浓度 体积
C1加载试剂 20X 0.60ul
SMARTer试剂盒RNA酶抑制物 40x 0.30ul
SMARTer试剂盒3’SMART CDS引物II A 12μM 4.20ul
SMARTer试剂盒稀释缓冲液 1X 6.90ul
循环条件I：
a)72℃，3min
b)4℃，10min
c)25℃，1min
逆转录(RT)反应混合物:
循环条件II：
a)42℃，90min
b)70℃，10min PCR Mix：
循环条件III：
a)95℃，1min
b)5个循环：
i)95℃，20s
ii)58℃，4min
ii)68℃，6min
c)9个循环：
i)95℃，20s
ii)64℃，30s
ii)68℃，6min
d)7个循环：
i)95℃，30s
ii)64℃，30s
ii)68℃，7min
e)72℃，10min
文库制备和RNA-Seq：从C1芯片收获WTA产物，并且根据制造商的建议，以微小修饰使用Nextera XT DNA样品制备试剂(亿明达公司(Illumina))来制备cDNA文库。具体地，反应在1/4推荐体积下进行，将标记步骤延长至10分钟，并且在PCR步骤期间的延长时间从30s增加到60s。在该PCR步骤之后，将所有96个样品进行聚池而不进行文库标准化，用0.9xAMPure XP SPRI珠粒(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))清洗两次，并且在缓冲液TE中洗脱。将聚池的文库使用Quant-IT DNA高-灵敏度测定试剂盒(英杰公司(Invitrogen))进行定量，并且使用高灵敏度DNA芯片(安捷伦(Agilent))检查。最后，将样品使用HiSeq2000或HiSeq 2500测序仪进行深入地测序。
群体对照的RNA-Seq：根据制造商的建议，通过使用RNeasy plus微小RNA试剂盒(RNeasy plus Micro RNA kit)(凯杰公司(Qiagen))提取总RNA而产生群体对照。随后，将1μL在水中的RNA添加至2μL的裂解反应混合物，使用循环条件I(如上文)进行热循环。接着，添加4μL的RT反应混合物并且将该混合物使用循环条件II(如上文)进行热循环。最后，将1μL的总RT反应添加至9μL的PCR混合物并且将该混合物使用循环条件III(如上文)进行热循环。将产物进行定量，稀释至0.125ng/μL，并且如以上制备、清洁和测试文库。
流式细胞术和细胞内细胞因子染色：将分选的天然T细胞在通过用抗体染色检测之前用佛波醇-12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)(50ng/ml，西格玛-奥德里奇(Sigma-aldrich))、伊屋诺霉素(1 μg/ml，西格玛-奥德里奇)以及含有莫能星(Golgistop)(BD生物科学公司(BD Biosciences))的一种蛋白质运输抑制物刺激4h。将表面标记在室温下在有1％FCS的PBS中染色20分钟，然后随后将细胞固定在Cytoperm/Cytofix(BD生物科学公司)中，用透化/洗涤缓冲液(Perm/Wash Buffer)(BD生物科学公司)透化并且用生物传奇公司(Biolegend)轭合抗体即布瑞安紫罗兰(Brilliant violet)650抗小鼠IFN-γ(XMG1.2)和别藻蓝素–抗-IL-17A(TC 11-18H10.1)染色，稀释于如14所描述的透化/洗涤缓冲液。Foxp3染色是由e生物科学公司(eBiosciences)根据它们的‘针对细胞内(核)蛋白质的一步方案(Onestep protocol for intracellular(nuclear)proteins)’用Foxp3染色试剂盒(00-5523-00)进行的。使用FACS Calibur或LSR II(二者都属BD生物科学公司(BDBiosciences))收集数据，然后使用Flow Jo软件(Treestar)分析。
使用ELISA对细胞因子分泌的定量：如上所述培养来自敲除小鼠和其野生型对照的天然T细胞，在48h和96h之后收集它们的上清液，并且根据制造商的说明书，通过ELISA(来自BD生物科学公司的用于IL-17和IL-10的抗体)或通过用于指定的细胞因子的细胞计数珠粒阵列(BD生物科学公司)测定细胞因子浓度。
RNA-表达的RNA-流式荧光原位杂交法(RNA-FlowFish)分析：遵循制造商方案，用来自昂飞公司的ViewRNA ISH细胞测定试剂盒制备在与RNA-seq样品相同条件下所制备的细胞。在60倍放大下，用ImageStream X MkII的高通量图像采集允许单细胞的高分辨率图像(包括亮视野)的分析。通过类型1探针靶向感兴趣的基因，通过类型4探针靶向管家基因，并且用dapi染色细胞核。基于细胞属性像面积、纵横比(亮视野图像)和细胞核染色来选择单细胞。作为阴性对照，使用细菌DapB基因(类型1探针)。用amnis IDEAS软件进行点计数，来获得表达分布。
蛋白表达的CyTOF分析：培养体外分化细胞并且在72h处收获，随后进行与以上描述的流式细胞术方案类似的3h刺激。随后，如之前所述15制备样品。将分离自报告基因小鼠的淋巴结和CNS的体内细胞(由于其数量有限)嵌入分离自CD4-/-小鼠的CD3+T-细胞池中，以允许适当的样品制备。将来自CD4-/-小鼠的细胞染色，并且针对CD3+CD4-7AAD-细胞进行分选，以确保在CyTOF染色期间，获得低量的CD4+染色，并且可以经由电脑模拟鉴别来自LN和CNS的CD4+细胞。
在Th17分化期间单细胞的RNA-seq作图：将体外分化的CD4+天然T细胞的mRNA水平在两种类型的极化条件下进行作图：Tgfβ1+IL6和Tgfβ3+IL6。虽然两种治疗都导致了IL17-产生(古尔埃斯齐(Ghoreschi)，K.，劳伦斯(Laurence)，A.，杨(Yang)，X.P.，平原(Hirahara)，K.&O’谢伊(Shea)，J.J.，自身免疫疾病中T辅助17细胞异质性和致病性(Thelper 17 cell heterogeneity and pathogenicity in autoimmune disease)《免疫学发展趋势》(Trends Immunol)32,395-401(2011))，只有后者当过继性转移时导致自身免疫(奥斯坦(ostins)，L.等人，宿主-微生物相互作用塑造了炎性肠病的遗传架构(Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatorybowel disease)，《自然》(Nature)485，119-124(2012))。微流体芯片(富鲁达C1)用于单细胞mRNA SMART-Seq文库的制备。每个极化状态是在进入分化过程的48hr和96hr处取样。除这些单细胞RNA-seq文库之外，在每个条件重复两次的情况下并且在1500万读数的平均深度下，还测序了至少10,000种细胞的其对应大部分群体。
使用Top-Hat，将RNA-seq读数与小鼠基因组的NCBI构造37(UCSC mm9)进行比对。通过Cufflinks来处理得到的比对，以评估转录物的表达。还使用了基于RSEM(通过期望最大化的RNA-Seq)软件用于mRNA定量的替代流程。除非另有说明，用这种替代流程获得的结果类似于本文呈现的结果。
针对每个文库，计算文库质量度量学，如基因组比对率、核糖体RNA污染、以及3’或5’范围偏差。过滤具有这些参数的低值的细胞；剩余细胞(约80％的总体描绘的细胞)具有类似的质量度量学。作为另外的预处理步骤，减去显著地(p<1e-3)与文库质量度量学相关的主成分。最后，除非另有说明，丢弃来自在至少20％的样品细胞中没有明显表达(每百万每千碱基外显子的片段(FPKM)>10)的每种样品的基因，保持针对体外样品的平均约6k基因以及针对体内样品的约3k基因。
虽然群体重复的基因表达水平与彼此紧密相关(皮尔逊(Pearson)r>0.97，对数标度)，在单独细胞之间存在基因表达谱的实质差异(0.72<r<0.82，均值：0.78；图1b)。尽管这种广泛的细胞到细胞变化，但在所有单细胞中的平均表达与群体数据有很好的相关性(r>0.92)。
