CN107771077B

CN107771077B - 用于治疗轴突损伤的小白菊内酯及其衍生物

Info

Publication number: CN107771077B
Application number: CN201680032229.0A
Authority: CN
Inventors: 菲利普·路德维格·亚历山大·戈布雷希特; 迪特马尔·菲舍尔
Original assignee: Ruhr Universitaet Bochum
Current assignee: Universitaet zu Koeln
Priority date: 2015-04-20
Filing date: 2016-03-10
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2036-03-10
Also published as: EP3285761B1; EP3285761A1; JP6835738B2; CN107771077A; US20190388388A1; JP2018515447A; US11298337B2; US20180140574A1; WO2016169698A1; EP3085371A1

Abstract

本发明涉及一种减少轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的化合物，从包括微管蛋白羧肽酶抑制剂和微管蛋白酪氨酸连接酶激活剂及其组合的组中选择，用于治疗轴突损伤。

Description

用于治疗轴突损伤的小白菊内酯及其衍生物

技术领域

本发明涉及神经受损或疾病的轴突损伤的治疗。

背景技术

神经系统、大脑、脊髓和周围神经复杂、脆弱的结构容易受到各种形式的损伤。例如周围神经的损伤(周围神经病变)可能通过各种创伤发生，包括挫裂伤、局部挫伤(枪伤)、拉伸/牵引损伤、受压、药物注射损伤或电击伤。另外，周围神经病变可以是全身性疾病的结果，例如糖尿病或麻风病、维生素缺乏症、药物治疗例如化疗、放射治疗、过量酒精摄入、免疫系统疾病或病毒感染。中枢神经系统中的轴突损伤可能由切断、破裂或受压/挫伤引起，或者与造成轴突受损的疾病关联，例如由中风或多发性硬化引起的轴突损伤和轴突断裂。

周围神经损伤是导致可观的功能性发病率和医疗支出的常见原因。在周围神经切断或破裂的情况下可以采用手术。在周围神经的重建中，受伤的神经被识别和暴露，以使得可以在受伤的水准之上和之下检查正常的神经组织，去除神经的受伤部分，然后仔细地重新近接切断的神经末端。然而，有大部分的损伤不适合进行一期修复，并且尽管严格应用复杂的显微外科技术，大部分案例中标准临床管理导致感觉和运动恢复不足。

通常，损伤的周围神经组织具有再生断开的轴突的能力，因此具有修复能力。所谓的神经再生的机制可能包括新神经胶质的生成、轴突的延长、功能性突触的再髓鞘化或恢复。然而，周围神经系统(PNS)与中枢神经系统(CNS)的神经再生能力有着很强的差异。与周围神经系统相反，由于由髓鞘源性的因子引起的抑制轴突环境和抑制胶质瘢痕的形成，中枢神经轴突再生非常有限。另外，中枢神经元具有低得多的再生受损伤轴突的内在能力。然而，尽管周围神经系统中的受损伤轴突显示出了较大的内在轴突再生潜力，功能性再生通常是有限的，主要是由于来自雪旺细胞的神经营养支持随着时间以及轴突误导降低。在长距离再生的情况下，这些方面尤其地明显，例如腿部坐骨神经或手臂正中神经受损伤后。因此，目的在于加速轴突再生并由此改善功能性恢复的新颖治疗措施的发展是非常有必要的。

发明内容

因此，本发明的目的是提供用于治疗轴突损伤的化合物。

该问题通过一种降低轴突尖端中的微管蛋白去酪氨酸化的化合物解决，化合物从包括微管蛋白羧肽酶(TCP)抑制剂和微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)激活剂及其组合的组中选择，以用于治疗轴突损伤。

意外地，TCP抑制剂小白菊内酯被发现明显地促进了培养物中的成年背根神经节神经元的轴突生长。另外，与相应的对照组相比，药物在体内的应用加速了轴突生长并促进了野生型小鼠的功能性坐骨神经再生。这可以显示为局部和全身的药物应用。因此，TCP抑制剂例如小白菊内酯和TTL激活剂为神经损伤的和改善神经修复提供了有前景的药理治疗。

小白菊内酯的有益效果据推测来源于一种表示为微管蛋白羧肽酶(TCP)的蛋白质的药理抑制剂引起的轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的降低。如本文中所使用的，术语“微管蛋白羧肽酶抑制剂”是指靶向并且抑制TCP活性的一类药物，其切断-Glu-Tyr键以从天然酪氨酸化微管蛋白释放C端酪氨酸残基或抑制微管蛋白去酪氨酸化。如本文中所使用的，术语“微管蛋白酪氨酸连接酶激活剂”是指靶向并且激活一种表示为微管蛋白酪氨酸连接酶(TTL)的蛋白质的药物，另一方面，该蛋白质将COOH-端酪氨酸残基加入微管蛋白中。TCP抑制剂小白菊内酯增加了细胞培养物中的轴突再生。令人注意地，TCP抑制剂在体内的神经内或腹腔应用显著地促进了受伤动物的坐骨神经再生并且加速了功能性恢复。因此，减少轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的药理学方法提供了一种新颖且适用于临床的策略，以显著地改善神经修复和中枢投射并且治疗轴突损伤。有利地，局部和全身的药物应用被显示为是有效的。

如本文中所使用的，术语“轴突”是指周围神经元或中枢神经元的一个细长的突起。轴突通常将电神经冲动传导远离神经元的细胞体。轴突及其绝缘鞘层被称为神经纤维。在中枢神经系统中，髓鞘由少突胶质细胞生成，在周围神经系统中，髓鞘由雪旺细胞所形成。周围神经纤维包括轴突、髓鞘、雪旺细胞和神经内膜，中枢神经纤维不包括雪旺细胞和神经内膜，但包括有少突胶质细胞。如本文中所使用的，术语“轴突尖端”是指轴突的终端或轴突的端。在轴突的尖端是被称为生长锥的动态分室，生长的轴突通过生长锥在它们的环境中移动。

如本文中所使用的，术语“轴突损伤”是指任何神经纤维和神经组织的轴突的损伤。术语“神经”是指感觉纤维、运动纤维或这两者。术语“轴突损伤”指神经受损和由轴突损伤造成的周围神经病变，也指视神经或脊髓的损伤。周围神经病变可以是全身性疾病的结果，例如糖尿病或麻风病、维生素缺乏症、药物治疗例如化疗、放射治疗、过量酒精摄入、免疫系统疾病或病毒感染。轴突损伤可能表现在神经受损或疾病。周围神经系统受到的神经受损由例如肢体的断裂或切割，并且可能脊髓由于切断、破裂或受压/挫伤而受损而引起。轴突损伤也可能与造成轴突受损的疾病关联，例如由中风或多发性硬化引起的轴突损伤和轴突断裂。

神经受损可能由创伤引起，如挫裂伤、局部挫伤、拉伸/牵引损伤、受压、药物注射损伤或电击伤。特别的损伤为神经切断、破裂或受压/挫伤。根据Seddon分类法，神经受损的分类根据三种主要类型的神经纤维受损和是否有连续性将受损的程度与症状、病理和的预后关联。神经失用指轴突保持完整，但存在髓鞘损伤导致沿神经纤维的冲动传导中断的周围神经系统的紊乱。轴突断裂指一种由于比神经失用更严重的夹伤或挫伤造成的损伤，其中神经纤维与神经髓鞘均破坏。神经断裂是最严重的损伤，发生于严重的挫伤、拉伸或撕裂。不仅是轴突，并且封装结缔组织失去连续性。神经断裂的极端程度是横断。在实施例中，神经受损指的是轴突断裂或神经断裂。

