JP2018515447A - 軸索障害の処置用のパルテノライドおよびその誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
パルテノライドは、Sigma‐Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入し、ジメチルスルホキシド(DMSO:dimethyl sulfoxide)に溶解して適切な濃度を得た。ノコダゾールは、Sigma‐Aldrichから購入し、DMSOに溶解して適切な濃度を得た。SB216763は、Sigma‐Aldrichから購入し、DMSOに溶解して適切な濃度を得た。
C57BL/6,129/Olaの遺伝背景の雌雄の成体(8〜12週)野生型およびGSK3αS21A/GSK3βS9Aマウス(アレッシ博士教授(Prof.Dr.Alessi)、ダンディー大学)を、食餌と水を自由摂取として12時間の明/暗サイクルに維持し、パルテノライドの効果を調べる実験を除く全ての研究に使用した。パルテノライド実験は、C57BL/6J背景のマウスで行った。動物は、実験で使用する前に同一条件下で少なくとも10日間収容した。ゴブレヒト(Gobrecht)ら、ネイチャー・コミュニケーションズ(Nature Communications.)2014;5:4561に記載のように、坐骨神経挫滅(SNC:Sciatic nerve crush)を行った。簡潔に説明すると、ケタミン(60〜80mg/kg、ファイザー(Pfizer)、ニューヨーク、米国ニューヨーク州)およびキシラジン(10〜15mg/kg、バイエル(Bayer)、レバークーゼン、ドイツ)の腹腔内注射により動物を麻酔した。臀部に約10mmの皮膚切開を行い、坐骨切痕から三枝分岐まで右坐骨神経を露出させた。組織損傷を最小にしながら、下肢後面筋肉組織を慎重に広げた。Dumon#5鉗子(ヘルムレ(Hermle)、トゥットリンゲン、ドイツ)を使用して脛腓分岐部の近位で30秒間挫滅損傷を行い、カーボン(Sigma)でマークした。6‐0縫合糸を使用して皮膚を閉じた。
ゴブレヒト(Gobrecht)ら、ネイチャー・コミュニケーションズ(Nature Communications.)2014;5:4561に記載のように、成体野生型(wt;wild type)およびGSK3α/GSK3Pマウスから後根神経節(DRG)ニューロンを分離した。DRG(T8‐L6)を収集し、DMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、カールズバッド、米国カリフォルニア州)中0.25%のトリプシン/EDTA(GEヘルスケア(GE Healthcare)、チャルフォントセントジャイルズ、英国)および0.3%のコラゲナーゼIA型(シグマ(Sigma)、セントルイス、米国ミズーリ州)において、37℃および5%CO2で45分間インキュベートし、機械的に解離した。10%のウシ胎児血清(GEヘルスケア(GE Healthcare))、ペニシリン/ストレプトマイシン(500U/ml;メルクミリポア(Merck Millipore)、ビルリカ、米国マサチューセッツ州)および5‐フルオロ‐2’‐デソキシウリジン(100nM;シグマ(Sigma))を含むDMEMに細胞を再懸濁した。ポリ‐D‐リシン(PDL、0.1mg/ml;分子量<300,000kDa;シグマ(Sigma))およびラミニン(20μg/ml;シグマ(Sigma))で被覆した96ウェルプレート(Nunc、ドイツ)で、37℃および5%CO2で細胞を培養した。
2コンパートメントチャンバ(AXIS(商標)軸索分離デバイス、Millipore)をPDLおよびラミニンで被覆した培養皿に載置した。成体マウスのDRGニューロンを、ニューロンが全てのマイクロチャネルに軸索を伸ばすまで、細胞体コンパートメントで3日間培養した。
神経筋接合部の再建を分析するために、マウスをSNCから4日後に屠殺した。ゴブレヒト(Gobrecht)ら、ネイチャー・コミュニケーションズ(Nature Communications.)2014;5:4561に記載のように、長母指伸筋を切開し、1時間PFAで後固定した。その後、筋肉を、一晩PBS中2%TritonXで透過処理した。軸索を、ニューロフィラメントに対する抗体(1:2,000;Abcam)で標識した。PBS‐T中Alexa594結合α‐ブンガロトキシン(BTX)(1:1,000;インビトロジェン(Invitrogen))で1時間培養することにより、シナプスを視覚化した。