单细胞谱揭示了IL17-相关的体外异质性：考虑到来自用Tgfβ1+Il6分化的细胞中单独基因的表达的分布，观察到了广谱的行为。在所有细胞中，约40％所分析的基因是组成性地表达。让人欣慰的是，这组基因高度富含管家基因(p<x)。然而，还看到了TH17标签细胞因子(例如，IL17f、IL9和IL21)和早期作用的转录因子(例如，Rorc、Irf4、Batf、Stat3、Hif1a、和Mina)的组成型表达。剩余的基因表现出双峰表达模式，在至少20％的细胞中具有高mRNA水平并且在剩余细胞中具有低出很多(通常不能检测到)的水平。有趣的是，这些双峰基因包括关键的TH17标签细胞因子、趋化因子及其受体(例如，IL23r、IL17a、Ccl20)。还针对来自IL-10家族的调节性细胞因子(IL10、IL24、IL27ra)，看到了双峰性，如之前在群体水平的数据中所观察到的。最后，针对表征其他T细胞谱系的转录因子和细胞因子，看到了小部分的表示(通常<30％的细胞)(例如，IL12rb2、Stat4[Th1]、Ccr4、和Gata3[Th2]、和低水平的Foxp3[iTreg])。来自IL10模块的基因的表达可能代表了自我限制机理，其在细胞的亚群中是有活性的并且可以在用Tgfβ1分化的TH17细胞的‘非病原性’作用中发挥作用。来自其他T细胞亚群的表达可以表示样品被非Th17细胞污染，或者，而是反映了“杂交体”双阳性细胞的更复杂的图。
执行高通量高分辨率的流式RNA-荧光原位杂交技术(RNA-FlowFISH)(无扩增成像技术)来验证单细胞表达数据中的异质性反应了真正的生物学差异，而非文库制备偏差和与少量细胞RNA的扩增相关的技术噪音。针对9个基因，选择来覆盖宽范围的表达和变化水平，通过RNA-流式荧光原位杂交法检测的异质性紧密反映了测序数据。例如，管家基因(如β-肌动蛋白(Actb)和β2-微球蛋白(B2m))和关键Th17转录因子(例如，Rorc、Irf4、Batf)的表达匹配单细胞RNA-Seq和RNA-FISH测量中的对数正态分布。相比之下，其他标签基因(例如，IL17a，IL2)显著示出了更高水平的异质性，概括了RNA-SEQ结果。
细胞亚群的鉴定：为了量化这种行为，改编了夏来科(Shalek)等人的模型(夏来科(Shalek)等人“单细胞转录组学揭示了表达中的双峰和免疫细胞中的剪接(Single-celltranscriptomics reveals bimodality in expression and splicing in immunecells)”《自然》(Nature)，2013年5月19日，doi:10.1038/nature1217)，该模型使用三种参数描述了跨细胞的既定基因的分布：(α)–表达细胞的％；(Σ)：针对这些表达细胞，表达的标准差；和(μ)：针对这些表达细胞，表达的平均水平。在这种改编的模型中，这些参数是通过将表达分布与两个分布的混合物-模型拟合来推断：表达细胞的对数正态分布和非表达细胞的指数分布。有趣的是，发现标签细胞因子IL17a表现出在细胞的体外转录中变异性的最高水平之一。另外的细胞因子、趋化因子及其受体，包括Ccl20、IL2、IL10、IL9和IL24，是在高度可变的基因中。虽然这些关键基因表现出强可变性，但是尚不清楚这些模式对细胞状态的情报性到什么程度。为了对此调研，计算各种CD4+谱系和所有其他所表达的基因之间的相关性。群集该图谱揭示了调节性细胞因子(IL10模块)和促炎分子(IL17，Rorc)之间的明显的区别。来自IL10模块的表达可能代表了自我限制机理，其在细胞的亚群中是有活性的并且在用Tgfβ1分化的TH17细胞的‘非病原性’作用中发挥作用。
为了对此调研，对细胞空间进行主成分分析。发现，PCA可以适当地从不表达IL17a的细胞中分离IL17a表达细胞。另外，发现，前面的PC与IL17a正相关并且与IL10负相关。因此，前面的两个PC的空间中细胞的描绘跨越潜在病原性细胞(高水平的IL-17a和低水平的免疫抑制细胞因子，像IL-10)到非病原性细胞(相反的表达谱)之间的谱。这些PC通过计算与其他细胞特性的相关性来表征。
GPR65促进Th17分化并且压制IL2：第一组实验鉴定了靶基因GPR65，其为遗传学上与自身免疫障碍(如多发性硬化症、强直性脊柱炎、炎症性肠病、和克罗恩病)相关联的糖鞘脂受体。GPR65已示出与和炎症应答相关联的基因的模块(本文称为IL17模块)的正相关，并且与和调节性细胞因子谱相关联的基因的模块(本文称为IL10)的负相关。该IL17模块包括基因如BATF、STAT4、MINA、IL17F、CTLA4、ZBTB32(PLZP)、IL2、IL17A、和RORC。该IL10模块包括基因如IL10、IRF4、IL9、IL24、和SMAD3。已知与IL17模块具有正相关的基因包括BATF、HIF1A、RORC、和MINA。已知与IL17模块具有负相关的基因包括FOXP3、AHR、TRP53、IKZF3、IRF4、IRF1、IL10、IL23、和IL9。如通篇披露中所描述的，IL17模块的新颖调节物包括DEC1、CD5L、和ZBTB32(PLZP)。
为了探索GPR65的作用，获得GPR65-/-小鼠并且在各种T细胞条件(Th0、T16、T36、B623、T)下分化天然T细胞。图40A和40B证实了，在GPR65敲除细胞中，IL17A表达减少了，例如，在图40A中，针对T16条件减少42％，针对T36条件减少48％，并且针对B623条件减少73％，并且在图40B中，针对T16条件减少20％并且针对T36条件减少13％。另外，该B623条件示出增加的干扰素γ(IFNγ)产生，通常归因于Th1细胞并且与引发严重免疫应答相关的细胞因子。这些结果证实GPR65是Th17分化的调节物。因此，调控GPR65可以用于影响T细胞群体朝向或偏离Th17表型。
第二组实验鉴定了又称Bhlhe40的靶基因DEC1。DEC1是碱性螺旋-环-螺旋转录因子，其已知在T细胞激活时以CD28依赖性方式高度诱导(马丁内斯-罗德拉(Martínez-Llordella)等人“需要CD28-诱导的转录因子DEC1用于有效的自体反应CD4+T细胞应答(CD28-inducible transcription factor DEC1 is required for efficientautoreactive CD4+T cell response.)”，《实验医学杂志》(J Exp Med.)2013年7月29日；210(8):1603-19.doi:10.1084/jem.20122387.Epub 2013年7月22日)。DEC1被需要用于形成实验性自身免疫脑脊髓炎，并且在生产促炎性细胞因子GM-CSF、IFNγ、和IL-2中发挥了关键作用(布卢斯通(Bluestone)，2013)。本文呈现的研究之前，以前不知道DEC1通常与T细胞相关，或者具体与Th17细胞相关。
为了探索DEC1的作用，获得DEC1-/-小鼠并且在各种T细胞条件(Th0、T16、T36、B623、T)下分化天然T细胞。如图41A中所示，IL-17A表达在非病原性条件即T16中是不变的，但是表达在病原性条件T36和B623中是减少的，例如，针对T36条件约55％降低并且针对B623条件约43％降低。如图41B中所示，该DEC1敲除细胞还证实了FOXP3阳性细胞的增加。图41C证实，通过证实针对所有Th17条件IL17A的减少和针对所有Th17条件IL-10产生的增加，细胞因子分泌测定(CBA)在很大程度上支持图41A中所见的ICC数据。这些结果证实DEC1是病原性Th17分化的启动子。因此，调控DEC1可以用于影响T细胞群体朝向或偏离Th17病原性表型。
第三组实验鉴定了又称Zbtb32的靶基因PLZP。PLZP是已知是GATA-3的阻遏物的转录因子。PLZP已经示出负调节T细胞激活(I-Cheng Ho，2004)并且调节细胞因子表达激活(SC妙(Miaw)，2000)。
为了探索PLZP的作用，获得PLZP-/-小鼠并且在各种T细胞条件(Th0、T16、T36、B623、T)下分化天然T细胞。如图42A中所示，IL-17A生产在病原性Th17细胞条件T36和B623中减少。这些结果证实PLZP是病原性Th17分化的启动子。因此，调控PLZP可以用于影响T细胞群体朝向或偏离Th17病原性表型。
第四组实验鉴定了靶基因TCF4(转录因子4)，其为碱性螺旋-环-螺旋转录因子。已知TCF4与包括MAPK信号传导途径和肌细胞生成途径的超级途径有关。
为了探索TCF4的作用，获得TCF4-/-小鼠并且在各种T细胞条件(Th0、T16、T36、B623、T)下分化天然T细胞。如图43中所示，在病原性Th17细胞条件B623中IL-17A产生减少。这些结果证实TCF4可以用作病原性Th17分化的启动子。因此，调控TCF4可以用于影响T细胞群体朝向或偏离Th17病原性表型。
实例10：CD5L，细胞内脂质代谢的调节物，限制Th17细胞的病原性
产生IL-17的Th17细胞存在于组织炎症位置处，并且在人类和相关的鼠模型中涉及多种自身免疫疾病的发病机制(克莱因埃维特菲尔德(Kleinewietfeld)和哈弗乐(Hafler)2013，李(Lee)，柯林斯(Collins)等人，2014)。然而，不是所有的产生IL-17的Th17细胞都诱导自身免疫组织炎症和疾病(‘病原性’)。通过预防肠道菌群的组织侵犯并且促进上皮屏障功能，衬于正常的肠粘膜内的Th17细胞被认为在组织稳态中起重要作用(古格拉尼(Guglani)和卡迪尔(Khader)2010)。另外，Th17细胞在宿主防御中针对病原体如真菌(白色念珠菌)和胞外细菌(金黄色葡萄球菌)发挥了关键作用(葛芬(Gaffen)，赫尔南德斯-桑托斯(Hernandez-Santos)等人，2011，罗马尼(Romani)2011)。因此，Th17细胞示出在其功能中很大程度的多样性：在一方面，它们是组织炎症和自身免疫的有效诱导剂，并且在另一方面，它们促进组织稳态和屏障功能。体内控制Th17细胞的这些对立的功能的胞外信号和胞内机制仅部分已知并且深入研究的。