因此，在实施例中，轴突损伤是一种导致神经元功能性损失的周围神经系统或中枢神经系统的受损。在优选的实施例中，轴突损伤是一种坐骨神经或视神经或脊髓中枢投射的受损。视神经或脊髓中枢投射的轴突损伤是优选的一种中枢神经系统受损。另外的优选的周围神经的轴突损伤与坐骨神经一样，是投射到手臂和手指的神经的损伤。坐骨神经或投射到手臂和手指的神经是长神经并且特别地易受损伤。损伤可以导致不可逆的感觉和运动功能损失并且给患者带来痛苦。视神经的受损常常导致终身的和严重的视力障碍，甚至各眼睛的完全失明。另外，通常轴突再生不会发生在包括其他轴突的中枢投射的脊髓中。轴突损伤可以导致严重的残疾，如四肢瘫或截瘫。由于该原因，小白菊内酯的轴突生长促进效果可能会有利地改善脊髓受损后的临床结果。在另外的实施例中，轴突损伤是一种颅神经的受损，特别是视神经或三叉神经，特别是其眼支的受损。在另外的实施例中，轴突损伤是一种臂丛或支配内脏器官的神经的受损。

在视神经头的轴突受损的情况下，轴突损伤引起的其他障碍或疾病可能选自包括青光眼的组。在实施例中，轴突受损与周围神经病变、青光眼、中风或多发性硬化关联。周围神经病变的例子有糖尿病神经病变和细胞抑制剂引起的病变。

在另外的实施例中，轴突损伤与角膜的受损或移植角膜的去神经支配，或损伤的视神经或三叉神经，特别是其眼支中轴突切断的纤维关联。角膜的受损可能由切断或磨损引起。角膜通常是人体表面神经支配最密集的组织。然而，角膜的移植导致角膜轴突的切割，因此移植的角膜完全去神经支配。对供体组织的再神经支配是高可变度的，并且在很多案例中，初次手术后会持续多年感觉减退。因此。促进轴突从眼神经进入到角膜特别是移植的角膜的生长是非常有利的。

由于小白菊内酯已经显示出轴突生长锥的直接相互作用，角膜中的轴突生长可能会由于小白菊内酯而加速。有利地，可以证明小白菊内酯不仅能促进周围神经的神经再生，也能促进中枢神经元，如视网膜神经节细胞的神经再生，这表明小白菊内酯可以用于青光眼或受损视神经中轴突切断的纤维的治疗。

优选地，用于治疗轴突损伤的减少轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的化合物为微管蛋白羧肽酶抑制剂。优选的微管蛋白羧肽酶抑制剂为小白菊内酯，或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐、酯、和/或衍生物或结构类似物。小白菊内酯是一种倍半萜内酯，通常从菊科的一种也被称为小白菊的植物短舌匹菊(Tanacetum parthenium)中提取。小白菊内酯是一种4,5-环氧-6α-羟基-γ-内酯的名称。小白菊内酯的化学式(1)如下：

小白菊内酯包括手性中心，并且因此它的外消旋体、对映体或立体异构体也是可能的且可用的。如下的化学式(1a)给出了小白菊内酯的一种优选的立体异构体：

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)命名法，小白菊内酯也被表示为(1aR，4E，7aS，10aS，10bR)-1a，5-二甲基-8-亚甲基-2,3,6,7,7a,8,10a，10b-八氢氧杂环壬[9,10]环癸[1,2-b]呋喃-9(1aH)-酮。小白菊内酯已经显示出可以明显地促进体外神经元的生长，促进周围神经再生(坐骨神经)，并且明显地加速受伤后体内的功能性恢复。另外，它也促进了中枢神经系统神经突的生长，例如培养的视网膜神经节细胞。

在实施例中，小白菊内酯的衍生物或结构类似物也可以用于微管蛋白羧肽酶抑制。在实施例中，小白菊内酯衍生物从包括8-，9-或14-羟基小白菊内酯和/或13-氨基小白菊内酯，例如通常被称为二甲氨基小白菊内酯(DMAPT)的13-二甲氨基小白菊内酯的组中选择。有利地，二甲氨基小白菊内酯(DMAPT)为可溶性且口服生物利用的衍生物。

这样的小白菊内酯衍生物可以提高化合物的溶解度，这可能有利于配制合适的药物制剂配方，并且提供改善的水溶液环境中化合物生物利用度。羟基衍生物可以选自8-，9-或14-羟基小白菊内酯，特别是羟基-8a-小白菊内酯的组。13-氨基小白菊内酯衍生物可以选自包括11βH,13-二甲氨基小白菊内酯、11βH,13-二乙氨基小白菊内酯、13-(叔丁基氨基)小白菊内酯、11βH,13-(吡咯烷-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(吗啉-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌嗪-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(高哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(七亚甲基亚氨-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(氮杂环丁烷-1-基)小白菊内酯、和/或11βH,13-二烯丙基氨基小白菊内酯组成的组。一种优选的氨基小白菊内酯为13-二甲氨基小白菊内酯。

小白菊内酯的结构类似物也可以作为微管蛋白羧肽酶抑制剂。在实施例中小白菊内酯的结构类似物从包括蓟苦素、根据下列的化学式(2)和(3)的化合物和/或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐和/或酯的组中选择：

根据IUPAC命名法，蓟苦素也被称为[(1R，2S，4E，8Z，10S)-8-(羟甲基)-4-甲基-13-亚甲基-12-氧代-11-氧杂双环[8.3.0]三十四烷-4,8-二烯-2-基](3S)-3,4-二羟基-2-亚甲基-丁酸或[(3aR，4S，6E，10Z，11aR)-10-(羟甲基)-6-甲基-3-亚甲基-2-氧代-3a，4,5,8,9,11a-六氢环癸[b]呋喃-4-基](3R)-3,4-二羟基-2-亚甲基丁酸。一种优选的蓟苦素的立体异构体由如下化学式(4)表示：

小白菊内酯还可以以溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐和酯的形式应用。术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱或酸制备的盐。药学上可接受的盐可以由药学上可接受的无毒碱，包括无机碱和有机碱，有机阴离子，有机阳离子，卤化物或碱方便地制备。术语药学上可接受的盐包括碱金属盐和游离酸或游离碱的加成盐。合适的药学上可接受的融合蛋白的碱加成盐包括金属盐和有机盐。优选的衍生自无机碱的盐包括铵、钙、镁、钾和钠盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯、仲、叔胺。小白菊内酯和它的衍生物或类似物可以以盐酸盐或马来酸盐的形式使用。

特别地，在神经内的化合物的应用浓度，特别是小白菊内酯，可以在≥0.01μM至≤10μM的范围内，特别是在≥0.01μM至≤1μM范围内，或≥0.05μM至≤0.1μM范围内，或≥0.05μM至≤1μM范围内。

