JP2023502255A - Ｔ細胞受容体同定のための組成物及び方法 - Google Patents

Ｔ細胞受容体同定のための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための組成物及び方法を提供する。同定は、マーカーベース選択の前後のＴＣＲの頻度の比較に基づいて行うことができる。また、同定は、変異抗原及び野生型抗原によって刺激された細胞プールにおけるＴＣＲの頻度の比較に基づいて行うこともできる。【選択図】図１

Description

相互参照
本出願は、２０１９年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／９３７，５９５号による利益を主張し、当該出願は、参照により本明細書に援用される。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は抗原－主要組織適合複合体の認識を担い、炎症応答の開始を導く。細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞を含む多くのＴ細胞サブセットが存在する。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている）は、異常な細胞（例えば、ウイルスに感染した細胞または腫瘍細胞）を殺滅する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている）は、他の免疫細胞の活性化や成熟を助ける。細胞傷害性Ｔ細胞及びヘルパーＴ細胞は、それぞれの応答のトリガーとなる特異的な標的抗原を認識した後にその機能を発揮する。Ｔ細胞の抗原特異性は、Ｔ細胞の表面上に発現するＴＣＲによって定義することができる。Ｔ細胞受容体は、２つのポリペプチド鎖から構成されたヘテロダイマータンパク質であり、最も一般的なものはアルファ鎖及びベータ鎖であるが、少数のＴ細胞がガンマ鎖及びデルタ鎖を発現することもある。ＴＣＲの特異的なアミノ酸配列及び結果としての三次元構造が、ＴＣＲの抗原特異性及び親和性を規定する。ＴＣＲは膨大な数の可能な配列が存在するため、個々のＴ細胞のＴＣＲ鎖のアミノ酸配列及びコードＤＮＡ配列は、一生物の全体のＴＣＲレパートリーの中でほぼ常にユニークであるか、または非常に少ない存在量である。このような配列の多様性は、Ｔ細胞の発生中に複数の細胞機序によって達成され、免疫システムが膨大な種類の潜在的抗原に応答する能力における極めて重要な側面と考えられる。
ＴＣＲレパートリーの解析は、免疫システムの特徴ならびに疾患の病因及び進行（特に抗原性トリガーが未知のもの）について、より十分な理解を得る一助となり得る。
本明細書では、ハイスループットでデータをシークエンシングすることからＴＣＲクローンを同定するための方法を開発する必要性が認識されている。
１つの態様において、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備することであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲの同族対を発現する、準備することと、（ｂ）各Ｔ細胞の１つのＴＣＲの同族対の第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドと第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドとを対合し、それにより、複数のポリヌクレオチド対を生成することと、（ｃ）複数のポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達することであって、各レシピエント細胞が、複数のポリヌクレオチド対のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを含む、送達することと、（ｄ）複数のポリヌクレオチド対を複数のレシピエント細胞で発現させることと、（ｅ）複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数のレシピエント細胞におけるＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、（ｆ）複数のレシピエント細胞を１つ以上の抗原に接触させ、それにより、複数のレシピエント細胞のサブセットでマーカーを活性化することと、（ｇ）複数のレシピエント細胞のサブセットをマーカーに基づいて単離することと、（ｈ）複数のレシピエント細胞のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数のレシピエント細胞のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、（ｉ）複数のレシピエント細胞のサブセットにおける頻度が複数のレシピエント細胞における頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、複数のレシピエント細胞のサブセットにおけるＴＣＲの頻度は、複数のレシピエント細胞におけるＴＣＲの頻度より少なくとも１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上高い。いくつかの実施形態において、マーカーはＴ細胞活性化マーカーである。いくつかの実施形態において、マーカーはレポータータンパク質である。いくつかの実施形態において、レポータータンパク質は蛍光タンパク質である。いくつかの実施形態において、マーカーは、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、または分泌タンパク質である。いくつかの実施形態において、マーカーは、細胞内タンパク質または分泌タンパク質であり、当該方法はさらに、単離することの前に、複数のレシピエント細胞を固定する及び／または透過処理することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数のレシピエント細胞をゴルジブロッカー接触させることを含む。いくつかの実施形態において、分泌タンパク質はサイトカインである。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態において、細胞表面タンパク質は、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原は、１つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＭＨＣテトラマー、ナノ粒子、またはこれらの任意の組合せ上に示される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＣは、対象から単離された１つ以上の細胞であるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＣは、１つ以上の人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＣは、１つ以上のＡＰＣに外来性であるＭＨＣ分子を発現する。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＣは、１つ以上のがん細胞、腫瘍様塊（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）、がんオルガノイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）、またはこれらの誘導体である。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＣは、抗原コードＤＮＡまたはＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはｍＲＮＡベクターである。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡベクターは自己増幅ｍＲＮＡである。いくつかの実施形態において、１つ以上のＡＰＣは、１つ以上の抗原でパルスされる。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原は、１つ以上の腫瘍抗原に由来する。いくつかの実施形態において、１つ以上の腫瘍抗原は、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＷＴ－１、ＳＳＸ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＰＲＡＭＥ、サバイビン、Ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ｍａｒｔ－１、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、マンマグロビン、ｐ５３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、プロテイナーゼ３、ムチン１、またはＭＡＧＥ－Ａ４を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原は、遺伝子異常またはエピジェネティック異常を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子異常は、点変異、融合、欠失、挿入、フレームシフト、イントロン封入、または代替スプライシングを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の抗原は、健康な細胞に比べてがん細胞で上方調節される（例えば、抗原の発現レベルが上方調節される）。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーまたは複数のレシピエント細胞のサブセットのＴＣＲレパートリーから、（ｉ）で同定されるＴＣＲを選択することを含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）で同定されるＴＣＲを選択することは、ＴＣＲを増幅することを含む。いくつかの実施形態において、（ｃ）のポリヌクレオチドはバーコードを含む。
別の態様において、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備することであって、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲの同族対を発現する、準備することと、（ｂ）各Ｔ細胞の１つのＴＣＲの同族対の第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドと第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドとを対合し、それにより、複数のポリヌクレオチド対を生成することと、（ｃ）複数のポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを、第１の複数のレシピエント細胞及び第２の複数のレシピエント細胞に送達することであって、第１の複数のレシピエント細胞または第２の複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、複数のポリヌクレオチド対のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、送達することと、（ｄ）複数のポリヌクレオチド対を、第１及び第２の複数のレシピエント細胞で発現させることと、（ｅ）第１の複数のレシピエント細胞を第１の抗原と接触させ、それにより、第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットの第１のマーカーを活性化し、第２の複数のレシピエント細胞を第２の抗原と接触させ、それにより、第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットの第２のマーカーを活性化することと、（ｆ）第１のサブセットを第１のマーカーに基づいて単離し、第２のサブセットを第２のマーカーに基づいて単離することと、（ｇ）第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットのＴＣＲレパートリー及び第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度及び第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、（ｈ）第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットにおける頻度が第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットにおける頻度よりも高いＴＣＲを同定することとを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態において、第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットにおけるＴＣＲの頻度は、第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットにおけるＴＣＲの頻度より少なくとも１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上高い。いくつかの実施形態において、第１のマーカー及び第２のマーカーは同じである。いくつかの実施形態において、第１のマーカー及び第２のマーカーは異なる。いくつかの実施形態において、第２の抗原は、第１の抗原に相同ではない。いくつかの実施形態において、第１の抗原及び第２の抗原は、同じタンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、第１の抗原は変異配列を含み、第２の抗原は野生型配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の抗原はがん細胞由来に由来し、第２の抗原は健康な細胞に由来する。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、接触させる前に、複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数のレシピエント細胞におけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーまたは第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットのＴＣＲレパートリーから、（ｈ）で同定されるＴＣＲを選択することを含む。いくつかの実施形態において、（ｈ）で同定されるＴＣＲを選択することは、ＴＣＲを増幅することを含む。いくつかの実施形態において、（ｃ）のポリヌクレオチドはバーコードを含む。
いくつかの実施形態において、複数のＴ細胞は、対象から単離される。いくつかの実施形態において、複数のＴ細胞は腫瘍浸潤リンパ球である。
別の態様において、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する複数の細胞を準備することであって、複数の細胞の各細胞が、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲを発現し、複数のＴＣＲが、少なくとも５つの異なる同族対を含み、かつ複数のＶ遺伝子からのＶ領域を含み、複数のＴＣＲが、複数の細胞に外来性である、準備することと、（ｂ）複数の細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数の細胞におけるＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、（ｃ）複数の細胞を１つ以上の抗原に接触させ、それにより、複数の細胞のサブセットのマーカーを活性化することと、（ｄ）細胞のサブセットをマーカーに基づいて単離することと、（ｅ）複数の細胞のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数の細胞のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することと、（ｆ）複数の細胞のサブセットにおける頻度が複数の細胞における頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数の細胞のＴＣＲレパートリーまたは複数の細胞のサブセットのＴＣＲレパートリーから、（ｆ）で同定されるＴＣＲを選択することを含む。いくつかの実施形態において、（ｆ）で同定されるＴＣＲを選択することは、ＴＣＲを増幅することを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）における複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲをコードする配列は、バーコードを含む。
別の態様において、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、（ａ）複数のＴＣＲを発現する第１の複数の細胞及び複数のＴＣＲを発現する第２の複数の細胞を準備することであって、第１の複数の細胞または第２の複数の細胞の各細胞が、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲを発現し、複数のＴＣＲが少なくとも５の異なる同族対を含み、かつ複数のＶ遺伝子からのＶ領域を含み、複数のＴＣＲが、第１の複数の細胞または第２の複数の細胞に外来性である、準備することと、（ｂ）第１の複数の細胞を第１の抗原に接触させ、それにより、第１の複数の細胞の第１のサブセットの第１のマーカーを活性化し、第２の複数の細胞を第２の抗原に接触させ、それにより、第２の複数の細胞の第２のサブセットの第２のマーカーを活性化することと、（ｃ）第１のサブセットを第１のマーカーに基づいて単離し、第２のサブセットを第２のマーカーに基づいて単離することと、（ｄ）第１の複数の細胞の第１のサブセットのＴＣＲレパートリー及び第２の複数の細胞の第２のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、第１の複数の細胞の第１のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度及び第２の複数の細胞の第２のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、（ｅ）第１の複数の細胞の第１のサブセットにおける頻度が第２の複数の細胞の第２のサブセットにおける頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の細胞のＴＣＲレパートリーまたは第１の複数の細胞の第１のサブセットのＴＣＲレパートリーから、（ｅ）で同定されるＴＣＲを選択することを含む。いくつかの実施形態において、（ｅ）で同定されるＴＣＲを選択することは、ＴＣＲを増幅することを含む。いくつかの実施形態において、（ａ）における複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲをコードする配列は、バーコードを含む。
いくつかの実施形態において、頻度は、１つのＴＣＲのシークエンシングリード数をＴＣＲレパートリーの総シークエンシングリード数で割ったものによって決定される。いくつかの実施形態において、同定されたＴＣＲは標的反応性ＴＣＲである。
別の態様において、本開示は、ＴＣＲ、または本明細書に記載の方法のいずれか１つによって同定されたＴＣＲを発現する細胞を含む、医薬組成物を提供する。
参照による援用
本開示で言及されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許または特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれているように示されている場合と同じ程度において、参照により本明細書に援用される。参照により援用される刊行物及び特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示内容と矛盾する程度において、本明細書は、任意のこのような矛盾する内容に取って代わる及び／または優先するように意図されている。
本明細書の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点については、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明、及びその添付図面（本明細書では「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」、「図（Ｆｉｇ）」、及び「図（ＦＩＧＵＲＥ）」とも称される）を参照することによって、より十分な理解が得られるであろう。
本明細書に記載のＴ細胞受容体同定のワークフローの一例を示す。 選択前プールと選択後プールにおけるＴＣＲの頻度を比較することによるＴ細胞受容体同定のワークフローの一例を示す。 第１の選択後プールと第２の選択後プールにおけるＴＣＲの頻度を比較することによるＴ細胞受容体同定のワークフローの一例を示す。 本明細書に記載の方法を用いたＴ細胞受容体同定の実験データを示す。データは、リアル選択後のポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞（Ｙ軸）及び選択前のポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞（Ｘ軸）における各ＴＣＲの頻度を示す。 本明細書に記載の方法を用いたＴ細胞受容体同定の実験データを示す。データは、模擬選択後のポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞（Ｙ軸）及び選択前のポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞（Ｘ軸）における各ＴＣＲの頻度を示す。 本明細書に記載の方法を用いたＴ細胞受容体同定の実験データを示す。データは、「リアル」共培養（Ｙ軸）及び「模擬」共培養（Ｘ軸）におけるＴＣＲの濃縮係数を示す。点のサイズは、選択前のポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲの頻度を示す。
本開示では、別段の明記がない限り、単数形の使用は複数形を含む。さらに、「または」の使用は、別段の記載がない限り、「及び／または」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、限定的であるようには意図されていない。
「約」または「およそ」という用語は、当業者による判定で特定の値に対し許容される誤差範囲を意味し、この誤差は、部分的には、値がどのように測定または定量されるか、すなわち、測定システムの制約に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における慣例に従い、１以内のまたは１以上の標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は、値の１桁以内、好ましくは値の５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。別段の明記がない限り、本出願及び特許請求の範囲に特定の値が記載される場合、「約」という用語は、特定の値における許容可能な誤差範囲内を意味することを想定するものとする。
「免疫受容体」という用語は、免疫細胞が標的を認識するために産生する受容体タンパク質または受容体タンパク質複合体を指す。標的は、抗原またはその一部（例えば、エピトープ）とすることができる。抗原は、タンパク質またはペプチドとすることができる。標的は、ＭＨＣ結合ペプチドとすることができる。免疫受容体の例としては、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）、抗体（「免疫グロブリン」と互換的に使用）、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が挙げられる。
「免疫受容体鎖」という用語は、免疫受容体のサブユニットとして機能するポリペプチドを指す。免疫受容体鎖の例としては、免疫グロブリン（Ｉｇ）の重鎖、免疫グロブリンの軽鎖、ＴＣＲのアルファ鎖、ＴＣＲのベータ鎖、ＴＣＲのガンマ鎖、ＴＣＲのデルタ鎖が挙げられる。
「二分性（ｂｉｐａｒｔｉｅ）免疫受容体」という用語は、２つの遺伝子にコードされたポリペプチドによって形成される免疫受容体を指す。細胞内では、２つの遺伝子が１つの染色体の異なる座位に位置する場合も、異なる染色体に位置する場合もある。この２つの遺伝子は、再構成遺伝子（例えば、Ｖ（Ｄ）Ｊ－再構成遺伝子）であり得る。Ｖ（Ｄ）Ｊ再構成遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれる機構を通じて生成され得る。これは、一次リンパ系器官で発生し、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）、及びいくつかの場合では多様（Ｄ）遺伝子セグメントが、ほぼランダムに再構成される。二分性免疫受容体の例としては、限定されるものではないが、ＢＣＲ（再構成重鎖遺伝子及び再構成軽鎖遺伝子によってコードされる）、抗体（再構成重鎖遺伝子及び再構成軽鎖遺伝子によってコードされる）、ＴＣＲ（再構成ＴＲＡ遺伝子及び再構成ＴＲＢ遺伝子によってコードされるか、または再構成ＴＲＧ遺伝子及び再構成ＴＲＤ遺伝子によってコードされる）が挙げられる。
「ソースＴＣＲ発現細胞」という用語は、自らのＴＣＲを発現ベクターにクローニングできるＴＣＲ発現細胞（例えば、Ｔ細胞）を指す。
「レシピエント細胞」という用語は、免疫受容体発現ベクター（例えば、ＴＣＲ発現ベクター）に機能的に導入できる細胞を指す。「機能的に導入される」という表現は、免疫受容体発現ベクター内でコードされた免疫受容体がレシピエント細胞内で発現できることを意味する。レシピエント細胞の例としては、限定されるものではないが、ＣＤ４５＋細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、幹細胞、細菌細胞、酵母細胞、及び細胞株が挙げられる。
「濃縮」、「単離」、「分離」、「選別」、「精製」、「選択」という用語、またはこれらの等価物は互換的に使用することができ、これらの用語は、試料から所与の特性を有するサブ試料を得ることを指す。例えば、濃縮することは、所望の細胞系列、またはある特定の細胞表現型（例えば、その細胞表現型に特徴的なある特定の細胞マーカーを発現するまたはある特定の細胞マーカー遺伝子を発現しない）を少なくとも約２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％含む細胞集団または細胞試料を得ることを含み得る。
本明細書で使用する場合、「ＴＣＲレパートリー」という用語は、ＴＣＲの集合またはライブラリーを指す。いくつかの場合では、試料または複数の細胞のＴＣＲレパートリーは、試料内の、または複数の細胞によって発現する、全てまたは実質的に全てのＴＣＲを含む。いくつかの場合では、試料または複数の細胞のＴＣＲレパートリーは、試料内のＴＣＲまたは複数の細胞によって発現するＴＣＲの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含み得る。いくつかの場合では、試料または複数の細胞のＴＣＲレパートリーは、試料内の、または複数の細胞によって発現するユニークなＴＣＲの少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％を含み得る。様々な態様において、ＴＣＲレパートリーを解析することは、ＴＣＲレパートリーのＴＣＲをコードする配列をシークエンシングすることを含み得る。
概要
ソースＴＣＲ発現細胞のポリクローナル集団は、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団に変換することができ、ここで、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の操作されたＴＣＲレパートリーは、ソースＴＣＲ発現細胞の天然ＴＣＲレパートリー（例えば、ＴＣＲ鎖の同族対の組合せ）を含み得る。ＴＣＲは二分性であることから、従来の技術でこの作業を行うのは困難であった。本明細書で提供する方法は、このような困難を克服するために使用することができる。ＴＣＲプログラムレシピエント細胞を使用することは、ソースＴＣＲ発現細胞を使用することに比べて、いくつかの利点が存在し得る。例えば、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、より多くの数で調製することができ、より理想的な機能特性を有し得、より理想的なエピジェネティック状態にあり得、より均一な遺伝子または表現型のバックグラウンドを有し得、抗原依存的刺激を強化するための追加の作用物質を発現するように設計することができ、または選択を補助するためのレポーター遺伝子を発現するように操作することができる。ＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、推定上の抗原反応性ＴＣＲを同定するのに使用することができる。推定上の抗原反応性ＴＣＲを同定するための方法は、選択前及び／または選択後の特定のＴＣＲの頻度を決定することを含み得る。本明細書で提供する方法は、細胞マーカーに基づく従来の選択方法に関連する制限（例えば、偽陽性）を克服し得る。例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いた細胞選別では、多くの選択された細胞が細胞マーカーを発現しても標的抗原に反応しないことがあるため、結果的に偽陽性となることがある。本明細書で提供する方法を使用すれば、偽陽性率を大幅に低減し、真の抗原反応性細胞を同定する確率（ｃｈａｎｇｅ）を高めることができる。
本明細書で提供する方法の一例として、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、１つ以上の抗原（例えば、ＭＨＣと複合化された１つ以上の抗原）に接触させることができる。１つ以上の抗原と接触させた後、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞を選択（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、パンニングまたは他の方法を用いて）に供して、選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞を得ることができる。選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、シークエンシングすることができる。シークエンシングリードを使用して、各ＴＣＲの頻度または相対的存在量を測定することができる（図１～３の「ＴＣＲ頻度分析」を参照）。ＴＣＲの頻度は、ＴＣＲ（例えば、ユニークな配列を有するＴＣＲ）をコードするオリジナル分子（例えば、ｃＤＮＡ）の数を１つの試料中に観察される全てのオリジナル分子の数で割ったものとして定義することができる。ＴＣＲ頻度分析は、推定上の標的反応性ＴＣＲ（例えば、抗原反応性ＴＣＲ）を同定するために使用することができる。いくつかの場合では、選択前に、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞（例えば、選択前のＴＣＲプログラムレシピエント細胞）は、シークエンシングし、ＴＣＲ頻度分析に供することができる。選択前プール及び選択後プールにおけるＴＣＲの頻度は、標的反応性ＴＣＲを同定するために使用することができる（図２）。いくつかの場合では、選択前のＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、第１の抗原と、第１の抗原のバリアントである第２の抗原とに接触させてもよい。第２の抗原は、第１の抗原と比較して１つ以上の変異を含んでもよい。第１及び第２の抗原に接触させた後、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞を選択に供して、選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞の第１及び第２のプールを得ることができる。選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞の第１及び第２のプールは、シークエンシングし、ＴＣＲ頻度分析に供することができる。第１のプール及び第２のプールにおけるＴＣＲの頻度は、標的反応性ＴＣＲを同定するために使用することができる（図３）。本発明のＴＣＲプログラムレシピエント細胞及び推定上の抗原反応性または腫瘍反応性ＴＣＲを同定する方法は、様々な用途に使用することができる。
本明細書で提供する方法は、ＴＣＲの集団から複数の抗原反応性または腫瘍反応性ＴＣＲを同定するために使用することができる。本明細書で提供する方法は、ＴＣＲの集団から複数の腫瘍反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するために使用することができ、ここで、ＴＣＲの集団は、少なくとも約２０、３０、５０、１００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なる同族対を含む。複数の同族ＴＣＲまたはそのサブセットを発現する複数の細胞は、１つ以上の腫瘍反応性ＴＣＲを同定するために使用することができる。複数の同族ＴＣＲまたはそのサブセットは、複数の細胞に外来性であり得る。複数のＴＣＲまたはそのサブセットは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０の異なる同族対を含み得る。いくつかの場合では、複数の腫瘍反応性ＴＣＲまたはそのサブセットは、約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、もしくは４，０００以上、またはそれ以上の異なる同族対を含み得る。複数の腫瘍反応性ＴＣＲの各ＴＣＲは、異なるエピトープもしくは異なるタンパク質に特異的であり得、または異なる（ｉ）ＴＣＲアルファＣＤＲ３配列、（ｉｉ）ＴＣＲベータＣＤＲ３可変ドメイン配列、（ｉｉｉ）ＴＣＲアルファ可変ドメイン配列、（ｉｖ）ＴＣＲベータ可変ドメイン配列、もしくは（ｖ）ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ可変ドメイン配列を一緒に含み得る。当該方法はさらに、対象からＴＣＲの集団を発現するＴ細胞の集団を単離することを含み得る。異なるＴＣＲの同族対は、少なくとも５、１０、１５、２０、またはそれ以上の異なるＶ遺伝子からのＶ領域を含み得る。