具有不同效应子功能的不同类型的Th17细胞可以通过细胞因子的不同组合在体外生产。已经示出(百特利(Bettelli)，卡里尔(Carrier)等人，2006；范贺文(Veldhoen)，霍金(Hocking)等人，2006；哈林顿(Harrington)等人，2006)，两种细胞因子、IL-6和TGFβ1，可以在体外诱导天然T细胞分化成Th17细胞，尽管这些细胞是实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(中枢神经系统的自身免疫病模型)的较差的诱导剂。将这些细胞暴露至促炎细胞因子IL-23可以使得它们成为诱导疾病的、病原性的细胞(麦克赫亚(McGeachy)，朴-延森(Bak-Jensen)等人，2007，阿瓦斯蒂(Awasthi)，里奥尔-布兰科(Riol-Blanco)等人，2009，雅格(Jager)，达尔达霍恩(Dardalhon)等人，2009，麦克赫亚，陈(Chen)等人，2009)。实际上，细胞因子的其他组合，如IL-1β+IL-6+IL-23(古尔埃斯齐(Ghoreschi)，劳伦斯(Laurence)等人，2010)或TGFβ3+IL-6+IL-23，可以诱导Th17细胞的分化，这些Th17细胞当在体内过继性转移时引发强烈的EAE和严重组织炎症。比较用这些不同的体外分化方案产生的Th17细胞的基因表达谱导致基因标签的鉴定，该基因标签将病原性与非病原性Th17细胞进行区分，该基因标签由以下组成：病原性Th17细胞中表达的16种基因的促炎模块(例如，T-bet、GMCSF和IL-23R)和非病原性细胞中表达的7种基因的调节模块(例如，IL-10)。非病原性Th17细胞暴露到IL-23，将这些细胞转化为病原性表型，其中调节模块的表达减少，并且促炎模块的表达被诱导，表明IL-23是决定Th17细胞的功能性表型的主细胞因子。
在人类中，Th17细胞的两种不同亚型也已经用针对不同类型的病原体的特异性进行了描述。共生产IL-17和IFNγ的Th17细胞响应于白色念珠菌而产生，而共生产IL-17和IL-10的Th17细胞具有对于金黄色葡萄球菌感染的特异性(杰林斯基(Zielinski)，米尔(Mele)等人)。IL-1和IL-23二者都响应于抗原促成这些功能上不同亚型的Th17细胞中的每种的诱发。这些人类Th17细胞亚群与小鼠中病原性和非病原性Th17细胞的比较表明白色念珠菌-特异性Th17细胞可以反映病原性Th17细胞，并伴随促炎模块的表达，而金黄色葡萄球菌-特异性Th17细胞更类似于自身免疫小鼠模型中所描述的非病原性Th17细胞。
鉴定驱动病原性和非病原性Th17细胞的关键分子开关将允许病原性Th17细胞的选择性抑制，同时使非病原性的潜在组织保护性Th17细胞不受影响。迄今为止，IL-23在分化的Th17细胞中引起病原性表型的胞内机制还不是很清楚。基因组方法提供了找到这样的候选机制的引人注目的无偏方法，(优素福(Yosef)等人，2014)，但是很可能病原性和非病原性细胞在体内共存，并且在体外共同分化，限制了检测到细微信号的能力。事实上，之前的标签比较病原性和非病原性衍生的细胞的群体，并没有发现强候选调节物，而是发现效应分子。单细胞RNA-Seq的出现开辟了鉴定此类细微的而生理上重要的调节物的道路。
在此，将来自体内自身免疫损伤和来自体外分化的Th17细胞的单细胞RNA-Seq谱用于鉴定Th17病原性的新颖调节物，即CD5L(CD5样)。CD5L主要在非病原性Th17细胞中表达，并且当暴露于IL-23时下调。CD5L缺乏通过以下方式将非病原性Th17细胞转化成诱导疾病的病原性Th17细胞：调节该Th17细胞脂质体，改变多不饱和脂肪酰基(PUFA)和饱和脂质之间的平衡，并且进而影响Rorγt(Th17细胞分化的主转录因子)的活性和结合。因此，CD5L目前被鉴定为一种区分Th17细胞功能性状态的关键调节物，并且T细胞脂质代谢被鉴定为调节Th17细胞的病原性的途径中的主要组分。
结果：Th17细胞在宿主防御中针对胞外病原体和维持肠组织稳态中发挥了关键作用，但是也在多种自身免疫疾病的病原性诱导中涉及到。平衡如‘病原性’和‘非病原性’Th17细胞中涉及的机制大多仍是未知的。在此，使用单细胞RNA-Seq以鉴定CD5L(CD5-样)为新颖的调节物之一，该调节物选择性地在非病原性细胞中而没有在病原性Th17细胞中表达。虽然CD5L并没有影响Th17分化，它用作主功能性开关，因为CD5L的缺失将‘非病原性’Th17细胞转化成‘‘病原性’Th17细胞，这促进了小鼠体内自身免疫疾病。显示出CD5L通过调节胞内脂质体来介导这种作用，这样使得CD5L缺陷的Th17细胞示出饱和脂质(包括胆固醇代谢物)表达的增加、和多不饱和脂肪酰基(PUFA)表达的减少。这进而改变了Rorγt(Th17细胞的主转录因子)的配体可用性和功能、以及T细胞功能。这项研究鉴定CD5L为Th17细胞的功能性状态的一种关键调节物，并且强调了T细胞中平衡免疫保护和疾病中脂质饱和和脂质代谢的重要性。
单细胞RNA-Seq鉴定CD5L为病原性的高排名候选调节物：为了鉴定Th17细胞功能的候选调节物，在非病原性(TGFβ1+IL-6)和病原性(IL-1β+IL-6+IL-23)条件下，对在体内EAE期间从CNS分离或在体外分化的Th17细胞分析单细胞RNA-Seq谱。简言之，使用以下三条线的证据针对基因与病原性的潜在相关性来对基因分等级：(1)在体外(在非病原性条件中)分化的单Th17细胞中转录物表达的协方差分析，这表明两个反相关模块的存在：“促炎模块”(与Il17a表达呈正相关)和“调节模块”(与Il10表达呈正相关)；(2)在任一条件下分化的单一Th17细胞的主成分分析(PCA)，其显示出细胞跨越病原性谱，这样使得PC1上的细胞位置与病原性基因的表达相关；和(3)在体内EAE期间从CNS和淋巴结分离的单一Th17的PCA，其显示出细胞沿着第一PC(从效应子到记忆到耗竭状态)和第二PC(从天然样到最终分化的状态)跨越多功能性谱。
通过潜在调节物的单细胞分析，Cd5l(Cd5-样)是高排名基因之一，显示出两个关键特征的出人意料的组合：(1)它仅在非病原性条件下衍生的Th17细胞中进行体外表达(图45D)；而(2)在那些非病原性细胞中，它表达为一种与在Th17细胞中促炎模块中的其他基因共变的一员。第一，在病原性条件(IL-1β+IL-6+IL-23)下衍生的Th17细胞的绝大多数(约80％)缺少Cd5l表达，而在非病原性(TGF-b1+IL-6)条件下分化的Th17细胞主要表达Cd5l(图45C)。此外，在非病原性条件(TGFβ1+IL-6)下分化的分选的IL-17A+(GFP+，其中GFP受控于IL-17启动子)细胞中的大部分表达Cd5l(图45D，左上图)，与和IL17模块的其原始相关性一致(在非-分选细胞中；下面)。相比之下，在两种不同病原性条件(IL-1βIL-6+IL-23或TGFβ3+IL-6)下分化的Th17细胞在大多数T细胞中缺少Cd5l表达。类似地，在单细胞水平下，从经历了主动EAE的小鼠的中枢神经系统(CNS)分选的致脑炎Th17细胞(CD4+IL-17A.GFP+)没有表达任何Cd5l(图45D，右下图)。第二，CD5L与促炎模块的定义标签高度呈正相关，并且与调节性模块呈负相关。具体地而言，它在促炎模块中属于前5种基因，其表达也与之前定义的病原性基因标签的表达强烈相关(图45A，经验p值<0.05)。此外，表达更高水平的Cd5l的非病原性Th17细胞针对上述PC1也具有较低分数，与病原性标签一样(图45B，0.44的皮尔逊相关性；p<10-7)。
CD5L是清道夫受体富含半胱氨酸的超家族中的一员(萨里斯(Sarrias)MR等人2004)。其在巨噬细胞中的表达在之前进行了报道(宫崎(Miyazaki)，広上(Hirokami)等人，1999)，并且已经显示出在胞吞作用后在脂肪细胞中与胞质的脂肪酸合酶结合。还已经报道，针对于病原体相关分子模式(PAMP)，它是一种受体，并且可以在调节先天免疫应答中具有一定功能(马丁内斯(Martinez)VG等人，2014)。然而，还没有报道，它在T细胞中表达，并且因此其在T细胞功能中的作用尚未鉴定。