减少微管蛋白去酪氨酸化的化合物例如小白菊内酯可以单独地或与其他治疗成分组合用在轴突损伤的治疗中。在实施例中，上文所述的减少微管蛋白去酪氨酸化的化合物例如小白菊内酯可以与选自紫杉醇、埃博霉素B和/或一种ROCK抑制剂例如Y27632的化合物组合使用。根据IUPAC命名法，紫杉醇被表示为(2α，4α，5β，7β，10β，13α)-4,10-双(乙酰氧基)-13-{[(2R，3S)-3-(苯甲酰氨基)-2-羟基-3-苯基丙酰基]氧基}-1,7-二羟基-9-氧代-5,20-环氧噻吨-11-烯-2-基苯甲酸酯，并且可以为商品名Taxol。与紫杉醇或埃博霉素B的组合对于中枢神经系统的轴突损伤的治疗可能是特别地有利的。如本文中所使用的，术语“ROCK抑制剂”是指靶向并且抑制一种被称为Rho相关蛋白激酶的蛋白质的药物。一种合适的ROCK抑制剂为一种被称为Y27632或(1R，4R)-4-((R)-1-氨基乙基)-N-(吡啶-4-基)环己甲酰胺二盐酸盐的化合物。

可降低轴突尖端中的微管蛋白去酪氨酸化的化合物可以配制成为药物组合物。本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，包括一种作为有效成分的降低轴突尖端中的微管蛋白去酪氨酸化的化合物，该化合物由包括微管蛋白羧肽酶抑制剂和微管蛋白酪氨酸连接酶激活剂及其组合的组中选择，用于轴突损伤的治疗。

一种优选的化合物是TCP抑制剂。在药物组合物的实施例中，TCP抑制剂是小白菊内酯或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐、酯、和/或衍生物或结构类似物。在实施例中，小白菊内酯衍生物从包括8-，9-或14-羟基小白菊内酯和/或13-氨基小白菊内酯例如二甲氨基小白菊内酯(DMAPT)的组中选择。羟基衍生物可以选自8-，9-或14-羟基小白菊内酯，特别是羟基-8a-小白菊内酯的组。13-氨基小白菊内酯衍生物可以选自包括11βH,13-二甲氨基小白菊内酯、11βH,13-二乙氨基小白菊内酯、13-(叔丁基氨基)小白菊内酯、11βH,13-(吡咯烷-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(吗啉-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌嗪-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(高哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(七亚甲基亚氨-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(氮杂环丁烷-1-基)小白菊内酯、和/或11βH,13-二烯丙基氨基小白菊内酯组成的组。一种优选的氨基小白菊内酯为13-二甲氨基小白菊内酯。在另外的实施例中，小白菊内酯的结构类似物从包括蓟苦素、根据化学式(2)和(3)的化合物和/或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐和/或酯的组中选择。

在实施例中，药物组合物用于治疗周围神经系统或中枢神经系统的轴突损伤，特别是坐骨神经或脊髓中枢投射的受损。在实施例中，药物组合物用于治疗与周围神经病变、青光眼、中风或多发性硬化关联的轴突损伤。周围神经病变的例子有糖尿病神经病变和细胞抑制剂引起的病变。在另外的实施例中，药物组合物用于治疗与受损或移植的角膜的去神经支配关联的轴突损伤，或治疗与损伤的视神经或三叉神经，特别是其眼支中轴突切断的纤维有关的轴突损伤。

根据本发明，药物组合物可以包括降低轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的化合物作为有效成分，药学上可接受的载体和可选的治疗成分或佐剂。因此本发明也涉及用于轴突损伤的治疗的药物组合物，其中组合物包括根据本发明的作为有效成分的降低轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的化合物和药学上可接受的载体。

化合物可以溶解或分散在药学上可接受的载体中。术语“药学上可接受的载体”是指当被合适地施用到受试者例如人体中时，不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。例如，药学上的载体可以是固体、液体或气体。合适的载体和佐剂可以是固体或液体并且对应于药物制剂配方技术中通常使用的物质。例如，水、丙二醇、油、酒精等都可能形成液体制剂如溶剂。固体载体的例子包括乳糖、石膏粉、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的例子有糖浆、花生油、橄榄油和水。气体载体的例子包括二氧化碳和氮气。

组合物可以适合于口服或胃肠外施用。胃肠外施用包括皮下、肌肉、静脉、神经内、根周、腹腔和局部施用。在实施例中，组合物被配制为用于局部如神经内或根周的应用，或用于全身应用，如腹腔、静脉、皮下或口服应用。用于治疗周围神经，组合物可以全身地或神经内地施用，例如坐骨神经。优选地，也可以局地或局部施用，例如根周应用。在另外的实施例中，组合物可以被配制为用于眼内应用或滴眼液。以滴眼液形式的施用可以用于损伤或移植的角膜或青光眼的治疗，或损伤的视神经或三叉神经，特别是其眼支中轴突切断的纤维的治疗。适合注射应用的组合物包括无菌水溶液或分散体。

特别地，在神经内的化合物的应用浓度，特别是小白菊内酯，可以在≥0.01μM至≤10μM的范围内，特别是在≥0.01μM至≤1μM范围内，或≥0.05μM至≤0.1μM范围内，或≥0.05μM至≤1μM范围内。已经发现，0.01μM至0.1μM范围内的浓度显著地且相似地增加了体内坐骨神经损伤后的轴突再生，而高于10μM的浓度则会减少轴突再生。

例如，中枢神经系统的治疗也可以是局部的施用，如神经注射，微型泵等，但优选的是通过消化道施用化合物。特别地，药物组合物可以全身地施用，例如口服地、全身地或腹腔内地施用。在另外的实施例中，组合物可以作为滴眼液施用。以滴眼液形式的眼内施用可以用于治疗受损的角膜、移植的角膜、青光眼，或治疗损伤的视神经或三叉神经，特别是其眼支中轴突切断的纤维。药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在并通过药学领域众所周知的任何方法制备。药物组合物可以使用本领域技术人员众所周知的标准药物技术在无菌条件下制备。

药物组合物可以包括单独的减少微管蛋白去酪氨酸化的化合物例如小白菊内酯，或与其他治疗成分组合。优选的治疗成分向胶质瘢痕的中央髓鞘或抑制因子提供了去抑制效果。在实施例中，药物组合物包括作为有效成分的降低轴突尖端中的微管蛋白去酪氨酸化的化合物，如上述的小白菊内酯，与选自紫杉醇、埃博霉素B和/或一种ROCK抑制剂例如Y27632的化合物的组合。包括紫杉醇、埃博霉素B作为另外治疗成分的药物组合物可能对于中枢神经系统的轴突损伤的治疗特别有利。

