CN117771392A - 一种gpr65激动剂和aav病毒在用于制备治疗脑缺血性疾病的药物组合上的用途及药物组合 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种促进脑缺血后神经功能恢复的新方法，具体而言，涉及一种GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗脑缺血性疾病的药物组合上的用途及药物组合。GPR65激动剂和AAV病毒联合使用能够进一步延长脑缺血性疾病的治疗时间窗。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进脑缺血后神经功能恢复的新方法，具体而言，涉及一种GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗脑缺血性疾病的药物组合上的用途及药物组合。
背景技术
缺血性脑卒中是世界上致死率和致残率最高的疾病之一，由于脑血管堵塞导致供血不足，从而导致正常的神经功能不可逆损害和脑组织永久性梗死。除了组织型纤溶酶原激活剂(tPA)被FDA批准在临床使用，没有其他被FDA批准的新药被应用，然而，由于tPA的治疗时间窗窄以及出血转化的风险高，只有<5％的患者能够接受tPA的治疗。研究表明，缺血性卒中正在转变为一种慢性疾病，而卒中后的康复治疗能够增强神经功能的恢复，这可能与突触发生、轴突再生、树突生长等内源性神经修复密切相关，这提高了增强神经可塑性可能促进脑缺血恢复的可能性。然而，目前的康复治疗手段以康复训练为主，且患者神经功能的恢复往往并不完全且恢复周期长达数月甚至一年以上，除此之外尚缺乏其他更安全有效的治疗药物和干预手段。因此，寻找脑卒中后能够促进神经功能恢复和具有较宽治疗时间窗的康复治疗药物是非常迫切的。
BTB09089是G蛋白偶联受体65(G protein-coupled receptor 65，GPR65)的特异性激动剂，该受体又称为T细胞死亡相关基因8(TDAG8)，是一种质子敏感性受体，在脑组织内广泛表达，活化的GPR65广泛参与神经炎症、细胞免疫、细胞凋亡等生物学过程。研究发现在小鼠大脑中动脉阻塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R)前6h侧脑室注射BTB09089能够减少24h和72h的脑梗死体积和减轻神经功能损伤，并且在小鼠MCAO/R前24h敲除GPR65能够增加24h和72h的脑梗死体积和加重神经功能，其作用机制与Akt信号通路有关。此外，在MCAO/R后24h，GPR65-/-小鼠的脑梗死体积显著增加，该作用可能与抑制小胶质细胞活性有关。这两项研究表明GPR65是脑缺血急性期潜在的神经保护靶点，同时也说明预防性给予BTB09089在脑缺血急性期发挥神经保护作用。但是该化合物是否能够在脑缺血亚急性期促进神经功能恢复的作用尚不清楚。课题组前期研究表明在脑缺血亚急性期，延迟性慢性酸后处理(delayed chronic acidicpostconditioning，DCAPC)能够通过GPR65增强梗死周边区的轴突再生和突触重建，抑制胶质疤痕形成和小胶质细胞的活化，进而促进神经功能恢复。同时，敲除GPR65基因，可抑制DCAPC对脑缺血后脑组织修复及神经功能恢复的促进作用；而利用含有GPR65基因的腺相关病毒载体AAV-GPR65恢复GPR65-/-小鼠脑梗死周边区GPR65的表达，又能恢复DCAPC的治疗作用，这表明GPR65激活在DCAPC发挥神经修复的过程是必需的，但是这并不能说明单纯激活GPR65就足以促进神经修复进而改善神经功能，而BTB09089是目前科研应用的唯一一种可以激动GPR65受体的工具药物，因此本研究利用小鼠光化学法诱导的大脑皮质终末动脉阻塞模型(photothrombotic ischemia，PTI)，采用腹腔注射的给药方式观察BTB09089延迟性处理(起始给药时间为PTI 3、7或14天后)对神经功能恢复的作用，旨在为缺血性脑损伤患者的康复治疗寻求新的药物和解决方案。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗脑缺血性疾病的药物组合上的用途及药物组合，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，
本发明的第一方面，提供一种GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗脑缺血性疾病的药物组合上的用途。