坐骨神経を分離し、6時間、後固定し、一晩4℃で30%の蔗糖に移し、Tissue‐Tek(サクラ(Sakura)、ライデン、オランダ)に包埋した。クリオスタット(ライカ(Leica)、ヴェッツラー、ドイツ)で縦断切片および横断切片を切断し、被覆ガラススライド(Superfrost plus、フィッシャー(Fisher)、ピッツバーグ、米国ペンシルベニア州)上に解凍載置し、将来の使用のために−20℃で保存した。
バプティスタ(Baptista AF)ら,ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・メソッド(J Neurosci Methods.)2007;161(2):259‐64に記載されるように、溶媒を神経内注入した11匹のC57BL/6Jマウスおよびパルテノライドで処置した11匹の動物で、static sciatic index(SSI)を計算することにより運動機能回復を定量した。
ゴブレヒト(Gobrecht)ら、ネイチャー・コミュニケーションズ(Nature Communications.)2014;5:4561に記載のように、von Freyフィラメントテストにより実験群あたり11匹の動物でSNCから0、1、4、7、14および21日後にSNC後の感覚機能回復を決定した。テストは、一日の同じ時間に、同じ実験者により行った。
1.1 培養下の軸索成長の決定
上述の成体野生型マウスから解離したDRGニューロンで、成熟ニューロンの軸索成長に対するチューブリンカルボキシペプチダーゼ(TCP)阻害剤パルテノライドの効果を決定した。細胞を溶媒、0.1nM、1nM、2.5nM、5nM、10nMまたは100nMのパルテノライドで処置し、2日間培養した。
パルテノライドに影響された軸索成長が微小管動態の調節により媒介されたことを検証するために、微小管を不安定化し、軸索成長を減少させることが知られているグリコーゲンシンターゼキナーゼ3(GSK3:Glycogen synthase kinase 3)阻害剤SB216763(sb)およびノコダゾール(noco)に対してパルテノライドの効果を評価した。
パルテノライドが培養下で軸索形成を開始させたのではなく既存の軸索と直接相互作用したこと、および既に成長刺激されたDRGニューロンの軸索再生を促進するのに十分であること検証するために、上述のように細胞体コンパートメントと軸索コンパートメントとの流体分離を可能にする2コンパートメント培養プラットフォームを利用した。この目的のため、成体DRGニューロンを2コンパートメントチャンバで3日間培養して再生状態にしてから軸索を切断した。軸索切断から1日後に、溶媒(veh)または5nMのパルテノライドを細胞体コンパートメント(par、soma)または軸索コンパートメント(par、axon)内のいずれかに投与し、他方のコンパートメントには溶媒をそれぞれ投与した。対照細胞の各コンパートメントには溶媒を投与した。
パルテノライドによりもたらされる成熟ニューロンの軸索成長が微小管の脱チロシン化の阻害を介して促進されたことを検証するために、野生型(wt)またはGSK3S/Aダブルノックインマウス(α/β)からの培養されたDRGニューロンの軸索先端を、溶媒(−)または5μMのGSK3阻害剤SB216763(sb)もしくは10nMのパルテノライド(par)に曝露した。曝露から3日後に、軸索を脱チロシン化チューブリンおよびβIII‐チューブリンにつき染色した。パルテノライド処置により、軸索先端の脱チロシン化チューブリンのレベルが減少したことが分かった。図2は、溶媒(−)、5μMのSB216763(sb)または10nMのパルテノライド(par)への曝露から3日後の、wtおよびGSK3S/Aダブルノックインマウス(α/β)からの培養物の非脱チロシン化チューブリン陽性軸索先端の定量を示した図である。三つの独立した実験のデータを、溶媒処置wt群に正規化した。図2から分かるように、パルテノライドは、成体野生型ニューロンの非脱チロシン化軸索先端の割合を有意かつGSK3αS/A/GSK3βS/Aニューロンで測定されたのと同程度に増加させた。
0.01μM、0.05μM、0.1μM、1μM、10μMおよび100μMの増加していく濃度のパルテノライドを、坐骨神経損傷の直後に野生型マウスの坐骨神経の挫滅部位内に投与し、坐骨神経切片の軸索再生を評価して濃度効果を決定した。坐骨神経挫滅および処置から3日後に、坐骨神経を分離し、再生関連タンパク質SCG10に対する抗体で染色した。SCG10陽性軸索を、カーボンで標識した損傷部位から2mmおよび3mm先で定量した。溶媒および0.05μMのパルテノライド群では、群あたり五匹の動物を使用し、他の濃度ではそれぞれ二匹の動物を使用した。動物あたり五つの坐骨神経切片を分析した。