本明細書で提供する方法は、小さな試料サイズの試料（例えば、最大で約１００，０００、１０，０００、１，０００、１００、またはそれ以下の細胞を有する試料）から抗原反応性または腫瘍反応性ＴＣＲを同定することができる。本明細書で提供する抗原反応性または腫瘍反応性ＴＣＲを同定する方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の集団を発現する対象からＴ細胞の集団を単離することを含み得、このＴ細胞の集団は、最大約１，０００細胞、１０，０００細胞、または１００，０００細胞を含み得る。
発現ベクター
ソースＴＣＲ発現細胞からのＴＣＲは、発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドライブラリーを生成するために使用され、発現のためにレシピエント細胞に送達することができる。発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドライブラリーは、ベクターのライブラリーを含み得る。発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドは、線状または環状の核酸分子としてレシピエント細胞に送達することができる。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドは、エレクトロポレーションによってレシピエント細胞に送達することができる。いくつかの場合では、ポリヌクレオチドは、カチオン性ポリマーなどの担体によってレシピエント細胞に送達することができる。
ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載のレシピエント細胞に送達することができる。ポリヌクレオチド分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはこれらの組合せであり得る。ポリヌクレオチド分子はｍＲＮＡであり得る。ポリヌクレオチド分子は核酸のアナログを含み得る。
ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子は、ＴＣＲの全コード配列またはその一部を含み得る。ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子は、ＴＣＲアルファ鎖もしくはＴＣＲベータ鎖、またはＴＣＲガンマ鎖もしくはＴＣＲデルタ鎖を含むＴＣＲの同族対のコード配列を含み得る。ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子は、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子は、ベクターによってレシピエント細胞に送達することができる。ベクターは、ベクターの力価及び形質移入または形質導入の効率を決定する目的で、マーカー遺伝子（例えば、ＧＦＰ）を含んでもよい。いくつかの場合では、細胞は、低い感染多重度（ＭＯＩ）、例えば、少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、またはそれ以上のＭＯＩで形質移入または形質導入することができる。いくつかの場合では、細胞は、最大で約３．０、２．９、２．８、２．７、２．６、２．５、２．４、２．３、２．２、２．１、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、またはそれ以下のＭＯＩで形質移入または形質導入することができる。いくつかの場合では、複数の異なるＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子のライブラリーは、個々のレシピエント細胞が１、２、３、４、５、６、７、８つ、またはそれ以上のＴＣＲのみを発現できるように複数のレシピエント細胞に送達することができる。いくつかの場合では、複数の異なるＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子のライブラリーは、個々のレシピエント細胞が最大で約８、７、６、５、４、３、２、または１つのＴＣＲ（複数可）を発現できるように複数のレシピエント細胞に送達することができる。いくつかの場合では、個々のレシピエント細胞は、１つのＴＣＲ（例えば、ユニークなＴＣＲ対）のみを発現することができる。例えば、レンチウイルスベクターまたは自己増幅ＲＮＡを使用して、ユニークなＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子の１コピーを１つのレシピエント細胞に送達することができる。別の例として、ユニークなＴＣＲをコードするポリヌクレオチド分子は、任意の利用可能な遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）によって、レシピエント細胞のゲノムに遺伝子的にノックインさせることができる。
ＴＣＲは、プラスミド、トランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙ Ｂａｃ）、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、ＡＡＶベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター）などのベクターから発現させることができる。ベクターのさらなる例としては、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、及び発現ベクターが挙げられる。プラスミドベクターの非限定的な例としては、ｐＵＣ、ｐＢＲ３２２、ｐＥＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、及びこれらのバリアントが挙げられる。さらに、ベクターは、追加の発現制御配列（例えば、エンハンサー配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終結配列など）、選択マーカー配列（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、複製起点などを含み得る。いくつかの場合では、ベクターは、レシピエント細胞に導入され、それにより、形質転換されたレシピエント細胞を産生する核酸である。ベクターは、レシピエント細胞内での複製を可能にする核酸配列（例えば、複製起点）を含み得る。また、ベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子及び他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターは、ＴＣＲの発現を可能にする配列に作用可能に結合した、本開示に従う対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドを含む発現ベクターであり得る。ベクターは、ウイルス及び非ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、アデノウイルスベクター（その複製可能形態、複製欠損形態、及びガットレス形態を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ－４０）ベクター、ウシ乳頭腫ベクター、エプスタインバーベクター、ヘルペスベクター、ワクシニアベクター、モロニーマウス白血病ベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳癌ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、ならびに非ウイルス性プラスミドであり得るバキュロウイルスベクターは、昆虫細胞での発現に適していると考えられる。
いくつかの実施形態において、ベクターは自己増幅ＲＮＡレプリコン（自己複製（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）（ｍ）ＲＮＡ、自己複製（ｓｅｌｆ－ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（ｍ）ＲＮＡ、自己増幅（ｍ）ＲＮＡ、またはＲＮＡレプリコンとも称される）である。自己増幅ＲＮＡレプリコンは、自分自身を複製することができるＲＮＡである。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、細胞の内部で自分自身を複製することができる。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡポリメラーゼ及び目的分子をコードする。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰまたはＲｄＲｐ）であり得る。自己増幅ＲＮＡレプリコンは、プロテアーゼまたはＲＮＡキャッピング酵素もコードすることができる。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、アルファウイルスとして知られるＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅファミリーであるかそれに由来し、これには、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６、セムリキフォレストウイルス、ミデルブルフウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バルマフォレストウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ホワロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチ（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ）ウイルス、ハイランズＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ンドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、バギークリークウイルス、及び国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によってアルファウイルスとして分類された他の任意のウイルスが含まれ得る。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、弱毒化形態のアルファウイルス（例えば、ＶＥＥ ＴＣ－８３ワクチン株）の一部であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、細胞に対する細胞変性効果またはアポトーシス効果なしで目的分子の発現を可能にする、ウイルスの減弱形態である。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、宿主細胞、標的細胞、または生物における特定の機能（例えば、ＴＣＲ発現の持続または増加）のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｓｉｌｉｃａで操作または選択されている。例えば、自己増幅ＲＮＡレプリコンの異なるバリアントを有する宿主細胞の集団を、異なる時点での（自己増幅型ＲＮＡレプリコンまたは宿主ゲノムによってコードされた）１つ以上の目的分子の発現レベルに基づいて選択することができる。いくつかの実施形態において、選択または操作された自己増幅ＲＮＡレプリコンは、宿主細胞または生物からのＩ型インターフェロン応答、自然抗ウイルス応答、または適応免疫応答を低減するように修飾されており、その結果、ＲＮＡレプリコンのタンパク質発現は、宿主細胞、標的細胞、または生物でより長く持続するまたはより高いレベルで発現する。いくつかの実施形態において、この最適化された自己増幅ＲＮＡレプリコン配列は、所望の表現型形質（例えば、野生型株またはワクチン株と比較して、より高いもしくは持続的な目的分子の発現、またはより低いベクターに対する自然抗ウイルス免疫応答）を有する個々の細胞または細胞集団から得られる。いくつかの実施形態において、所望のまたは選択された自己増幅ＲＮＡレプリコン配列を有する細胞は、自己増幅ＲＮＡレプリコンを含む治療薬剤で治療された後に有益な応答特性を有する対象（例えば、ヒトまたは動物）（例えば、エリートレスポンダーまたは完全寛解中の対象）から得られる。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンベクターは、追加の作用物質を発現することができる。いくつかの実施形態において、追加の作用物質は、サイトカイン、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、グランザイムＢ、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、追加の作用物質は、ＴＣＲの発現に直接影響を及ぼすことにより、または宿主細胞の表現型を調節する（例えば、アポトーシスまたは増殖を誘導する）ことにより、ＴＣＲの発現を調節することが可能である。いくつかの実施形態において、自己増幅ＲＮＡレプリコンは、１つ以上のサブゲノムポリヌクレオチド（複数可）を産生するための１つ以上のサブゲノム配列（複数可）を含み得る。いくつかの実施形態において、サブゲノムポリヌクレオチドは、細胞の翻訳機構による翻訳のための機能的ｍＲＮＡ分子として作用する。サブゲノムポリヌクレオチドは、サブゲノム配列からサブゲノムポリヌクレオチドを産生するようポリメラーゼに指示する自己増幅ＲＮＡレプリコン上の定義された配列エレメント（例えば、サブゲノムプロモーターまたはＳＧＰ）の機能を介し産生することができる。いくつかの実施形態において、ＳＧＰは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＤＲＰまたはＲｄＲｐ）によって認識される。いくつかの実施形態において、複数のＳＧＰ配列が単一の自己増幅ＲＮＡレプリコン上に存在し、そしてこの配列は、ＴＣＲ、ＴＣＲの構成成分、または追加の作用物質をコードするサブゲノム配列の上流に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＳＧＰ配列のヌクレオチド長または組成を修飾して、サブゲノムポリヌクレオチドの発現特性を変更することができる。いくつかの実施形態において、同一でないＳＧＰ配列は、対応するサブゲノムポリヌクレオチドの比率がＳＧＰ配列が同一である場合と異なるように自己増幅ＲＮＡレプリコン上に位置する。いくつかの実施形態において、同一でないＳＧＰ配列は、ＴＣＲ及び追加の作用物質（例えば、サイトカイン）の産生を指示して、ＴＣＲ発現が増加し、標的細胞または宿主に対する細胞傷害効果なしで標的細胞が増加またはより迅速に増殖し、またはＲＮＡレプリコンに対する自然もしくは適応免疫応答を弱めるような互いに対する比率で産生されるようにする。いくつかの実施形態において、サブゲノム配列及びＳＧＰ配列の互いに対する位置及びゲノム配列自体に対する位置を使用して、サブゲノムポリヌクレオチドの互いに対する比率を変更することができる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲをコードするＳＧＰ及びサブゲノム配列は、ＴＣＲの発現が追加の作用物質に対し実質的に増加するように、追加の作用物質をコードするＳＧＰ及びサブゲノム領域の下流に位置し得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡレプリコンまたはＳＧＰは、サイトカインがＴ細胞の増殖を促進し、またはＴＣＲの治療効果を増強し、ただし重篤な副作用（例えば、サイトカイン放出症候群、サイトカインストーム、または神経学的毒性）を引き起こさないように、最適な量のサイトカインを発現するように選択または操作されている。
いくつかの実施形態において、本明細書では、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖をコードする対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、本明細書では、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖をコードする対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、またはこれらのシュードタイプに由来する。いくつかの実施形態において、ベクターは非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、非ウイルス性ベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞貫通ペプチド、またはリポスフィアに製剤化することができる。
２つの鎖の発現は、２つのプロモーターまたは１つのプロモーターによって駆動され得る。いくつかの場合では、２つのプロモーターが使用される。いくつかの場合では、２つのプロモーターが、２つの鎖のそれぞれのタンパク質コード化配列と共に、ヘッドトゥヘッド、ヘッドトゥテール、またはテールトゥテールの方向に配置され得る。いくつかの場合では、１つのプロモーターが使用される。２つのタンパク質コード配列は、１つのプロモーターを使用して両方の鎖を発現させることができるように、任意選択でインフレームで、結合し得る。そして、このような場合、２つのタンパク質コード配列をヘッドトゥテール方向で配置し、リボソーム結合部位（例えば、内部リボソーム結合部位、すなわちＩＲＥＳ）、プロテアーゼ切断部位、または自己プロセシング切断部位（例えば、２Ａペプチドをコードする配列）で接続して、バイシストロニック発現を促進することができる。いくつかの場合では、２つの鎖が単鎖ポリペプチドとして発現できるように２つの鎖をペプチドリンカーで結合することができる。各発現鎖は、再配置されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を含めた完全な可変ドメイン配列を含み得る。各発現鎖は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含めた完全な可変ドメイン配列を含み得る。各発現鎖は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、及びＣＤＲ３を含めた完全な可変ドメイン配列を含み得る。いくつかの場合では、各発現鎖はさらに定常ドメイン配列を含み得る。
発現ベクターを作出するには、融合したＴＣＲ遺伝子に追加の配列を加える必要があり得る。このような追加の配列としては、ベクター骨格（例えば、標的細胞内または大腸菌などの一時的な宿主内でのベクターの複製に必要なエレメント）、プロモーター、ＩＲＥＳ、自己切断ペプチドをコードする配列、ターミネーター、アクセサリー遺伝子（例えば、ペイロード）、さらには対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドの部分配列（例えば、定常ドメインをコードする配列の一部）が挙げられる。
プロテアーゼの切断部位としては、限定されるものではないが、エンテロキナーゼ切断部位：（Ａｓｐ）４Ｌｙｓ；第Ｘａ因子の切断部位：Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ；トロンビン切断部位、例えば、Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ；レニン切断部位、例えば、Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｉｌｅ－Ｈｉｓ；コラゲナーゼ切断部位、例えば、Ｘ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ（Ｘは任意のアミノ酸である）；トリプシン切断部位、例えば、Ａｒｇ－Ｌｙｓ；ウイルスプロテアーゼ切断部位、例えばウイルス２Ａまたは３Ｃプロテアーゼ切断部位（限定されるものではないが、ピコルナウイルスからのプロテアーゼ２Ａ切断部位、Ａ型肝炎ウイルス３Ｃ切断部位、ヒトライノウイルス２Ａプロテアーゼ切断部位、ピコルナウイルス３プロテアーゼ切断部位を含む）；ならびにカスパーゼプロテアーゼ切断部位、例えば、活性化されたカスパーゼ－３によって認識及び切断されるＤＥＶＤ（切断は第２のアスパラギン酸残基の後に生じる）が挙げられる。いくつかの実施形態において、本開示は、プロテアーゼ切断部位を含む発現ベクターであって、プロテアーゼ切断部位が細胞プロテアーゼ切断部位またはウイルスプロテアーゼ切断部位を含む、発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態において、第１のタンパク質切断部位は、フリン；ＩＰＮＶのＶＰ４；タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ；ライノウイルスの３Ｃプロテアーゼ；ＰＣ５／６プロテアーゼ；ＰＡＣＥプロテアーゼ、ＬＰＣ／ＰＣ７プロテアーゼ；エンテロキナーゼ；第Ｘａ因子プロテアーゼ；トロンビン；ゲネナーゼＩ；ＭＭＰプロテアーゼ；カブモザイクポティウイルスの核内包タンパク質（Ｎ１ａ）；デング熱４型フラビウイルスのＮＳ２Ｂ／ＮＳ３、黄熱ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ；カリフラワーモザイクウイルスのＯＲＦ Ｖ；ＫＥＸ２プロテアーゼ；ＣＢ２；または２Ａによって認識される部位を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質切断部位は、ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位である。いくつかの実施形態において、ウイルス内部切断可能シグナルペプチド切断部位は、Ｃ型インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ハンタウイルス、フラビウイルス、または風疹ウイルスに由来する部位を含む。
本開示のベクターに含めるのに適したＩＲＥＳエレメントは、真核生物リボソームに係合可能なＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態において、本開示のＩＲＥＳエレメントは、少なくとも約２５０塩基対、少なくとも約３５０塩基対、または少なくとも約５００塩基対である。本開示のＩＲＥＳエレメントは、限定されるものではないが、ウイルス、哺乳類、及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａを含めた生物のＤＮＡに由来し得る。いくつかの場合では、ＩＲＥＳエレメントが由来するウイルスＤＮＡとしては、限定されるものではないが、ピコルナウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ、及びポリオウイルスｃＤＮＡが挙げられる。ＩＲＥＳエレメントが由来する哺乳類ＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）をコードするＤＮＡ及び塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）をコードするＤＮＡが挙げられる。ＩＲＥＳエレメントが由来するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ遺伝子が挙げられる。ポリオウイルスＩＲＥＳエレメントの追加例としては、例えば、ポリオウイルスＩＲＥＳ、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、またはＡ型肝炎ウイルスＩＲＥＳが挙げられる。フラビウイルスＩＲＥＳエレメントの例としては、Ｃ型肝炎ウイルスＩＲＥＳ、ＧＢウイルスＢ ＩＲＥＳ、またはペスチウイルスＩＲＥＳ（限定されるものではないが、ウシウイルス性下痢ウイルスＩＲＥＳもしくは古典的豚熱ウイルスＩＲＥＳを含む）が挙げられる。
自己プロセシング切断部位の例としては、限定されるものではないが、インテイン配列、修飾インテイン、ヘッジホッグ配列、他のホッグファミリー配列、２Ａ配列（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａ配列）、及び各々のバリエーションが挙げられる。
組換えＴＣＲの発現のためのベクターは、任意の数のプロモーターを含むことができ、このプロモーターは、構成的、調節可能または誘導可能、細胞型特異的、組織特異的、または種特異的である。さらなる例としては、テトラサイクリン応答性プロモーターが挙げられる。ベクターは、ＴＣＲ遺伝子を発現させる宿主細胞に適合したレプリコンとすることができ、また、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）内でも機能するレプリコンを含み得る。プロモーターは構成的または誘導的であり得、ここで誘導は、例えば、特定の細胞型または特定の成熟度に関連する。代替的に、複数のウイルスプロモーターが好適な場合がある。プロモーターの例としては、β－アクチンプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、伸長因子１Ａ（ＥＦ－１ＡまたはＥＰ－１アルファ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＦｒｉｅｎｄ脾臓フォーカス形成ウイルスプロモーターが挙げられる。プロモーターは、エンハンサーに関連しても関連しなくてもよく、エンハンサーは、特定のプロモーターに天然に関連しても異なるプロモーターに関連してもよい。
遺伝子発現の宿主細胞であるレシピエント細胞は、限定されるものではないが、動物細胞、特に哺乳類細胞であってもよく、微生物細胞（細菌、酵母、もしくは真菌）または植物細胞であってもよい。宿主細胞の例としては、昆虫培養細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞）、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、真菌（例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｕｍ、及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ種）、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＣＯＳ、２９３、３Ｔ３（マウス）、Ｖｅｒｏ（アフリカミドリザル）細胞、及び様々なトランスジェニック動物系（限定されるものではないが、ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ウシを含む）が挙げられる。バキュロウイルス（特にＡｃＮＰＶ）ベクターは、例えば、昆虫細胞株におけるポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なプロモーターの調節制御下での単一ＯＲＦの発現を用いて、本開示の単一ＯＲＦ ＴＣＲ発現及び切断に使用することができる。哺乳類細胞で使用されるプロモーターは、構成的（ヘルペスウイルスＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター）、または調節的（例えば、メタロチオネインプロモーター）であり得る。ベクターは、特定の哺乳類細胞に感染するウイルス（例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、及びアデノウイルス、ならびにこれらの誘導体）に基づき得る。プロモーターとしては、限定されるものではないが、サイトメガロウイルス、アデノウイルス後期、ワクシニア７．５Ｋプロモーターが挙げられる。エノラーゼは構成的酵母プロモーターの一例であり、アルコールデヒドロゲナーゼは調節的プロモーターの一例である。
特定のプロモーター、転写終結配列、組織特異的配列、及び他の任意選択の配列（例えば、組織特異的配列をコードする配列）の選択は、発現が行われる細胞型によって決定することができる。細菌、酵母、真菌、哺乳類、昆虫、ニワトリ、または他の動物細胞であってもよい。
ＴＣＲ発現ベクターから発現するＴＣＲは、天然形態をとっても、操作された形態をとってもよい。いくつかの場合では、操作された形態は、一本鎖のＴＣＲ断片である。いくつかの場合では、操作された形態はＴＣＲ－ＣＡＲである。また、既存の方法を使用して、これらの操作された形態のＴＣＲを発現するＴＣＲ発現ベクターを作成するために機能的配列（例えば、リンカー、ＣＤ２８ ＴＭドメイン）を対合ＴＣＲエンコードポリヌクレオチドに導入することもできる。
ソースＴＣＲ発現細胞
ＴＣＲの２本の鎖をインフォマティクス的または物理的に対合することができるソースＴＣＲ発現細胞は、様々な生物からの様々な細胞型であってよく、様々な組織または器官から単離することができる。ソースＴＣＲ発現細胞は、様々な試料から得ることができる。ソースＴＣＲ発現細胞は、ＴＣＲを産生することができる。ソースＴＣＲ発現細胞は免疫細胞であり得る。免疫細胞とは、自然及び／または適応免疫応答の開始及び／または実行に機能的に関与する造血器起源の細胞を指す。ソースＴＣＲ発現細胞はリンパ球（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））であり得る。ソースＴＣＲ発現細胞はＴ細胞であり得る。
ソースＴＣＲ発現細胞は、様々な試料から得るまたは単離することができる。ソースＴＣＲ発現細胞は、様々な試料から得られたまたは単離された免疫細胞であり得る。試料は、本明細書に記載の様々な供給源または対象から得ることができる。レシピエント細胞も、本明細書に記載の試料から得ることができる。
ある特定の実施形態において、ソースＴＣＲ発現細胞は、免疫されたか、感染、がん、自己免疫状態、または任意の他の疾患を患っている対象または宿主（例えば、ヒトまたは他の動物）の血液試料または他の生物学的試料から単離して、潜在的に臨床的意義のある病原体特異的、腫瘍特異的、及び／または疾患特異的な抗体またはＴＣＲを同定することができる。例えば、当該ヒトは、疾患と診断されている場合もあれば、疾患の症状を示している場合もあれば、疾患と診断されていない場合もあれば、疾患の症状を示していない場合もある。例えば、当該ヒトは、感染病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンなど）、抗原、または疾患に対し有用なＴＣＲに曝露された及び／またはそのようなＴＣＲを作製できるヒトであり得る。例えば、当該動物は、感染病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンなど）、抗原、または疾患に対し有用なＴＣＲに曝露された及び／またはそのようなＴＣＲを作製できる動物であり得る。免疫された宿主からのある特定の免疫細胞は、１つ以上の問題とされる標的抗原及び／または１つ以上の未知の抗原に対しＴＣＲを作製することができる。本開示において、リンパ球プールは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、任意の好適な方法によって、例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、パニング、または他のスクリーニング方法を用いて細胞をスクリーニング及び選別することにより、所望の免疫細胞について濃縮して試料から複数の免疫細胞を生成することができる。
免疫細胞は、幹細胞から誘導することができる。幹細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、より特定的には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。代表的なヒト幹細胞はＣＤ３４＋細胞であり得る。単離された免疫細胞は、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ Ｔ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球、もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群より選択されるＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋ Ｔリンパ球、ＣＤ８＋ Ｔリンパ球、またはＣＤ４＋ＣＤ８＋ Ｔリンパ球であり得る。
いくつかの実施形態において、ソースＴＣＲ発現細胞は、非免疫ヒトまたは非ヒトドナーから単離された免疫細胞であり得る。免疫することにより、免疫原に結合するＶａ－ＶβまたはＶγ－Ｖδの組合せを作製する免疫細胞の増殖（クローン増殖）を誘導することができる。しかし、免疫されていない対象からの脾臓細胞及び／または免疫細胞、あるいは他の末梢血リンパ球を使用すると、可能性のあるＴＣＲレパートリーをより良好に表現することができ、また、任意の動物種を用いた後続のＴＣＲライブラリーの構築も可能になる。
いくつかの場合では、ソースＴＣＲ発現細胞は末梢血試料から得ることができる。末梢血細胞は、特定の細胞型（例えば、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞など）について濃縮することができる。また、末梢血細胞は、特定の細胞型（例えば、単核球、赤血球、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞など）を選択的に枯渇させることもできる。試料は、異なるＴＣＲを発現する少なくとも約５、１０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２５００、５０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１００００、２５００００、５０００００、７５００００、１００００００、２５０００００、５００００００、７５０００００、または１０００００００のサブセットの免疫細胞または個々の免疫細胞を含み得る。