CD5L表达特异性地与体外和体内非病原性Th17细胞相关联：假设，在非病原性条件下分化的但是与IL17炎症模块相关联的Th17细胞中CD5L的专一表达，可以指示出在调节非病原性和病原性状态之间转换中的独特作用。虽然与炎症模块的共表达和与本身病原性标签的相关性(图45A、B)可以表明作为病原性的正调节物的功能，CD5L明显不存在于在病原性条件下体外分化的或分离自CNS的损伤中的Th17细胞中(图45C、D)表明了更微妙的作用。具体而言，假设CD5L可以是病原性的负调节物，解释了其不存在于真实病原性细胞。值得注意地，细胞中状态变化的负调节物的mRNA通常与多个模块被共同调节，它们在从酵母(西格尔(Segal)等人，自然遗传学(Nature Genetics)2003；皮尔(Pe’er)等人，生物信息学(Bioinformatics)2002)到人类(阿米特(Amit)等人，自然遗传学(Nature Genetics)2007)的真核生物中进行负调节。
为了测试这种假设，首先对用不同分化条件下培养的天然CD4T细胞的qPCR(图45E、F)和蛋白质表达分析(图45G)初步发现的以下内容进行验证和扩展：CD5L独特表达于体外和体内非病原性Th17细胞中。在mRNA水平下，在Th0、Th1或Th2辅助T细胞中几乎没有发现Cd5l表达(图45E)，在用TGFβ1+IL-6分化的Th17细胞中高表达，但是在用IL-1β+IL-6+IL-23分化的Th17细胞或在iTreg中表达少至无(图45E)。重要的是，通过流式细胞术针对CD5L蛋白表达观察到类似的模式(图45G)。
其次，探索CD5L表达是否与体内更少的病原性Th17细胞相关。第一，在用完全弗氏佐剂(CFA)中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35-55)免疫后，分析分离自小鼠的Th17细胞中的Cd5l表达。Th17细胞(CD3+CD4+IL-17.GFP+)分选自体表(脾)并且发现Cd5l仅在IL-17+而不在IL-17-T细胞中表达(图45H，左图)。在鲜明对比之下，Cd5l没有在来自CNS的Th17细胞中表达，尽管存在Il17的明显表达(图45H，右图)，与单细胞RNA-seq数据一致(图45D)。其次，在分离自天然小鼠的Th17细胞上分析Cd5l表达，该Th17细胞衬于肠粘膜内并且不与炎症相关。IL-17A.GFP+和IL-17A.GFP-CD4T细胞分离自天然小鼠的肠系膜淋巴结(mLN)和固有层(LP)，其中Th17细胞被认为有助于组织稳态和粘膜的屏障功能。从正常肠粘膜的mLN和LP收获的IL-17+而不是IL-17-T细胞表达了高水平的Cd5l(图45I和数据未显示)。因此，CD5L是在非病原性(而不是在病原性)体内Th17细胞中表达的基因。
最后，测试IL-23暴露(已知使得Th17细胞更具病原性)是否可以直接调节Cd5l表达。假设，如果CD5L是IL23-依赖性病原性的正调节物，其表达将通过IL23增加，然而如果它是负调节物，其表达将被压制。当T细胞激活48小时后诱导IL-23R时，将天然T细胞用TGFβ1+IL-6分化48h并且然后在新鲜培养基中在有或没有IL-23情况下进行扩增。与PBS对照(图45F)相比，Il-23的添加显著压制了Cd5l表达，与获得促炎模块并且成为病原性Th17细胞的这些细胞一致，并且与CD5L作为病原性的负调节物的假设分配一致。
在不影响天然T细胞的Th17分化的条件下，CD5L抑制/减轻Th17细胞效应子功能：为了分析CD5L是否发挥任何体内功能性作用，用MOG35-55/CFA对野生型(WT)和Cd5l缺陷小鼠进行免疫以诱导EAE。CD5L-/-小鼠呈现出显著更严重的临床EAE，该EAE持续了至少28天，然而WT小鼠在免疫后12天开始恢复(图46A)。其次，在EAR过程中，分析CD4T细胞的表型。FoxP3+Treg细胞类似频率发现于WT和CD5L-/-小鼠中，表明疾病的严重性增加不是由于Cd5l缺陷小鼠中Treg数量的减少(图50A)。在另一方面，在CD5L-/-小鼠的CNS中观察到产生IL-17的CD4T细胞的显著更高百分比以及IFNγ+CD4T细胞的更低百分比(图46A和51B)。此外，响应于体外MOG重激活，来自CD5L-/-小鼠的引流淋巴结(dLN)的细胞显示出更高的增殖应答并且产生更多IL-17(图51C、D)。这与CD5L在定义Th17细胞的功能中的直接或间接作用一致。
为了确定CD5L的作用是否是因为在Th17细胞分化中的直接作用，在非病原性Th17细胞条件下分析天然WT和CD5L-/-CD4T细胞，并且分析CD5L是否直接调节标签Th17基因的表达。CD5L的缺失并没有影响天然T细胞的Th17分化，如通过IL-17表达通过胞内细胞因子染色或通过ELISA所测量的(图46B、C)，也没有影响包括Il17f、Il21、Il23r或Rorc的其他标签Th17基因的Th17分化(图46D)。然而，在非病原性Th17分化条件下，WT Th17细胞产生IL-10，然而CD5L-/-Th17细胞显示出IL-10表达的减少，如通过ELISA(图46C)或qPCR分析(图46D)所确定的。这些观测表明，CD5L并没有直接调节Th17细胞分化，仅Th17细胞分化不能解释CD5L-/-小鼠中对EAE的易感性的增加，但是事实上CD5L可以影响分化的Th17细胞的内部状态。
其次，确定CD5L在扩展或维持效应子/记忆Th17细胞中是否具有任何作用。为此，洗涤在非病原性条件下分化的天然Th17细胞，并且在没有IL-23情况下重新铺板。当重刺激时，该CD5L-/-Th17细胞具有明显更高百分比的IL-17A+细胞和IL-23R+细胞(图46E)，表明CD5L缺乏导致更稳定地扩展Th17细胞。与该结果一致，如通过qPCR所确定的，CD5L-/-Th17细胞表达更多的Il17a和Il23r以及更少的Il10(图46F)。因此，CD5L并不调节天然T细胞的初始Th17细胞分化，但是其控制这些天然T细胞随着时间的扩增和/或效应子功能。与该结果一致，直接从CD5L-/-小鼠离体分离的效应因子记忆细胞(CD4+CD62L-CD44+)表达显著更高的IL-17水平和更低的IL-10水平(图46G)。产生IL-17的效应子记忆T细胞的这种更高百分比可以反映出在CD5L-/-小鼠的组库中持续存在的Th17细胞的更大稳定性和更高频率。为了解决体内分离的Th17细胞在每个细胞的基础上是否还产生更多IL-17，将RORγt+(GFP+)效应因子/记忆T细胞从WT和CD5L-/-小鼠中进行分选，分析当离体激活时它们的细胞因子产生。来自CD5L-/-小鼠的RORγt.GFP+T细胞显示出更多的IL-17生产和更少的IL-10生产，表明在CD5L不存在的情况下，RORγt+细胞是更好的IL-17生产者(图46H)。
CD5L是调节Th17细胞病原性的主开关：为了研究CD5L的缺失是否可以将非病原性Th17细胞转化成病原性、诱导疾病的Th17细胞，将CD5L-/-小鼠与2D2转基因小鼠杂交，该2D2转基因小鼠表达对MOG 35-55/IAb具有特异性的TCR。具有CD5L缺乏的天然2D2转基因T细胞在非病原性(TGFβ1+IL-6)Th17条件下分化并且然后转移到WT接受者。转移之前，从WT和CD5L-/-2D2天然细胞产生类似频率的IL-17+T细胞(图47A)，与CD5L不影响天然T细胞的Th17分化的观测一致。
其次，比较在WT和CD5L-/-2D2细胞的接受者中临床和组织学疾病进展。正如预期的，WT 2D2 Th17细胞的许多接受者(6/13)显示出非常少至无临床或组织学疾病的迹象。引人注目的是，所有(12/12)CD5L-/-2D2接受者都发展具有视神经炎的严重EAE。此外，CD5L-/-2D2接受者具有显著重量减轻并且在CNS中形成了更异常的淋巴样滤泡样结构，一种由高度病原性IL-23处理的Th17细胞诱导的疾病标志(图47B、C)(彼得斯(Peters)，皮彻(Pitcher)等人，2011)。因此，CD5L的T细胞固有表达在抑制Th17细胞的病原性中起着关键作用。过继性转移之后，将T细胞从经历过EAE的小鼠的CNS分离。与WT 2D2 T细胞相比，2D2CD5L-/-T细胞保留了非常高频率的产生IL-17的T细胞、以及减少的IL-10水平(图47D)。当过继性转移时，WT 2D2 T细胞获得体内IFNγ产生，然而只有非常小部分的CD5L-/-2D2 T细胞生产IFNγ，表明CD5L还可以调节Th17细胞的稳定性。与该观测一致，当将天然WT和CD5L-/-2D2 T细胞转移到WT宿主，并且在未诱导EAE(没有给予百日咳毒素)的情况下用MOG35-55/CFA免疫小鼠时，与WT相比，CD5L-/-2D2 T细胞累积更高频率的IL-17A+T细胞。引人注目地，当WT T细胞表达IL-10时，没有CD5L-/-2D2 T细胞表达IL-10(图47E)。