4.1 in vivoの坐骨神経再生の決定
パルテノライドの神経内投与がin vivoで坐骨神経再生を促進するか否かを調べるために、50nMのパルテノライドまたは溶媒を、野生型マウスの挫滅坐骨神経内に手術と同時に投与し、SNCから3日後に再生に対する効果を決定した。
再生軸索がパルテノライド処置から4日後に既に標的に良好に再分布し始めていることを検証するために、長母指伸筋のBTXおよびニューロフィラメント染色を行った。マウスをSNCおよび50nMのパルテノライド(par)での処置から4日後に屠殺し、長母指伸筋を切開し、染色した。図4Dは、坐骨神経挫滅から4日後の、パルテノライド(par)または溶媒(veh)処置したマウスの長母指伸筋全組織標本のα‐ブンガロトキシン(BTX)およびニューロフィラメント(NF)染色を示した図である。図4Dに示されるように、パルテノライドで処置した動物には神経筋接合部が見られたが、溶媒処置対照には見られなかった。
パルテノライド投与がin vivoの機能回復も加速したか否かを試験するために、坐骨神経挫滅後に50nMのパルテノライドで処置後の成体野生型マウスの再生結果を、上述のようにstatic sciatic index(SSI)およびvon Freyテストを使用して機能的に評価した。
ゴブレヒト(Gobrecht)ら、ネイチャー・コミュニケーションズ(Nature Communications.)2014;5:4561に記載のように、成体野生型(wt)およびGSK3α/GSK3βマウスから後根神経節(DRG)ニューロンを分離した。DRG(T8‐L6)を収集し、DMEM(ライフテクノロジーズ(Life Technologies)、カールズバッド、米国カリフォルニア州)中0.25%のトリプシン/EDTA(GEヘルスケア(GE Healthcare)、チャルフォントセントジャイルズ、英国)および0.3%のコラゲナーゼIA型(シグマ(Sigma)、セントルイス、米国ミズーリ州)において、37℃および5%CO2で45分間インキュベートし、機械的に解離した。10%のウシ胎児血清(GEヘルスケア(Healthcare))、ペニシリン/ストレプトマイシン(500U/ml;メルクミリポア(Merck Millipore)、ビルリカ、米国マサチューセッツ州)および5‐フルオロ‐2’‐デソキシウリジン(100nM;Sigma)を含むDMEMに細胞を再懸濁した。ポリ‐D‐リシン(PDL、0.1mg/ml;分子量<300,000kDa;シグマ(Sigma))およびラミニン(20μg/ml;シグマ(Sigma))で被覆した96ウェルプレート(Nunc、ドイツ)で、37℃および5%CO2で細胞を培養した。細胞を、溶媒または0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nMまたは100nMのパルテノライド(シグマアルドリッチ(Sigma‐Aldrich))またはクニシン(エキストラシンシース(Extrasynthese))で処置し、2日間培養した。
6.1:神経内パルテノライド投与
実施例4.1に記載のように、1.25pg、6.25pg、12.5pg、125pg、1,250pgおよび12,500pgの用量のパルテノライドを、野生型マウスの坐骨神経挫滅部位に手術と同時に投与し、3日後に再生に対する効果を決定した。
全身パルテノライド投与が坐骨神経再生を促進できるか否かをテストするために、20ng/kg、200ng/kg、2μg/kgおよび20のμg/kgのパルテノライド用量を、坐骨神経損傷後に腹腔内注入した。
パルテノライドが中枢神経系の細胞に対して有効か否かをテストするために、成体網膜神経節細胞の神経突起の伸展を決定した。この目的で、成体マウス網膜を解離し、溶媒(−)、リチウム(li)またはパルテノライド(Par、1nM)の存在下で4日間培養した。細胞を固定してβIII‐チューブリンにつき染色し、網膜神経節細胞ごとの神経突起の長さを決定した。1nMのパルテノライド(par)、リチウム(li)、または両方で処置後の網膜神経節細胞の神経突起成長の定量を図7に示す。図7から分かるように、パルテノライドは、未処置対照と比較して神経突起成長を顕著かつ有意に促進した。リチウムは有意な効果が見られなかったが、パルテノライドの有益な効果をさらに強めた。
Claims (15)
- 軸索障害の処置用の、チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤およびチューブリンチロシンリガーゼ活性化剤ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される、軸索先端の微小管の脱チロシン化を減少させる化合物。