いくつかの場合では、ソースＴＣＲ発現細胞は、固形組織を含む組織試料から得ることができ、非限定的な例としては、脳、肝臓、肺、腎臓、前立腺、卵巣、脾臓、リンパ節（扁桃腺を含む）、甲状腺、胸腺、膵臓、心臓、骨格筋、腸、喉頭、食道、及び胃からの組織が挙げられる。さらなる非限定的な供給源としては、骨髄、臍帯血、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍が挙げられる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞株を使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、健康なドナー、がんと診断された患者、または感染症と診断された患者に由来し得るか、またはそこから得ることができる。いくつかの実施形態において、細胞は、異なる表現型特性を呈する細胞の混合集団の一部である。
ソースＴＣＲ発現細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞であり得る。ＴＩＬは、がんに罹患した臓器から単離することができる。１つ以上の細胞を、がんを有する臓器（これは、脳、心臓、肺、眼、胃、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮、膀胱、皮膚、髪、爪、耳、腺、鼻、口、唇、脾臓、歯肉、歯、舌、唾液腺、扁桃腺、咽頭、食道、大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨、腱、靭帯、副腎、骨格筋、平滑筋、血管、血液、脊髄、気管、尿管、尿道、視床下部、下垂体、幽門、副腎、卵巣、卵管、子宮、膣、乳腺、精巣、精嚢、陰茎、リンパ、リンパ節、またはリンパ管であり得る）から単離することができる。１つ以上のＴＩＬは、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸、または膵臓に由来し得る。ＴＩＬは、膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺、または心臓に由来し得る。１つ以上の細胞は、膵島細胞、例えば、膵臓β細胞であり得る。いくつかの場合では、ＴＩＬは胃腸管のがんに由来し得る。ＴＩＬ培養は、複数の方法で調製することができる。例えば、腫瘍は、非がん組織または壊死領域から切除することができる。次に、腫瘍を長さ約２～３ｍｍに断片化することができる。いくつかの場合では、腫瘍は、約０．５ｍｍ～約５ｍｍのサイズ、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約２ｍｍ～約３ｍｍ、約３ｍｍ～約４ｍｍ、または約４ｍｍ～約５ｍｍのサイズに断片化することができる。腫瘍断片を酵素で消化して単一細胞懸濁液を得、そこから既存の方法を用いてリンパ球またはＴ細胞を単離することができる。腫瘍断片は、培地及び細胞刺激剤（例えば、サイトカイン）を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することもできる。いくつかの場合では、ＩＬ－２を利用して腫瘍断片からＴＩＬを増殖することができる。ＩＬ－２の濃度は、約６０００ＩＵ／ｍＬであり得る。ＩＬ－２の濃度は、約２０００ＩＵ／ｍＬ、３０００ＩＵ／ｍＬ、４０００ＩＵ／ｍＬ、５０００ＩＵ／ｍＬ、６０００ＩＵ／ｍＬ、７０００ＩＵ／ｍＬ、８０００ＩＵ／ｍＬ、９０００ＩＵ／ｍＬ、または最大約１００００ＩＵ／ｍＬであってもよい。ＴＩＬは、ひとたび増殖させたら、腫瘍反応性を決定するためにｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに供することができる。例えば、ＴＩＬは、ＦＡＣＳにより、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ５８の発現について評価することができる。また、ＴＩＬは、共培養、細胞傷害性、ＥＬＩＳＡ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供することもできる。いくつかの場合では、ＴＩＬ培養物を凍結保存したり、急速に増殖させたりしてもよい。ＴＩＬなどの細胞は、限定されるものではないが、胎児、新生児、若年者、及び成人を含む発達段階のドナーから単離することができる。
１つ以上の試料は、１つ以上の供給源に由来し得る。試料の１つ以上は、２つ以上の供給源に由来し得る。試料の１つ以上は、１名以上の対象に由来し得る。試料の１つ以上は、２名以上の対象に由来し得る。試料の１つ以上は、同じ対象に由来し得る。１名以上の対象は、同じ種に由来し得る。１名以上の対象は、異なる種に由来し得る。１名以上の対象は、健康であり得る。１名以上の対象は、疾患、障害、または状態に罹患している可能性がある。
試料は、ある状態を有する対象から採取することができる。いくつかの実施形態において、試料を採取される対象は、患者（例えば、がん患者、またはがんを有する疑いのある患者）とすることができる。対象は、哺乳類（例えば、ヒト）とすることができ、男性であっても女性であってもよい。いくつかの実施形態において、女性は妊娠中である。試料は、腫瘍生検であり得る。生検は、例えば、医療提供者（医師、医師助手、看護師、獣医師、歯科医師、カイロプラクター、救急医療技師、皮膚科医、腫瘍専門医、胃腸科医、または外科医を含む）によって実施することができる。
対象は、標的抗原が発現する疾患を有し得る。例えば、疾患はがんであり得、これには、Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨癌（ユーイング肉腫及び骨肉腫及び悪性線維性組織球腫を含む）、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍（胃腸）、原発不明、中枢神経系癌、原発性リンパ腫、子宮頸癌、胆管癌、慢性リンパ性白血病（ｃｌｌ）、慢性骨髄性白血病（ｃｍｌ）、慢性骨髄増殖性新生物、大腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ｄｃｉｓ）、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、性腺外生殖細胞腫瘍、眼癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、卵管癌、骨の悪性線維性組織球腫及び骨肉腫、胆嚢癌、胃（胃）癌、胃腸カルチノイド腫瘍、胃腸間質腫瘍（ｇｉｓｔ）、胚細胞腫瘍、外胚葉性、卵巣性、精巣性、妊娠性絨毛疾患、グリオーマ、有毛細胞性白血病、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、組織球症、ランゲルハンス細胞、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌（原発性）、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレーム、男性乳癌、骨の悪性組織球症及び骨肉腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞腫、中皮腫、悪性、原発不明転移性扁平上皮頚部癌、口腔癌、多発性骨髄腫／形質細胞新生物、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物及び慢性骨髄増殖性新生物、骨髄性白血病、慢性（ｃｍｌ）、骨髄性白血病、急性（ＡＭＬ）、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口唇及び口腔癌ならびに中咽頭癌、骨肉腫及び骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、膵臓癌及び膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫）、傍神経節腫、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、妊娠及び乳癌、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞（腎臓）癌、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、横紋筋肉腫、子宮肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、原発不明転移性扁平上皮頚部癌、胃（胃）癌、ｔ細胞リンパ腫、皮膚癌、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿管及び腎盂、移行細胞癌、移行細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮内膜及び子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍が含まれる。
いくつかの実施形態において、試料は、体液（例えば、血液、唾液、リンパ液、尿、脳脊髄液、精液、痰、便、または組織破砕物）である。いくつかの実施形態において、試料は唾液である。いくつかの実施形態において、試料は全血である。いくつかの実施形態において、十分な量の細胞を得るために、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｍＬの血液体積が採取される。いくつかの場合では、血液は、マグネシウムキレート剤（限定されるものではないが、ＥＤＴＡを含む）を含む装置に収集することができ、これは４℃で保存される。任意選択で、カルシウムキレート剤（限定されるものではないが、ＥＧＴＡを含む）を加えてもよい。いくつかの場合では、細胞溶解阻害剤が血液に加えられる。細胞溶解阻害剤としては、限定されるものではないが、ホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド誘導体、ホルマリン、グルタルアルデヒド、グルタルアルデヒド誘導体、タンパク質架橋剤、核酸架橋剤、タンパク質及び核酸架橋剤、一級アミン反応性架橋剤、スルフヒドリル反応性架橋剤、スルフヒドリル付加またはジスルフィド還元、炭水化物反応性架橋剤、カルボキシル反応性架橋剤、光反応性架橋剤、または切断性架橋剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、非核酸物質は、酵素処理（例えば、プロテアーゼ消化）を用いて出発材料から除去することができる。
複数の試料は、少なくとも２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、またはそれ以上の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１０００、またはそれ以上の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００の試料、９０００、または１０，０００の試料、または１００，０００の試料、または１，０００，０００以上の試料を含み得る。複数の試料は、少なくとも約１０，０００の試料を含み得る。
第１の試料は１つ以上の細胞を含み得、第２の試料は１つ以上の細胞を含み得る。第１の試料の１つ以上の細胞は、第２の試料の１つ以上の細胞と同じ細胞型であってもよい。第１の試料の１つ以上の細胞は、複数の試料の１つ以上の異なる細胞としての異なる細胞型であってもよい。
複数の試料は、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）得ることができる。複数の試料は、同時に（ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ）得ることができる。複数の試料は、順次得ることができる。複数の試料は、数年にわたって得ることができ、例えば、１００年、１０年、５年、４年、３年、２年、または１年にわたって１つ以上の異なる試料を得ることができる。１つ以上の試料は、１つ以上の異なる試料を得てから約１年以内に得ることができる。１つ以上の試料は、１つ以上の異なる試料を得てから１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、４か月、３か月、２か月、または１か月以内に得ることができる。１つ以上の試料は、１つ以上の異なる試料を得てから３０日、２８日、２６日、２４日、２１日、２０日、１８日、１７日、１６日、１５日、１４日、１３日、１２日、１１日、１０日、９日、８日、７日、６日、５日、４日、３日、２日、または１日以内に得ることができる。１つ以上の試料は、１つ以上の異なる試料を得てから約２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間以内に得ることができる。１つ以上の試料は、１つ以上の異なる試料を得てから約６０秒、４５秒、３０秒、２０秒、１０秒、５秒、２秒、または１秒以内に得ることができる。１つ以上の試料は、１つ以上の異なる試料を得てから１秒未満で得ることができる。
いくつかの実施形態において、特定の表現型のＴ細胞からのＴＣＲが対象となる。これを達成するには、Ｔ細胞のサブ集団を単離／濃縮／選別することができる。１つの実施形態において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、及びパーフォリン、または他の適切な分子（例えば、他のサイトカイン及び転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔｃｆ１（ヒトにおけるＴＣＦ７））を１つ以上発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法によって決定することができる。いくつかの実施形態において、１つ以上の目的遺伝子も発現するＴ細胞、例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、パーフォリン、Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔｃｆ１（ヒトの場合はＴＣＦ７）、または他のサイトカイン及び転写因子からのＴＣＲ配列は、単一細胞ＲＮＡシークエンシングによって得ることができる。
Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から得ることができる。Ｔ細胞は、組織または細胞に接触させることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化または増殖させることができる。例えば、患者の末梢血から単離したＴ細胞は、腫瘍抗原を提示する細胞（例えば、腫瘍細胞、腫瘍組織、腫瘍様塊、腫瘍ライセートでパルスされたＡＰＣ、または腫瘍ｍＲＮＡ負荷ＡＰＣ）と共培養することができる。腫瘍抗原を提示する細胞は、定義済み抗原、定義済み抗原のセット、または未定義の抗原のセット（例えば、腫瘍ライセートまたは全腫瘍ｍＲＮＡ）でパルスされたＡＰＣ、またはこれを発現するように操作されたＡＰＣであり得る。例えば、定義済み抗原を提示する場合、ＡＰＣは、既知の配列を有する１つ以上の短いエピトープ（例えば、７～６０アミノ酸長）をコードする１つ以上のミニジーンを発現することができる。また、ＡＰＣは、２つ以上のエピトープをコードする配列を含むベクターから２つ以上のミニジーンを発現することもできる。未定義の抗原を提示する場合、ＡＰＣを腫瘍ライセートまたは全腫瘍ｍＲＮＡでパルスすることができる。腫瘍抗原を提示する細胞は、共培養の前に照射してもよい。共培養は、共刺激シグナルまたはサイトカインを提供することができる試薬（例えば、抗ＣＤ２８抗体）を含む培地で行われ得る。このような共培養は、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を刺激及び／または増殖することができる。これらの細胞は、本明細書に記載の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７）を用いて選択または濃縮することができる。この方法を用いて、患者の末梢血、増殖前のＴＩＬ、または増殖後のＴＩＬから腫瘍抗原反応性Ｔ細胞を予め濃縮することができる。これらの予め濃縮したＴ細胞をインプットとして使用して、本明細書に記載の方法を用いて融合（または物理的に結合）したＴＣＲを得たり、単一細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑを用いてインフォマティクス的に対合したＴＣＲ配列を得たりすることができる。いくつかの場合では、予め濃縮したＴ細胞は、例えば、単一細胞バーコードを用いたシークエンシングにより、ＴＣＲの同族対を同定するための任意の他の方法に供される入力として使用することができる。また、本明細書に記載の方法を用いて調製された抗原及びＡＰＣは、本明細書の他の箇所に記載された様々な選択方法のためにＴＣＲプログラムレシピエント細胞に接触させるために使用することができる。
このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で末梢血Ｔ細胞を使用する場合、予め濃縮したＴ細胞（例えば、ＣＤ１３７＋）は、共培養中にマーカー（例えば、ＣＤ１３７）発現を獲得したＴ細胞を含んでもよく、また採血時に既にマーカーを発現しているＴ細胞を含んでもよい。後者の集団は、それでも腫瘍反応性であり得る。この方法は、記載されたＴＩＬの単離よりも簡単な代替的方法をもたらし得る。
いくつかの場合では、生きたＴＩＬを単離するための新鮮な腫瘍が利用できないことがあり、このような場合、凍結または固定した組織から核を単離することができる。また、このような核は、融合したＴＣＲポリヌクレオチドライブラリーを得るための対合二分性免疫受容体クローニングプロセス（この場合は対合ＴＣＲクローニング）のための入力、またはインフォマティクス的に対合ＴＣＲ配列を得るための単一細胞ＲＮＡ Ｓｅｑのための入力としても機能し得る。
ＴＣＲの多様性
ＴＣＲ発現細胞を有する元の部位は、対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドのレパートリーの特性に影響を及ぼし得、その結果、得られるＴＣＲ発現ベクター及びＴＣＲプログラムレシピエント細胞のレパートリーにも影響を及ぼし得る。このようなレパートリーの特徴の１つの態様は、遺伝子使用の多様性であり得る。
いくつかの場合では、レパートリーは２超、５超、１０超、５０超、１００超、５００超、１，０００超、５，０００超、１０，０００超、５０，０００超、または１００，０００超のＶ（Ｄ）Ｊの組合せを含み得る。いくつかの場合では、レパートリーは２超、５超、１０超、５０超、１００超、５００超、１，０００超、５，０００超、１０，０００超、５０，０００超、または１００，０００超の異なるＶ（Ｄ）Ｊの組合せを含み得る。これは、ソースＴＣＲ発現細胞のポリクローナル集団のＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子の使用法が非常に多様で、その結果Ｖ（Ｄ）Ｊの組合せが非常に多様になり得るためである。
対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドまたはＴＣＲ発現ベクターのＶＪの組合せは、両方のＴＣＲ鎖が使用するＶ遺伝子及びＪ遺伝子によって定義することができる。対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドまたはＴＣＲ発現ベクターのＶ（Ｄ）Ｊの組合せは、両方のＴＣＲ鎖が使用するＶ遺伝子、Ｄ遺伝子、Ｊ遺伝子によって定義することができる。例えば、ＴＲＡＶ８－４／ＴＲＡＪ４５／ＴＲＢＶ２９－１／ＴＲＢＪ１－５は、対合ＴＣＲの特定のＶＪの組換えを定義することができる。ＴＣＲ鎖のコード配列を考慮すれば、Ｖ－Ｑｕｅｓｔ及びＭｉＸＣＲなどの計算ツールを用いてＶ（Ｄ）Ｊの組合せを推論することができる。
２つの異なる対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチド（または２つの異なる免疫受容体発現ベクター）は、同じＶ（Ｄ）Ｊの組換えを共有していても異なる配列を有する場合があることに留意すべきである。この理由としては、（１）Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え中にＶ－Ｄ、Ｄ－Ｊ、及びＶ－Ｊ接合部でランダムな挿入及び欠失が生じ得ること、ならびに（２）配列バリエーションが変異誘発及び遺伝子合成によって人工的に作出され、可変の配列が遺伝子合成中に導入され得ることが考えられる。例えば、２つの融合したＴＣＲ遺伝子は、同じＶＪの組換えを有しても異なるＣＤＲ３配列を有する場合がある。対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、ソースＴＣＲ発現細胞からの第１のＴＣＲ鎖及び第２のＴＣＲ鎖の同族対の組合せ（または細胞内のネイティブ対組合せ）を含み得る。複数の対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは、複数のＴＣＲ発現細胞からの第１のＴＣＲ鎖及び第２のＴＣＲ鎖の複数の同族対の組合せを含み得る。ソースＴＣＲ発現細胞は、異なるクローン型を有し得るため、対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドまたは発現ベクターのポリクローナル集団がもたらされ得る。ポリクローナルＴＣＲ発現ベクターを複数のレシピエント細胞に送達することにより、少なくとも１００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、または少なくとも１００，０００，０００、またはそれ以上の異なるＴＣＲ（または異なるＴＣＲの同族対の組合せ）を発現する、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団を産生することができる。異なるＴＣＲの各々は、対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチド内にユニークな配列を有し得る。
このポリクローナルの特徴により、本開示に記載の方法を用いて得られた対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリー、及びＴＣＲプログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、以前に報告された対応物から区別することができる。例えば、既存の方法を用いて、１つまたは一握りのＴＣＲコード配列、ＴＣＲドメインコード配列、または対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドから開始し、変異誘発またはエラープローンＰＣＲを用いてこれらの開始配列の多数のバリエーションを生成して、対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドの大きなライブラリーを作出することができる。したがって、これらのライブラリーは、１つまたは一握りのＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子の組合せを含み得る。これに対し、本開示に記載の方法を用いて得られる対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリー、及びＴＣＲプログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、約１，０００超、約５，０００超、約１０，０００超、約５０，０００超、約１００，０００超、約５００，０００超、約１，０００，０００超、約５，０００，０００超、または約１０，０００，０００超の配列を含み得、約１，０００超、約５，０００超、約１０，０００超、約５０，０００超、約１００，０００超、約５００，０００超、約１，０００，０００超、約５，０００，０００超、または約１０，０００，０００超のＶＪまたはＶＤＪの組合せを含み得る。いくつかの場合では、本開示に記載の方法を用いて得られる対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリー、及びＴＣＲプログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約５００、少なくとも約１，０００、少なくとも約２，０００、少なくとも約５，０００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１００，０００、少なくとも約１，０００，０００、または少なくとも約１０，０００，０００のＶＪまたはＶＤＪの組合せを含み得る。さらに、本開示に記載の方法を用いて得られる対合ＴＣＲ発現ポリヌクレオチドのライブラリー、発現ベクターのライブラリー、及び免疫受容体プログラムレシピエント細胞のポリクローナル集団は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、もしくはそれ以上の異なるＴＲＡＶ（ＴＣＲα鎖のＶ遺伝子）サブグループ、及び／または少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、またはそれ以上の異なるＴＲＢＶ（ＴＣＲβ鎖のＶ遺伝子）サブグループを含み得る。
レシピエント細胞の供給源
レシピエント細胞（例えば、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞）は、様々な供給源に由来し得る。レシピエント細胞はＴ細胞であってもよい。レシピエント細胞として使用されるＴ細胞は、対象から得ることができる（例えば、初代Ｔ細胞）。いくつかの場合では、ソースＴＣＲ発現細胞としてのＴ細胞は、対象から得られる。Ｔ細胞は、本明細書に記載の任意の試料から得ることができる。いくつかの場合では、レシピエントＴ細胞は、対象から得られる。「対象」という用語は生物を指す。例えば、生物は、免疫応答が誘発され得る生物（例えば、哺乳類）であり得る。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びこれらのトランスジェニック種が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含む複数の供給源から取得することができる。ある特定の態様において、Ｔ細胞株を使用することができる。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、アルファベータＴ細胞、またはガンマデルタＴ細胞であり得る。本開示のある特定の態様において、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離などの様々な技法を用いて、対象から収集した血液単位から得ることができる。個体の循環血液からの細胞は、アフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、リンパ球（Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞、赤血球細胞、及び血小板を含む）を含み得る。アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、この後の処理ステップのために細胞を適切な緩衝液または培地に入れることができる。いくつかの場合では、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄することができる。洗浄溶液は、カルシウムまたはマグネシウムまたは他の二価カチオンが欠如していてもよい。カルシウムの不在下での初期活性化ステップは、活性化拡大をもたらし得る。洗浄ステップは、例えば、半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１ ｃｅｌｌ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）をメーカーの指示に従って使用するなどの方法により、遂行することができる。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、ＣａフリーＰＢＳ、ＭｇフリーＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または他の生理食塩水溶液（緩衝液の有無にかかわらず）に再懸濁することができる。代替的に、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養基に直接再懸濁させてもよい。
１つの態様において、Ｔ細胞は、赤血球細胞を溶解し、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離または対向流遠心溶出法によって単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球または組織から単離される。組織からＴ細胞を単離する場合（例えば、腫瘍組織から腫瘍浸潤Ｔ細胞を単離する場合）、赤血球を溶解したり単球を枯渇させたりする前に、組織を刻むかまたは断片化して細胞を解離させる。特定のＴ細胞のサブ集団（例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及びＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）は、ポジティブまたはネガティブ選択技法によってさらに単離することができる。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合体化ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ）と共に、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間期間にわたりインキュベートすることにより、単離することができる。１つの態様において、時間期間は約３０分である。さらなる態様において、時間期間は、３０分～３６時間またはそれ以上、及びこれらの値間の全ての整数値を範囲とする。さらなる態様において、時間期間は、約１時間以上、約２時間以上、約３時間以上、約４時間以上、約５時間以上、または約６時間以上である。また別の態様において、時間期間は１０～２４時間である。１つの態様において、インキュベートの時間期間は約２４時間である。他の細胞型に比べてＴ細胞が少ない任意の状況（例えば、腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離する際）では、Ｔ細胞の単離により長いインキュベート時間を使用することができる。さらに、より長いインキュベート時間を使用することで、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を高めることができる。したがって、Ｔ細胞が抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズに結合することができる時間を短縮もしくは延長することにより、及び／またはビーズ：Ｔ細胞の比率を上げるかもしくは下げることにより、培養開始時またはプロセス中の他の時点でＴ細胞のサブ集団を選択したり排除したりすることができる。加えて、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３抗体及び／または抗ＣＤ２８抗体の比率を上げるかまたは下げることにより、培養開始時または他の所望の時点でＴ細胞のサブ集団を選択したり排除したりすることができる。いくつかの場合では、複数ラウンドの選択を使用することができる。ある特定の態様において、選択手順を実施し、「選択されていない」細胞（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズに結合していない可能性のある細胞）を活性化及び増殖プロセスで使用することができる。「選択されていない」細胞をさらなる選択ラウンドに供してもよい。
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択が行われた細胞にユニークな表面マーカーを対象とする抗体を組み合わせることによって遂行することができる。方法の一例は、ネガティブ磁気免疫付着またはフローサイトメトリーによる細胞選別及び／または選択であり、これは、ネガティブ選択が行われた細胞に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体のカクテルを使用する。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。ある特定の態様において、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及びＦｏｘＰ３＋を典型的に発現する制御性Ｔ細胞を濃縮するかまたは正の選択を行うことが有用であり得る。代替的に、ある特定の態様において、調節性Ｔ細胞を抗Ｃ２５結合体化ビーズまたは他の類似の選択方法によって枯渇させる。
１つの実施形態において、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、及びパーフォリン、または他の適切な分子（例えば、他のサイトカイン及び転写因子、例えば、Ｔ－ｂｅｔ、Ｅｏｍｅｓ、Ｔｃｆ１（ヒトにおけるＴＣＦ７））を１つ以上発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングするための方法は、例えば、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法によって決定することができる。