本发明也涉及减少轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的，从微管蛋白羧肽酶抑制剂和微管蛋白酪氨酸连接酶激活剂及其组合的组中选择的化合物在制备用于轴突损伤治疗的药剂中的应用。在实施例中，TCP抑制剂为小白菊内酯或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐、酯、和/或衍生物或结构类似物。在实施例中小白菊内酯衍生物从包括8-，9-或14-羟基小白菊内酯和/或13-氨基小白菊内酯例如二甲氨基小白菊内酯(DMAPT)的组中选择。羟基衍生物可以选自8-，9-或14-羟基小白菊内酯，特别是羟基-8a-小白菊内酯的组。13-氨基小白菊内酯衍生物可以选自包括11βH,13-二甲氨基小白菊内酯、11βH,13-二乙氨基小白菊内酯、13-(叔丁基氨基)小白菊内酯、11βH,13-(吡咯烷-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(吗啉-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌嗪-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(高哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(七亚甲基亚氨-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(氮杂环丁烷-1-基)小白菊内酯、和/或11βH,13-二烯丙基氨基小白菊内酯组成的组。一种优选的氨基小白菊内酯为13-二甲氨基小白菊内酯。在另外的实施例中，小白菊内酯的结构类似物从包括蓟苦素、根据化学式(2)和(3)的化合物和/或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐和/或酯的组中选择。在实施例中，轴突损伤是一种周围神经系统或中枢神经系统的受损，特别是坐骨神经或视神经或脊髓中枢投射的受损。在实施例中，轴突损伤与周围神经病变、青光眼、中风或多发性硬化关联。周围神经病变的例子有糖尿病神经病变和细胞抑制剂引起的病变。在另外的实施例中，轴突损伤与受损的或移植角膜的去神经支配，或损伤的视神经或三叉神经，特别是其眼支中轴突切断的纤维关联。

减少微管蛋白去酪氨酸化的化合物例如小白菊内酯可以单独地或与其他治疗成分组合使用。在实施例中，应用涉及使用如上文所述的减少微管蛋白去酪氨酸化的化合物例如小白菊内酯，以及选自紫杉醇、埃博霉素B和/或一种ROCK抑制剂例如Y27632的化合物，用于制备治疗轴突损伤的药剂。

本发明的另一方面涉及治疗轴突损伤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的减少轴突尖端微管蛋白去酪氨酸化的化合物，化合物从包括蛋白羧肽酶抑制剂和微管蛋白酪氨酸连接酶激活剂及组合的组中选择。

受试者包括人类受试者和动物受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类受试者或小鼠或用于医疗目的的大鼠。本文所使用的术语“治疗有效量”表示足够引起受试者临床上显著的条件的改善的用量或剂量。

在实施例中，该方法涉及施用一种TCP抑制剂。在实施例中TCP抑制剂是小白菊内酯或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐、酯、和/或衍生物或结构类似物。在实施例中，小白菊内酯衍生物从包括8-，9-或14-羟基小白菊内酯和/或13-氨基小白菊内酯例如二甲氨基小白菊内酯(DMAPT)的组中选择。羟基衍生物可以选自8-，9-或14-羟基小白菊内酯，特别是羟基-8a-小白菊内酯的组。13-氨基小白菊内酯衍生物可以选自包括11βH,13-二甲氨基小白菊内酯、11βH,13-二乙氨基小白菊内酯、13-(叔丁基氨基)小白菊内酯、11βH,13-(吡咯烷-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(吗啉-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(4-甲基哌嗪-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(高哌啶-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(七亚甲基亚氨-1-基)小白菊内酯、11βH,13-(氮杂环丁烷-1-基)小白菊内酯、和/或11βH,13-二烯丙基氨基小白菊内酯组成的组。小白菊内酯的结构类似物也可以作为TCP抑制剂。一种优选的氨基小白菊内酯为13-二甲氨基小白菊内酯。在另外的实施例中，小白菊内酯的结构类似物从包括蓟苦素、根据化学式(2)和(3)的化合物和/或其外消旋体、对映体、立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐和/或酯的组中选择。

在实施例中，该方法涉及施用如上文所述的减少微管蛋白去酪氨酸化的化合物例如小白菊内酯，以及选自紫杉醇、埃博霉素B和/或一种ROCK抑制剂例如Y27632的化合物。

在实施例中，轴突损伤是一种周围神经系统或中枢神经系统的受损，特别是坐骨神经或视神经或脊髓中枢投射的受损。在实施例中，轴突损伤与周围神经病变、青光眼、中风或多发性硬化关联。周围神经病变的例子有糖尿病神经病变和细胞抑制剂引起的病变。在另外的实施例中，轴突损伤与受损的或移植角膜的去神经支配，或损伤的视神经或三叉神经，特别是其眼支中轴突切断的纤维关联。

治疗可能包括口服或胃肠外施用。胃肠外施用包括皮下、肌肉、静脉、神经内、根周和腹腔施用。在实施例中组合物通过神经内、根周、腹腔、静脉、皮下或口服途径施用。用于治疗周围神经时，化合物可能被神经内地施用，例如坐骨神经。局部施用例如根周施用也可能是优选的。特别地，在神经内的化合物的应用浓度，特别是小白菊内酯，可以在≥0.01μM至≤10μM的范围内，特别是在≥0.01μM至≤1μM范围内，或≥0.05μM至≤0.1μM范围内，或≥0.05μM至≤1μM范围内。例如用于治疗中枢神经系统，化合物可能优选地通过消化途径施用。对于受损的角膜组织或移植的角膜或青光眼的治疗，可能优选地以滴眼液的形式施用。

治疗可能是连续的长期治疗，或包括单次或几次的施用。已经发现，与溶媒对照组相比，单次的注射已经足够显著地加速体内的坐骨神经的功能性再生。

除非另有定义，本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。

下文的实施例用于更加详细地说明本发明，但并不构成其限制。

附图说明

图1：图1A显示了培养2天后的使用如文中不同小白菊内酯浓度处理，并用βIII微管蛋白染色的野生型小鼠的解离的DRG神经元。比例尺：100μm。图1B显示了神经元培养物的轴突生长的量化。误差棒表示平均值的标准误差。统计显著性由ANOVA和事后Holm Sidak检验所确定。处理效果与溶媒对照组相比，***p≤0.001。图1C显示了培养2天后的，使用溶媒(-)、5μM的GSK3抑制剂SB216763(sb)、1nM的小白菊内酯(par)、5μM的sb与1nM的par的组合物、10nM的诺考达唑(noco)或par与noco的组合物中的其一所处理的野生型或GSK3^S/A双基因敲入的小鼠(α/β)的解离的背根神经节(DRG)的轴突生长的量化。误差棒表示平均值的标准误差。统计显著性由方差分析和事后HolmSidak检验所确定。治疗效果与溶媒处理的α/β组相比，***p≤0.001，**p≤0.01。处理效果与溶媒处理的野生型组相比，^###p≤0.001，^##p≤0.01。图1D显示了轴突切断1天后，显示通过两区室腔的微通道生长的成年DRG神经元的βIII-微管蛋白阳性轴突的培养物。如图所示，将溶媒(veh)或5nM的小白菊内酯应用于体区室(par，soma)或轴突区室(par，axon)之一。比例尺：250μM。图1E显示了轴突切断1天后，通过两区室腔的微通道生长的培养物的轴突生长的量化。对5个实验的数据进行平均。误差棒表示平均值的标准误差。统计显著性由ANOVA和事后Holm Sidak检验所确定。处理效果：**p≤0.01。

图2显示了暴露于溶媒(-)、5μM的SB216763(sb)或10nM的小白菊内酯(par)3天后，来自野生型(wt)和GSK3^S/A双基因敲入(α/β)的小鼠的培养物的非去酪氨酸化微管蛋白阳性轴突尖端的量化。来自三个独立实验的数据被归一化到溶媒处理的wt组。误差棒表示平均值的标准误差。统计显著性由ANOVA和事后Holm Sidak检验所确定。处理效果：***p≤0.001。