于本发明的一实施例中，所述GPR65激动剂的结构如下：
于本发明的一实施例中，所述AAV病毒为过表达GPR65于神经元的AAV病毒。
于本发明的一实施例中，所述AAV病毒为AAV-Syn-GPR65病毒。AAV病毒的名字为HBAAV2/9-Syn-m-GPR65-3xflag-ZsGreen，简写AAV-Syn-GPR65。
于本发明的一实施例中，GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗脑卒中后神经功能恢复的药物组合上的用途。
于本发明的一实施例中，GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备延长脑卒中治疗时间窗的药物组合上的用途。
于本发明的一实施例中，GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备协同延长脑卒中治疗时间窗的药物组合上的用途。
本发明的第二方面，提供一种药物组合，包括：
GPR65激动剂；和AAV病毒。
于本发明的一实施例中，所述GPR65激动剂的结构如下：
于本发明的一实施例中，所述AAV病毒为过表达GPR65于神经元的AAV病毒。于本发明的一实施例中，所述AAV病毒为AAV-Syn-GPR65病毒。
在单细胞数据库scRNASeqDB中检索发现，GPR65在皮层神经元存在表达。为了进一步延长BTB09089治疗时间窗，为此，我们构建了以synapsin为启动子的含有GPR65基因的腺相关病毒载体(AAV-Syn-GPR65)，该载体仅在神经元内特异性表达GPR65。通过大脑皮质注射AAV-Syn-GPR65至GPR65-/-小鼠脑梗死周边区，观察BTB09089对GPR65敲除小鼠过表达脑神经元GPR65后神经修复的作用。此外，本研究利用AAV-Syn-GPR65在野生型小鼠的脑梗死周边区神经元上过表达GPR65，观察BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用能否延长BTB09089对野生型小鼠的治疗时间窗，旨在为慢性脑缺血患者的临床防治探索新的治疗方式。
附图说明
图1为BTB09089治疗浓度的探索实验的实验流程图。
图2为BTB09089治疗浓度的探索实验的足误率折线图。###P<0.001vs PTI组。结果以平均值±标准误表示。
图3为BTB09089治疗浓度的探索实验的不对称评分折线图。###P<0.001vs PTI组。结果以平均值±标准误表示。
图4为BTB09089治疗时间窗的探索实验的实验流程图。
图5为BTB09089治疗时间窗的探索实验的足误率折线图。###P<0.001vs PTI组。结果以平均值±标准误表示。
图6为BTB09089治疗时间窗的探索实验的不对称评分折线图。#P<0.05vs PTI组，##P<0.01vs PTI组，###P<0.001vs PTI组。结果以平均值±标准误表示。
图7为BTB09089激活GPR65受体对神经功能恢复的作用的实验流程图。
图8为BTB09089激活GPR65受体对神经功能恢复作用的足误率。###P<0.001vs PTI组；$$P<0.01vs BTB09089组，$$$P<0.001vs BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图9为BTB09089激活GPR65受体对神经功能恢复作用的不对称评分。###P<0.001vsPTI组；$P<0.05vs BTB09089组，$$$P<0.001vs BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图10为BTB09089延迟性处理激活神经元GPR65受体促进GPR65-/-阳性病毒小鼠PTI后运动功能的恢复的实验流程图。
图11为AAV-Syn-GPR65与NeuN、GFAP、Iba-1共定位情况。
图12为AAV-Syn-GPR65的标签蛋白flag的表达情况。