ポジティブまたはネガティブ選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させてもよい。ある特定の態様において、細胞及びビーズが最大限接触するように、ビーズ及び細胞を混合する体積を減らす（例えば、細胞の濃度を高める）ことができる。例えば、１つの態様において、２０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。別の態様において、１０億細胞／ｍＬの濃度が使用される。さらなる態様において、１億細胞／ｍＬ超が使用される。さらなる態様において、少なくとも約１，０００万、１，５００万、２，０００万、２，５００万、３，０００万、３，５００万、４，０００万、４，５００万、または５，０００万細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。いくつかの態様において、少なくとも約７，５００万、８，０００万、８，５００万、９，０００万、９，５００万、または１億細胞／ｍＬの細胞濃度が使用される。いくつかの態様において、少なくとも約１億２，５００万または１億５，０００万細胞／ｍＬの細胞濃度を使用することができる。高濃度で使用することで、細胞収率の増加、細胞の活性化、細胞の増殖がもたらされ得る。さらに、高い細胞濃度を使用することで、目的標的抗原（例えば、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞）の発現が弱い可能性のある細胞の捕捉、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞の捕捉をより効率的に行うことが可能になり得る。このような細胞集団は、治療的価値を有し得る。例えば、高濃度の細胞を使用することで、ＣＤ２８の発現が弱い可能性のあるＣＤ８＋Ｔ細胞をより効率的に選択することが可能になる。
いくつかの場合では、より低濃度の細胞を使用することができる。Ｔ細胞及び表面の混合物を大幅に希釈することにより、粒子と細胞との間の相互作用を最小化することができる。これにより、粒子に結合する多量の目的抗原を発現する細胞を選択することができる。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞はより高いレベルのＣＤ２８を発現することができ、希薄な濃度ではＣＤ８＋Ｔ細胞よりも効率的に捕捉することができる。いくつかの態様において、使用される細胞の濃度は、少なくとも約５×１０５／ｍＬ、５×１０６／ｍＬ、またはそれ以上である。他の態様において、使用される濃度は、約１×１０５／ｍＬ～１×１０６／ｍＬ、及びこれらの値間の任意の整数値であり得る。他の態様において、細胞はローテーターで、２～１０℃または室温のいずれかで、様々な速度で、様々な長さの時間の間、インキュベートすることができる。
また、刺激用のＴ細胞は、洗浄ステップ後に凍結してもよい。凍結及びその後の解凍のステップは、細胞集団中の顆粒球及びある程度までの単球を除去することにより、より均一な産物をもたらすことができる。血漿及び血小板を除去する洗浄ステップの後に、細胞を凍結溶液に懸濁することができる。多くの凍結溶液及びパラメーターがこの文脈で有用であり得るが、使用することができる１つの方法は、２０％ ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン及び７．５％ ＤＭＳＯ、または３１．２５％ Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０及び５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び７．５％ ＤＭＳＯを含む培養基、またはＨｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含む他の好適な細胞凍結培地を使用することを伴う。次に、細胞を凍結して－８０℃とし、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存することができる。細胞は、－２０℃で直ちに無制御凍結することにより、または液体窒素中で凍結することができる。ある特定の態様において、凍結保存細胞は、本明細書に記載のように解凍及び洗浄し、室温で１時間静置させてから活性化する。
また、本開示の文脈において、増殖した細胞（例えば、Ｔ細胞療法用のＴＣＲを発現する操作された細胞）が必要とされ得る時期よりも前の時間期間に、対象から血液試料またはアフェレーシス産物を収集することも企図されている。そのため、増殖させる細胞の供給源は、必要な任意の時点で収集することができ、Ｔ細胞などの所望の細胞は、本明細書に記載のようなＴ細胞療法から利益を受ける任意の数の疾患または状態に対するＴ細胞療法で後に使用するために単離及び凍結される。いくつかの場合では、一般的に健康な対象から血液試料またはアフェレーシスを採取する。ある特定の態様において、疾患を発症するリスクがあるがまだ疾患を発症していない一般的に健康な対象から血液試料またはアフェレーシスを採取し、後に使用するために目的細胞を単離及び凍結する。ある特定の態様において、Ｔ細胞は増殖させ、凍結し、後に使用することができる。ある特定の態様において、試料は、本明細書に記載の特定の疾患の診断後すぐに、ただし、いかなる治療も行う前に患者から収集する。さらなる態様において、細胞は、任意の数の関連治療モダリティー（限定されるものではないが、薬剤、例えば、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びＦＫ５０６、抗体、または他の免疫除去剤（ｉｍｍｕｎｏａｂｌａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び放射線照射による治療を含む）の前に、対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離される。
本開示のさらなる態様において、Ｔ細胞は、対象に機能的Ｔ細胞を残す治療の直後に、患者から得られる。この点については、ある特定のがん治療後、詳細には、免疫系を損傷する薬物による治療の後、治療直後、通常は患者が治療から回復する期間中、得られたＴ細胞の質が、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖する能力において最適であるか、または改善している可能性があることが観察されている。したがって、本開示の文脈内において、この回復期に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系統の他の細胞を含む血液細胞を収集することが企図されている。さらに、ある特定の態様において、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦによる動員）及び条件付けレジメンを使用して、特に、治療後の規定された時間ウインドウ中に、対象内で特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または拡大が好ましい条件を作出することができる。例示的な細胞型としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。
レシピエント細胞として使用するＴ細胞は、対象から得られた初代Ｔ細胞の他には、細胞株の細胞（例えば、細胞株のＴ細胞）であってもよい。細胞株のＴ細胞の例としては、限定されるものではないが、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｋ－Ｔ１、ＴＡＬＬ－１、ＭＯＬＴ１６／１７、及びＨＵＴ７８／Ｈ９が挙げられる。
レシピエント細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、顆粒球、好酸球、赤血球、血小板、幹細胞、ｉＰＳＣ、または間葉系幹細胞であり得る。加えて、レシピエント細胞は、細胞株の細胞であってもよい。細胞株は、腫瘍原性細胞株であっても人工的に不死化した細胞株であってもよい。細胞株の例としては、限定されるものではないが、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｃａｃｏ２細胞、Ｕ２－ＯＳ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、ＤＧ４４細胞、Ｋ－５６２細胞、Ｕ－９３７細胞、ＭＲＣ５細胞、ＩＭＲ９０細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＨＣＴ－１１６細胞、Ｈｕ－ｈ７細胞、Ｈｕｖｅｃ細胞、及びＭｏｌｔ４細胞が挙げられる。レシピエント細胞は、自己由来Ｔ細胞であっても同種異系Ｔ細胞であってもよい。レシピエント細胞は、遺伝子的に修飾または操作された細胞であってもよい。いくつかの実施形態において、レシピエント細胞は、機能的ＴＣＲ複合体（例えば、ＣＤ３－ガンマ、ＣＤ３－デルタ、ＣＤ３－イプシロン、ＣＤ３－ゼータ）の形成に必要なタンパク質を発現する。これらの細胞内で、外来性ＴＣＲをその天然形態で発現させることができる。いくつかの実施形態において、レシピエント細胞は、機能的ＴＣＲ複合体の形成に必要な全てのタンパク質を発現するわけではない。これらの細胞内で、外来性ＴＣＲを操作された形態で発現させることができる。いくつかの場合では、操作された形態は、一本鎖のＴＣＲ断片である。いくつかの場合では、操作された形態はＴＣＲ－ＣＡＲである。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）の調製
ソースＴＣＲ発現細胞またはＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）と共に共培養して、ＡＰＣが提示する抗原が、ＴＣＲ発現細胞またはＴＣＲプログラムレシピエント細胞（Ｔ細胞であり得る）が発現するＴＣＲに接触できるようにすることができる。ＡＰＣは、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）であってもよい。ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞などのプロフェッショナルＡＰＣであり得る。ＡＰＣは、単球または単球由来の樹状細胞であり得る。ａＡＰＣはＴＣＲ及び共刺激性分子のリガンドを発現し、Ｔ細胞を活性化及び増殖することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞を活性化するための任意の遺伝子を発現するように設計することができる。ａＡＰＣは、Ｔ細胞を増殖するための任意の遺伝子を発現するように設計することができる。ａＡＰＣは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカイン、または任意の組合せであり得る。ａＡＰＣは、ゲノム移植を受け得る細胞集団にシグナルを送達することができる。例えば、ａＡＰＣは、シグナル１、シグナル、２、シグナル３、または任意の組合せを送達することができる。シグナル１は抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル１は、ペプチド－ＭＨＣ複合体によるＴＣＲのライゲーション、またはＣＤ３シグナル伝達複合体の活性化をもたらし得るＣＤ３に向けられたアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル２は共刺激シグナルであり得る。例えば、共刺激シグナルは、抗ＣＤ２８、誘導性共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）であり得、これらはそれぞれＩＣＯＳ－Ｌ、ＣＤ７０、４－１ＢＢＬに結合する。シグナル３はサイトカインシグナルであり得る。サイトカインは任意のサイトカインとすることができる。サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはこれらの任意の組合せであり得る。
いくつかの場合では、ａＡＰＣは、細胞集団を刺激、活性化、及び／または増殖するために使用することができる。いくつかの場合では、ａＡＰＣがアロ特異性を誘導しないことがある。ａＡＰＣは、いくつかの場合ではＨＬＡを発現しないことがある。ａＡＰＣは、活性化及び／または刺激に使用され得る遺伝子を安定的に発現するように遺伝子修飾することができる。いくつかの場合では、Ｋ５６２細胞を活性化に使用することができる。Ｋ５６２細胞は、増殖のために使用することもできる。Ｋ５６２細胞はヒト赤白血病細胞株である。Ｋ５６２細胞は、目的遺伝子を発現するように操作することができる。Ｋ５６２細胞は、内在的にＨＬＡクラスＩ、ＩＩ、またはＣＤ１ｄ分子を発現しない場合があるが、ＩＣＡＭ－１（ＣＤ５４）及びＬＦＡ－３（ＣＤ５８）を発現し得る。Ｋ５６２は、Ｔ細胞にシグナル１を送達するように操作することができる。例えば、Ｋ５６２細胞は、ＨＬＡクラスＩを発現するように操作することができる。いくつかの場合では、Ｋ５６２細胞は、追加的な分子、例えば、Ｂ７、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、４－１ＢＢＬ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３ ｍＡｂ、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、ＣＤ１ｄ、抗ＣＤ２、膜結合ＩＬ－１５、膜結合ＩＬ－１７、膜結合ＩＬ－２１、膜結合ＩＬ－２、切断ＣＤ１９、または任意の組合せを発現するように操作することができる。いくつかの場合では、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３ ｍＡｂの膜形態、クローンＯＫＴ３を発現することができる。いくつかの場合では、操作されたＫ５６２細胞は、ＣＤ８０及びＣＤ８３に加えて、抗ＣＤ３ ｍＡｂの膜形態、クローンＯＫＴ３、抗ＣＤ２８ ｍＡｂの膜形態を発現することができる。
いくつかの場合では、Ｔ細胞の刺激は、抗原及び照射された組織適合性ＡＰＣ（例えば、フィーダーＰＢＭＣ）を用いて実施することができる。いくつかの場合では、細胞は、ＰＨＡなどの非特異的マイトジェン及び同種異系フィーダー細胞を用いて成長させることができる。フィーダーＰＢＭＣは、４０Ｇｙで照射することができる。フィーダーＰＢＭＣは、約１０Ｇｙ～約１５Ｇｙ、約１５Ｇｙ～約２０Ｇｙ、約２０Ｇｙ～約２５Ｇｙ、約２５Ｇｙ～約３０Ｇｙ、約３０Ｇｙ～約３５Ｇｙ、約３５Ｇｙ～約４０Ｇｙ、約４０Ｇｙ～約４５Ｇｙ、約４５Ｇｙ～約５０Ｇｙで照射することができる。いくつかの場合では、照射されたフィーダー細胞のみの対照フラスコを抗ＣＤ３及びＩＬ－２で刺激してもよい。
ａＡＰＣはビーズであってもよい。球状ポリスチレンビーズにペプチド－ＭＨＣ複合体、及び任意選択でＣＤ２８に対する抗体をコーティングし、これをＴ細胞の活性化または刺激に使用することができる。ビーズは任意のサイズとすることができる。いくつかの場合では、ビーズは３及び６マイクロメートル、または約３及び６マイクロメートルであり得る。ビーズのサイズは、４．５マイクロメートルまたは約４．５マイクロメートルであり得る。ビーズは、任意の細胞：ビーズの比率で利用することができる。例えば、１ミリリットル当たり１００万細胞において、ビーズ：細胞の比率を３：１で使用することができる。また、ａＡＰＣは、硬質球状粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ、磁性ナノまたはマイクロ粒子、ナノサイズ量子ドット、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフィア、非球状粒子、カーボンナノチューブバンドル、楕円ＰＬＧＡ微粒子、ナノワーム、流動性脂質二重層含有システム、２Ｄ支持脂質二重層（２Ｄ－ＳＬＢ）、リポソーム、ＲＡＦＴソーム／マイクロドメインリポソーム、ＳＬＢ粒子、またはこれらの任意の組合せであってもよい。
いくつかの場合では、ａＡＰＣはＣＤ４ Ｔ細胞を増殖することができる。例えば、ａＡＰＣは、ＨＬＡクラスＩＩ制限ＣＤ４ Ｔ細胞の抗原処理及び提示経路を模倣するように操作することができる。Ｋ５６２は、ＨＬＡ－Ｄ、ＤＰα、ＤＰβ鎖、Ｉｉ、ＤＭα、ＤＭβ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、またはこれらの任意の組合せを発現するように操作することができる。例えば、ＨＬＡ制限抗原特異的ＣＤ４ Ｔ細胞を増殖するために、操作されたＫ５６２細胞をＨＬＡ制限ペプチドでパルスすることができる。
いくつかの場合では、ａＡＰＣの使用は、Ｔ細胞の活性化、増殖、または任意の組合せのために、外来的に導入されたサイトカインと組み合わせることができる。また、細胞はｉｎ ｖｉｖｏで増殖させることもでき、例えば、ゲノム移植細胞を対象に投与した後に対象の血液中で増殖させることができる。
推定上の抗原反応性ＴＣＲの同定
本明細書で提供する方法は、Ｔ細胞から抗原反応性ＴＣＲを同定するために使用することができる。Ｔ細胞（例えば、ソースＴＣＲ発現細胞）は、ＭＨＣ結合抗原の特定または特定の集団を認識するＴＣＲを同定するために、末梢血、脾臓、リンパ節、及び腫瘍などの複数の臓器からスクリーニングすることができる。本明細書に記載の方法を用いて得られたポリクローナルＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、これらの用途ではソースＴＣＲ発現細胞の代わりとなり得る。これらの用途では、レシピエント細胞は、細胞株Ｔ細胞などの細胞株の細胞であってもよい。細胞株のＴ細胞の例としては、限定されるものではないが、Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、Ｋ－Ｔ１、ＴＡＬＬ－１、ＭＯＬＴ１６／１７、及びＨＵＴ７８／Ｈ９が挙げられる。細胞株のＴ細胞の内在性ＴＣＲは不活性化（例えば、ノックアウトまたはノックダウン）してもよい。例えば、本明細書で提供する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞（例えば、ソースＴＣＲ発現細胞）を提供することを含み得、この場合、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞は、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲの同族対を発現することができる。次に、各Ｔ細胞のＴＣＲの同族対の第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを対合し、それにより、複数のポリヌクレオチド対を生成することができる。複数のポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドは、複数のレシピエント細胞（例えば、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞）に送達することができ、この場合、各レシピエント細胞は、複数のポリヌクレオチド対のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、複数のポリヌクレオチド対であっても複数のポリヌクレオチド対のコピーであってもよい。ポリヌクレオチドは、複数のポリヌクレオチド対の配列を含むベクター（例えば、本明細書に記載の発現ベクター）であってもよい。複数のポリヌクレオチド対は、複数のレシピエント細胞で発現させることができる。複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数のレシピエント細胞におけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することができる。次に、複数のレシピエント細胞を１つ以上の抗原に接触させることができる。接触させると、複数のレシピエント細胞のサブセット上でマーカーが活性化され、複数のレシピエント細胞のサブセットをマーカーに基づいて単離することができる。複数のレシピエント細胞のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数のレシピエント細胞のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することができる。複数のレシピエント細胞のサブセットにおける頻度が、複数のレシピエント細胞における頻度よりも高いＴＣＲは、推定上の標的反応性ＴＣＲとして同定することができる。
本明細書に記載の抗原は、ＭＨＣ結合抗原であり得る。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ結合抗原は、ペプチドＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）、ｐＭＨＣテトラマー、ｐＭＨＣオリゴマーである。例えば、ｐＭＨＣは、ストレプトアビジン足場でテトラマー化したり、様々な化学的足場でオリゴマー化したりすることができる。いくつかの実施形態において、ｐＭＨＣ、ｐＭＨＣテトラマー、ｐＭＨＣオリゴマーを蛍光標識して、ｐＭＨＣを認識するポリクローナルＴＣＲプログラムレシピエント細胞のＦＡＣＳ選別を促進する。いくつかの実施形態において、ｐＭＨＣ、ｐＭＨＣテトラマー、ｐＭＨＣオリゴマーを固体表面に結合して、ｐＭＨＣを認識するポリクローナルＴＣＲプログラムレシピエント細胞の濃縮を促進する。固体表面は、粒子、ナノ粒子、磁性粒子、または磁性ナノ粒子の固体表面であってもよい。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ結合抗原は細胞の表面上に提示される。いくつかの場合では、細胞は抗原提示細胞（ＡＰＣ）である。ＡＰＣは、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞などのプロフェッショナルＡＰＣであり得る。また、ＡＰＣは、ＭＨＣやＨＬＡを発現する他の細胞（例えば、人工ＡＰＣ）であってもよい。例えば、がん細胞株からの細胞は、ＡＰＣであってもよい。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、１つのクラスＩ ＭＨＣアレルのみを発現するように操作することができる。いくつかの実施形態において、ＡＰＣは、任意の数のクラスＩ ＭＨＣアレル及びクラスＩＩ ＭＨＣアレル（例えば、１つの対象から単離された全てのクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣアレル）を発現するように操作することができる。対象はヒトであり得る。ヒトは患者であり得る。患者はがん患者であり得る。
いくつかの実施形態において、ＭＨＣ結合抗原のエピトープは十分に定義されている。例えば、ｐＭＨＣテトラマーの場合、エピトープペプチドは化学的に合成することができる。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ結合抗原のエピトープは未知であるか、または十分に定義されていない。例えば、抗原タンパク質がＡＰＣで過剰発現し、複数のエピトープがＡＰＣによって提示されることがある。別の例では、少数のタンパク質群（例えば、少なくとも２つのタンパク質、少なくとも３つのタンパク質、少なくとも４つのタンパク質、少なくとも５つのタンパク質、少なくとも１０のタンパク質、少なくとも２０のタンパク質、少なくとも３０のタンパク質、少なくとも４０のタンパク質、または少なくとも５０のタンパク質）がＡＰＣで過剰発現することがある。いくつかの場合では、見込みのあるエピトープを包含する抗原の断片がＡＰＣで過剰発現することがある。例えば、抗原は変異タンパク質の一部をコードするポリペプチドであり得、この場合変異残基はポリペプチドのほぼ中央にある。また、抗原は、異常発現したタンパク質の一部をコードするポリペプチドであってもよい。このようなポリペプチドを合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）と称することがある。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをミニジーンと称することがある。５～２０個の一連のミニジーンを、リンカーペプチドで連続的に結合して長いポリペプチド鎖にすることができ、これをタンデムミニジーン（ＴＭＧ）と称することがある。ミニジーンはＤＮＡまたはＲＮＡであり得、多くの形式（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ｍＲＮＡ、ＲＮＡレプリコン）をとることができる。ミニジーンのプールは、ミニジーンの形式に応じて、形質移入、形質転換、形質導入、及びエレクトロポレーションなどの方法によってＡＰＣに導入することができる。ミニジーンは、変異ペプチド（例えば、点変異を伴う）、または他の遺伝子的もしくはエピジェネティックな異常（例えば、融合、欠失、挿入、フレームシフト、イントロン包含、選択的スプライシング、もしくは過剰発現）によって腫瘍で過剰発現するペプチドをコードすることができる。このようなペプチドは、最新のゲノム、トランスクリプトーム、及び／またはプロテオーム分析、例えば、全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）、全ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）、トランスクリプトームシークエンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）、ＭＨＣ－ペプチド溶出質量分析、またはこれらの組合せを通じて、腫瘍試料で同定することができる。別の例では、未知数のタンパク質がＡＰＣで過剰発現することがあり、このような場合、ｃＤＮＡプールをＡＰＣに送達することができる（例えば、形質移入、エレクトロポレーション、または本明細書に記載のベクターを用いた他の送達方法）。
いくつかの実施形態において、抗原をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡをＡＰＣに形質移入することによって、抗原をＡＰＣに導入することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質としての抗原をＡＰＣの培養基に加えることができる。いくつかの実施形態において、ペプチドとしての抗原をＡＰＣの培養液に加えることができる。
抗原は標的抗原であり得る。抗原は腫瘍抗原であり得る。抗原としては、腫瘍特異的抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原を発現する細胞、腫瘍関連抗原を発現する細胞、腫瘍上の胚性抗原、自己由来腫瘍細胞、腫瘍特異的膜抗原、腫瘍関連膜抗原、成長因子受容体、成長因子リガンド、またはがんに関連する他のタイプの抗原もしくは抗原提示細胞もしくは物質を挙げることができる。腫瘍抗原は腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）であり得る。本明細書で使用する場合、「ＴＳＡ」という用語は、腫瘍細胞にユニークであり、体内の他の細胞には存在しない抗原を指す。腫瘍抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。本明細書で使用する場合、「ＴＡＡ」という用語は、腫瘍細胞にユニークではなく、正常な細胞にも発現する抗原を指す。腫瘍での抗原の発現は、免疫系が抗原に応答するのを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、腫瘍細胞ではより高いレベルで発現し得る。ＴＡＡは、患者の腫瘍細胞をシークエンシングし、腫瘍にのみ見出される変異タンパク質を同定することにより、決定することができる。このような抗原を「ネオ抗原」と称する。腫瘍抗原は、上皮性癌抗原、前立腺特異的癌抗原（ＰＳＡ）もしくは前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、膀胱癌抗原、肺癌抗原、結腸癌抗原、卵巣癌抗原、脳癌抗原、胃癌抗原、腎細胞癌抗原、膵臓癌抗原、肝臓癌抗原、食道癌抗原、頭頸部癌抗原、大腸癌抗原、リンパ腫抗原、Ｂ細胞リンパ腫抗原、白血病抗原、骨髄腫抗原、急性リンパ性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原であり得る。抗原の例としては、限定されるものではないが、１ＧＨ－ＩＧＫ、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、９Ｄ７、アシクロフィリン（ａｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）Ｃ関連タンパク質、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、α－アクチニン－４、Ａ３、Ａ３３抗体に特異的な抗原、ＡＲＴ－４、Ｂ７、Ｂａ７３３、ＢＡＧＥ、ＢＣＲ－ＡＢＬ、ベータ－カテニン、ベータ－ＨＣＧ、ＢｒＥ３－抗原、ＢＣＡ２２５、ＢＩＮＧ－４、ＢＲＣＡ１／２、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３／ＣＡ２７．２９／ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、カルシウム活性化塩化物イオンチャネル２、ＣＡＧＥ、ＣＡＭ４３、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ－１、炭酸脱水酵素ＩＸ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＣＡＳＰ－８／ｍ、ＣＣＣＬ１９、ＣＣＣＬ２１、ＣＤ１、ＣＤ１ａ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１１Ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ－ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７０Ｌ、ＣＤ７４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ９５、ＣＤ１２６、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１５４、ＣＤＣ２７、ＣＤＫ４、ＣＤＫ４ｍ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＭＬ６／６、ＣＯ－０２９、ＣＴＬＡ４、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ７、ＣＸＣＬ１２、サイクリンＢ、ＨＩＦ－１ａ、結腸特異的抗原－ｐ（ＣＳＡｐ）、ＣＥＡ（ＣＥＡＣＡＭＳ）、ＣＥＡＣＡＭ６、ｃ－Ｍｅｔ、ＤＡＭ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１（ＴＲＯＰ－２）、ＥＧＰ－２、ＥＬＦ２－Ｍ、Ｅｐ－ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ－５、フィブロネクチン、Ｆｌｔ－１、Ｆｌｔ－３、葉酸受容体、Ｇ２５０抗原、Ｇａ７３３ＶＥｐＣＡＭ、ＧＡＧＥ、ｇｐ１００、ＧＲＯ－β、Ｈ４－ＲＥＴ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＭ１．２４、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）及びそのサブユニット、ＨＭＧＢ－１、低酸素誘導因子（ＨＩＦ－１）、ＨＳＰ７０－２Ｍ、ＨＳＴ－２、ＨＴｇｐ－１７５、Ｉａ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－λ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１３Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１７Ｒ、ＩＬ－１８Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３、ＩＬ－２５、未成熟ラミニン受容体、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、ＫＣ４－抗原、ＫＳＡ、ＫＳ－１－抗原、ＫＳ１－４、ＬＡＧＥ－１ａ、Ｌｅ－Ｙ、ＬＤＲ／ＦＵＴ、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＭＡＲＴ－１、ＭＡＲＴ－２、ＴＲＡＧ－３、ＭＣ１Ｒ、ｍＣＲＰ、ＭＣＰ－１、メソテリン、ＭＩＰ－１Ａ、ＭＩＰ－１Ｂ、ＭＩＦ、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣＳａｃ、ＭＵＣ１３、ＭＵＣ１６、ＭＵＭ－１／２、ＭＵＭ－３、ＭＹＬ－ＲＡＲ、ＮＢ／７０Ｋ、Ｎｍ２３Ｈ１、ＮｕＭＡ、ＮＣＡ６６、ＮＣＡ９５、ＮＣＡ９０、ＮＹ－ＥＳＯ－１、Ｐポリペプチド、ｐ１５、ｐ１６、ｐ５３、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ３、ＰＡＭ４抗原、膵臓癌ムチン、ＰＤ１受容体（ＰＤ－１）、ＰＤ－１受容体リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）、ＰＤ－１受容体リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、ＰＩ５、胎盤成長因子、ｐ５３、ＰＬＡＧＬ２、Ｐｍｅ１１７、前立腺酸性ホスファターゼ、ＰＳＡ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬＧＦ、ＩＬＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－６、ＩＬ－２５、ＲＣＡＳ１、ＲＳ５、ＲＡＧＥ、ＲＡＮＴＥＳ、Ｒａｓ、Ｔ１０１、ＳＡＧＥ、ＳＡＰ－１、５１００、ＳＳＸ－２、サバイビン、サバイビン－２Ｂ、ＳＤＤＣＡＧ１６、ＴＡ－９０／Ｍａｃ２結合タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＣ、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－βＲＩＩ、Ｉｇ ＴＣＲ、ＴＬＰ、テロメラーゼ、テネイシン、ＴＲＡＩＬ受容体、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、ＴＳＰ－１８０、ＴＮＦ－α、Ｔｎ抗原、Ｔｈｏｍｓｏｎ－Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ抗原、腫瘍壊死抗原、チロシナーゼ、ＶＥＧＦＲ、ＥＤ－Ｂフィブロネクチン、ＷＴ－１、ＸＡＧＥ、１７－１Ａ－抗原、補体因子Ｃ３、Ｃ３ａ、Ｃ３ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ５、血管新生マーカー、ｂｃ１－２、ｂｃ１－６、ならびにＫ－ｒａｓ（がん遺伝子マーカーでありがん遺伝子産物である）が挙げられる。
ＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、認識しない細胞から選択されることがある。ＴＣＲプログラムレシピエント細胞をこの目的（例えば、抗原を認識するＴＣＲの濃縮または同定）に使用する場合、ＴＣＲプログラムレポーター細胞またはＴＣＲ操作レポーター細胞とも呼ばれることがある。選択は、可溶性の、蛍光標識された、または表面結合したｐＭＨＣ、ｐＭＨＣテトラマー、またはｐＭＨＣオリゴマーへの結合に基づいて行ってもよい。選択は、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞がＭＨＣ結合抗原に接触した後のマーカー（例えば、Ｔ細胞活性化マーカー）の発現に基づいて行ってもよい。マーカーは細胞表面マーカーであってもよい。細胞表面マーカーは、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、及び他のＴ細胞活性化マーカー、またはこれらの組合せであり得る。選択は、カルシウム流入に基づいて行ってもよい。マーカーは、細胞内タンパク質または分泌タンパク質であり得る。細胞内タンパク質は、転写因子またはリン酸化タンパク質であり得る。分泌タンパク質は、サイトカインまたはケモカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはこれらの組合せ）であり得る。分泌タンパク質をマーカーとして使用する場合、タンパク質輸送の阻害剤を細胞に加えてもよい。タンパク質輸送の阻害剤は、ゴルジブロッカーであり得る。ゴルジブロッカーは、ブレフェルジンＡ、モネンシンなどであり得る。分泌タンパク質は、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＴＮＦ－アルファ、またはＩＮＦ－ガンマであり得る。また、選択は、レポーター遺伝子の発現またはレポータータンパク質に基づいて行ってもよい。レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）であり得る。レポーター遺伝子発現は、ＴＣＲシグナルによって調節される転写因子の制御下にあってもよい。これらの転写因子の例としては、限定されるものではないが、ＡＰ－１、ＮＦＡＴ、ＮＦ－カッパ－Ｂ、Ｒｕｎｘ１、Ｒｕｎｘ３などが挙げられる。本明細書に記載されているように、いくつかの場合では、選択前において、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の選択前プールは、少なくとも約０．００１％、０．０１％、０．１％、０．２％、０．５％、０．８％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、またはそれ以上の標的反応性ＴＣＲを含み得る。いくつかの場合では、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の選択前プールは、最大で約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、３％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、またはそれ以下の標的反応性ＴＣＲを含み得る。選択後、標的反応性ＴＣＲのパーセンテージは、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の選択後プールで濃縮することができる。ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の選択後プールは、少なくとも約１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、またはそれ以上の標的反応ＴＣＲを含み得る。
いくつかの実施形態において、上記の基準に基づいて選択されたＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、ＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲをさらに濃縮するために、再び増殖させ選択に供することができる。いくつかの実施形態において、選択されたＴＣＲプログラムレシピエント細胞から単離されたＴＣＲ発現ベクター内の融合したＴＣＲポリヌクレオチドは、増幅してＴＣＲ発現ベクターに変換することができる。そして、これらのＴＣＲ発現ベクターを使用して、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の新たな集団を得ることができる。これらの細胞は、ＭＨＣ結合抗原を認識するＴＣＲをさらに濃縮するために、再び選択に供することができる。
抗原、エピトープ、提示ＭＨＣの識別方法を必ずしも知ることなく腫瘍反応性ＴＣＲを迅速に同定することは、がん免疫療法で幅広い用途を有し得、本明細書に記載の超並列ＴＣＲクローニング技術またはハイスループットＴＣＲ合成技術をレポーターに基づく選択法と組み合わせることにより、達成することができる。
レポーターに基づく選択法のスキームの一例を以下に概説する。レポーター細胞株はＴ細胞株（例えば、Ｊｕｒｋａｔ）であり得る。レポーター細胞株は、ＴＣＲシグナル伝達（例えば、ＮＦＡＴ、ＮＦ－カッパ－Ｂ、Ｎｕｒ７７）によって制御されるプロモーターによって駆動されるレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質または染色可能な細胞表面タンパク質）を保有することができる。任意選択で、レポーター細胞株の内在性ＴＣＲをノックアウトすることができる。レポーター細胞は、Ｔ細胞（例えば、腫瘍浸潤Ｔ細胞）の集団（その一部は腫瘍反応性（または腫瘍特異性））から得られたポリクローナルＴＣＲ発現レンチウイルスベクターで形質転換することができる。形質導入したレポーター細胞は、腫瘍細胞、腫瘍組織、腫瘍球、または腫瘍遺伝子を発現するように操作されたＡＰＣ（自己由来ＡＰＣまたは自己由来ＭＨＣを発現するように操作された同種異系ＡＰＣ）（すなわち、がんワクチンとして研究されてきた腫瘍ｍＲＮＡ装填ＡＰＣ）と共にインキュベートすることができる。レポーター細胞株に形質導入したＴＣＲが腫瘍反応性である場合、レポーター細胞内のレポーター遺伝子またはマーカー遺伝子をより高いレベル（いくつかの場合には低いレベル）で発現させ、その細胞を同定（例えば、ＦＡＣＳやＭＡＣＳを用いて選択／単離／濃縮）することができる。任意選択で、同定された腫瘍反応性のＴＣＲをシークエンシングしてもよい。選別した細胞から既に融合しているＴＣＲを単にＰＣＲ増幅し、ＴＣＲ発現ベクターにバッチでクローンすることができる。任意選択で、個々のＴＣＲは、例えば、ＴＣＲ発現ベクターを有するＥ．ｃｏｌｉコロニーを採取することにより、得ることができる。
いくつかの実施形態において、選択／単離／濃縮されたレポーター陽性またはマーカー陽性細胞（例えば、選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞）は、純粋に抗原反応性または腫瘍反応性ではない。しかし、それにもかかわらず、選択／単離／濃縮されたＴＣＲプログラムレシピエント細胞における抗原または腫瘍反応性細胞の頻度、または相対的存在量は、選択前のＴＣＲプログラムレシピエント細胞（例えば、選択前のＴＣＲプログラムレシピエント細胞）におけるものよりも高いことがある。抗原反応性または腫瘍反応性ＴＣＲの同定を容易にするために、選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングすることができる。いくつかの実施形態において、選択前のＴＣＲプログラムレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーもシークエンシングすることができる。選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞におけるＴＣＲの頻度が、選択前のＴＣＲプログラムレシピエント細胞におけるＴＣＲの頻度より少なくとも１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上高い場合、このＴＣＲは推定上の抗原反応性または腫瘍反応性ＴＣＲとみなすことができる。
いくつかの実施形態において、ＴＣＲが意図されない抗原ではなく意図された抗原を認識するためにＴＣＲが濃縮されることをさらに確実にするため、ネガティブ対照選択を実施することができる。意図された抗原がもたらされる選択は、「意図された選択」と呼ばれることがある。ネガティブ対照選択では、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞に発現するＴＣＲと結合するように、１つ以上の意図されない抗原が提供されることがある。例えば、意図された抗原が変異抗原（例えば、ネオ抗原）の一群である場合、意図されない抗原はネオ抗原の野生型対応物であり得る。例えば、ネオ抗原のミニジーン配列は、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｄタンパク質の断片である配列ＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡ［Ｄ］ＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮをコードすることができる（配列中、括弧内の「Ｄ」残基は、変異残基である）。このネオ抗原の野生型対応物は、ＴＥＹＫＬＶＶＶＧＡ［Ｇ］ＧＶＧＫＳＡＬＴＩＱＬＩＱＮとすることができる（配列中、括弧内の「Ｇ」は野生型残基である）。ネガティブ対照選択からのレポーターまたはマーカー陽性のＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、ＦＡＣＳやＭＡＣＳなどの選別によって選択／単離／濃縮することができる。意図した選択からの選択／単離／濃縮された細胞におけるＴＣＲの頻度が、陰性対照選択からの頻度よりも実質的に高い場合、このＴＣＲは推定抗原反応性ＴＣＲとみなすことができる。
ネオ抗原をコードするミニジーンのプールをＡＰＣに導入し、これをＴＣＲプログラムレシピエント細胞と混合することができる。レポーターまたはマーカー陽性のＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、ＦＡＣＳやＭＡＣＳなどの選別によって選択／単離／濃縮することができ、その結果、第１の集団である選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞が得られる。これに並行して、以下のようにネガティブ対照選択を実施することができる。ネオ抗原の野生型対応物をコードするミニジーンのプールを別のＡＰＣバッチに導入し、これをＴＣＲプログラムレシピエント細胞と混合することができる。レポーターまたはマーカー陽性のＴＣＲプログラムレシピエント細胞は、ＦＡＣＳやＭＡＣＳなどの選別によって選択／単離／濃縮することができ、その結果、第２の集団である選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞が得られる。第１の選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞におけるＴＣＲの頻度が、第２の選択後のＴＣＲプログラムレシピエント細胞におけるＴＣＲの頻度より少なくとも１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上高い場合、このＴＣＲは推定上のネオ抗原反応性ＴＣＲとみなすことができる。
別の例として、がん組織（例えば、結腸癌組織）からの増幅全ｍＲＮＡは、意図された選択に使用されるＡＰＣの１バッチに導入することができる。これに並行して、同じ臓器の健康な組織（例えば、健康な結腸組織）からの増幅全ｍＲＮＡは、ネガティブ対照選択に使用する別のバッチのＡＰＣに導入することができる。
ＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、細胞集団における各ＴＣＲの頻度を分析するために、ベータ鎖のＣＤＲ３配列、アルファ鎖のＣＤＲ３配列、またはその両方を分析することができる。ＣＤＲ３配列をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）は、ＴＣＲレパートリーを分析するために増幅することができる。
例えば、本明細書で提供する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を提供することを含み得、この場合、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞は、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲの同族対を発現することができる。次に、各Ｔ細胞のＴＣＲの同族対の第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチド及び第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを対合して、複数のポリヌクレオチド対を生成することができる。複数のポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドは、第１の複数のレシピエント細胞及び第２の複数のレシピエント細胞に送達することができ、この場合、第１の複数のレシピエント細胞または第２の複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞は、複数のポリヌクレオチド対のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み得る。複数のポリヌクレオチド対は、第１及び第２の複数のレシピエント細胞で発現させることができる。第１の複数のレシピエント細胞を第１の抗原に接触させ、それにより、第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットの第１のマーカーを活性化することができる。第２の複数のレシピエント細胞は第２の抗原に接触させ、それにより、第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットの第２のマーカーを活性化する。第２の抗原は、第１の抗原に相同でなくてもよい。第１の抗原及び第２の抗原は、同じタンパク質に由来し得る。第１の抗原は変異配列を含み得、第２の抗原は野生型配列を含み得る。第１の抗原はがん細胞に由来し得、第２の抗原は健康な細胞に由来し得る。例えば、第１の抗原はネオ抗原であってもよく、第２の抗原は野生型抗原であってもよい。次に、第１のサブセットを第１のマーカーに基づいて単離し、第２のサブセットを第２のマーカーに基づいて単離することができる。次に、第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットのＴＣＲレパートリー及び第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングすることができる。第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度と、第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度とを決定することができる。第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットにおける頻度が、第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットにおける頻度よりも高いＴＣＲは、推定上の標的反応性ＴＣＲとして同定することができる。任意選択で、当該方法はさらに、接触させる前に、複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数のレシピエント細胞におけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することを含んでもよい。
本明細書に記載の方法により、個別化ＴＣＲ－Ｔ療法のための腫瘍反応性ＴＣＲの同定、または患者の腫瘍組織もしくは末梢血中の腫瘍反応性Ｔ細胞を定量化するための免疫モニタリング検査が可能になる。例えば、がん患者から腫瘍生検を得ることができる。また、同じ患者から末梢Ｔ細胞または腫瘍浸潤性Ｔ細胞を得ることもできる。ある特定のマーカー（例えば、ＰＤ１、ＣＤ１３７、ＣＤ３９、ＣＤ６９、Ｔｉｍ３）またはこれらの組合せを発現するＴ細胞は、既存の方法を用いて選択／単離／濃縮することができる。末梢Ｔ細胞またはそのサブ集団からのＴＣＲは、例えば、本明細書に記載の単一細胞リアクターに基づく方法を用いて、ＴＣＲ発現ベクターにクローニングすることができる。特定のトランスクリプトームシグネチャー（例えば、ナイーブ様、疲弊、メモリー、幹細胞メモリー、または中心メモリーＴＣＦ７＋）を有するＴ細胞の集団からのインフォマティクス的に対合したＴＣＲ配列は、シークエンシング（例えば、単一細胞ＲＮＡ－ＳＥＱ）を用いて得ることができる。対合ＴＣＲコードポリヌクレオチド及びＴＣＲ発現ベクターは、遺伝子アセンブリ法（例えば、本明細書に記載のＴＣＲ遺伝子アセンブリ法）を用いて合成することができる。
次にこれらのＴＣＲを使用して、本明細書に記載のように、ＴＣＲ操作レポーター細胞株（例えば、レシピエント細胞）を操作することができる。一方、ＨＬＡ遺伝子は末梢血から増幅することができる。ヒトＨＬＡ発現を伴わないＡＰＣ細胞株（例えば、Ｋ５６２や７２１．２２１などのＭＨＣを発現しないまたは非常に低レベルで発現するヒト細胞株、ＣＯＳ－７などの非ヒト霊長類細胞株、内在性ＨＬＡをノックアウトしたヒト細胞株）を、患者のＨＬＡ遺伝子を発現するように操作することができる。また、患者からの自己由来ＡＰＣ（例えば、単球由来樹状細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞）もＡＰＣとして使用することができる。腫瘍試料（例えば、外科的試料または生検）からの全長ｍＲＮＡを単離し、増幅し、上記の自己由来またはＨＬＡ操作された同種異系ＡＰＣに形質移入して、腫瘍ｍＲＮＡ装填ＡＰＣを作出することができる。腫瘍試料は、コア生検または穿刺生検試料などの生検試料であり得る。腫瘍試料の体積が小さくても増幅に十分なｍＲＮＡを含み得るため、これらの試料の体積は小さくてもよい（例えば、＜１０００ｍｍ３、＜５００ｍｍ３、＜１００ｍｍ３、＜５０ｍｍ３）。いくつかの場合では、腫瘍試料の体積は、２０００ｍｍ３、１０００ｍｍ３、８００ｍｍ３、５００ｍｍ３、１００ｍｍ３、５０ｍｍ３、または２０ｍｍ３に等しいか、または最大でおよそその体積であり得る。このように、この方法は、大きな外科的腫瘍試料を得るのが困難な場合にも適用可能であり得る。ＴＣＲ操作レポーター細胞及び腫瘍ｍＲＮＡ装填ＡＰＣを共培養し、腫瘍反応性のレポーター発現細胞を上記のように単離することができる。単離した細胞からのＴＣＲをシークエンシングして、腫瘍反応性ＴＣＲの配列及び存在量を提供することができる。このような情報を含む報告を発行することができる。この方法は、従来のＴＣＲレパートリー分析と組み合わせて、腫瘍反応性ＴＣＲの存在量の精度を改善することができる。このパラグラフに記載の操作されたＡＰＣ及び腫瘍ｍＲＮＡ装填ＡＰＣを得るための方法は、本開示の他の箇所に記載の方法でも使用することができる。
例えば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法は、ＴＣＲの集団を発現する細胞の集団を準備することを含み得る。ＴＣＲの集団は、細胞の集団に外来性であってもよい。ＴＣＲの集団は、異なる同族対、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、５００、１，０００、１０，０００、１，０００，０００、またはそれ以上の異なる同族対を含み得る。ＴＣＲの集団は、少なくとも約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上の異なるＶ遺伝子からのＶ領域を含み得る。ＴＣＲの集団は、少なくとも１００のＶＪの組合せを含み得る。当該方法はさらに、細胞の集団を１つ以上の標的抗原に接触させることを含み得、この場合、複数の標的反応性ＴＣＲが、１つ以上の標的抗原に結合する。次に、複数の標的反応性ＴＣＲを単離または濃縮することができる。いくつかの場合では、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、またはそれ以上の複数の標的反応性ＴＣＲを単離または濃縮することができる。細胞の集団は、操作された細胞、疲弊していない細胞、または患者から単離されていない細胞であり得る。当該方法はさらに、細胞の集団を１つ以上の標的抗原に接触させることを含み得、この場合、複数の標的反応性ＴＣＲが、１つ以上の標的抗原に結合し得る。次に、複数の少なくとも５つの標的反応性ＴＣＲを単離または濃縮することができる。ＴＣＲの集団は、少なくとも約１００、２００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００の異なる同族対を含み得る。複数の標的反応性ＴＣＲは、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、またはそれ以上の異なるＶ遺伝子からのＶ領域を含む。いくつかの場合では、細胞の集団を、１つ以上の標的抗原を提示する腫瘍細胞または抗原提示細胞に接触させる。標的抗原は、腫瘍抗原または組織特異的抗原であり得る。１つ以上の標的抗原は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と複合体化し得る。ＭＨＣは、ＭＨＣテトラマーであり得る。当該方法はさらに、複数の標的反応性ＴＣＲのうちの少なくとも１つの標的反応性ＴＣＲを対象に投与することを含み得る。いくつかの場合では、細胞集団または操作された細胞集団の細胞は、レポーター遺伝子を含み得る。レポーター遺伝子は、細胞のＴＣＲが１つ以上の標的抗原のうちの１つの標的抗原に結合したときにシグナルを送るように調節することができる。細胞集団または操作された細胞集団は、細胞株の細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）であってもよい。
例えば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備することを含み得る。複数のＴＣＲは、少なくとも約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、またはそれ以上の異なるＶ遺伝子からのＶ領域を含む少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、５００、１，０００、１０，０００、１，０００，０００、またはそれ以上の異なる同族対を含み得る。当該方法はさらに、複数のＴＣＲの各ＴＣＲのＴＣＲアルファ（またはガンマ）鎖をコードする第１のポリヌクレオチド及びＴＣＲベータ（またはデルタ）鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを物理的に結合し、それにより、複数の融合したポリヌクレオチドを生成することを含み得る。複数の融合したポリヌクレオチドは、複数の細胞で発現させることができ、この場合、複数の細胞のサブセットは、複数の標的反応性ＴＣＲを発現する。複数の細胞を１つ以上の標的抗原に接触させて、複数の標的反応性ＴＣＲを同定することができる。複数の標的反応性ＴＣＲを発現する複数の細胞のサブセットは、１つ以上の標的抗原に結合することができる。複数の細胞のサブセットを単離または濃縮し、それにより、複数の標的反応性ＴＣＲを単離または濃縮することができる。
例えば、複数の標的反応性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備することを含み得る。複数のＴＣＲは、少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、またはそれ以上の異なるＶ遺伝子からのＶ領域を含む少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、５００、１，０００、１０，０００、１，０００，０００、またはそれ以上の異なる同族対を含み得る。当該方法はさらに、いかなるバーコード化（例えば、単一細胞バーコード化）も使用せずに複数のＴＣＲの１つ以上の同族対をシークエンシングすることを含み得る。例えば、シークエンシングは、複数のＴＣＲの１つ以上の同族対のＴＣＲ鎖をシークエンシングすることを含み得、この場合、ＴＣＲ鎖は同じバーコードを含まない。次に、複数のＴＣＲまたはそのサブセットをコードする１つ以上の同族対は、例えば、可溶性形態でまたは複数の細胞で、発現させることができる。１つ以上の同族対を発現させるために使用する複数の細胞は、細胞株の細胞であってもよい。複数のＴＣＲまたはそのサブセットは、複数の標的反応性ＴＣＲを含み得る。次に、複数のＴＣＲを１つ以上の標的抗原と接触させて、標的反応性ＴＣＲを同定することができる。複数の標的反応性ＴＣＲは、１つ以上の標的抗原に結合することができ、次に単離または濃縮することができる。いくつかの場合では、ＴＣＲの同族対を同定するときに、複数のＴＣＲの各ＴＣＲのＴＣＲアルファ鎖をコードする第１のポリヌクレオチド及びＴＣＲベータ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドを物理的に結合し、それにより、複数の融合したポリヌクレオチドを生成することができる。当該方法はさらに、複数のＴＣＲの１つ以上の同族対をシークエンシングすることを含み得る。複数のＴ細胞は、対象から単離することができる。複数のＴ細胞は腫瘍浸潤性Ｔ細胞であり得る。複数のＴ細胞は疲弊したＴ細胞を含み得る。複数の標的反応性ＴＣＲをＦＡＣＳによって単離または濃縮することができる。複数の標的反応性ＴＣＲは、細胞表面マーカーまたはサイトカインマーカーによって単離することができる。例えば、標的反応性ＴＣＲは、ＦＡＣＳによる選別用に表面マーカー（例えば、ＣＤ６９、ＣＤ２５、４１ＢＢ）に特異的な抗体を使用することにより、単離または濃縮することができる。
いくつかの場合では、試料から単離した複数のＴ細胞を、例えば抗原を提示するＡＰＣを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養及び刺激し、複数のＴ細胞のサブセットを濃縮することができる。次に、これらの予め濃縮したＴ細胞を使用して標的反応性ＴＣＲを同定することができる。例えば、血液試料またはＰＢＭＣ試料から複数のＴ細胞を単離するときに、複数のＴ細胞のごく一部が標的反応性Ｔ細胞であることがある。このような場合、最初に複数のＴ細胞を１つ以上の標的抗原（例えば、ＭＨＣテトラマー形態をとるか、または細胞表面上に提示されているもの）に接触させて、Ｔ細胞を活性化することができる。複数のＴ細胞のサブセットは、マーカー（例えば、表面マーカー）に基づいて濃縮または単離することができ、次に、本明細書に記載の後続の同定方法（同族ＴＣＲ鎖の融合を含む）に使用することができる。また、予め濃縮したＴ細胞を他の方法に供し、例えばシークエンシングを用いて、同族対を同定することもできる。シークエンシングには、単一細胞バーコード化を使用することができる（例えば、Ｔ細胞を個々の区画に分割し、単一細胞から放出される核酸をバーコード化し、同じバーコードに基づいて単一細胞から核酸のシークエンシング及びＴＣＲ鎖の対合を行う）。
いくつかの場合では、本明細書で提供する方法は、複数のＴＣＲを発現する複数の細胞を提供することを含み得、複数の細胞の各細胞は、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲを発現する。複数のＴＣＲは、少なくとも５、１０、２０、５０、またはそれ以上の異なる同族対を含み得る。いくつかの場合では、複数のＴＣＲはさらに、複数のＶ遺伝子からのＶ領域を含み得る。複数のＴＣＲは、複数の細胞に外来性であってもよい。任意選択で、複数の細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングすることができ、複数の細胞におけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することができる。複数の細胞を１つ以上の抗原に接触させ、それにより、複数の細胞のサブセットのマーカーを活性化することができる。複数の細胞のサブセットは、マーカーに基づいて単離することができる。次に、単離に続いて、複数の細胞のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、複数の細胞のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度を決定することができる。複数の細胞のサブセットにおける頻度が、複数の細胞における頻度よりも高いＴＣＲは、推定上の標的反応性ＴＣＲとして同定することができる。
いくつかの場合では、本明細書で提供する方法は、複数のＴＣＲを発現する第１の複数の細胞及び複数のＴＣＲを発現する第２の複数の細胞を準備することを含み得、第１または第２の複数の細胞の各細胞は、複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲを発現する。第１の複数の細胞及び第２の複数の細胞は、同じ試料に由来し得る。例えば、第１の複数の細胞及び第２の複数の細胞は、同じ試料の２つのアリコートであり得る。複数のＴＣＲは、少なくとも５、１０、２０、５０、またはそれ以上の異なる同族対を含み得る。いくつかの場合では、複数のＴＣＲはさらに、複数のＶ遺伝子からのＶ領域を含み得る。複数のＴＣＲは、第１または第２の複数の細胞に外来性である。次に、第１の複数の細胞を第１の抗原に接触させ、それにより、第１の複数の細胞の第１のサブセットの第１のマーカーを活性化することができ、第２の複数の細胞を第２の抗原に接触させ、それにより、第２の複数の細胞の第２のサブセットの第２のマーカーを活性化することができる。第１のサブセットを第１のマーカーに基づいて単離し、第２のサブセットを第２のマーカーに基づいて単離することができる。第１の複数の細胞の第１のサブセットのＴＣＲレパートリー及び第２の複数の細胞の第２のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングすることができる。第１の複数の細胞の第１のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度と、第２の複数の細胞の第２のサブセットにおけるＴＣＲレパートリーのＴＣＲの頻度とを決定することができる。第１の複数の細胞の第１のサブセットにおける頻度が、第２の複数の細胞の第２のサブセットにおける頻度よりも高いＴＣＲは、推定上の標的反応性ＴＣＲとして同定することができる。頻度は、特定のＴＣＲのシークエンシングリード数をＴＣＲレパートリーの総シークエンシングリード数で割ったものによって決定することができる。いくつかの場合では、頻度は、特定のＴＣＲのユニーク分子インデックス（ＵＭＩ）数をＴＣＲレパートリーのＵＭＩ総数で割ったものによって決定することができる。ＵＭＩは、標準的なプロトコルを用いてシークエンシングライブラリーを調製するときに、シークエンシングする核酸分子に加えることができる。
本明細書に記載の同定された推定上の標的反応性ＴＣＲは、ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の選択前または選択後のプールから単離することができる。いくつかの場合では、同定された推定上の標的反応性ＴＣＲを合成する（例えば、化学的に合成する）ことができる。いくつかの場合では、同定された推定上の標的反応性ＴＣＲは、ダイアルアウトＰＣＲなどの核酸増幅法を用いて、選択前または選択後のプールから選択（例えば、増幅またはダイアルアウト）することができる。例えば、本明細書に記載の様々な態様において、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド（例えば、発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチド）は、バーコードを含み得る。バーコードは、プール内の特定のＴＣＲ配列にユニークなバーコードであり得る。バーコードの配列は任意に設計することができる。バーコードの配列は、一般的なピットフォール、例えば、不要な二次構造、制限部位、ＴＣＲ遺伝子内の他の配列との類似性、またはプライマー結合部位間の類似性を回避するように設計することができる。バーコードは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０ヌクレオチド長、またはそれ以上であり得る。バーコードは、対合ＴＣＲ配列に追加された配列であっても、対合ＴＣＲプールの各配列に既に含まれている配列であってもよい。例えば、本明細書に記載の自己アセンブリを用いて対合ＴＣＲを生成するときに、コネクター配列またはその一部をバーコードとして使用することができる。別の例として、バーコード配列は、発現可能なＴＣＲポリヌクレオチドライブラリーを調製するときに、ベクターに導入することができる。次に、同定された推定上の標的反応性ＴＣＲは、バーコード配列及び共通配列を標的とするプライマー対を用いて増幅することができる。
ＴＣＲを対合する方法
ソースＴＣＲ発現細胞から得られたポリクローナルＴＣＲは、物理的またはインフォマティクス的に対合することができる。ＴＣＲの対合に使用される方法の例を本明細書で提供する。
単一細胞リアクターに基づく方法
ソースＴＣＲ発現細胞からのＴＣＲは、単一細胞リアクター内で対合（例えば、物理的に融合）させることができる。単一細胞リアクターは、単一の生物学的粒子（例えば、単一細胞）からの目的分子が試薬とまたは互いに反応することができる区画であり得る。単一細胞リアクターは、２つの構成要素：（１）単一細胞からの目的分子を会合させることができる固体支持体、及び（２）生化学的反応を生じさせるための水性の内容物を含み得る。単一細胞リアクター内の目的分子は、異なる細胞からの目的分子が互いに接触したり、混合したりしないような反応を経ることができる。目的分子は、核酸、タンパク質、または細胞内に存在する他の分子であり得る。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡなどであり得る。核酸は、免疫受容体または免疫受容体鎖をコードすることができる。単一細胞リアクターは、区画であっても容器であってもよい。区画または容器は、液滴、チューブ、ウェル、アレイ上の不連続的領域、または硬化粒子（例えば、ヒドロゲル粒子）であり得る。