图3为基于SCG10染色的轴突的坐骨神经在夹伤的3天后，溶媒或如图所示的不同小白菊内酯浓度处理后坐骨神经的轴突再生量化。各处理组的动物量化如图中所示出的。

图4：图4A和图4B显示了神经内注射了溶媒(veh)或50nM的小白菊内酯(par)的坐骨神经SNC3天后的纵向切片。再生的轴突对SCG10(图4A)或pMAP1B(图4B)免疫组化染色。比例尺：500μm。星号表示夹伤点。图4C显示了来自如4A或4B中描述的，用溶媒(veh)或小白菊内酯(par)处理的动物的坐骨神经，在超过损伤点>1.5、>2、>2.5和>3毫米处的轴突量化。误差棒表示平均值的标准误差。统计显著性由ANOVA和事后Holm Sidak检验所确定。处理效果：***p≤0.001。图4D显示了来自坐骨神经夹伤和小白菊内酯(par)或溶媒(veh)处理4天后的小鼠的拇长伸肌整体的α-银环蛇毒素(BTX)和的神经丝(NF)的染色。白色箭头表示小白菊内酯处理的小鼠的重建的突触。比例尺：50μM。图4E显示了坐骨神经夹伤1、4、7、9、12、14和21天后(dpc)，由小白菊内酯(par，n＝11)或溶媒(veh，n＝11)处理的成年野生型小鼠中通过静止坐骨神经指数(SSI)测定的功能性运动恢复的量化。**p≤0.01；***p≤0.001。图4F显示了坐骨神经夹伤1、4、7、9、12、14和21天后，由小白菊内酯(par，n＝11)或溶媒(veh，n＝11)处理的成年野生型小鼠中通过von Frey测试测定的感觉功能性恢复的量化。处理效果：**p≤0.01；***p≤0.05。

图5为不同的蓟苦素和小白菊内酯(par)处理后的野生型DRG培养物中轴突生长的量化。来自被处理的神经元的数据被归一到溶媒对照组，对于小白菊内酯处理的轴突平均长度为933μm/神经元，对于蓟苦素处理的轴突平均长度为546μm/神经元。数据表示三次独立实验的平均值±标准误。与溶媒对照组向对比的处理效果：**p≤0.01，***p≤0.001，^##p≤0.01，^###p≤0.001。

图6：图6A显示了坐骨神经夹伤(SNC)且单次神经内注射(i.n.)溶媒(上)或小白菊内酯(6.25pg par；中)或腹腔注射(200ng/kg；下)3天后的代表性的坐骨神经纵向切片。再生的轴突由SCG10免疫组化染色。比例尺：500μm。星号表示夹伤点。图6B至6D显示了图6A中各个区域的放大；图6E和6F显示了来自如所描述的，用溶媒(veh)或几种剂量的小白菊内酯(par)神经内(E)或腹腔内地(F)注射的小鼠的坐骨神经，在超过损伤点1.5、2、2.5和3mm处的轴突量化。数据表示每个实验组至少6只个体小鼠的5个切片的平均值±标准误。处理效果与注射溶媒的动物相比，*p≤0.05，**p≤0.01,***p≤0.001。

图7显示了用1nM的小白菊内酯(par)、锂(li)或同时使用两种如所述处理的成年视网膜神经节细胞的神经突的生长的量化。与溶媒对照组(’)相比较的处理效果：**p≤0.01。

具体实施方式

示例

材料与方法：

小白菊内酯从Sigma-Aldrich(圣路易斯市，密苏里州)采购，并且被溶解于二甲基亚砜(DMSO)以产生合适的浓度。诺考达唑从Sigma-Aldrich(密苏里州，圣路易斯市)采购，并且被溶解于DMSO以产生合适的浓度。SB216763从Sigma-Aldrich(圣路易斯市，密苏里州)采购，并且被溶解于DMSO以产生合适的浓度。

手术操作：

雄性与雌性成年(8-12周)野生型和具有C57BL/6,129/O1a遗传背景的GSK3α^S21A/GSK3β^S9A小鼠(Prof.Dr.Alessi,邓迪大学)保持在12小时光/暗周期，随意获取食物和水，并用于所有的研究，但研究小白菊内酯的效果的实验除外。小白菊内酯实验使用的是具有C57BL/6J背景的小鼠。将动物在相同条件下饲养至少10天，然后在实验中使用。坐骨神经夹伤(SNC)按照Gobrecht等人于Nature communications(自然通讯)2014；5:4561.中所描述的进行。简而言之，通过腹腔内注射氯胺酮(60-80mg/kg，Pfizer，纽约，美国纽约州)和赛拉嗪(10-15mg/kg,Bayer，勒沃库森，德国)将动物麻醉。在臀部区域上进行约10mm的皮肤切口，以暴露从坐骨切迹到三叉神经点的右坐骨神经。股后肌群肌肉组织被小心地展开以最小化组织损伤。使用Dumont#5钳子(Hermle，图特林根，德国)和碳(Sigma)标记，在胫骨和腓骨分割的近端进行夹伤损伤30秒。使用6-0缝合线缝合皮肤。

神经夹伤后立即使用微细管和Nanoject IITM注射器(Drummond Scientific,布鲁莫尔,美国宾夕法尼亚州)进行坐骨神经的神经损伤点的注射。进行五次连续的69nl(纳升)注射，每次速度为23nl/秒，注射间隔为30秒。

DRG神经元培养和免疫细胞化学染色操作：

背根神经节(DRG)神经元按照Gobrecht等人于Nature communications(自然通讯)2014；5:4561.中所描述的，从成年野生型(wt)和GSK3α/GSK3β小鼠中分离。DRGs(T8-L6)由在DMEM(Life Technologies，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)中的0.25％的胰蛋白酶/EDTA(GE Healthcare，查尔芬特-圣贾尔斯，英国)和0.3％的胶原酶IA(Sigma，圣路易斯市，密苏里州)中以37℃和5％的CO₂培育45分钟并机械解离而收集。细胞重悬于包括10％胎牛血清(GEHealthcare)青霉素/链霉素(500U/ml；Merck Millipore，比尔里卡，美国马塞诸塞州)和5-氟-2'-脱氧尿苷(100nM；Sigma)的DMEM中。细胞在37℃和5％的CO₂下用多聚-D-赖氨酸(PDL，0.1mg/ml，分子量<300,000kDa；Sigma)和层粘连蛋白(20μg/ml；Sigma)包被的96孔板(Nunc，德国)培养。

为了评估在神经元轴突尖端的苏氨酸1265的磷酸化或去酪氨酸化微管蛋白水平，用溶媒、5μM的SB216763或1nM的小白菊内酯处理细胞培养物并培养3天。之后，用针对βIII-微管蛋白(1:2000；Covance)和pMAP1B(1：1000；Thermo Scientific)或者去酪氨酸化微管蛋白(1：2000；Millipore)的抗体染色培养物。轴突尖端被认为是βIII-微管蛋白阳性的神经元延伸的最后15μm。数据表示为来自至少两个单独实验的三个重复孔的平均值±标准误。使用单向或双向方差分析(ANOVA)随后进行Holm-Sidak事后检验评估组间差异的统计显著性。