图13为阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠的足误率折线图。#P<0.05vs PTI组，###P<0.001vs PTI组；$$P<0.01vs BTB09089组，$$$P<0.001vs BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图14为阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠的不对称评分折线图。#P<0.05vs PTI组；$P<0.05vs BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图15是阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠和WT小鼠在21天时网格恢复率的比较。**P<0.01vs WT-Ⅲ-BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图16是阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠和WT小鼠在21天时圆筒恢复率的比较。*P<0.05vs WT-Ⅲ-BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图17为BTB09089和神经元病毒联合使用能够延长BTB09089的治疗时间窗的实验流程图。
图18为BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用延长治疗时间窗实验探索的足误率折线图。##P<0.01vs PTI组，###P<0.001vs PTI组；$$P<0.01vs BTB09089组，$$$P<0.001vsBTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
图19为BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用延长治疗时间窗实验探索的不对称评分折线图。#P<0.05vs PTI组；$P<0.05vs BTB09089组。结果以平均值±标准误表示。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
GPR65激动剂和AAV病毒协同治疗脑缺血性疾病的探索实验
1.BTB09089母液的配制
称取7.746mg的BTB09089粉末，加入1mL的DMSO溶解，配成浓度为20mM的BTB09089母液，充分震荡混匀，-20℃分装保存，动物给药前用6％β-环糊精溶液(生理盐水配制)稀释至目标浓度。
BTB09089的结构式如下：
2.建立PTI模型
C57BL/6雄性野生型(Wild type，WT)小鼠购自山西医科大学实验动物中心。以C57BL/6为基因背景的GPR65基因敲除(GPR65 knock out，GPR65-/-)小鼠购自北京百奥赛图医药科技股份有限公司，并在山西医科大学实验动物中心饲养繁殖。所有动物均遵照国家实验饲养和使用指南。选取8-10周龄雄性野生型小鼠进行PTI模型构建，即得WT-PTI小鼠；GPR65敲除小鼠进行PTI模型构建，即得GPR65-/--PTI小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)进行麻醉，之后用脑立体定位仪将小鼠固定；通过正中切口暴露头骨，用干棉花清洁组织并擦干；参考小鼠脑立体定位图谱，标记大脑右侧的运动感觉皮层为手术位置：以Bregma点为原点，向右1.5mm为圆心，直径为2mm的圆形区域。随后，小鼠腹腔注射玫瑰红试剂(100mg/kg)，并用锡纸覆盖小鼠身体等待5min，之后用冷光源(25000LUX)照射标记的手术位置20min。
3.运动功能的评价
3.1网格实验：PTI造模前2天，对小鼠进行行为学适应性训练：将小鼠放置在方形网格上(40cm×20cm×35cm，2cm×2cm)，使其可以在网格上自主、稳定地行走。正式测试时，将小鼠单独放在网格上，使其自由行走，此时记录小鼠左前肢行走50步之中的滑步次数(足误率＝滑步次数/50×100％)。行走过程中如果小鼠足下没有支撑而穿过网格或者仅腕部靠在网格边缘被认为滑步。
3.2圆筒实验：根据小鼠垂直贴壁向上探索的特性而设计，评判动物对某一侧肢体的依赖程度。将小鼠放在一个透明有机玻璃筒内(圆筒直径10cm，高15cm)，观察并记录每只小鼠20个身体直立运动，分析并计算小鼠肢体不对称评分(不对称评分＝(未损伤侧前肢-损伤侧前肢)/(未损伤侧前肢+损伤侧前肢+双侧))。
4.BTB09089治疗浓度的探索实验(BTB09089延迟性处理促进WT小鼠PTI后运动功能恢复)