- 前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、パルテノライドまたはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、薬学的に許容可能な塩、エステルおよび/もしくは誘導体もしくは構造アナログである、請求項1に記載の化合物。
- 前記軸索障害は、末梢神経系または中枢神経系の損傷、特に坐骨神経もしくは視神経または脊髄の中枢投射の損傷である、請求項1に記載の化合物。
- 前記軸索障害は、末梢神経障害、緑内障、卒中または多発性硬化症に関連する、請求項1に記載の化合物。
- 前記軸索障害は、損傷もしくは移植された角膜の除神経に関連し、または病変を生じた視神経もしくは三叉神経、特にその眼枝の軸索切断繊維に関連する、請求項1に記載の化合物。
- 軸索障害の処置用の、チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤およびチューブリンチロシンリガーゼ活性化剤ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される軸索先端の微小管の脱チロシン化を減少させる化合物を活性成分として含む、医薬組成物。
- 前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、パルテノライドまたはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、薬学的に許容可能な塩、エステルおよび/もしくは誘導体もしくは構造アナログである、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記組成物は、神経内投与もしくは神経根周囲投与等の局所投与用に、または腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与もしくは経口投与等の全身投与用に製剤される、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記組成物は、眼内投与用に、特に点眼剤として製剤される、請求項7に記載の医薬組成物。
- 軸索障害の処置用の薬品の製造のための、チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤およびチューブリンチロシンリガーゼ活性化剤ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される軸索先端の微小管の脱チロシン化を減少させる化合物の使用。
- 前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、パルテノライドまたはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、薬学的に許容可能な塩、エステルおよび/もしくは誘導体もしくは構造アナログである、請求項10に記載の使用。
- 前記軸索障害は、末梢神経系または中枢神経系の損傷、特に坐骨神経もしくは視神経もしくは脊髄の中枢投射の損傷であるか、または、損傷もしくは移植された角膜の除神経に関連するか、もしくは病変を生じた視神経もしくは三叉神経、特にその眼枝の軸索切断繊維に関連する、請求項10に記載の使用。
- 軸索障害を処置する方法であって、チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤およびチューブリンチロシンリガーゼ活性化剤ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される軸索先端の微小管の脱チロシン化を減少させる治療上有効量の化合物を対象に投与することを含む、方法。
- 前記チューブリンカルボキシペプチダーゼ阻害剤は、パルテノライドまたはそのラセミ体、鏡像異性体、立体異性体、溶媒和物、水和物、薬学的に許容可能な塩、エステルおよび/もしくは誘導体もしくは構造アナログである、請求項13に記載の方法。
- 前記軸索障害は、末梢神経系または中枢神経系の損傷、特に坐骨神経もしくは視神経もしくは脊髄の中枢投射の損傷であるか、または、損傷もしくは移植された角膜の除神経に関連するか、もしくは病変を生じた視神経もしくは三叉神経、特にその眼枝の軸索切断繊維に関連する、請求項13に記載の方法。
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