因为IL-23可以压制CD5L的表达，并且由于CD5L发挥功能以抑制Th17细胞病原性，因此推断持续的CD5L表达应该拮抗Th17细胞的IL-23驱动的病原性。为了测试此假设，生产在Th17细胞中用于CD5L的异位表达的逆转录病毒载体。天然2D2 T细胞在病原性分化条件(IL-1β+IL-6+IL-23)下进行分化，用CD5L进行转导，转移到WT接受者，并且接着重量减轻并且发展临床EAE。转移之前，用CD5L转导的2D2 T细胞具有类似IL-17表达和增加的IL-10表达(图51A)。转移之后，当与WT对照相比时，在病原性条件下分化的Th17细胞中CD5L的异位表达降低了其病原性，其中此类Th17细胞导致小鼠中重量减轻的减少和EAE诱导的显著减少(图51B、C)。此外，体内转移的过表达CD5L的2D2 T细胞失去了IL-17生产，并且大部分的转移细胞开始生产IFNγ(图51D)。因此，CD5L并没有调节天然T细胞的Th17分化，但是影响了Th17细胞的功能状态，其中CD5L的缺失将非病原性Th17细胞转化成在体内稳定生产IL-17的病原性Th17细胞，并且CD5L在病原性Th17细胞内的持续过表达将这些细胞转化成较少病原性且不太稳定的表型，其中这些细胞失去了IL-17的表达并且在体内获得了产生IFNγ的Th1表型。这些两项数据组明确地支持CD5L作为Th17细胞的功能病原性状态的负调节物的功能。
与这些功能性发现一致，CD5L还调节之前在Th17细胞中定义的病原性/非病原性基因标签的表达。为了显示这一点，在非病原性TGFβ1+IL-6条件下，天然WT和CD5L-/-T细胞进行分化，并且使它们留在没添加任何外源IL-23的新鲜介质中持续48小时，随后通过qPCR进行mRNA表达分析。在非病原性条件下分化的CD5L缺陷Th17细胞显著上调了病原性标签的若干效应分子(其包括Il23r、Il3、Ccl4、Gzmb、Lrmp、Lag3和Sgk1)，并且下调了非病原性标签的若干基因(其包括Il10、Il9和Maf)(图47F)。然而，若干其他标签基因，不受CD5L影响，表明一种更有微妙的机制。
CD5L将Th17细胞脂质体平衡从饱和脂质转移至不饱和脂质，调控Rorγt配体可用性和功能：由于已知CD5L通过结合至脂肪细胞的细胞质中的脂肪酸合酶调节脂质代谢(黑川(Kurokawa)，新井(Arai)等人，2010)，推测CD5L还可以通过特定地调节T细胞中的脂质代谢物调节Th17细胞功能。为了测试这一假设，分析脂质代谢是否是通过CD5L进行调节的，并且是否与在来自CD5L-/-小鼠的Th17细胞中所观察到的病原性增加相关联。绘制在非病原性(TGFβ1+IL-6)和病原性(TGFβ1+IL-6+IL-23)条件下分化的WT和CD5L-/-Th17细胞的脂质体。可以使用质谱和液相色谱来解析并且鉴定细胞内或分化的Th17细胞的上清液中的约200种脂质代谢物。在WT和CD5L-/-之间差异表达的那些代谢物中，观察到了在非病原性条件下分化的CD5L-/-Th17细胞和在病原性条件下分化的WT Th17细胞之间脂质体的惊人的相似性(图48A)。其他代谢变化中，CD5L缺乏显著增加了饱和脂质(SFA)的水平，这些饱和脂质包括携带饱和脂酰基和胆固醇酯(CE)的代谢物(如通过液相色谱和质谱所测量的(图48B和52A))、以及游离胆固醇(如通过显微镜所示的(图52B))。此外，CD5L的不存在导致携带多不饱和脂酰基(PUFA)的代谢物显著减少(图48B)。与非病原性WT细胞相比，在两种病原性条件(IL-1β+IL-6+IL-23和TGFβ3+IL-6+IL-23)之一下分化的Th17细胞的脂质体中观察到了类似的CE增加和PUFA减少(图48C和图51A)。因此，Th17细胞病原性与脂质体饱和度平衡的偏移相关联，如在饱和脂质的增加和PUFA代谢物的减少中所反映的。
之前已经报道了，胆固醇代谢物如氧甾酮用作Rorγt的激动配体(吉恩(Jin)，马尔蒂努夫斯基(Martynowski)等人，2010，索鲁什(Soroosh)，吴(Wu)等人，2014)。之前的ChIP-Seq分析(肖(Xiao)，优素福(Yosef)等人，2014)表明Rorγt结合在Il23r和Il17的启动子和内含子区域中的若干位置处(图48D)，并且接近Il10的CNS-9，其中调节Il10表达的其他转录因子(如cMaf)也结合。如上所示，在Rorγt+Th17细胞中CD5L限制IL-23R和IL-17的表达并且促进IL-10生产，并且因为CD5L-缺陷的Th17细胞包含更高的胆固醇代谢物和较低的PUFA(图48A、B)。把这些数据放在一起，假设CD5L通过影响Rorγt与这些靶标的结合(通过影响SFA-PUFA平衡)来调节IL-23R、IL-17和IL-10的表达。
为了测试这一假设，首先通过使用ChIP-PCR和萤光素酶报告基因测定评价CD5L是否调控Rorγt活性。与假设一致，与WT相比，Rorγt的ChIP显示出在Il17和Il23r区域中Rorγt的更高结合和在CD5L缺陷的Th17细胞中与Il10区域结合的显著减少(图48D、E和52C)。一致地，CD5L的异位过表达足够压制Il17和Il23r启动子萤光素酶报告基因的Rorγt-依赖性转录(图48F和52D)并且在Rorγt存在的情况下增强Il10报告基因的转录(图48G)。
其次，测试添加SFA或PUFA改变WT Th17细胞的脂质体平衡是否可以调节Rorγt与基因组区域的结合(图48DE和52C)，发现在SFA存在的情况下，存在Rorγt与Il17和Il23r基因组元件结合的富集的显著增加，然而，在PUFA存在的情况下，存在Rorγt的结合的减少(图48D和52C)。PUFA的添加还显著增加了Rorγt与Il10 CNS-9区域结合的富集(图48E)，表明Th17细胞的脂质含量的操作可以真正调控Rorγt DNA结合能力。
最后，因此推断CD5L是否通过限制一种或多种Rorγt配体来调节Rorγt转录活性，Rorγt的外源激动剂的添加将挽救CD5L诱导的压制。事实上，添加7,27二羟基胆固醇，之前示为Rorγt的内源性配体(索鲁什(Soroosh)，吴(Wu)等人，2014)，挽救了CD5L驱动的对Il17报告基因转录的压制，表明配体可用性通过CD5L部分地促成了Rorγt功能的调节(图48H)。在另一方面，PUFA的添加在对照细胞中减少了Rorγt驱动的Il17a转录，在表达CD5L的那些细胞中并非如此(图48I)，表明PUFA的功能可以取决于Rorγt配体。事实上，虽然在激动配体存在的情况下，Rorγt可以强烈地反式激活Il23r增强子，向激动剂配体添加PUFA几乎完全抑制了Rorγt-介导的Il23r反式激活并且增强Il10反式激活(图48J、K)。这种观测表明，PUFA可以调控Rorγt配体结合，并且因此影响Rorγt反式激活Il23r和Il10的能力。在另一方面，虽然添加SFA本身对Rorγt-依赖性转录几乎没有影响，但它修饰了氧甾酮的功能(图48J、K)。因此，通过偏移脂质体平衡并且限制Rorγt配体可用性以及功能，CD5L调节Il23r和Il10(为病原性/非病原性标签的成员)的表达。
PUFA和SFA可以调节Th17细胞功能并且促成Th17细胞的CD5L依赖性调节：因为在非病原性条件下分化的CD5L-缺陷Th17细胞已经改变了脂质饱和度的平衡，并且因为PUFA和SFA可以调控Rorγt结合和功能活性，所以分析脂肪酸部分与Th17细胞功能和其对CD5L-驱动的Th17细胞病原性的贡献之间的相关性。首先测试添加PUFA和SFA对产生Th17细胞的作用。将WT Th17细胞用TGFβ1+IL-6进行分化，并且在PUFA或SFA存在下在新鲜介质中使用IL-23进行扩增。PUFA压制IL-17+和IL-23R.GFP+CD4T细胞的百分比(图49A)，表明PUFA可以在病原性条件下限制Th17细胞功能。在另一方面，SFA的添加增加了IL-17和IL-23R二者表达，但是此作用并不显著，可能是因为在病原性Th17细胞中已经非常高的SFA水平不可以通过外源性SFA的添加进行进一步改变。这导致与Il17和Il23r表达的qPCR分析一致，并且此外，在Rorγt-/-Th17细胞中，PUFA的作用消除(图49B)，表明PUFA的功能需要Rorγt表达。在非病原性条件下分化的CD5L-/-Th17细胞也对PUFA治疗敏感，导致IL-17+CD4+T细胞的减少的百分比(图49C)。