将PTI小鼠，随机分为4组：I-PTI组、IA-BTB09089(0.19mg/kg)处理组、IB-BTB09089处理组(0.38mg/kg)和IC-BTB09089处理组(0.76mg/kg)各6只，其中BTB09089的三个剂量处理组于PTI造模后3天开始隔日腹腔注射BTB09089至21天，并在PTI后3、7、14、21天进行网格和圆筒实验评估小鼠运动功能恢复情况，确定最佳治疗浓度。
5.BTB09089治疗时间窗的探索实验(BTB09089延迟性处理可时程依赖地促进WT小鼠PTI后运动功能恢复)
将PTI小鼠，随机分组：II-PTI组，IIA-BTB09089处理组(3-35d)、IIB-BTB09089处理组(7-35d)、IIC-BTB09089(14-35d)、IID-BTB09089(3-21d)各6只，药物处理组于PTI后3、7、14天开始隔日腹腔注射BTB09089(0.76mg/kg)至35天，其中于PTI后3天开始给药的小鼠分为两组，一组给药至35天，另一组给药至21天，然后停药。所有组别的小鼠在PTI后3、7、14、21、28、35天进行网格和圆筒实验评估小鼠运动功能恢复情况，确定最大治疗时间窗。
6.BTB09089激活GPR65受体对神经功能恢复的作用(BTB09089延迟性处理激活GPR65受体促进WT小鼠PTI后运动功能的恢复)
利用WT和GPR65-/-小鼠，确定激活GPR65对神经修复的作用。将WT小鼠分为III-PTI组和III-BTB09089处理组，每组各6只，将GPR65-/-小鼠分为Ⅳ-PTI组和Ⅳ-BTB09089处理组，每组各6只，BTB09089处理组于PTI后3天开始隔日腹腔注射BTB09089(0.76mg/kg)至21天，并在PTI后3、7、14、21天进行网格和圆筒实验评估各组小鼠运动功能恢复情况，确定激活GPR65能否恢复小鼠的运动功能。
7.AAV载体注射
我们构建了以synapsin为启动子的含有GPR65基因的腺相关病毒载体(AAV-Syn-GPR65，全称为HBAAV2/9-Syn-m-GPR65-3xflag-ZsGreen，1.6×1012CFU/mL)和空载体病毒(AAV-Syn-Control，全称为HBAAV2/9-Syn-ZsGreen，1.4×1012CFU/mL)，使用前将AAV-Syn-GPR65稀释至1.4×1012CFU/mL。AAV病毒是汉恒生物公司构建的。
选取6周龄雄性小鼠进行实验。小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)进行麻醉，之后用脑立体定位仪将小鼠固定；通过正中切口暴露头骨，用干棉花清洁组织并擦干；参考小鼠脑立体定位图谱，在小鼠右脑，以Bregma点为原点，标记三个AAV载体注射位点：(2.5，0，-0.88)、(1.5，0.33，-1)、(1.5，-0.66，-1)，颅钻钻开注射位点颅骨，用微量注射泵将AAV载体注射进入脑实质，注射速度为0.1μL/min，每个位点注射1μL；注射结束后留针10min再将注射针移出。小鼠AAV载体注射2周后构建PTI模型，AAV分为AAV-Syn-GPR65阳性病毒组和AAV-Syn-Control阴性病毒组。
8.组织免疫荧光染色
小鼠AAV载体注射2周之后构建PTI模型，在PTI后3周进行灌流取脑，之后在4％多聚甲醛中固定，并在15％、30％蔗糖溶液中梯度脱水使脑组织完全沉底。用冰冻切片机将脑组织切成一系列20μm厚的冠状切片。脑切片用柠檬酸钠缓冲液(0.01M，pH 6.0)在80℃下修复30分钟，10％的Triton X-100破膜30分钟，10％驴血清在室温下封闭2小时，用一抗兔抗NeuN(1﹕200，Sigma，Abn78)、兔抗GFAP(1：2000，Abcam，Ab278054)或者羊抗Iba-1(1:400，Novus Biologicals，NB100-1028)在4℃下孵育过夜。随后，将切片与相应的二抗驴抗兔IgGAlexa Fluor 594(1:400，Yeasen，34212ES60)或者驴抗羊IgGAlexa Fluor 594(1:400，Yeasen，34312ES60)在室温下孵育2小时。最后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液，室温孵育10分钟，用抗荧光衰减封片剂封片。利用徕卡荧光显微镜拍摄梗死周边区的荧光信号，观察AAV-Syn-GPR65病毒的ZsGreen绿色荧光信号与NeuN、GFAP、Iba-1的红色荧光信号的共定位情况。