１つの態様において、融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを調製するための方法は、（ａ）複数の容器を生成することであって、各々が、（１）二部性免疫受容体の第１のペプチド鎖をコードする第１の核酸及び二分性免疫受容体の第２のペプチド鎖をコードする第２の核酸を含む細胞と、（２）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマー及び／またはモノマーとを含む、生成することと、（ｂ）複数の重合可能またはゲル化可能なポリマー及び／またはモノマーを重合またはゲル化して、複数の硬化性粒子を形成することとを含み得、ここで、複数の硬化性粒子の各々は、重合またはゲル化した複数のポリマー及び／またはモノマーから構成されたマトリックスを有し、複数の硬化性粒子は、第１の核酸の第１のプライマー伸長産物及び第２の核酸の第２のプライマー伸長産物を含み、第１のプライマー伸長産物及び第２のプライマー伸長産物は、マトリックス内に埋め込まれているかまたは捕捉されており、第１のプライマー伸長産物及び第２のプライマー伸長産物の拡散は制限されている。
第１及び第２のプライマー伸長産物は、逆転写（ＲＴ）産物、第２鎖合成（ＳＳＳ）産物、または増幅産物であり得る。第１及び／または第２のプライマー伸長産物は、アダプター配列を含み得る。いくつかの実施形態において、アダプター配列は、第１または第２の核酸分子とハイブリダイズ可能または相補的ではない。いくつかの実施形態において、第１及び第２のプライマー伸長産物は、可変ドメインをコードする。いくつかの実施形態において、可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／または第２のプライマー伸長産物はさらに、定常ドメインをコードする。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、細胞を溶解して、第１の核酸及び第２の核酸を放出することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の核酸及び第２の核酸を逆転写することを含む。いくつかの実施形態において、逆転写は、ＲＴプライマーを使用することによって実施される。いくつかの実施形態において、ＲＴプライマーは拡散制限剤に結合しており、拡散制限剤は、マトリックス内のＲＴプライマーの拡散を制限する。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、テンプレートスイッチ反応またはＳＳＳ反応を行うことを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の核酸及び第２の核酸を増幅して、第１及び第２の増幅産物を生成することを含む。いくつかの実施形態において、第１の核酸または第２の核酸の各々について、増幅は、第１の増幅プライマー及び第２の増幅プライマーを使用することによって実施される。いくつかの実施形態において、第１の増幅プライマーは拡散制限剤に結合しており、拡散制限剤は、マトリックス内の第１の増幅プライマーの拡散を制限する。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数の硬化粒子を洗浄することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数の硬化粒子を洗浄して、複数の硬化粒子から試薬を拡散できるようにすることを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、ＲＴプライマー、増幅プライマー、テンプレートスイッチプライマー、ＳＳＳプライマー、またはこれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数の硬化粒子を繰り返し洗浄することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、洗浄ステップの後に、複数の硬化粒子を油中で乳化し、それにより、追加の複数の容器を形成することを含み、追加の複数の容器の各容器は、複数の硬化粒子のうちの単一の硬化粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のプライマー伸長産物は、拡散制限剤に結合している。いくつかの実施形態において、拡散制限剤はポリマーである。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である。いくつかの実施形態において、拡散制限剤は粒子である。いくつかの実施形態において、粒子の直径は、マトリックスの細孔サイズよりも大きい。いくつかの実施形態において、拡散制限剤はマトリックスである。いくつかの実施形態において、第１のプライマー伸長産物及び第２のプライマー伸長産物は、捕捉剤を介して拡散抑制剤に結合している。いくつかの実施形態において、捕捉剤は固定化部分を含む。いくつかの実施形態において、固定化部分は、捕捉剤を拡散制限剤に結合する。
いくつかの実施形態において、固定化部分は反応性基を含む。いくつかの実施形態において、捕捉剤はさらに、標的化部分を含む。いくつかの実施形態において、標的化部分は捕捉オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１の増幅プライマーは、捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２の増幅産物はオリゴヌクレオチド配列を含み、オリゴヌクレオチド配列は捕捉オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それにより、第１及び第２の増幅産物を捕捉剤に結合させ、それにより、拡散制限剤に結合する。いくつかの実施形態において、反応性基は、スクシンイミジルエステル、アミド、アクリルアミド、アシルアジド、アシルハライド、アシルニトリル、アルデヒド、ケトン、アルキルハライド、アルキルスルホネート、無水物、アリールハライド、アジリジン、ボロネート、カルボジイミド、ジアゾアルカン、エポキシド、ハロアセトアミド、ハロプラチネート、ハロトリアジン、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミダイト、シリルハライド、スルホン酸エステル、スルホニルハライド、アミン、アニリン、チオール、アルコール、フェノール、ヒラジン（ｈｙｒａｚｉｎｅ）、ヒドロキシルアミン、カルボン酸、グリコール、または複素環である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の増幅産物及び第２の増幅産物を結合して、追加の複数の血管の各血管内に融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドを形成し、それにより、複数の融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドを有する融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーを生成することを含む。いくつかの実施形態において、第１の増幅産物及び第２の増幅産物は、ライゲーションまたはＰＣＲによって結合している。いくつかの実施形態において、第１の増幅産物及び第２の増幅産物は、ホスホジエステル結合によって結合して、連続的なポリヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態において、第１の増幅産物及び第２の増幅産物は、インフレームで結合している。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、追加の複数の血管から複数の融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドを放出することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数の融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドの各々を環状化することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、複数の融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドの各々をベクターに挿入することを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、自己増幅ＲＮＡレプリコン、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルス、またはビリオンである。いくつかの実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、またはこれらのシュードタイプに由来する。いくつかの実施形態において、ベクターは非ウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、非ウイルス性ベクターは、ナノ粒子、カチオン性脂質、カチオン性ポリマー、金属ナノポリマー、ナノロッド、リポソーム、ミセル、マイクロバブル、細胞貫通ペプチド、またはリポスフィアである。いくつかの実施形態において、二分性免疫受容体はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファペプチド鎖及びＴＣＲベータペプチド鎖、またはＴＣＲガンマペプチド鎖及びＴＣＲデルタペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、リンパ球はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、炎症性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、腫瘍組織または血液試料から単離される。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドを宿主細胞内に送達することを含む。いくつかの実施形態において、融合した二分性免疫受容体ポリヌクレオチドライブラリーは、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００、または少なくとも１０，０００，０００の異なる融合した二分性免疫受容体配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のペプチド鎖及び第２のペプチド鎖は、二分性免疫受容体の同族対である。いくつかの実施形態において、容器は液滴である。いくつかの実施形態において、液滴は油中水滴型の液滴である。いくつかの実施形態において、硬化粒子はヒドロゲル粒子である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、多糖、ポリアクリルアミド、またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態において、多糖は、アガロース、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセロース、キトサン、またはアルギネートである。いくつかの実施形態において、モノマーは、アクリルアミドまたはメタクリルアミドモノマーである。いくつかの実施形態において、重合またはゲル化された複数のポリマー及び／またはモノマーは、アガロース及びポリアクリルアミドの混合物を含む。いくつかの実施形態において、重合またはゲル化された複数のポリマー及び／またはモノマーは、架橋されている。いくつかの実施形態において、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマー及び／またはモノマーを重合またはゲル化することは、開始剤を使用することを含む。いくつかの実施形態において、開始剤はＵＶ光または化学物質である。いくつかの実施形態において、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマー及び／またはモノマーを重合またはゲル化することは、容器の温度を低下させることを含む。
本明細書で提供する方法は、液体中で実施することができ、（ａ）核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第１の伸長産物を形成することと、（ｂ）第１のプライマー及び第２のプライマーを含むプライマーセットで第１の伸長産物またはその逆相補鎖を増幅し、それにより、第１の増幅産物を形成することと、（ｃ）液体中でポリマーマトリックスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それにより、第１の増幅産物の拡散を制限することと、（ｄ）ヒドロゲル粒子を洗浄し、それにより、ヒドロゲル分子から第２のプライマーを枯渇させることとを含む。いくつかの実施形態において、第１のプライマーまたは第１の増幅産物は、拡散制限剤に結合している。
いくつかの場合では、液体中で実施される方法は、（ａ）核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第１の伸長産物を形成することと、（ｂ）液体中でポリマーマトリックスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それにより、第１の伸長産物またはその逆相補鎖の拡散を制限することと、（ｃ）ヒドロゲル粒子を洗浄することと、（ｄ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を第１のプライマー及び第２のプライマーを含むプライマーセットで増幅し、それにより、第１の増幅産物を形成することとを含み得る。
いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドまたは第１の伸長産物は、拡散制限剤に結合している。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、追加の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長することを含む。いくつかの実施形態において、核酸分子及び追加の核酸分子は、免疫受容体の第１のペプチド鎖及び第２のペプチド鎖をコードし、第１のペプチド鎖及び第２のペプチド鎖は、免疫受容体の同族体対である。いくつかの実施形態において、拡散制限剤は、ポリマーまたは粒子である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、または多糖である。いくつかの実施形態において、粒子の直径は、ポリマーマトリックスの細孔サイズよりも大きい。いくつかの実施形態において、拡散制限剤はポリマーマトリックスである。いくつかの実施形態において、核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸分子はゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸分子はメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドは逆転写（ＲＴ）プライマーである。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＲＴプライマーをテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドで伸長し、それにより、テンプレートスイッチオリゴヌクレオチドの逆相補配列を有する第１の伸長産物を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、アダプター配列を有する第２鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを使用して、第１の伸長産物の逆相補鎖を合成することを含む。いくつかの実施形態において、アダプター配列は、核酸分子または第１の伸長産物とハイブリダイズ可能または相補的ではない。いくつかの実施形態において、第１の伸長産物はアダプター配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸分子は、免疫受容体のペプチド鎖をコードする。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ヒドロゲルの洗浄後または洗浄中に、試薬をヒドロゲル粒子に接触させて、試薬がヒドロゲル粒子内に拡散するようにすることを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、オリゴヌクレオチドまたは酵素である。いくつかの実施形態において、酵素はポリメラーゼである。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、洗浄後にヒドロゲル粒子を油中で乳化することを含む。
いくつかの場合では、液体中で実施される方法は、（ａ）複数の液滴を形成することであって、複数の液滴の少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、形成することと、（ｂ）単一細胞からの第１の核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第１の伸長産物を形成し、単一細胞からの第２の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第２の伸長産物を形成することと、（ｃ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を第１のプライマー及び第２のプライマーを含む第１のプライマーセットで増幅し、それにより、第１の増幅産物セットを形成し、第２の伸長産物またはその逆相補鎖を第３のプライマー及び第４のプライマーを含む第２のプライマーセットで増幅し、それにより、第２の増幅産物セットを形成することと、（ｄ）第１の増幅産物セットの増幅産物を第２の増幅産物セットの増幅産物に結合することであって、結合することが、第２及び第４のプライマーの不在下の液体中で結合することを含む、結合することとを含み得る。
いくつかの場合では、液体中で実施される方法は、（ａ）複数の液滴を形成することであって、複数の液滴のうちの少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、形成することと、（ｂ）単一細胞からの第１の核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第１の伸長産物を形成し、単一細胞からの第２の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第２の伸長産物を形成することと、（ｃ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を第１のプライマー及び第２のプライマーを含む第１のプライマーセットで増幅し、それにより、第１の増幅産物セットを形成し、第２の伸長産物またはその逆相補鎖を第３のプライマー及び第４のプライマーを含む第２のプライマーセットで増幅し、それにより、第２の増幅産物セットを形成することと、（ｄ）第２及び第４のプライマーを除去し、第１の増幅産物セットの増幅産物を第２の増幅産物セットの増幅産物に結合することとを含み得る。
いくつかの実施形態において、各液滴は、複数の重合可能またはゲル化可能なポリマー及び／またはモノマーを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、液体中にポリマーマトリックスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それにより、第１の増幅産物セット及び第２の増幅産物セットの拡散を制限することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ヒドロゲル粒子を洗浄し、それにより、ヒドロゲル粒子から第２のプライマー及び第４のプライマーを枯渇させることを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１及び第２の増幅産物セット上に粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、増幅産物上に粘着末端を生成することは、ＵＳＥＲ酵素を使用することを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１及び第２の増幅産物セットをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１及び第２の増幅産物セットをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、第１のプライマー及び第３のプライマーは同じプライマーである。いくつかの実施形態において、第１のプライマー、第３のプライマー、第１の増幅産物セット、または第２の増幅産物セットは、拡散制限剤に結合している。
いくつかの場合では、液体中で実施される方法は、（ａ）複数の液滴を形成することであって、複数の液滴のうちの少なくとも２つの液滴が単一細胞を含む、形成することと、（ｂ）単一細胞からの第１の核酸分子とハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第１の伸長産物を形成し、単一細胞からの第２の核酸分子とハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを伸長し、それにより、第２の伸長産物を形成することと、（ｃ）液体中でポリマーマトリックスを生成してヒドロゲル粒子を形成し、それにより、第１の伸長産物及び第２の伸長産物の拡散を制限することと、（ｄ）第１の伸長産物またはその逆相補鎖を第１のプライマー及び第２のプライマーを含む第１のプライマーセットで増幅し、それにより、第１の増幅産物セットを形成し、第２の伸長産物またはその逆相補鎖を第３のプライマー及び第４のプライマーを含む第２のプライマーセットで増幅し、それにより、第２の増幅産物セットを形成することと、（ｅ）第１の増幅産物セットの増幅産物を第２の増幅産物セットの増幅産物に結合することとを含み得る。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｃ）の後にヒドロゲル粒子を洗浄することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、試薬をヒドロゲル粒子に接触させて、試薬がヒドロゲル粒子内に拡散するようにすることを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、酵素またはオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、第１のプライマーセット及び／または第２のプライマーセットを含む。いくつかの実施形態において、酵素は、ポリメラーゼ、リガーゼ、ＵＳＥＲ酵素、またはこれらの組合せである。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、洗浄後にヒドロゲル粒子を油中で乳化することを含む。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドは、拡散制限剤に結合している。いくつかの実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドまたは第２のオリゴヌクレオチドはＲＴプライマーである。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第２鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを使用して、第１及び／または第２の伸長産物の逆相補鎖を合成することを含む。いくつかの実施形態において、ＳＳＳプライマーはアダプター配列を含む。いくつかの実施形態において、アダプター配列は、第１及び／または第２の伸長産物とハイブリダイズ可能または相補的ではない。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、ＲＴプライマーをテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドで伸長することを含む。いくつかの実施形態において、単一細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。いくつかの実施形態において、第１の核酸分子及び第２の核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡはゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。いくつかの実施形態において、第１の核酸分子は、免疫受容体の第１のペプチド鎖をコードし、第２の核酸分子は、免疫受容体の第２のペプチド鎖をコードする。いくつかの実施形態において、第１のペプチド鎖及び第２のペプチド鎖は、免疫受容体の同族対である。いくつかの実施形態において、第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は可変ドメインを含む。いくつかの実施形態において、可変ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、またはこれらの組合せを含む。いくつかの実施形態において、第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は定常ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のペプチド鎖または第２のペプチド鎖は、膜貫通領域及び／または細胞質テールを含む。いくつかの実施形態において、免疫受容体はＢ細胞受容体である。いくつかの実施形態において、免疫受容体はＴ細胞受容体である。いくつかの実施形態において、拡散制限剤は、ポリマーまたは粒子である。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ポリアクリルアミド、多糖、またはポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態において、粒子の直径は、ヒドロゲル粒子の細孔サイズよりも大きい。いくつかの実施形態において、拡散制限剤はポリマーマトリックスである。いくつかの実施形態において、結合することは、第１及び第２の増幅産物セット上に粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、増幅産物上に粘着末端を生成することは、ＵＳＥＲ酵素を使用することを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１及び第２の増幅産物セットをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１及び第２の増幅産物セットをライゲーションすることを含む。
本明細書で提供する方法は、（１）複数の少なくとも１，０００個の細胞を準備することであって、少なくとも１，０００個の細胞の各細胞が、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む、準備することと、（２）複数の少なくとも１，０００個の区画を準備することであって、少なくとも１，０００個の区画の各区画が固体支持体を含み、固体支持体が、（ａ）第１の共通配列、第２の共通配列、ならびに第１及び第２の共通配列の間のＴＣＲアルファ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）第３の共通配列、第４の共通配列、ならびに第３及び第４の共通配列の間のＴＣＲベータ鎖をコードするタンパク質コード配列を含む、第２のポリヌクレオチドとを含み、各区画内のＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖が、複数の細胞のうちの少なくとも１つに存在する同族対であり、それにより、各々ＴＣＲアルファ鎖をコードする第１の複数のタンパク質コード配列及び各々ＴＣＲベータ鎖をコードする第２の複数のタンパク質コード配列が得られる、準備することと、（３）各区画内の第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを物理的に結合することとを含み得る。いくつかの実施形態において、第１の複数のタンパク質コード配列は、少なくとも１０のＴＲＡＶサブグループを含み、第２の複数のタンパク質コード配列は、少なくとも１０のＴＲＢＶサブグループを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１，０００の区画の各区画は、複数の少なくとも１，０００個の細胞からの細胞を含む。いくつかの実施形態において、区画は、ウェル、マイクロウェル、または液滴である。いくつかの実施形態において、固体支持体は、ビーズ、ヒドロゲル粒子、またはウェルもしくはマイクロウェルの表面である。いくつかの実施形態において、複数の少なくとも１，０００個の区画において、第１の共通配列、第２の共通配列、第３の共通配列、または第４の共通配列は同じである。
ＴＣＲ鎖を物理的に結合する方法に関するさらなる詳細は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４６１７０号に見出すことができ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
ＴＣＲ遺伝子の自己アセンブリ
ソースＴＣＲ発現細胞からのＴＣＲは、例えばシークエンシングを用いて、インフォマティクス的に対合することができる。ネイティブ対合（または同族）ＴＣＲをコードする配列は、限定されるものではないが、単一細胞バーコード化及びシークエンシング技術の使用を含めた様々な方法を用いて同定することができる。ネイティブ対合ＴＣＲをコードする配列を得た後に、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して１つ以上の核酸配列を構築またはアセンブリし、任意の所与の宿主細胞（複数可）内でネイティブ対合ＴＣＲを高処理かつ低コストの方式で発現させることができる。１つ以上の核酸配列は、約１、５、１０、２０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の異なるＴＣＲをコードする異なる配列を含み得る。
１つの態様において、複数の核酸分子を生成するための方法は、第１の複数の核酸分子を準備することであって、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、準備することと、第２の複数の核酸分子を準備することであって、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、１つの核酸分子が定常ドメインをコードする配列を含まない、準備することと、第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子を接触させることであって、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と結合して、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む、核酸分子を形成し、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列ならびにＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、接触させることとを含み得る。
いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、第１のＴＣＲ鎖の異なる第１のＣＤＲ３及び／または第２のＴＣＲ鎖の異なるＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子は、同じ区画内で接触される。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はさらにコネクター配列を含み、当該コネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とを結合する。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はアンチコネクター配列をさらに含み、当該アンチコネクター配列はコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、コネクター配列はアンチコネクター配列とハイブリダイズして、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とを結合する。いくつかの実施形態において、コネクター配列はコドン多様化され、その結果、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子のコネクター配列は、第１の複数の核酸分子の他の核酸分子の他のコネクター配列と異なる。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はさらに、第１のＴＣＲ鎖の第１のＪ領域及び／または第２のＴＣＲ鎖の第２のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、（ｉ）第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲアルファ鎖であり、第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲベータ鎖である、または（ｉｉ）第１のＴＣＲ鎖がＴＣＲガンマ鎖であり、第２のＴＣＲ鎖がＴＣＲデルタ鎖である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子はＴＲＡＶ遺伝子、ＴＲＢＶ遺伝子、ＴＲＧＶ遺伝子、またはＴＲＤＶ遺伝子である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は二重鎖核酸分子である。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はさらに、自己切断ペプチドの一部をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、アンチコネクター配列は、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子のオーバーハングである。いくつかの実施形態において、コネクター配列またはアンチコネクター配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００ヌクレオチド、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｉ）第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とハイブリダイズした第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子の３’末端を伸長すること、及び／または（ｉｉ）第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とハイブリダイズした第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子の３’末端を伸長することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む核酸分子を、制限酵素に接触させて粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む核酸分子を、定常領域またはその一部をコードする配列を含む追加の核酸分子に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列とＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む核酸分子を、粘着末端を介し追加の核酸分子とライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、第１のＣＤＲ３をコードする配列及び第２のＣＤＲ３をコードする第２の配列は、最大約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、または５ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。
別の態様において、各核酸分子がＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその領域をコードする、複数の核酸分子を生成するための方法は、第１の複数の核酸分子と第２の複数の核酸分子とを接触させて、少なくとも２つの異なる核酸分子を含む、第３の複数の核酸分子を生成することを含み得、少なくとも２つの異なる核酸分子の各々は、異なるＴＣＲ鎖またはその領域をコードする異なる配列を有し、少なくとも２つの異なる核酸分子は、同じ区画内で生成される。
いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子の各核酸分子は、ＴＣＲ鎖のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子はヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、またはＴＲＡＶ４１である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、またはＴＲＢＶ３０である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及びＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖はＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子は、追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖及び追加のＴＣＲ鎖はＴＣＲ鎖の同族対である。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、異なるＴＣＲ鎖またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子はコネクター配列を含み、当該コネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの当該所与の核酸分子を第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子に結合するために使用可能である。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子及び第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子は、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子は、アンチコネクター配列を含み、当該アンチコネクター配列は、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子のコネクター配列と相補的である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とを結合することを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズすることは、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子のコネクター配列を、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｉ）第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子を鋳型として用いて、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子を鋳型として用いて、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子の遊離３’末端を伸長して、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第１の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子と、第２の複数の核酸分子のうちの所与の核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を追加の核酸分子に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、追加の核酸分子はＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と追加の核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、第３の複数の核酸分子のうちの少なくとも５つ（例えば、いくつかの場合では、少なくとも約６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、またはそれ以上）の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、第３の複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、同じ区画は、ウェル、管、または液滴である。
別の態様において、複数の核酸分子を生成するための方法は、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする配列を含み、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、準備することと、（ｃ）第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子を接触させることであって、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と結合して、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む、直鎖状の核酸分子を形成し、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列ならびにＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、接触させることとを含み得る。
別の態様において、複数の核酸分子を生成するための方法は、（ａ）第１の複数の核酸分子を準備することであって、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が、（ｉ）第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第１のＣＤＲ３及び第２のＴＣＲ鎖の第２のＣＤＲ３をコードする合成配列と、（ｉｉ）第３のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の第３のＣＤＲ３及び第４のＴＣＲ鎖の第４のＣＤＲ３をコードする合成配列とを含み、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の第１の同族対に由来し、第３のＣＤＲ３及び第４のＣＤＲ３が、ＴＣＲ鎖の第２の同族対に由来する、準備することと、（ｂ）第２の複数の核酸分子を準備することであって、第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む、準備することと、（ｃ）第１の複数の核酸分子及び第２の複数の核酸分子を接触させることであって、第１の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子が第２の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子と結合して、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列と、ＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列とを含む、核酸分子を形成し、第１のＣＤＲ３及び第２のＣＤＲ３をコードする配列ならびにＴＣＲ Ｖ遺伝子が、ＴＣＲ鎖の同族対に由来する、接触させることとを含み得る。
別の態様において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成するための方法は、（ａ）ＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む少なくとも１つの核酸分子を準備することと、（ｂ）複数の核酸分子を準備することであって、複数の核酸分子の各々がＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含み、複数の核酸分子が少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する少なくとも２つの異なる配列を含む、準備することと、（ｃ）（ａ）の少なくとも１つの核酸分子を、同じ区画内の（ｂ）の複数の核酸分子に接触させることとを含み得、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子は、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して、ＣＤＲ３をコードする配列と少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子のうちの１つに由来する配列とを含む、第３の核酸分子を生成し、それにより、ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする核酸分子を生成することが可能である。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子は第１の複数の核酸分子を含み、当該第１の複数の核酸分子の各核酸分子はＴＣＲ鎖のＣＤＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子は、少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子の任意の１つの所与のＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する配列を含む複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に特異的に結合可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、第１の複数の核酸分子の各核酸分子はさらに、ＴＣＲ鎖のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子はヒトＴＣＲ Ｖ遺伝子またはマウスＴＣＲ Ｖ遺伝子である。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＡＶ１－１、ＴＲＡＶ１－２、ＴＲＡＶ２、ＴＲＡＶ３、ＴＲＡＶ４、ＴＲＡＶ５、ＴＲＡＶ６、ＴＲＡＶ７、ＴＲＡＶ８－１、ＴＲＡＶ８－２、ＴＲＡＶ８－３、ＴＲＡＶ８－４、ＴＲＡＶ８－６、ＴＲＡＶ９－１、ＴＲＡＶ９－２、ＴＲＡＶ１０、ＴＲＡＶ１２－１、ＴＲＡＶ１２－２、ＴＲＡＶ１２－３、ＴＲＡＶ１３－１、ＴＲＡＶ１３－２、ＴＲＡＶ１４、ＴＲＡＶ１６、ＴＲＡＶ１７、ＴＲＡＶ１８、ＴＲＡＶ１９、ＴＲＡＶ２０、ＴＲＡＶ２１、ＴＲＡＶ２２、ＴＲＡＶ２３、ＴＲＡＶ２４、ＴＲＡＶ２５、ＴＲＡＶ２６－１、ＴＲＡＶ２６－２、ＴＲＡＶ２７、ＴＲＡＶ２９、ＴＲＡＶ３０、ＴＲＡＶ３４、ＴＲＡＶ３５、ＴＲＡＶ３６、ＴＲＡＶ３８－１、ＴＲＡＶ３８－２、ＴＲＡＶ３９、ＴＲＡＶ４０、及びＴＲＡＶ４１からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのＴＣＲ Ｖ遺伝子は、ヒトＴＲＢＶ２、ＴＲＢＶ３－１、ＴＲＢＶ４－１、ＴＲＢＶ４－２、ＴＲＢＶ４－３、ＴＲＢＶ５－１、ＴＲＢＶ５－４、ＴＲＢＶ５－５、ＴＲＢＶ５－６、ＴＲＢＶ５－８、ＴＲＢＶ６－１、ＴＲＢＶ６－２、ＴＲＢＶ６－３、ＴＲＢＶ６－４、ＴＲＢＶ６－５、ＴＲＢＶ６－６、ＴＲＢＶ６－８、ＴＲＢＶ６－９、ＴＲＢＶ７－２、ＴＲＢＶ７－３、ＴＲＢＶ７－４、ＴＲＢＶ７－６、ＴＲＢＶ７－７、ＴＲＢＶ７－８、ＴＲＢＶ７－９、ＴＲＢＶ９、ＴＲＢＶ１０－１、ＴＲＢＶ１０－２、ＴＲＢＶ１０－３、ＴＲＢＶ１１－１、ＴＲＢＶ１１－２、ＴＲＢＶ１１－３、ＴＲＢＶ１２－３、ＴＲＢＶ１２－４、ＴＲＢＶ１２－５、ＴＲＢＶ１３、ＴＲＢＶ１４、ＴＲＢＶ１５、ＴＲＢＶ１６、ＴＲＢＶ１８、ＴＲＢＶ１９、ＴＲＢＶ２０－１、ＴＲＢＶ２４－１、ＴＲＢＶ２５－１、ＴＲＢＶ２７、ＴＲＢＶ２８、ＴＲＢＶ２９－１、及びＴＲＢＶ３０からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの異なるＴＣＲ Ｖ遺伝子に由来する複数の配列の各配列は、Ｌ－ＰＡＲＴ１、Ｌ－ＰＡＲＴ２、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、及び／またはＦＲ３をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖はＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲガンマ鎖、またはＴＣＲデルタ鎖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はさらに、追加のＴＣＲ鎖の追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子は追加のＴＣＲ鎖の追加のＪ領域を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ３をコードする配列及び追加のＣＤＲ３をコードする追加の配列は最大１００ヌクレオチド離れている。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ鎖及び追加のＴＣＲ鎖はＴＣＲ鎖の同族対である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子はコネクター配列を含み、コネクター配列は、少なくとも１つの核酸分子を複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子に結合して第３の核酸分子を生成可能である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸分子及び複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子は、機能的ＴＣＲ鎖またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子はアンチコネクター配列を含み、当該アンチコネクター配列は、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子のコネクター配列に相補的である。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とを結合することを含む。いくつかの実施形態において、結合することは、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とをハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、ハイブリダイズすることは、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子のコネクター配列を（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子のアンチコネクター配列とハイブリダイズすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ｉ）（ａ）の少なくとも１つの核酸分子を鋳型として用いて、複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、及び／または（ｉｉ）複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子を鋳型として用いて、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子の遊離３’末端を伸長して、第３の核酸分子を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、（ａ）の少なくとも１つの核酸分子と（ｂ）の複数の核酸分子のうちの１つの核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の核酸分子を制限酵素に接触させて粘着末端を生成することを含む。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の核酸分子を追加の核酸分子に接触させることを含む。いくつかの実施形態において、追加の核酸分子はＴＣＲ鎖の定常領域またはその一部をコードする。いくつかの実施形態において、当該方法はさらに、第３の核酸分子と追加の核酸分子とをライゲーションすることを含む。いくつかの実施形態において、各々が異なるＴＣＲ鎖またはその一部をコードする複数の核酸分子は、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの少なくとも５つの異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、複数の核酸分子のうちの少なくとも１０の異なる核酸分子が、同じ区画内で生成される。いくつかの実施形態において、同じ区画は、ウェル、管、または液滴である。
ＴＣＲ遺伝子アセンブリ法に関するさらなる詳細は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６５５８号に見出すことができ、当該出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
医薬組成物
本開示は、本明細書に記載の方法によって同定されたＴＣＲまたはＴＣＲを発現する細胞と、１つ以上の医薬的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤との組合せを含む医薬組成物も提供する。このような組成物は、緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水など）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、またはデキストラン、マンニトール）、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び防腐剤を含み得る。本開示の組成物は、静脈内投与用に製剤化することができる。
本開示の医薬組成物は、治療（または予防）する疾患に適した方法で投与することができる。投与の量及び頻度は、患者の状態ならびに患者の疾患のタイプ及び重症度などの因子によって決定することができるが、臨床試験によって適切な薬用量を決定する場合もある。
医薬組成物は、不純物（例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製能を有するレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残留抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、ヒト血清プール、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養基成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌、及び真菌からなる群より選択される不純物）が実質的に存在しないと考えられ、例えば、検出可能なレベルの不純物が存在しない。いくつかの場合では、細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇｒｏｕｐ Ａ、及びこれらの任意の組合せからなる群より選択される少なくとも１つであり得る。
実施例１：ＴＩＬからのネオ抗原反応性ＴＣＲのハイスループット同定
がん患者から腫瘍組織を外科的に取り出すことができる。術後２４時間以内に、０．５～３ｃｍ３の腫瘍組織を氷上で刻むことができる。確立された酵素処理（例えば、コラゲナーゼ及びＤｎａｓｅ Ｉを使用）及び任意選択で組織分離装置（例えば、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣＳ）を用いて単一細胞懸濁液を得ることができる。セルストレーナーを使用して大きなデブリを移動することができる。ＦＡＣＳを用いて単一細胞（例えば、単一生細胞）を単離することができる。Ｔ細胞（例えば、生Ｔ細胞）は、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳに基づく様々なポジティブ選択またはネガティブ選択の方法を用いて単離することができる。Ｔ細胞を様々なシークエンシング法のインプットとして使用して、各Ｔ細胞内の対合ＴＣＲ鎖を決定することができる。様々なシークエンシング方法としては、限定されるものではないが、サンガーシークエンシング、ハイスループットシークエンシング、合成によるシークエンシング、単一分子シークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）、デジタル遺伝子発現、Ｃｌｏｎａｌ Ｓｉｎｇｌｅ ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ、ショットガンシークエンシング、マクサム・ギルバートシークエンシング、または超並列シークエンシングが挙げられる。Ｔ細胞は、単一細胞ＲＮＡ－Ｓｅｑ法（例えば、ｉｎＤｒｏｐやＤｒｏｐＳｅｑ）のインプットとして使用することができる。簡潔に説明すると、各細胞を液滴またはマイクロウェルにカプセル化する。各細胞にユニークなポリヌクレオチドバーコード（例えば、逆転写プライマーまたはテンプレートスイッチオリゴヌクレオチドに存在）を同じ細胞からの多くのｍＲＮＡ分子に導入する。各細胞の転写プロファイルならびにアルファ鎖及びベータ鎖のＴＣＲ配列は、同じポリヌクレオチドバーコードを共有するため、得ることができる。そのため、ＴＣＲのアルファ鎖及びベータ鎖の配列は、インフォマティクス的にリンクしている。典型的な実験では、１，０００～５，０００のインフォマティクス的に対合したＴＣＲ配列を得ることができる。各対合ＴＣＲ配列からは、ＴＲＡＶ遺伝子識別情報、ＣＤＲ３－アルファ配列、ＴＲＡＪ遺伝子識別情報、ＴＲＢＶ遺伝子識別情報、ＣＤＲ３－ベータ配列、及びＴＲＢＪ遺伝子識別情報が、ＭｉＸＣＲなどの公的に入手可能なソフトウェアパッケージを用いて抽出することができる。この情報は、１，０００～５，０００のＴＣＲを全てコードする対合ＣＤＲ３Ｊオリゴヌクレオチド（オリゴ）のプールを設計するために使用することができる。これらの対合ＣＤＲ３Ｊオリゴは、米国仮特許出願第６２／８２９，８１３号、第６２／８３８，４６５号、及び第６２／８９８，０５３号、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２６５５８号に記載のＴＣＲ遺伝子アセンブリ法を用いて対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドのプールを合成するために使用でき、これらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。この対合ＴＣＲコードポリヌクレオチドのプールは、ギブソンアセンブリまたはゴールデンゲートアセンブリなどの方法を用いてレンチウイルスベクターのプールに変換することができ、この場合、完全長ＴＣＲベータ鎖及び完全長ＴＣＲアルファ鎖はＰ２Ａ自己切断ペプチドを介して結合し、ＴＣＲはヒトＥＦ１Ａプロモーターによって駆動される。
代替的に、ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖をインフォマティクス的に対合し、対合ＴＣＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する代わりに、各単一Ｔ細胞における個々の区画内でＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖を結合してもよい。例えば、複数のＴ細胞の各Ｔ細胞を液滴またはヒドロゲル粒子などの個々の区画内に封じ込め、各ＴＣＲ鎖のｍＲＮＡを逆転写し増幅することができる。次に、ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖の増幅産物は、ライゲーションやオーバーラップＰＣＲなどの方法によって物理的に結合することができる。ＴＣＲ鎖を物理的に結合する方法は、２０１８年８月１３日出願の米国仮特許出願第６２／７１８，２２７号、２０１８年８月３１日出願の米国仮特許出願第６２／７２５，８４２号、２０１８年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／７３２，８９８号、２０１９年３月１４日出願の米国仮特許出願第６２／８１８，３５５号、及び２０１９年３月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８２３，８３１号、及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４６１７０号に記載されており、これらの各出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
レンチウイルスベクターは、Ｊｕｒｋａｔ７６ベースのレポーター細胞株（Ｒｏｓｓｋｏｐｆ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７）（ＴＣＲシグナル伝達によって蛍光タンパク質が発現する）を形質導入するために使用することができる。形質導入は、形質導入したレポーター細胞の大部分が１つのみのＴＣＲを発現するように、低い感染多重度（ＭＯＩ）で実施することができる。ＴＣＲ発現レポーター細胞は、ＴＣＲ操作レポーター細胞とみなすことができる。これらの細胞は、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞とみなすこともできる。これらの細胞のアリコートの全ＤＮＡまたはＲＮＡを単離し、これらの細胞の外来性ＴＣＲ座位を増幅し、ＮＧＳに供して、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における各ＴＣＲの頻度または相対的存在量を測定することができる。
切除した腫瘍組織の別の部分は、全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）用のゲノムＤＮＡ及び全トランスクリプトームシークエンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）用のゲノムＲＮＡを調製するために使用することができる。
ＡＰＣを生成するには、２つの選択肢が考えられ得る。自己由来ＡＰＣは、自己由来Ｂ細胞をＢ－リンパ芽球様細胞（Ｂ－ＬＣＬ）に変換するか、または自己由来単球を単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）に分化させることにより、得ることができる。代替的に、人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）を使用してもよい。これを行うために、ＷＥＳ及びトランスクリプトームシークエンシングデータから、患者のクラスＩ ＭＨＣ遺伝子の遺伝子型を得ることができる。このようなＭＨＣ遺伝子をコードする全ての遺伝子は合成することができ、これらの遺伝子をコードするｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写、酵素的キャッピング、酵素的ポリアデニル化によって得ることができる。得られたｍＲＮＡは、内因性ＭＨＣが発現しないａＡＰＣ細胞株（例えば、Ｋ５６２細胞株）にエレクトロポレーションすることができる。Ｋ５６２細胞株は、共刺激分子を発現するように操作することができる（Ｂｕｔｌｅｒ ａｎｄ Ｈｉｒａｎｏ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１４）。
ミニジーンのプール、タンデムミニジーン、またはタンデムミニジーンのプール（各ミニジーンは、腫瘍試料のＷＥＳ及びＲＮＡ－Ｓｅｑで発見された１３位に変異残基を有する２５－ｍｅｒの変異ペプチドをコードする）を、プラスミド形態（Ｐａｓｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１６）またはｍＲＮＡ形態（Ｋｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；Ｓａｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０１７；Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１８）で調製し、ＡＰＣに形質移入またはエレクトロポレーションすることができる。ＡＰＣは、上記のＴＣＲ操作レポーター細胞と共培養することができる。１２～２４時間後、蛍光タンパク質の発現レベルが上方調節されたレポーター細胞をＦＡＣＳによって単離することができる。この選択は、意図された選択とみなすことができる。これらの単離された細胞は、第１の複数の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞とみなすことができる。
別のミニジーンのプール、タンデムミニジーンのプールのタンデムミニジーン（各ミニジーンは、上記の変異ペプチドの２５－ｍｅｒ野生型対応物をコードする）も同様に調製し、ＡＰＣに形質移入またはエレクトロポレーションすることができる。ＡＰＣは、上記のＴＣＲ操作レポーター細胞と共培養することができる。１２～２４時間後、蛍光タンパク質の発現レベルが上方調節されたレポーター細胞をＦＡＣＳによって単離することができる。この選択は、ネガティブ対照選択とみなすことができる。これらの単離された細胞は、第２の複数の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞とみなすことができる。
第１及び第２の複数の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞のアリコートの全ＤＮＡまたはＲＮＡを別々に単離し、これらの細胞の外来性ＴＣＲ座位を増幅し、ＮＧＳに供して、第１及び第２の複数の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における各ＴＣＲの頻度または相対的存在量を測定することができる。
ＮＧＳデータから、第１の複数の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における頻度または相対的存在量が、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞及び第２の複数の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の頻度または相対的存在量より有意に高いＴＣＲを、確立した統計分析を用いて同定することができる。これらのＴＣＲは、推定上のネオ抗原反応性ＴＣＲとみなすことができる。図３は、ＴＣＲ同定プロセスのワークフローを示す。図３のＴＣＲ頻度分析は、第１の抗原に接触した後の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における第１のＴＣＲの頻度を、第２の抗原に接触した後の選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における第２のＴＣＲの頻度と比較することを含む。