其次，研究脂质饱和度对Th17细胞病原性的贡献。据推测，如果脂质饱和度的平衡区分非病原性WT Th17细胞和病原性CD5L-/-Th17细胞，向WT Th17细胞添加SFA并且向CD5L-/-Th17细胞(TGFβ1+IL-6)添加PUFA可以导致与Th17细胞病原性有关的转录标签的互反变化。因此(使用纳米链n计数器)，分析在SFA-或对照处理的WT Th17细胞中和在用TGFβ1+IL-6分化的PUFA-或对照处理的CD5L-/-Th17细胞中Th17细胞分化和功能的316基因标签的表达。发现，PUFA-处理的CD5L-/-Th17细胞类似于WT非病原性Th17细胞，并且SFA-处理的WT非病原性Th17细胞更相似于CD5L-/-Th17细胞(图49D)。qPCR分析确定PUFA和SFA互反调节在病原性标签中关键基因(其包括Il10、Il23r、Ccl5、Csf2和Lag3)的表达(图49D)。(值得注意地，在一些情况下，PUFA和SFA具有相同作用；例如，在通过任一脂肪酸处理后Il22表达增加。)总之，这些观测表明脂质饱和度的平衡通过Th17细胞转录组促成Th17细胞的CD5L-依赖性调节。
讨论：Th17细胞是一种能够具有多样化功能的T辅助细胞谱系，这些功能的范围是从维持肠稳态、针对病原体安装宿主防御、至诱导自身免疫疾病。Th17细胞如何可以介导此类多样化和对立功能仍是个待解决的关键问题。这尤其重要，由于抗-IL-17和基于Th17的疗法在一些自身免疫性疾病中一直非常有效，但是在其他疾病中没有影响(吉诺维斯(Genovese)，凡登布希(Van den Bosch)等人，2010，许贝尔(Hueber)，桑兹(Sands)等人，2012，莱奥纳尔迪(Leonardi)，马西森(Matheson)等人，2012，帕普(Papp)，莱奥纳尔迪(Leonardi)等人，2012，蓓特(Baeten)和库克罗(Kuchroo)，2013，帕特尔(Patel)，李(Lee)等人，2013)，甚至当Th17细胞与疾病的过程遗传连锁时(卓(Cho)2008，利斯(Lees)，巴雷特(Barrett)等人，2011)。使用单细胞基因组学，这个问题已得到解决，并且已经鉴定了Th17细胞的鉴定的新颖功能调节物。
在此，将CD5L作为影响Th17细胞病原性的新颖调节物之一来强调并且调研。显示出：(1)CD5L仅在非病原性Th17细胞中高度表达但是在这些细胞中与促炎模块共同变化，一种与病原性的负调节物一致的模式；(2)CD5L并不影响Th17分化，但是影响Th17细胞的长期扩增和功能表型；(3)CD5L-缺乏将非病原性Th17细胞转化成病原性Th17细胞；并且(4)CD5L调节Th17细胞中脂质代谢并且改变在SFA和PUFA之间的平衡。
看似自相矛盾，CD5L仅在非病原性Th17细胞中表达，但是与促炎模块共同变化。这个初步观测使我们作出假设，CD5L是非病原性到病原性转换的负调节物，由于在来自酵母的生物体中，通常已知在调节网络中此类负调节物与它们阻遏的靶标共同变化。功能性分析证实了这一假设，表明确实可以表达CD5L来限制非病原性Th17细胞中的促炎模块。因此，在非病原性细胞中具有这种特定模式-专一表达但与促炎模块共同变化的其他基因也可以是淬灭促炎效应因子功能的阻遏物。因此，根据环境背景或触发物，通过抑制单基因像CD5L的表达，可以容易地将非病原性Th17细胞转化成促炎或病原性Th17细胞。这由数据支持，数据明确显示出IL-23R信号传导可以压制CD5L表达并且CD5L的持续表达抑制Th17细胞的促炎功能。除压制促炎模块之外，CD5L还可以促进调节性模块的功能，从而用作允许对环境触发物快速应答是的开关，这样使得Th17细胞可以改变其功能表型，而不必依赖于其他中间途径。还清楚的是，CD5L的表达可以使非病原性Th17细胞的功能稳定，这样使得调节性模块和促炎模块可以在细胞群中共存。这一观测还强调了在非病原性Th17细胞中共同表达的调节性模块和促炎模块之间的分子差异，表明可以生产IL-17和IL-10的非病原性Th17细胞在生理过程中具有独特作用。这与可以响应于肠微生物在小肠中形成(埃斯普卢加斯(Esplugues)，胡贝尔(Huber)等人，2011)的Th17细胞以及还可以共同生产IL-10并对于针对肺粘膜表面上的金黄色葡萄球菌感染的保护性免疫推测而言是重要的(杰林斯基(Zielinski)，米尔(Mele)等人)的Th17细胞并不调节自身免疫或组织损伤的新近发现一致。
病原性和非病原性Th17细胞都存在于引流淋巴结中，但是病原性Th17细胞出现在组织炎症的位置(CNS)并且非病原性Th17细胞出现在肠或其他粘膜表面中，其中它们促进粘膜屏障功能并且还维持组织稳态。这反映到CD5L的表达中，其在肠的Th17细胞中在稳态下高度表达，但是在CNS中在自身免疫组织炎症的峰值处没有高度表达。在EAE期间CNS中存在的IL-23可以压制CD5L并且将非病原性Th17细胞转化成病原性Th17细胞。在稳态下，并不知道什么促进了CD5L表达和在肠中的非病原性。考虑到TGFβ在肠中的丰度及其在体内生产IL-10的CD4T细胞的分化(梅纳德(Maynard)，哈林顿(Harrington)等人，2007，康科尔(Konkel)和陈(Chen)2011)和在体外Th17细胞分化(百特利(Bettelli)，卡里尔(Carrier)等人，2006，范贺文(Veldhoen)，霍金(Hocking)等人，2006)中的作用，TGFβ是显而易见的候选物。具体共生菌(伊万诺夫(Ivanov)，新子(Atarashi)等人，2009，杨(Yang)，托尔钦斯基(Torchinsky)等人，2014)和来自微生物区的代谢物(阿尔帕伊阿(Arpaia)，坎贝尔(Campbell)等人，2013)也在调节T细胞分化中涉及到。值得注意地，CD5L被报道为分泌性蛋白(宫崎(Miyazaki)，広上(Hirokami)等人，1999)并且在识别PAMP中发挥作用(马丁内斯(Martinez)VG等人，2014)。可能的是，在体内，由在肠中的非病原性Th17细胞表达的CD5L可以与微生物区相互作用，并且维持肠耐受性和非病原性Th17表型。因此，Th17细胞的两种功能性状态可以是高度可塑的，并且根据环境，病原性或非病原性Th17细胞可以通过感测在组织微环境中的变化来产生。然而，显然CD5L在非病原性Th17细胞中的表达针对维持Th17细胞的非病原性功能性状态是至关重要的，并且IL-23快速压制CD5L，这使这些细胞呈病原性。这一假设还预测了，在炎症性肠病期间，通过局部在肠中的IL-23的生产，非病原性Th17细胞可以很容易地转化成病原性Th17细胞。
CD5L如何调节Th17细胞的病原性？在本研究中，提供证据表明，通过调节Th17细胞中胞内脂质代谢，CD5L可以至少部分地调节Th17细胞功能。显示出CD5L通过与脂肪酸合酶的直接结合抑制脂肪酸的从头合成(黒川(Kurokawa)，新井(Arai)等人，2010)，但这尚未在T细胞中证实。发现，在Th17细胞中，CD5L不是脂肪酸合成的一般抑制物，但是调节PUFA与SFA的平衡。显示出PUFA抑制针对Rorγt的配体-依赖性功能，这样使得在CD5L或PUFA存在的情况下，增强了Rorγt与Il17a和Il23r的结合，伴随这两种基因降低的反式激活，而在Il10座位处的结合以及从该座位的表达增强。值得注意地，之前并未报道Rorγt’调节Il10表达的能力。由于CD5L并不影响整体Th17细胞分化，这表明CD5L和脂质平衡对Rorγt功能的非常微妙的作用：增强了Rorγt结合至一些座位和在这些座位处的反式激活，在其他座位中则降低，并且可能不影响其在其他座位处的功能，如一般Th17细胞分化所需要的那些。这如何在机制上实现仍有待调研。例如，Il10转录的调节是复杂的，并且取决于多样的转录因子和表观遗传修饰。在Th17细胞中，Stat3和c-Maf可以促进Il10的表达(斯图姆霍弗(Stumhofer)，西尔弗(Silver)等人，2007，许(Xu)，杨(Yang)等人，2009)。因为Stat3、C-Maf和Rorγt可以都结合至相同的Il10增强子元件，因此可能的是，根据可用配体的质量和数量，Rorγt可以与其他转录因子相互作用，并且调节Il10转录。更一般地说，这支持如下假设，其中Rorγt配体的谱至少部分取决于细胞中CD5L调节的PUFA与SFA脂质平衡，并且其中不同配体影响对Rorγt的不同特异性，允许采用例如与不同功能性状态相关的一系列功能性状态。将需要进一步研究来充分阐明这样的机制。
若干代谢途径与Th17细胞分化相关联。HIF1α可以通过Rorγt的直接反式激活促进Th17细胞分化(丹格(Dang)，巴尔比(Barbi)等人，2011，时(Shi)，王(Wang)等人，2011)并且乙酰辅酶A羧化酶可以通过糖酵解和脂肪合成途径调节Th17/Treg平衡(贝罗德(Berod)，弗里德里希(Friedrich)等人，2014)。HIF1α和乙酰辅酶A羧化酶均与肥胖症相关联，并且在调节Th17细胞分化和功能的基因中具有突变的小鼠已经显示出获得肥胖表型(维纳(Winer)，帕尔泽(Paltser)等人，2009，艾哈迈德(Ahmed)和葛芬(Gaffen)，2010，权(Jhun)，尹(Yoon)等人，2012，马修斯(Mathews)，沃慕布朗(Wurmbrand)等人，2014)。因此，显现在Th17细胞形成和肥胖症之间有关联。肥胖症标志是饱和脂肪和胆固醇的累积。在本研究中，提供证据表明，在细胞水平下，脂质体饱和度可以通过调节Rorγt功能促进Th17细胞功能。