9.免疫印迹(Westernblot)
小鼠AAV载体注射3周后取材，将小鼠颈椎脱臼处死，迅速断头取脑，分离注射AAV区域的皮层组织。将组织放入含有蛋白酶、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液中进行裂解。将等量蛋白质用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。将PVDF膜用5％脱脂牛奶在室温下孵育2小时，之后将PVDF膜置于一抗小鼠抗flag(1:500，Cell Signaling，8146)或者兔抗GAPDH(1:6000，Bioworld，Ap0063)，并在4℃下孵育过夜。随后用山羊抗小鼠(1:5000，Boster，Ba1050)或者山羊抗兔(1:5000，Boster，Ba1054)辣根过氧化物酶(HRP)二抗在室温下孵育2小时。
在Bio-Rad成像系统上使用ECL超敏化学发光试剂盒对flag或者GAPDH免疫印迹图像进行可视化。
10.BTB09089延迟性处理激活神经元GPR65受体促进GPR65-/-阳性病毒小鼠PTI后运动功能的恢复
利用阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠，确定BTB09089激活神经元GPR65对神经修复的作用。
将GPR65-/-小鼠分为阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)，阴性病毒组进一步分为V-PTI组和V-BTB09089处理组各6只，阳性病毒组小鼠进一步分为VI-PTI组和VI-BTB09089处理组各6只。BTB09089处理组于PTI后3天开始隔日腹腔注射BTB09089(0.76mg/kg)至21天，并在PTI后3、7、14、21天进行网格和圆筒实验评估各组小鼠运动功能恢复情况，确定激活神经元GPR65能否恢复小鼠的运动功能。
11.BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用延长治疗时间窗实验探索
将WT小鼠分为阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)。阴性病毒组(AAV-Syn-Control)小鼠进一步分为VII-PTI组和VII-BTB09089处理组各6只，阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)小鼠进一步分为IX-PTI组和IX-BTB09089处理组各6只。在BTB09089最大治疗时间窗(延长至7天)基础上进一步延迟7天开始隔日腹腔注射BTB09089(0.76mg/kg)至42天，并在PTI后3、7、14、21、28、35、42天进行网格和圆筒实验评估小鼠运动功能恢复情况，以确定在神经元过表达GPR65能否扩大BTB09089治疗时间窗。
结果
1.BTB09089延迟性处理促进WT小鼠PTI后运动功能恢复(BTB09089治疗浓度的探索实验)
为了探究BTB09089后处理的最佳治疗浓度，实验流程按照图1进行。通过网格和圆筒实验观察不同浓度的BTB09089延迟性处理(即PTI后3天开始给药)对PTI后3、7、14、21天小鼠运动功能的影响。
图2为BTB09089治疗浓度的探索实验的足误率折线图。从图2中可知，与I-PTI组相比，0.76mg/kg的IC-BTB09089处理组可显著降低小鼠左前肢PTI后7、14、21天的足误率；而0.38mg/kg的IB-BTB09089处理组和0.19mg/kg的IA-BTB09089处理组对PTI后各时间点的足误率均无显著改善作用。
图3为BTB09089治疗浓度的探索实验的不对称评分折线图。从图3中可知，与I-PTI组相比，0.76mg/kg的IC-BTB09089处理组还可显著降低小鼠PTI后7、14、21天不对称评分，但其它剂量组无显著作用。
以上结果提示，BTB09089延迟处理可浓度依赖地促进PTI后小鼠运功功能的恢复，且0.76mg/kg BTB09089作用最佳，因此采用此浓度进行后续实验。
2.BTB09089延迟性处理可时程依赖地促进WT小鼠PTI后运动功能恢复
为了探究BTB09089后处理的治疗时间窗，实验流程按照图4进行。通过网格和圆筒实验观察3-35天、7-35天和14-35天的BTB09089延迟性处理对PTI后3、7、14、21、28、35天小鼠运动功能的影响。