実施例２：ＴＩＬからの腫瘍反応性ＴＣＲのハイスループット同定
腫瘍試料からＴ細胞（例えば、生Ｔ細胞）を単離する方法、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖の配列をインフォマティクス的に結合する方法、対合ＴＣＲエンコードポリヌクレオチドのプールを得る方法、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞を得る方法、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞の各ＴＣＲの頻度または相対的存在量を得る方法は、実施例１に記載のものと同じであり得る。
自己由来腫瘍スフェロイドを抗原提示細胞として使用することができる。外科的に取り出した腫瘍から、確立された方法を用いて腫瘍スフェロイドを得ることができる（Ｓａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１７）。選択前ＴＣＲ操作レポーター細胞は、ＴＣＲ操作レポーター細胞及び腫瘍細胞の比率が１：１になるように腫瘍スフェロイドと共培養することができる。抗ＣＤ２８抗体を共培養物に加えてシグナル２を得ることができる。１２～２４時間の共培養後、実施例１と同様に、蛍光タンパク質のレベルが上昇したＴＣＲ操作レポーター細胞を単離することができる。また、選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における各ＴＣＲの頻度も、実施例１に記載のように得ることができる。選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における頻度または相対的存在量が、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における頻度または相対的存在量より有意に高いＴＣＲを、確立した統計解析を用いて同定することができる。これらのＴＣＲは、推定上の腫瘍反応性ＴＣＲとみなすことができる。図１及び図２は、ＴＣＲ同定プロセスのワークフロー例を示す。図２のＴＣＲ頻度分析は、選択前ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における第１のＴＣＲの頻度を、選択後ＴＣＲプログラムレシピエント細胞における第２のＴＣＲの頻度と比較することを含む。
実施例３：合成ＴＣＲライブラリーからのモデルＴＣＲの濃縮
本明細書に記載のハイスループットスクリーニングアッセイの実現可能性、感度、及び／または特異性を評価するため、約１０００の完全長の発現可能なＴＣＲのライブラリーを合成した。このライブラリー内で、４つのＴＣＲは既知の標的を有する十分に研究されたＴＣＲ（モデルＴＣＲとも称される）であり、残りは主に反応性が不明の腫瘍試料からのＴＣＲである。４つのモデルＴＣＲは以下の通り。
（１）ＤＭＦ４（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１制限ＭＡＲＴ－１エピトープに反応）
（２）ＤＭＦ５（ＤＭＦ４と同じＨＬＡ－Ａ＊０２：０１制限ＭＡＲＴ－１エピトープに反応するが、より高い親和性を有することが報告されている）
（３）Ｃ４（ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１制限ＷＴ－１エピトープに反応）
（４）Ｃ４－ＤＬＴ（Ｃ４と同じＨＬＡ－Ａ＊０２：０１制限ＷＴ－１エピトープに反応するが、より高い親和性を有することが報告されている）
全ての合成ＴＣＲがマウス定常領域を有していた。このＴＣＲライブラリーをレンチウイルスベクターにクローニングし、ＥＦ－１アルファプロモーターによって駆動した。レンチウイルスベクターの骨格には、別のプロモーターによって駆動するＹＦＰ発現カセットも含まれていた。このベクターライブラリーを用いてレンチウイルス粒子混合物を調製し、機能的感染多重度（ＭＯＩ）約０．１でドナーからの末梢Ｔ細胞に感染させるために使用した。言い換えれば、感染後、約１０％のＴ細胞がＹＦＰ陽性となるようにレンチウイルス粒子を滴定した。この低いＭＯＩは、複数の外来性ＴＣＲがゲノム内に機能的に組み込まれているＴ細胞が出現するのを低減するために使用した。細胞表面上のマウスＴＣＲ定常ドメインを染色したところ、ＴＣＲが１つのゲノム座位のみから転写されているにもかかわらず、ほとんどのＹＦＰ陽性細胞でマウス化ＴＣＲが容易に検出可能であった。ＹＦＰ陽性ＣＤ８＋細胞をＦＡＣＳ選別し、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを用いて短時間増殖させた。これらの操作されたＴ細胞を、ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞、または選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞と称する。この実施例では、実験データにより、選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞の１％未満がＣＤ１３７陽性であることが確認された。
次に、２つのバージョンの抗原提示細胞を調製した。第１のバージョンでは、Ｋ５６２細胞に、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１をコードするｍＲＮＡと、上記のＭＡＲＴ－１エピトープ及びＷＴ－１エピトープをコードするｍＲＮＡとをエレクトロポレーションした。第２のバージョンでは、Ｋ５６２細胞に、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１をコードするｍＲＮＡと、無関係な抗原（または対照抗原）をコードするｍＲＮＡとをエレクトロポレーションした。次に、２つの共培養物をセットアップした。第１の共培養物は、「リアル」共培養物と呼ばれ、ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞及び第１のバージョンの抗原提示細胞が含まれた。例えば、「リアル」共培養物は、ＴＣＲが同定されるべきである標的抗原（例えば、ＴＳＡまたはＴＡＡ）を含み得る。第２の共培養物は「模擬」共培養物と呼ばれ、ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞と第２のバージョンの抗原提示細胞が含まれた。１日共培養した後、ＣＤ１３７陽性Ｔ細胞を他の細胞から選別した。リアル及び模擬の共培養物から選別したこれらの細胞は、それぞれ、リアル選別後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞及び模擬選別後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞と称する。
選択前、リアル選択後、模擬選択後のポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞における各ＴＣＲの頻度をＮＧＳによって調べた。これを行うため、選別した細胞から全ＲＮＡを単離し、マウスＴＲＢＣドメインを標的とする遺伝子特異的ＲＴプライマーを用いて逆転写（ＲＴ）に供した。次に、ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）を含む第２鎖合成（ＳＳＳ）プライマーを加えた。ＳＳＳプライマーは、５’ドメインと、ＵＭＩとして機能する８ｎｔのランダム配列と、合成ＴＣＲの５’ＵＴＲを標的とする３’遺伝子特異的ドメインとを有する。好熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｑ５）の存在下で、変性、アニーリング、及び伸長のサーモサイクルを１回行って、第２鎖の合成を完了した。次に、ＳＳＳの５’ドメイン及びマウスＴＲＢＣドメイン上のネスト領域（すなわち、ＲＴプライマーからのネストした領域）を標的とする一対のプライマーを使用して、合成ＴＣＲベータ鎖ｃＤＮＡを増幅した。これらのｃＤＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳシステム（例えば、ＭｉＳｅｑ、ＭｉｎｉＳｅｑ、ＨｉＳｅｑ、またはＮｅｘｔＳｅｑ）でシークエンシングして、各ｃＤＮＡ分子上のＣＤＲ３ベータ配列を得た。同じＵＭＩ及び同じＣＤＲ３ベータを共有するリード数は、デジタル的に折りたたみ、１つのオリジナルｃＤＮＡ分子としてカウントした。リード数が１０未満のオリジナルｃＤＮＡ分子は省略した。ＴＣＲの頻度は、このＴＣＲをコードするオリジナルｃＤＮＡ分子の数を、１つの試料で観察される全てのオリジナルｃＤＮＡ分子の数で割ったものとして定義することができる。
図４はリアル選択後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞及び選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞における各ＴＣＲの頻度を示し、「リアル」共培養及び選別後に各ＴＣＲが濃縮されたことを示している。各頻度値に小さな数値（１ｅ－６）を加えて、頻度０を表す点をこのプロット上で対数スケールで示すことができるようにした。各頻度値に０～１ｅ－６の範囲の乱数を加えて、Ｘ軸及びＹ軸で同じ頻度値を有する異なるＴＣＲを表す点が完全に重ならないようにした。４つ全てのモデルＴＣＲが、リアル選択後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞の場合に、選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞より約１０倍高い頻度を示していることが分かる。これに対し、他のほとんどのＴＣＲは、リアル選別後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞では検出されないか、またはリアル選別前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞における頻度の１０倍未満であった（例えば、１０倍未満の濃縮を示している）。一方、「模擬」共培養後では、ＤＭＦ４以外のこれらのモデルＴＣＲは濃縮を示さなかった（図５）。図５は、模擬選択ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞（Ｙ軸）及び選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞（Ｘ軸）における各ＴＣＲの頻度を示す。図４と同様に、各頻度に小さな数値（１ｅ－６）及びノイズを加えた。発明者らの以前の実験でＤＭＦ４がかなりの非特異的結合を示したことは、ＤＭＦ４を用いて操作したＴ細胞が、ＭＡＲＴ１抗原を伴わずにＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ ｍＲＮＡを形質移入したＫ５６２細胞と共培養した後にＣＤ１３７の上方調節を示すという点において、注目に値する。そのため、この実施例では、「模擬」共培養及び選別において、ＤＭＦ４の望ましくない濃縮が観察された。
図６は、「リアル」共培養及び「模擬」共培養におけるＴＣＲの濃縮係数を示す。「リアル」共培養における濃縮係数は、リアル選択後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲの頻度を選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞における頻度で割ったものとして定義することができる。「模擬」共培養における濃縮係数は、模擬選択後ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞におけるＴＣＲの頻度を選択前ポリクローナルＴＣＲ－Ｔ細胞における頻度で割ったものとして定義することができる。全ての頻度値に小さな数値（１ｅ－６）及び０～１ｅ－６の乱数を加えて見やすくした。図４及び図５と一致して、モデルＴＣＲであるＣ４、Ｃ４－ＤＬＴ、及びＤＭＦ５は、「リアル」共培養で濃縮を示し、ＤＭＦ４は、「リアル」共培養及び「模擬」共培養の両方で濃縮を示した。これらのデータは、機能的な抗原特異的ＴＣＲが、本明細書に記載の頻度に基づくスクリーニング法を用いて同定できることを示すものである。
本発明の様々な実施形態が本明細書で示され説明されてきたが、当業者にはこのような実施形態が単に例として提供されていることが明らかであろう。本発明が、本明細書内に示された具体的な実施例によって限定されることを意図するものではない。本発明を前述の明細書を参照しながら説明したが、本明細書内の実施形態の説明及び例示が限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。当業者には、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変化、及び置換えが想到されよう。さらに、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する本明細書に記載の特定の記述、構成、または相対的な割合に限定されないことを理解されたい。本発明を実施する際には、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替物が用いられ得ることを理解されたい。そのため、本発明は、このような代替物、変更、変形形態、または等価物も網羅することが企図されている。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、それにより、これらの請求項の範囲内の方法及び構造ならびにその等価物が網羅されることが意図されている。

Claims (54)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、
    （ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備することであって、前記複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、前記複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲの同族対を発現する、前記準備することと、
    （ｂ）各Ｔ細胞の前記１つのＴＣＲの前記同族対の第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドと第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドとを対合し、それにより、複数のポリヌクレオチド対を生成することと、
    （ｃ）前記複数のポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを複数のレシピエント細胞に送達することであって、各レシピエント細胞が、前記複数のポリヌクレオチド対のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを含む、前記送達することと、
    （ｄ）前記複数のポリヌクレオチド対を前記複数のレシピエント細胞で発現させることと、
    （ｅ）前記複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記複数のレシピエント細胞における前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、
    （ｆ）前記複数のレシピエント細胞を１つ以上の抗原に接触させ、それにより、前記複数のレシピエント細胞のサブセットでマーカーを活性化することと、
    （ｇ）前記複数のレシピエント細胞の前記サブセットを前記マーカーに基づいて単離することと、
    （ｈ）前記複数のレシピエント細胞の前記サブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記複数のレシピエント細胞の前記サブセットにおける前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、
    （ｉ）前記複数のレシピエント細胞の前記サブセットにおける頻度が前記複数のレシピエント細胞における頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、前記方法。
  2. 前記複数のレシピエント細胞の前記サブセットにおける前記ＴＣＲの前記頻度が、前記複数のレシピエント細胞における前記ＴＣＲの前記頻度より少なくとも１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上高い、請求項１に記載の方法。
  3. 前記マーカーがＴ細胞活性化マーカーである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記マーカーがレポータータンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記レポータータンパク質が蛍光タンパク質である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記マーカーが、細胞表面タンパク質、細胞内タンパク質、または分泌タンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記マーカーが、細胞内タンパク質または分泌タンパク質であり、前記方法が、単離することの前に、前記複数のレシピエント細胞を固定する及び／または透過処理することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記複数のレシピエント細胞をゴルジブロッカーに接触させることをさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記分泌タンパク質がサイトカインである、請求項３に記載の方法。
  10. 前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、パーフォリン、またはこれらの組合せである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記細胞表面タンパク質が、ＣＤ３９、ＣＤ６９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ、ＣＤ１３７、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＧＩＴＲ、ＦｏｘＰ３、またはこれらの組合せである、請求項３に記載の方法。
  12. 前記１つ以上の抗原が、１つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ＭＨＣテトラマー、ナノ粒子、またはこれらの任意の組合せ上に示される、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記１つ以上のＡＰＣが、対象から単離された１つ以上の細胞であるか、またはそれに由来する、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記１つ以上のＡＰＣが、１つ以上の人工ＡＰＣ（ａＡＰＣ）である、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記１つ以上のＡＰＣが、前記１つ以上のＡＰＣに外来性であるＭＨＣ分子を発現する、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記１つ以上のＡＰＣが、１つ以上のがん細胞、腫瘍様塊（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）、がんオルガノイド（ｔｕｍｏｒｏｉｄ）、またはこれらの誘導体である、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記１つ以上のＡＰＣが、抗原コードＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡベクターである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ｍＲＮＡベクターが自己増幅ｍＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記１つ以上のＡＰＣが、前記１つ以上の抗原でパルスされる、請求項１２に記載の方法。
  21. 前記１つ以上の抗原が、１つ以上の腫瘍抗原に由来する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記１つ以上の腫瘍抗原が、１つ以上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）である、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記１つ以上の抗原が、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＷＴ－１、ＳＳＸ、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＰＲＡＭＥ、サバイビン、Ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ－Ａ／Ｍａｒｔ－１、チロシナーゼ、ＰＳＡ、ＣＥＡ、マンマグロビン、ｐ５３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、プロテイナーゼ３、ムチン１、またはＭＡＧＥ－Ａ４を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記１つ以上の抗原が、遺伝子異常またはエピジェネティック異常を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記遺伝子異常が、点変異、融合、欠失、挿入、フレームシフト、イントロン封入、または選択的スプライシングを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記１つ以上の抗原が、健康な細胞に比べてがん細胞で上方調節される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記複数のレシピエント細胞の前記ＴＣＲレパートリーまたは前記複数のレシピエント細胞の前記サブセットの前記ＴＣＲレパートリーから、（ｉ）で同定される前記ＴＣＲを選択することをさらに含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. （ｉ）で同定される前記ＴＣＲを選択することが、前記ＴＣＲを増幅することを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. （ｃ）における前記ポリヌクレオチドがバーコードを含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、
    （ａ）複数のＴＣＲを発現する複数のＴ細胞を準備することであって、前記複数のＴ細胞の各Ｔ細胞が、前記複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲの同族対を発現する、前記準備することと、
    （ｂ）各Ｔ細胞の前記１つのＴＣＲの前記同族対の第１のＴＣＲ鎖をコードする第１のポリヌクレオチドと第２のＴＣＲ鎖をコードする第２のポリヌクレオチドとを対合し、それにより、複数のポリヌクレオチド対を生成することと、
    （ｃ）前記複数のポリヌクレオチド対を含むポリヌクレオチドを、第１の複数のレシピエント細胞及び第２の複数のレシピエント細胞に送達することであって、前記第１の複数のレシピエント細胞または前記第２の複数のレシピエント細胞の各レシピエント細胞が、前記複数のポリヌクレオチド対のうちの少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、前記送達することと、
    （ｄ）前記複数のポリヌクレオチド対を、前記第１の複数のレシピエント細胞及び前記第２の複数のレシピエント細胞で発現させることと、
    （ｅ）前記第１の複数のレシピエント細胞を第１の抗原に接触させ、それにより、前記第１の複数のレシピエント細胞の第１のサブセットの第１のマーカーを活性化し、前記第２の複数のレシピエント細胞を第２の抗原に接触させ、それにより、前記第２の複数のレシピエント細胞の第２のサブセットの第２のマーカーを活性化することと、
    （ｆ）前記第１のサブセットを前記第１のマーカーに基づいて単離し、前記第２のサブセットを前記第２のマーカーに基づいて単離することと、
    （ｇ）前記第１の複数のレシピエント細胞の前記第１のサブセットのＴＣＲレパートリー及び前記第２の複数のレシピエント細胞の前記第２のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記第１の複数のレシピエント細胞の前記第１のサブセットにおける前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度及び前記第２の複数のレシピエント細胞の前記第２のサブセットにおける前記ＴＣＲレパートリーの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、
    （ｈ）前記第１の複数のレシピエント細胞の前記第１のサブセットにおける頻度が前記第２の複数のレシピエント細胞の前記第２のサブセットにおける頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、前記方法。
  31. 前記第１の複数のレシピエント細胞の前記第１のサブセットにおける前記ＴＣＲの前記頻度が、前記第２の複数のレシピエント細胞の前記第２のサブセットにおける前記ＴＣＲの前記頻度より少なくとも１．５倍、１．８倍、２．０倍、２．５倍、３．０倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、またはそれ以上高い、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記第１のマーカー及び前記第２のマーカーが同じである、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記第１のマーカー及び前記第２のマーカーが異なる、請求項３０または３１に記載の方法。
  34. 前記第２の抗原が、前記第１の抗原に相同ではない、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記第１の抗原及び前記第２の抗原が、同じタンパク質に由来する、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. 前記第１の抗原が変異配列を含み、前記第２の抗原が野生型配列を含む、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記第１の抗原ががん細胞に由来し、前記第２の抗原が健康な細胞に由来する、請求項３０～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 接触させる前に、前記複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記複数のレシピエント細胞における前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することをさらに含む、請求項３０～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記第１の複数のレシピエント細胞のＴＣＲレパートリーまたは前記第１の複数のレシピエント細胞の前記第１のサブセットの前記ＴＣＲレパートリーから、（ｈ）で同定される前記ＴＣＲを選択することをさらに含む、請求項３０～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. （ｈ）で同定される前記ＴＣＲを選択することが、前記ＴＣＲを増幅することを含む、請求項３９に記載の方法。
  41. （ｃ）における前記ポリヌクレオチドがバーコードを含む、請求項３０～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記複数のＴ細胞が対象から単離される、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記複数のＴ細胞が腫瘍浸潤リンパ球である、請求項４２に記載の方法。
  44. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、
    （ａ）複数のＴＣＲを発現する複数の細胞を準備することであって、前記複数の細胞の各細胞が、前記複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲを発現し、前記複数のＴＣＲが、少なくとも５つの異なる同族対を含み、かつ複数のＶ遺伝子からのＶ領域を含み、前記複数のＴＣＲが、前記複数の細胞に外来性である、前記準備することと、
    （ｂ）前記複数の細胞のＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記複数の細胞における前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、
    （ｃ）前記複数の細胞を１つ以上の抗原に接触させ、それにより、前記複数の細胞のサブセットのマーカーを活性化することと、
    （ｄ）前記複数の細胞の前記サブセットを前記マーカーに基づいて単離することと、
    （ｅ）前記複数の細胞の前記サブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記複数の細胞の前記サブセットにおける前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、
    （ｆ）前記複数の細胞の前記サブセットにおける頻度が前記複数の細胞における頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、前記方法。
  45. 前記複数の細胞の前記ＴＣＲレパートリーまたは前記複数の細胞の前記サブセットの前記ＴＣＲレパートリーから、（ｆ）で同定される前記ＴＣＲを選択することをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
  46. （ｆ）で同定される前記ＴＣＲを選択することが、前記ＴＣＲを増幅することを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. （ａ）における前記複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲをコードする配列がバーコードを含む、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
  48. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同定するための方法であって、
    （ａ）複数のＴＣＲを発現する第１の複数の細胞及び前記複数のＴＣＲを発現する第２の複数の細胞を準備することであって、前記第１の複数の細胞または前記第２の複数の細胞の各細胞が、前記複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲを発現し、前記複数のＴＣＲが少なくとも５つの異なる同族対を含み、かつ複数のＶ遺伝子からのＶ領域を含み、前記複数のＴＣＲが、前記第１の複数の細胞または前記第２の複数の細胞に外来性である、前記準備することと、
    （ｂ）前記第１の複数の細胞を第１の抗原に接触させ、それにより、前記第１の複数の細胞の第１のサブセットの第１のマーカーを活性化し、前記第２の複数の細胞を第２の抗原に接触させ、それにより、前記第２の複数の細胞の第２のサブセットの第２のマーカーを活性化することと、
    （ｃ）前記第１のサブセットを前記第１のマーカーに基づいて単離し、前記第２のサブセットを前記第２のマーカーに基づいて単離することと、
    （ｄ）前記第１の複数の細胞の前記第１のサブセットのＴＣＲレパートリー及び前記第２の複数の細胞の前記第２のサブセットのＴＣＲレパートリーをシークエンシングし、前記第１の複数の細胞の前記第１のサブセットにおける前記ＴＣＲレパートリーのうちの１つのＴＣＲの頻度及び前記第２の複数の細胞の前記第２のサブセットにおける前記ＴＣＲレパートリーの１つのＴＣＲの頻度を決定することと、
    （ｅ）前記第１の複数の細胞の前記第１のサブセットにおける頻度が前記第２の複数の細胞の前記第２のサブセットにおける頻度より高いＴＣＲを同定することとを含む、前記方法。
  49. 前記第１の複数の細胞のＴＣＲレパートリーまたは前記第１の複数の細胞の前記第１のサブセットの前記ＴＣＲレパートリーから、（ｅ）で同定される前記ＴＣＲを選択することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
  50. （ｅ）で同定される前記ＴＣＲを選択することが、前記ＴＣＲを増幅することを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. （ａ）における前記複数のＴＣＲのうちの１つのＴＣＲをコードする配列がバーコードを含む、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
  52. 前記頻度が、１つのＴＣＲのシークエンシングリード数を前記ＴＣＲレパートリーの総シークエンシングリード数で割ったものによって決定される、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
  53. 前記同定されたＴＣＲが標的反応性ＴＣＲである、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法によって同定されたＴＣＲまたはＴＣＲを発現する細胞を含む、医薬組成物。
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