除调节Th17细胞的病原性之外，CD5L缺陷Th17细胞显现保留了体内更稳定的Th17表型。与WT 2D2细胞(其实现更多的IFNγ+表达)相比之下，当转移到WT宿主中时，来自在非病原性条件下分化的CD5L缺陷天然2D2 T细胞的Th17细胞大多保留了IL-17+和IFNγ-。此外，与WT 2D2 T细胞相比，在免疫后，未分化的天然CD5L-/-CD4+2D2 T细胞的转移导致更高频率的IL-17A+细胞。因为CD5L并没有调节天然T细胞的Th17细胞分化，这表明在CD5L不存在的情况下，该Th17细胞表型可以更稳定。可能的是，Th17细胞稳定性部分取决于配体可用性。因此，由Th17细胞对微环境的感测可以改变CD5L表达并且调节Rorγt配体可用性，这进而可以影响Th17表型和功能。
因此，通过使用单细胞基因组学和计算分析，CD5L已经鉴定为Th17细胞的病原性的新颖阻遏物，强调了单细胞基因组学鉴定影响Th17细胞功能的分子开关的能力，在其他方式下这种能力被群体水平的基因组谱遮蔽。CD5L显现是不影响Th17分化本身的分子开关，而是可能通过调节可用的Rorγt配体的质量和/或数量来影响Th17细胞功能(病原性与非病原性表型)的分子开关，允许单一主调节物可采取多种功能状态。这些结果将脂质体与免疫细胞的基本功能相关联，为灵敏且和特异性的治疗干预开辟了新途径。
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实例11：GPR65促进Th17分化并且对于EAE是至关重要的
GPR65，为一种鞘糖脂受体，与促炎模块共同表达(图4B和S6E)，表明它可能在促进病原性中有作用。GPR65还在从CNS收获的体内Th17细胞中高度表达，这些细胞获得Th1-样效应因子/记忆表型(图2D)。重要的是，GPR65的遗传变异与多发性硬化症(国际多发性硬化症遗传学(International Multiple Sclerosis Genetics)等，2011)、强直性脊柱炎(国际强直性脊柱炎遗传学(International Genetics of Ankylosing Spondylitis)等，2013)、炎症性肠病(乔斯廷斯(Jostins)等人，2012)、和克罗恩病(弗兰克(Franke)等人，2010)相关联。
在体外Th17分化中和在体内自身免疫发展中测试GPR65的作用。将体外分离自Gpr65-/-小鼠的天然T-细胞用TGF-β1+IL-6(非病原性条件)或用IL-1β+IL-6+IL-23(病原性条件)分化96小时。在这两种情况下，如通过胞内细胞因子染色(ICC)所测量的，与其野生型对照相比，在Gpr65-/-细胞中IL-17a阳性细胞减少约40％(图5A)。与野生型相比，来自用IL-23重新激活的Gpr65-/-小鼠的记忆细胞还显示出IL-17a阳性细胞约45％的减少(图S6)。一致地，上清液的酶联免疫吸附测定(ELISA)显示出在病原性(IL-1β+IL-6+L-23)分化条件下，IL-17a(p<0.01)和IL-17f(p<2.5X10-5)分泌的减少(图5B)和IL-10分泌的增加(p<0.01，图S6C)。
为了进一步证实GPR65对Th17功能的作用，测量Gpr65-/-Th17细胞的大部分群体的RNA-seq谱，这些细胞在TGF-β1+IL-6下体外分化96小时。支持GPR65作为Th17细胞的病原性驱动子的作用，发现针对在TGF-β1+IL-6下表征更多调节性细胞的基因(阳性PC1，图4C)和针对在病原性标签中下调的基因(李(Lee)等人，2012)(P<1.4X10-4，超几何检验)，在Gpr65-/-细胞中上调(与野生型相比)的基因是显著富集的(P<18.5X10-31，超几何检验)。
为了确定GPR65的缺失对组织炎症和体内自身免疫疾病的作用，将衍生自Gpr65-/-小鼠的CD4+淋巴细胞和脾细胞转移到RAG-1-/-小鼠中，随后进行MOG35-55免疫。发现，在表达GPR65的T细胞不存在的情况下，保护小鼠免受EAE(图5D)，并且与用野生型细胞转移的对照相比，从LN和脾回收少的多的IL-17A和IFN-γ阳性细胞(图S6B)。此外，来自用MOG35-55免疫的小鼠的脾和LN细胞的体外重刺激显示出，与其野生型对照相比，GPR65的缺失导致MOG-特异性的IL-17A或IFN-γ阳性细胞的大幅降低(图5C)，表明GPR65调节致脑炎T细胞的体内产生。总之，数据强烈证实，GPR65是病原性Th17表型的正调节物，并且其缺失导致避免EAE的保护。
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实例12：MOG-刺激的Plzp-/-细胞在生产病原性Th17细胞中具有缺陷
PLZP(ROG)，转录因子，是GATA3的已知的阻遏物(妙(Miaw)等人，2000)(Th2主调节物)，并且在T辅助细胞中调节细胞因子表达(妙(Miaw)等人，2000)。由于Plzp与促炎模块共同表达，因此假设它可以在Th17细胞中调节病原性。(然而，不可能进行EAE实验，由于PLZP-/-小鼠在EAE-易感背景基础上是不可获得的。)
当体外分化的Plzp-/-细胞在与野生型可比较水平下产生IL-17A(图S8A)，MOG-驱动的回忆测定揭示了Plzp-/-细胞在IL-17A生产中具有缺陷，该缺陷在重新刺激过程中随着MOG浓度增加而变得明显(图5H)。此外，当在用于扩增之前体内分化的Th17细胞的IL-23存在的情况下重新激活时，Plzp-/-细胞还比野生型细胞产生更少的IL-17A(图S8B)。最后，Plzp-/-T细胞分泌更少的IL-17A、IL-17F(图5I)、IFN-γ、IL-13和GM-CSF(图S8C)。这些观测表明PLZP调节更宽范围的炎性细胞因子的表达。在48小时处进入Plzp-/-细胞的分化，与WT相比，上调了Irf1(FC＝5.1)、Il-9(FC＝1.8)和调节性模块的其他转录物(表S10)，然而阻遏来自促炎模块的转录物，如Ccl-20(FC＝0.38)、Tnf(FC＝0.10)和Il-17a(FC＝0.42)。
因此，通过单细胞基因组学和协方差分析，已经鉴定了Th17细胞的病原性的多种新颖调节物，这些调节物影响Th17细胞体外形成和体内自身免疫。
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***
虽然已经在本文示出并描述了本发明的优选实施例，但是对本领域的普通技术人员而言应该显而易见是这样的实施例仅以举例方式提供。在不偏离本发明的情况下众多变化、改变和取代现在将被本领域的普通技术人员想到。应该理解的是，在实践本发明中可以采用本文描述的本发明的实施例的不同替代方案。

Claims (35)

1.一种对涉及T细胞平衡的免疫应答进行诊断、预测和/或分级的方法，该方法包括检测选自表1或表2的基因的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平，并且将该检测到的水平与标签基因或基因产物的表达、活性和/或功能的水平对照进行比较，其中该检测到的水平与该对照水平的差异指示该受试者体内免疫应答的存在。
2.一种监测受试者体内的免疫应答的方法，该方法包括在第一时间点检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，在第二时间点检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的水平，并且将该第一检测到的表达、活性和/或功能的水平与该第二检测到的表达、活性和/或功能的水平进行比较，其中该第一和第二检测到的水平的变化指示在该受试者体内该免疫应答的变化。
3.一种鉴定处于风险或正在遭受免疫应答的患者群体的方法，该方法包括检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在该患者群体中的表达、活性和/或功能的水平，并且比较表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在未处于风险或未正在遭受免疫应答的患者群体中的表达、活性和/或功能的水平，其中表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在这些患者群体中的表达、活性和/或功能的水平差异将该患者群体鉴定为处于风险或正在遭受免疫应答。