图5为BTB09089治疗时间窗的探索实验的足误率折线图。从图5中可知，与II-PTI组相比，3-35天的IIA-BTB09089处理组可显著降低小鼠左前肢PTI后7、14、21、28、35天的足误率；同时，7-35天的IIB-BTB09089处理组可显著降低小鼠左前肢PTI后28、35天的足误率。但是，与II-PTI组相比，14-35天的IIC-BTB09089处理组对小鼠的足误率并无影响。
图6为BTB09089治疗时间窗的探索实验的不对称评分折线图。从图6中可知，与II-PTI组相比，3-35天的IIA-BTB09089处理组还可显著降低小鼠PTI后7、14、21、28、35天不对称评分。同时，7-35天的IIB-BTB09089处理组可显著降低小鼠PTI后28、35天不对称评分。但是，与II-PTI组相比，14-35天的IIC-BTB09089处理组对小鼠的不对称评分、运动功能并无影响。
以上结果表明，BTB09089的治疗时间窗可延长至7天。
此外，我们还进行了停药实验，3-21天给小鼠腹腔注射BTB09089(即IID-BTB09089处理组)，然后停止给药，通过网格和圆筒实验观察小鼠在停药后的运动功能，图5和图6的结果显示，BTB09089处理组小鼠在28、35天仍然能够维持21天时的运动功能。
3.BTB09089延迟性处理激活GPR65受体促进WT小鼠PTI后运动功能的恢复
为了探究GPR65受体激活对小鼠运动功能的影响，实验流程按照图7进行。通过网格和圆筒实验观察PTI后3、7、14、21天WT和GPR65-/-小鼠运动功能的变化。
图8为BTB09089激活GPR65受体对神经功能恢复作用的足误率。图9为BTB09089激活GPR65受体对神经功能恢复作用的不对称评分。
图8和图9的结果显示：在PTI造模后第3天，各组的足误率和不对称评分均无显著性差异。在WT小鼠上，与III-PTI组相比，III-BTB09089组小鼠PTI后7、14、21天的足误率显著下降；同时，III-BTB09089可显著降低WT小鼠在PTI后第21天的不对称评分。然而，在GPR65-/-小鼠上，与IV-PTI组相比，IV-BTB09089组小鼠在PTI后各时间点的足误率和不对称评分均无显著变化。此外，与GPR65-/-小鼠的IV-BTB09089组相比，WT小鼠的III-BTB09089组在PTI后7、14、21天足误率显著降低，在PTI后14、21天的不对称评分显著降低。
以上结果表明，BTB09089通过激活GPR65受体可显著促进小鼠PTI后的运动功能恢复。
4.BTB09089延迟性处理激活神经元GPR65受体促进GPR65-/-阳性病毒小鼠PTI后运动功能的恢复
为了探究激活神经元GPR65能否影响PTI后的运动功能，实验流程按照图10进行。
通过网格和圆筒实验观察PTI后3、7、14、21天阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠运动功能的变化。图11为AAV-Syn-GPR65与NeuN、GFAP、Iba-1共定位情况。图12为AAV-Syn-GPR65的标签蛋白flag的表达情况。图13为阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠的足误率折线图。图14为阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠的不对称评分折线图。图15是阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠和WT小鼠在21天时网格恢复率的比较。图16是阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)GPR65-/-小鼠和WT小鼠在21天时圆筒恢复率的比较。
通过图11的组织免疫荧光结果显示：AAV病毒特异性表达于神经元而非小胶质细胞和星形胶质细胞上，AAV-Syn-GPR65病毒表达的ZsGreen绿色荧光蛋白与神经元标志物NeuN共定位，而与小胶质细胞标志物Iba-1及星形胶质细胞标志物GFAP无共定位，说明该病毒载体在神经元特异性表达。图12的结果显示，AAV-Syn-GPR65病毒在梗死周边区成功表达GPR65蛋白。