两区室腔培养物：

两区室腔(AXIS^TM轴突隔离装置,Millipore)安装在PDL和层粘连蛋白包被的培养皿上。成年小鼠的DEG神经元于体区室中培养3天，直至神经元延伸轴突通过所有微通道。然后通过从轴突区室中快速去除培养基而轴突切断神经元。之后，小白菊内酯(5nM)或溶媒被应用于体侧或轴突侧。体区室和轴突区室之间建立的流体静压产生了流体流动，阻止药物扩散到微通道中。培养24小时后，用4％的PFA固定神经元。在免疫细胞化学βIII微管蛋白染色后，量化平均神经元长度。

α-银环蛇毒素(BTX)拇长伸肌染色：

为了分析神经肌肉接点的重建，在培养4天后处死小鼠。拇长伸肌的肌肉解剖并固定于PFA中，如Gobrecht等人于Nature communications(自然通讯)2014；5:4561.中所描述。之后，肌肉在2％的TritonX中在PBS中透化处理过夜。轴突用神经丝抗体(1:2,000；Abcam)标记。通过与PBS-T中的Alexa594-缀合的α-银环蛇毒素(BTX)(1:1000；Invitrogen)一起培育1小时来显现突触。

坐骨神经组织中轴突再生的量化：

分离坐骨神经，后固定6小时，转移至在4℃下30％蔗糖过夜，并置于Tissue-Tek(Sakura，莱顿，荷兰)。在低温恒温器(Leica，韦茨拉尔，德国)上切割纵向和横切面，融裱到包被的玻片(Superfrost plus，Fisher，匹兹堡，美国宾夕法尼亚州)上，并储存于-20℃下以用于进一步使用。使用再生关联的蛋白SCG10(1：1,500；Novus Biologicals，剑桥，UK)或pMAP1B(1:500；Thermo Scientific)的抗体对坐骨神经的冰冻组织切片(14μm)进行免疫组化染色。按照Gobrecht等人于Nature communications(自然通讯)2014；5:4561.中所描述的，在超过碳标记的损伤点的几个点量化SCG-10阳性的轴突。使用单向ANOVA，然后进行Holm-Sidak事后检验评估组间差异的统计学显著性。各实验组包括来自5只小鼠的至少5个切片。

静止坐骨神经指数：

11只神经内注射溶媒的C57BL/6J小鼠和11只小白菊内酯处理的动物中的功能性运动恢复通过计算静止坐骨神经指数(SSI)量化，如Baptista AF等人于Neurosci Methods(神经科学方法)2007；161(2):259-64.中所描述的。

从地面抬起小鼠，分别地拍摄左右后脚。在SNC后的第0、1、4、7、9、11、14、17和21天，通过测量爪长度(PL)和第一和第五脚趾之间距离(FF)估计野生型和转基因GSK3基因敲入小鼠在坐骨神经夹伤对侧(C，左)和同侧(I，右)的趾展。基于上述公式计算静止坐骨神经指数SSI：SSI＝101.3((IFF-CFF)/CFF)-54.03((IPL-CPL)/CPL)-9.5，如Baptista AF等人于Neurosci Methods(神经科学方法)2007；161(2):259-64.中所述。

数据以每个实验组8-10只动物的平均值±标准误表示。使用双向ANOVA，然后进行Holm-Sidak事后检验评估组间差异的统计学显著性。

Von Frey检验：

如Gobrecht等人于Nature communications(自然通讯)2014；5:4561.中所描述，SNC后的功能性感觉恢复通过每个实验组11只动物在SNC的0、1、4、7、14和21天后的VonFrey纤维丝测试所测定。测试在各天的同一时间由同一实验者进行。

为此，小鼠被放置于高架金属网格(网格大小：2mm)上，并使其适应15分钟。之后，考虑同侧后爪对范围内无害的von Frey纤维丝(Muromachi Kikai Co.,LTD，东京，日本)的反应，从最小的纤维丝开始，增加纤维丝尺寸直到出现阳性反应，显示为爪的急剧收回。使用双向ANOVA，然后进行Holm-Sidak事后检验评估组间差异的统计学显著性。

例1：通过体外小白菊内酯在轴突尖端中抑制微管蛋白羧肽酶进行轴突再生1.1测定培养物中的轴突生长

微管蛋白羧肽酶(TCP)抑制剂小白菊内酯对于成熟神经元的轴突生长的影响在通过上文所述的方法从野生型小鼠解离的DRG神经元中测定。细胞用溶媒、0.1nM、1nM、2.5nM、5nM、10nM或100nM小白菊内酯处理并培养2天。

图1A显示了用溶媒、1nM、10nM和100nM小白菊内酯处理的细胞，培养2天后用βIII-微管蛋白染色。图1B显示了神经元培养物的轴突生长的量化。来自3个独立的实验的数据被归一化到溶媒处理的对照组，轴突生长的平均长度为933μm/神经元。从图1A和1B可以看出，小白菊内酯显著地并且浓度依赖性地增加了轴突生长。测量到的最强的影响发生在1nM和5nM，而浓度≥100nM时培养物中的轴突生长减少。这表明小白菊内酯的作用是浓度依赖性的。

1.2微管动力学调控的测定

为了验证小白菊内酯对于轴突生长的影响是由微管动力学调控而介导，针对已知的可以使得微管失稳和减少轴突生长的糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂SB216763(sb)和诺考达唑(noco)评估了小白菊内酯的作用。

糖原合成酶激酶3(GSK3)是一种包括两种亚型(GSK3α和GSK3β)的蛋白激酶。通过坐骨神经夹伤(SNC)的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号,两种亚型均被磷酸化和失活。在GSK3α/GSK3β双基因敲入的小鼠(GSK3^S/A)中，GSK3α的丝氨酸21和GSK3β的丝氨酸9被丙氨酸所取代，通过AKT的抑制的GSK3磷酸化被阻止，从而表达GSK0033组成性激活。持续的GSK激活明显地加速坐骨神经夹伤后的轴突再生。这些作用与提高的MAP1B磷酸化关联。

来自野生型和和GSK3α/GSK3β双基因敲入的成年小鼠的解离的DRG神经元分别用溶媒(veh)、5μM的GSK3β抑制剂SB216763(sb)、1nM小白菊内酯(par)、5μM的sb与1nM的par的组合物、10nM的诺考达唑(noco)或par与noco的组合物处理并培养2天。图1C显示了培养2天后各轴突生长的量化。从图1C中可以看出，小白菊内酯的有益效果不受SB216763影响，但有效地阻断了GSK3α/GSK3β促进轴突生长。相比之下，诺考达唑消除了了GSK3α^S/A/GSK3β^S/A和小白菊内酯的相似程度的有益效果，这表明小白菊内酯和GSK3α^S/A/GSK3β^S/A都增加对微管破坏剂的易感性。

这个发现表明，小白菊内酯对于轴突再生的积极作用有可能通过微管动力学的调控而介导。

1.3小白菊内酯与已有轴突相互作用的测定

为了验证小白菊内酯在培养物中与已有的轴突直接相互作用而不是引发轴突形成，并且也足以促进已经生长刺激的DRG神经元，使用两区室平台，平台允许体和轴突的区室可以如上文所述的具有流体分离。为此，将成年DRG神经元在两区室腔中培养3天，使其处于再生状态，然后进行轴突切断。轴突切断1天后将溶媒(veh)或5nM的小白菊内酯应用于体区室(par，soma)或轴突区室(par，axon)，同时另一个区室分别用溶媒处理。对照组细胞的各区室都使用溶媒。