4.一种用于监测经历针对异常免疫应答的治疗或疗法的受试者以确定患者是否响应于该治疗或疗法的方法，该方法包括检测表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在不存在该治疗或疗法的情况下的表达、活性和/或功能的水平，并且比较表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在存在该治疗或疗法的情况下的表达、活性和/或功能的水平，其中表1或表2的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物在存在该治疗或疗法的情况下的表达、活性和/或功能的水平差异指示该患者是否响应于该治疗或疗法。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该免疫应答是自身免疫应答或炎症应答。
6.如权利要求5所述的方法，其中该炎症应答与自身免疫应答、传染性疾病和/或基于病原体的障碍相关联。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中这些标签基因是Th17相关基因。
8.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中该治疗或疗法是处于足以诱导朝向调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、或Treg和Th1细胞的组合分化的量的GPR65拮抗剂。
9.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中该治疗或疗法是处于足以诱导T细胞朝向Th17细胞分化的量的、增强或增加GPR65表达的激动剂。
10.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中该治疗或疗法对选自下组的靶基因具有特异性，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
11.如权利要求10所述的方法，其中该治疗或疗法是处于足以将Th17细胞从病原性标签转换为非病原性标签的量的靶基因拮抗剂，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
12.如权利要求10所述的方法，其中该治疗或疗法是处于足以将Th17细胞从非病原性标签转换为病原性标签的量的、增强或增加选自下组的靶基因的表达的激动剂，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的方法，其中该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
14.根据权利要求8至13中任一项所述的方法，其中这些T细胞是天然T细胞，部分分化的T细胞，分化的T细胞，天然T细胞和部分分化的T细胞的组合，天然T细胞和分化的T细胞的组合，部分分化的T细胞和分化的T细胞的组合，或天然T细胞、部分分化的T细胞和分化的T细胞的组合。
15.一种调控T细胞平衡的方法，该方法包括使T细胞或T细胞群与一定量的T细胞调控剂接触，相比于在不存在该T细胞调控剂的情况下该T细胞或T细胞群的分化、维持和/或功能，该量足以通过改变Th17细胞、调节性T细胞(Treg)和其他T细胞亚群之间的平衡来修饰该T细胞或T细胞群的分化、维持和/或功能。
16.如权利要求15所述的方法，其中该T细胞调控剂是处于足以诱导朝向调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、或Treg和Th1细胞的组合分化的量的GPR65拮抗剂。
17.如权利要求15所述的方法，其中该T细胞调控剂是处于足以诱导T细胞朝向Th17细胞分化的量的、增强或增加GPR65表达的激动剂。
18.如权利要求15所述的方法，其中该T细胞调控剂对选自下组的靶基因具有特异性，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
19.如权利要求18所述的方法，其中该T细胞调控剂是处于足以将Th17细胞从病原性标签转换为非病原性标签的量的靶基因拮抗剂，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
20.如权利要求18所述的方法，其中该T细胞调控剂是处于足以将Th17细胞从非病原性标签转换为病原性标签的量的、增强或增加选自下组的靶基因的表达的激动剂，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中该T细胞调控剂是抗体、可溶性多肽、多肽剂、肽剂、核酸剂、核酸配体、或小分子剂。
22.根据权利要求15至21中任一项所述的方法，其中这些T细胞是天然T细胞，部分分化的T细胞，分化的T细胞，天然T细胞和部分分化的T细胞的组合，天然T细胞和分化的T细胞的组合，部分分化的T细胞和分化的T细胞的组合，或天然T细胞、部分分化的T细胞和分化的T细胞的组合。
23.一种方法，该方法增强细胞群中Th17分化，增加选自白细胞介素17F(IL-17F)、白细胞介素17A(IL-17A)、STAT3、白细胞介素21(IL-21)和RAR相关孤儿受体C(RORC)中的一种或多种Th17相关细胞因子或一种或多种Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，和/或降低选自FOXP3、干扰素γ(IFN-γ)、GATA3、STAT4和TBX21中的一种或多种非Th17相关细胞因子或非Th17相关转录调节物的表达、活性和/或功能，该方法包括使T细胞与一种药剂接触，该药剂增强CD5L、DEC1、PLZP、TCF4或其组合的表达、活性和/或功能。
24.如权利要求23所述的方法，其中该药剂增强CD5L、DEC1、PLZP、或TCF4中至少一种的表达、活性和/或功能。
25.如权利要求23或24所述的方法，其中该药剂是抗体、可溶性多肽、多肽激动剂、肽激动剂、核酸激动剂、核酸配体、或小分子激动剂。
26.如权利要求21或25所述的方法，其中该药剂是抗体。
27.如权利要求26所述的方法，其中该抗体是单克隆抗体。
28.如权利要求26所述的方法，其中该抗体是嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、或全人类单克隆抗体。
29.处于足以诱导朝向调节性T细胞(Treg)、Th1细胞、或Treg和Th1细胞的组合分化的量的GPR65拮抗剂用于治疗患者体内的异常免疫应答或该异常免疫应答的治疗的药物发现或者配制或制备针对该异常免疫应答的治疗的用途。
30.处于足以诱导T细胞朝向Th17细胞分化的量的、增强或增加GPR65表达的激动剂用于治疗患者体内的异常免疫应答或该异常免疫应答的治疗的药物发现或者配制或制备针对该异常免疫应答的治疗的用途。
31.处于足以将Th17细胞从病原性标签转换为非病原性标签的量的靶基因拮抗剂用于治疗患者体内的异常免疫应答或该异常免疫应答的治疗的药物发现或者配制或制备针对该异常免疫应答的治疗的用途，该靶基因选自下组，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
32.处于足以将Th17细胞从非病原性标签转换为病原性标签的量的、增强或增加选自下组的靶基因的表达的激动剂用于治疗患者体内的异常免疫应答或该异常免疫应答的治疗的药物发现或者配制或制备针对该异常免疫应答的治疗的用途，该组由以下各项组成：DEC1、PZLP、TCF4和CD5L。
33.T细胞调控剂用于治疗患者体内的异常免疫应答的用途。
34.一种用于治疗涉及免疫应答的疾病或病症的药物发现方法，该免疫应答涉及细胞群或组织中的T细胞平衡，该细胞群或组织表达选自表1或表2的基因的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物，该方法包括以下步骤：
(a)提供一种化合物或多种化合物，该一种化合物或多种化合物有待针对其在所述疾病或病症的治疗中的功效而被筛选；
(b)使所述化合物或所述多种化合物与所述细胞群或组织接触；
(c)检测选自表1或表2的基因的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物的表达、活性和/或功能的第一水平；
(d)将该检测到的水平与选自表1或表2的基因的一种或多种标签基因或者一种或多种标签基因的一种或多种产物或基因产物的表达、活性和/或功能的水平对照进行比较；并且，
(e)评估该检测到的水平与该对照水平之间的差异，以确定由所述化合物或所述多种化合物引起的免疫应答。
35.一种治疗方法或药物发现方法或者配制或制备治疗的方法，所述的方法包括如以上权利要求中任一项所述的方法或用途中的任一种。
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