图13～14的结果显示：在PTI后第3天，各组的足误率和不对称评分均无显著性差异。在阳性病毒小鼠上，与VI-PTI组相比，VI-BTB09089组小鼠PTI后14、21天的足误率显著下降；同时，VI-BTB09089可显著降低阳性病毒组小鼠在PTI后第14、21天的不对称评分。然而，在阴性病毒小鼠上，与V-PTI组相比，V-BTB09089组小鼠在PTI后各时间点的足误率和不对称评分均无显著变化。此外，与阴性病毒小鼠的V-BTB09089组相比，阳性病毒小鼠的VI-BTB09089组在PTI后14、21天足误率显著降低，在PTI后21天的不对称评分显著降低。
以上结果表明，BTB09089通过激活神经元GPR65受体可显著促进小鼠PTI后的运动功能恢复。此外，图15～16网格和圆筒实验显示，阳性病毒组的GPR65-/-小鼠在PTI后第21天的运动功能恢复率优于WT小鼠，这表明BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用，小鼠的运动功能恢复得更好。
5.BTB09089和神经元病毒联合使用能够延长BTB09089的治疗时间窗
为了探讨AAV-Syn-GPR65能否进一步扩大BTB09089的治疗时间窗，我们在WT小鼠进行PTI前两周注射AAV-Syn-GPR65至脑实质，以过表达梗死周边区神经元的GPR65，使GPR65受体维持在比较高的水平。实验流程按照图17进行。通过网格和圆筒实验观察PTI后3、7、14、21、28、35、42天阴性病毒组(AAV-Syn-Control)和阳性病毒组(AAV-Syn-GPR65)WT小鼠运动功能的变化。
图18为BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用延长治疗时间窗实验探索的足误率折线图。图18的结果显示：在PTI后第3天，各组的足误率均无显著性差异。在阳性病毒小鼠上，与IX-PTI组相比，IX-BTB09089组小鼠PTI后28、35、42天的足误率显著下降。然而，在阴性病毒小鼠上，与VII-PTI组相比，VII-BTB09089组小鼠在PTI后各时间点的足误率无显著变化。此外，与阴性病毒小鼠的VII-BTB09089组相比，阳性病毒小鼠的IX-BTB09089组在PTI后28、35、42天足误率显著降低。
图19为BTB09089和AAV-Syn-GPR65联合使用延长治疗时间窗实验探索的不对称评分折线图。图19的结果显示：在PTI后第3天，各组的不对称评分均无显著性差异。在阳性病毒小鼠上，与IX-PTI组相比，IX-BTB09089组小鼠PTI后42天的不对称评分显著降低。然而，在阴性病毒小鼠上，与VII-PTI组相比，VII-BTB09089组小鼠在PTI后各时间点的不对称评分无变化。此外，与阴性病毒小鼠的VII-BTB09089组相比，阳性病毒小鼠的IX-BTB09089组在PTI后42天不对称评分显著降低。
这表明，BTB09089和AAV病毒联合使用能够进一步延长BTB09089的治疗时间窗。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗脑缺血性疾病的药物组合上的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，所述GPR65激动剂的结构如下：
3.根据权利要求2所述的用途，所述AAV病毒为过表达GPR65于神经元的AAV病毒。
4.根据权利要求3所述的用途，所述AAV病毒为AAV-Syn-GPR65病毒。
5.根据权利要求4所述的要求，GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备治疗缺血性脑卒中后神经功能恢复的药物组合上的用途。
6.根据权利要求3所述的要求，GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备延长缺血性脑卒中治疗时间窗的药物组合上的用途。
7.根据权利要求6所述的要求，GPR65激动剂和AAV病毒在用于制备协同延长缺血性脑卒中治疗时间窗的药物组合上的用途。
8.一种药物组合，其特征在于，包括：
GPR65激动剂；和
AAV病毒。
9.根据权利要求8所述的药物组合，其特征在于，所述GPR65激动剂的结构如下：
10.根据权利要求8所述的药物组合，其特征在于，所述AAV病毒为过表达GPR65于神经元的AAV病毒；优选地，所述AAV病毒为AAV-Syn-GPR65病毒。
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