图1D显示了轴突切断1天后，通过两区室腔的微通道生长的成年DRG神经元的βIII-微管蛋白阳性轴突。图1E显示了轴突切断1天后的轴突生长的量化。对5次试验的数据进行平均。从图1E中可以看出，尽管体腔中的小白菊内酯没有比溶媒处理的组提高轴突生长，但轴突腔中的小白菊内酯显著地增加了轴突再生。这说明已有的轴突的长度由于小白菊内酯而增加。

该观察结果表明，小白菊内酯的中度的药理的TCP抑制增加了微管的动力，并且导致培养的神经元的轴突生长促进。

例2：测定小白菊内酯在体外影响微管去酪氨酸化

为了验证小白菊内酯通过抑制微管蛋白去酪氨酸化促进成熟神经元的轴突生长，来自野生型(wt)或GSK3^S/A双基因敲入(α/β)的小鼠的DRG神经元的轴突尖端被暴露于溶媒(-)、5μM的GSK3抑制剂SB216763(sb)或10nM的小白菊内酯(par)。暴露3天后轴突为去酪氨酸化微管蛋白和βIII-微管蛋白染色。可以看出，小白菊内酯处理降低了轴突尖端中去酪氨酸化微管蛋白的水平。图2显示了暴露于溶媒(-)、5μM的SB216763(sb)或10nM的小白菊内酯(par)3天后，来自wt和GSK3^S/A双基因敲入(α/β)的小鼠的培养物的非去酪氨酸化微管蛋白阳性轴突尖端的量化。来自三个独立的实验的数据被归一化到溶媒处理的wt组。从图2中可以看出，小白菊内酯显著地增加了成年野生型神经元中非去酪氨酸化轴突尖端的百分比，并且与GSK3α/GSK3β神经元中测量的程度相似。

这说明小白菊内酯通过抑制微管蛋白去酪氨酸化，促进成熟神经元中的轴突生长。

例3：测定体内小白菊内酯对于坐骨神经再生影响的效果的浓度依赖性

0.01μM、0.05μM、0.1μM、1μM、10μM和100μM的增加浓度的小白菊内酯在野生型小鼠坐骨神经损伤后立即应用于夹伤点，并评估坐骨神经切片中的轴突再生以测定浓度的影响。坐骨神经夹伤与处理3天后，坐骨神经分离，并用针对再生关联蛋白质SCG10的抗体染色。在超过碳标记的损伤点2mm和3mm处量化SCG10阳性的轴突。对于溶媒和0.5μM的小白菊内酯组，每组使用5只动物，对于其他浓度，每组使用了2只。每只动物分析了5个坐骨神经切片。

图3显示了坐骨神经夹伤3天后由溶媒(veh)或不同浓度的小白菊内酯处理后的坐骨神经的轴突再生量化。从图3可以看出，范围从0.01μM到0.1μM的浓度明显地且类似地增加了SNC3天后受损伤坐骨神经的轴突再生，而高于10μM的浓度反而减少轴突再生。

例4：体内的神经内小白菊内酯应用

4.1：体内坐骨神经再生的测定

为了研究小白菊内酯的神经内应用是否促进体内坐骨神经再生，50nM的小白菊内酯或溶媒与手术同时地应用于野生型小鼠的夹伤的坐骨神经，并且对于再生的影响在SNC3天后测定。

图4A和图4B显示了神经内注射了溶媒(veh)或50nM的小白菊内酯(par)的坐骨神经SNC3天后的纵向切片。再生的轴突对如图4A中显示的SCG10或如图4B中所显示的pMAP1B免疫组化染色。从图4A和图4B可以看出，小白菊内酯处理使得轴突能在超过损伤点长距离处再生且没有提升轴突的pMAP1B水平。图4C显示了如上文描述的用溶媒(veh)或小白菊内酯(par)处理的动物的坐骨神经，在超过损伤点>1.5mm、>2mm、>2.5mm和>3mm处的轴突量化。从图4C中可以看出，与溶媒处理的对照组相比，小白菊内酯的应用明显地增加了超过损伤点2.5mm处的轴突的数量>6倍。在手术后用小白菊内酯处理3天后才观察到在超过损伤点3mm距离处的轴突。

该发现显示了与溶媒处理的对照组相比，单次的注射足够显著地加速功能性再生。假设重复的TCP抑制剂的神经内注射或药物的全身应用可以进一步地加速轴突再生。另外，与GSK3α^S/A/GSK3β^S/A基因敲入的动物相比较，小白菊内酯的轴突再生作用更强，且不与增加的MAP1B磷酸化关联。

4.2小白菊内酯处理后神经肌肉接点的重建的测定

为了验证小白菊内酯处理4天后的再生的轴突已经成功地重新神经支配它们的目标，进行了拇长伸肌的BTX和神经丝染色。小鼠在SNC和用50nM的小白菊内酯(par)处理4天后处死，拇长伸肌的肌肉被解剖和染色。图4D显示了坐骨神经夹伤和小白菊内酯(par)或溶媒(veh)处理4天后的小鼠的拇长伸肌整体的α-银环蛇毒素(BTX)和的神经丝(NF)的染色。如图4D所示，在小白菊内酯处理的动物中发现了神经肌肉接点，而溶媒处理的对照组中没有发现。

4.3功能性恢复的测定

为了测试是否小白菊内酯的应用也加速体内的功能性恢复，使用上文所述的静止坐骨神经指数和von Frey测试来功能性地估测坐骨神经夹伤后用5nM的小白菊内酯处理的成年野生型小鼠的再生结果。

图4E显示了坐骨神经夹伤1、4、7、9、12、14和21天后(dpc)，由小白菊内酯(par，n＝11)或溶媒(veh，n＝11)处理的成年野生型小鼠中通过静止坐骨神经指数(SSI)测定的功能性运动恢复的量化。从图4E中可以看出，与溶媒处理的对照组动物在整个3周的观察期间持续的相比，小白菊内酯处理的动物在受伤后的4天就已经显示出了显著的SSI的提升。

图4F显示了坐骨神经夹伤1、4、7、9、12、14和21天后，由小白菊内酯(par，n＝11)或溶媒(veh，n＝11)处理的成年野生型小鼠中通过von Frey测试测定的感觉功能性恢复的量化。从图4F中可以看出，小白菊内酯的处理也加速了感觉恢复。损伤后第7天，von Frey测试可以检测到第一个改善，并且在12和14天仍然显著，因此反映为了达到各自的感觉恢复的目标，轴突需要较长的距离。

这些数据说明小白菊内酯的神经内应用明显地促进了坐骨神经的再生，并且加速了体内功能性运动和感觉恢复。

例5：应用小白菊内酯和蓟苦素后的体外轴突生长的测定

背根神经节(DRG)神经元按照Gobrecht等人于Nature communications(自然通讯)2014；5:4561.中所描述的，从成年野生型(wt)和GSK3α/GSK3β小鼠中分离。DRGs(T8-L6)由在DMEM(Life Technologies，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)中的0.25％的胰蛋白酶/EDTA(GE Healthcare，查尔芬特-圣贾尔斯，英国)和0.3％的胶原酶IA(Sigma，圣路易斯市，密苏里州)中以37℃和5％的CO₂培育45分钟并机械解离而收集。细胞重悬于包括10％胎牛血清(GEHealthcare)青霉素/链霉素(500U/ml；Merck Millipore，比尔里卡，美国马塞诸塞州)和5-氟-2'-脱氧尿苷(100nM；Sigma)的DMEM中。细胞在37℃和5％的CO₂下用多聚-D-赖氨酸(PDL，0.1mg/ml，分子量<300,000kDa；Sigma)和层粘连蛋白(20μg/ml；Sigma)包被的96孔板(Nunc，德国)培养。细胞用溶媒或0.1nM、1nM、2.5nM、5nM、10nM或100nM小白菊内酯(Sigma-Aldrich)或蓟苦素(Extrasynthese)处理并培养2天。

通过在4％PFA(Sigma)中固定并用针对NeuN(1：2,000；Abcam，ab177487，剑桥，英国)和βIII-微管蛋白(1:2000；Covance，普林斯顿，美国新泽西州)的抗体进行免疫细胞化学染色来测定轴突生长。使用Pathway 855显微镜系统(BD，富兰克林湖，美国新泽西州)和Attovision软件自动进行每个孔的总轴突长度和神经元数量的成像和量化，避免了实验者引起的量化偏差。每个神经元的轴突长度和每个实验组的神经元数量被归一化到对照组。

图5显示了神经元培养物的轴突生长的量化。数据表示每个实验至少6个重复孔和3次独立实验的平均值±标准误。使用单向或双向方差分析(ANOVA)随后进行Holm-Sidak事后检验评估组间差异的统计显著性。从图5中可以看出，小白菊内酯显著地并且浓度依赖性地增加了轴突生长。测量到的最强的影响发生在1nM和5nM，而浓度≥100nM时培养物中的轴突生长减少。这表明小白菊内酯的作用是浓度依赖性的。由于细胞数量对于所有测试浓度都不受影响，因此未观察到一般毒性。与小白菊内酯相比，衍生的蓟苦素也显示了显著的，但较不明确的轴突生长促进，最强的作用发生在0.5nM浓度。

例6：神经内和全身应用小白菊内酯后体内坐骨神经再生的测定

6.1：神经内小白菊内酯应用

如例4.1所描述的，对野生型小鼠手术后立即对坐骨神经的夹伤点应用1.25pg、6.25pg、12.5pg、125pg、1,250pg和12,500pg剂量的小白菊内酯，并且3天后测定再生的效果。

图6A、6B和6C显示了坐骨神经夹伤(SNC)且单次神经内注射(i.n.)溶媒(上)或小白菊内酯(6.25pg par；中间)3天后的坐骨神经纵向切片。图6B和6C显示了图6A中各个区域的放大。从图6A、图6B和图6C中可以看出，在溶媒注射的动物(B)中，超过受损点约2.5mm处仅探测到少量的轴突轮廓，而神经内小白菊内酯注射(C)后明显地出现了更多的再生的轴突。图6E显示了神经内地注射溶媒(veh)或小白菊内酯后的小鼠的坐骨神经在超过损伤点1.5、2、2.5和3mm处的轴突量化。从图6E中可以看出，从1.25至12.5pg范围内剂量的神经内应用明显地增加了SNC3天后的轴突再生。测定到最强的生长促进出现在6.25pg和12.5pg，与溶媒处理的对照组相比较，在超过受损点2.5mm处增加了多于3倍的轴突数量。

6.2：小白菊内酯的全身应用

为了测试全身性小白菊内酯施用是否能促进坐骨神经再生，坐骨神经受损后腹腔内地注射20ng/kg、200ng/kg、2μg/kg和20μg/kg剂量的小白菊内酯。

图6A和6D显示了坐骨神经夹伤(SNC)且单次腹腔(i.p.)注射小白菊内酯(200ng/kg；下)3天后的代坐骨神经纵向切片。图6D显示了图6A中腹腔(i.p.)小白菊内酯注射后区域的放大。从图6A和6D中可以看出，腹腔(D)小白菊内酯注射后，再生的轴突也显著地更多。图6F显示了使用溶媒(veh)或小白菊内酯腹腔内注射的坐骨神经的纵向切片上在超过损伤点1.5、2、2.5和3mm处的轴突量化。从图6F中可以看出，200ng/kg的单次注射显著地增加了2.5mm处的再生的轴突数量约2.5倍，与神经内小白菊内酯应用的结果相比稍微不明显。测试的更高的剂量没有显著地影响坐骨神经再生。

这些数据说明小白菊内酯的全身性应用也明显地促进了坐骨神经再生，并且加速了体内功能性运动和感觉恢复。

例7：小白菊内酯对于中枢神经系统细胞的作用的测定

为了测试小白菊内酯对于中枢神经系统的细胞是否有效果，测定了成年视网膜神经节细胞的神经突生长。为此，解离成年小鼠视网膜，在加入溶媒(-)、锂(li)或小白菊内酯(Par，1nM)存在下培养4天。细胞被固定且用βIII微管蛋白染色，测定各视网膜神经节细胞的神经突长度。图7显示了用1nM的小白菊内酯(par)、锂(li)或同时使用处理的成年视网膜神经节细胞的神经突的生长的量化。从图7中可以看出，于未处理的对照组相比，小白菊内酯明显地且显著地促进了神经突生长。锂没有显示出显著的效果，但进一步加强了小白菊内酯的有益效果。

这些数据说明小白菊内酯不仅能促进周围神经例如坐骨神经的神经再生，也能促进中枢神经元再生。这一发现表明，小白菊内酯也可能用于促进中枢神经系统神经再生，例如视神经或脊髓损伤后的再生。

这些数据共同提供了一种促进神经再生和治疗神经受损的新颖的治疗方法。显示了，在体内使用小白菊内酯的通过药理学的TCP抑制剂来抑制受损神经中的生长锥中的微管蛋白去酪氨酸化提供了一种新颖并且临床上可行的方法来加速轴突再生和改善功能性恢复。

Claims

1.一种减少轴突尖端中微管蛋白去酪氨酸化的化合物在制备治疗轴突损伤的药物中的应用，所述化合物选自微管蛋白羧肽酶抑制剂，所述微管蛋白羧肽酶抑制剂选自小白菊内酯、所述小白菊内酯的药学上可接受的盐、蓟苦素或所述蓟苦素的药学上可接受的盐，其中所述轴突损伤为周围神经系统或颅神经的受损，或与损伤的或移植的视网膜的去神经支配关联，并且其中所述化合物用于轴突再生。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述轴突损伤是坐骨神经或视神经的受损。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述轴突损伤与周围神经病变或青光眼关联。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述轴突损伤与受损的视神经或三叉神经中轴突切断的纤维关联。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述轴突损伤与所述三叉神经的眼支中轴突切断的纤维关联。

6.一种组合物在制备治疗轴突损伤的药物中的应用，所述组合物包括作为有效成分的降低轴突尖端中的微管蛋白去酪氨酸化的化合物，所述化合物选自微管蛋白羧肽酶抑制剂，所述微管蛋白羧肽酶抑制剂选自小白菊内酯、所述小白菊内酯的药学上可接受的盐、蓟苦素或所述蓟苦素的药学上可接受的盐，其中所述轴突损伤为周围神经系统或颅神经的受损，或与损伤的或移植的视网膜的去神经支配关联，并且其中所述化合物用于轴突再生。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述组合物被配制为用于局部或全身应用。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述化合物被配制为用于眼内应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述组合物被配制为滴眼液。