KR20200101948A - 신경계 질환 치료제 - Google Patents
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Abstract
신경계 질환의 치료에 있어서 유용한 약제를 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명에 의한 비타민 B12를 유효 성분으로 하는 약제는 M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 신경 재생 촉진 작용 등을 갖고, 신경계 질환, 특히 뇌경색, 인지증, 척수 손상 등의 중추신경계 질환의 치료제로서 매우 유용성이 높은 것이다.
Description
본 발명은 신경계 질환 치료제 등에 관한 것이다.
신경계 질환이란 뇌, 척수, 말초신경, 근육에 일어나는 질환이다. 이 중, 뇌, 척수에 일어나는 질환은 중추신경계 질환이라고 불린다. 뇌에 일어나는 중추신경계 질환의 대표적인 것으로서, 뇌경색, 인지증 등이 있다. 또한, 척수에 일어나는 중추신경계 질환의 대표적인 것으로서, 척수 손상 등이 있다.
뇌경색은 평성 26년(2014년) 1년간의 사인 제 4 위인 뇌혈관 장해의 약 60%를 차지하고, 감염 후에 개호가 필요하게 될 가능성이 높으며, 의료비의 면에서도 사회에 미치는 영향이 큰 질환이다. 뇌경색의 범위는 혈류가 완전하게 차단된 허혈 중심부(ischemic core, 단지 core, 핵이라고도 함)와 측부혈행로에 의해 혈류가 얻어지는 주변부 페넘브라(penumbra, 반영띠)로 나뉘어진다. Core부의 신경세포는 조속히 사멸하기 때문에(1차 손상), 이 부분의 레스큐는 곤란하지만, penumbra부는 세포사를 면하고 있는 부분이기 때문에 살아남을 가능성이 있어, 이 부분을 어떻게 레스큐할지가 뇌경색의 급성기 치료의 간이 된다. 뇌경색 병변부의 조직학적인 변화로서는 (1) 신경세포의 아폽토시스, (2) 염증의 야기, (3) 혈액뇌관문(BBB)의 붕괴 등이 일어나고 있다. 우리 나라에서 현재 사용되고 있는 뇌경색 치료약으로서는 우로키나아제나 항응고·항혈소판제 이외에, 혈액을 희석하는 것, 부종을 경감시키는 것 등이 있다. 프리라디칼을 제거하는 약제로서 에다라본(상품명 라디컷)이 2001년에 우리 나라에 있어서 승인되었지만, 구미 등에서는 아직 승인되어 있지 않다. 2005년부터는 혈전 용해 요법(t-PA)이 승인되었지만, 사용이 발병으로부터 4.5시간 이내에 한정되어 있다. 이와 같이, 2005년 이후에는 뇌경색의 새로운 치료약이 나오고 있지 않은 상황이다.
척수 손상은 본방에서 연간 5000명 정도가 신규 수상(受傷)한다고 보고되어 있으며, 동통이나 저림, 운동 기능 장해 등에 의해 QOL을 크게 저하시키는 원인이 된다. 척수 손상의 병태로서는, 수상시의 직달 외력에 의한 신경세포나 혈관 조직의 데미지(1차 손상)에 계속해서, 혈액척수관문의 파탄에 따른 일련의 반응(2차 손상)이 일어나는 것으로 손상 범위가 확대된다. 1차 손상은 피할 수 없는 것이며, 2차 손상을 어떻게 경감시킬지가 급성기∼아급성기 척수 손상 치료에 있어서 중요하게 된다. 그러나, 현재 임상에서 급성기 척수 손상에 대해 안전하게 사용할 수 있는 유효한 치료약은 존재하지 않고, 종래 사용되어 온 메틸프레드니솔론 대량 요법도, 그 부작용의 심각함때문에 미국의 급성기 척수 손상 치료 가이드라인에서는 『루틴하게 사용해서는 안된다』라고 명기되어, 척수 손상에 대하여는 유효한 신규 치료약이 절망되고 있는 상황이다.
말초 신경은 손상 후의 재생능을 갖고 있지만, 신경 기능의 회복은 충분하다고는 말할 수 없다. 신경이 손상되면, 왈러 변성에 의해 축색과 수초는 탐식 제거된다. 이어서, 재생 과정에 있어서, 미분화한 슈완 세포에서 형성되는 뷩너띠(Bungner’s band) 내를 재생 축색이 원위 방향으로 신장하여, 목표가 되는 근육의 재신경화가 일어난다. 최종적으로는, 재생 축색의 주위를 권취한 슈완 세포에 의한 수초가 형성된다. 그러나, 재생 신경의 신장 속도는 매우 늦어, 목표가 되는 근육까지의 거리가 긴 경우에는 근위축이 생겨서 충분한 기능 회복을 바랄 수 없게 된다. 그런데, 상술한 재생 과정의 각 단계에 있어서는 마크로파지가 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 최근 밝혀져 주목받고 있다. 마크로파지의 염증을 일으키는 작용은 잘 알려져 있지만, 이것과는 반대로 항염증성의 작용을 갖는 표현형도 갖고 있어, 각각 M1형, M2형이라고 불리고, 그 표현형간에는 연속성이 있는(M1-M2간의 시프트가 일어남) 것으로 생각되고 있다. 그리고, 일반적으로 항염증성의 표현형인 M2 마크로파지를 증가시킨 쪽이 신경 재생은 촉진되는 것으로 되어 있다.
한편, 중추신경에 있어서는 말초신경과 비교해서 재생 능력이 모자란 것이 알려져 있다. 중추신경 손상 후에는, 축색 주위에 수초를 형성하는 세포인 올리고덴드로사이트에 축색 신전 저해 물질이 발현되고, 또한 마크로파지/마이크로글리아, 아스트로사이트 등이 글리아 반흔을 형성해 축색 신전에 억제적으로 작용하는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 중추신경 손상 후에 있어서도 마크로파지/마이크로글리아의 염증 작용을 억제하는 것이 중요하고, 말초 신경과 마찬가지로 항염증성의 표현형인 M2마크로파지/마이크로글리아를 증가시킨 쪽이 신경 재생은 촉진되는 것으로 알려져 있다.
비타민 B12는 비타민 B12 결핍증의 치료에 유효하고, 비타민 B12 결핍증에서는 말초신경염, 척수 변화라고 한 신경학적 변화도 일어날 수 있는 것이 알려져 있다(특허문헌 1).
또한, 뇌허혈 환자는 건상자와 비교해서 혈중의 호모시스테인 농도가 높아지고 있으며, 혈중의 호모시스테인 농도와 뇌허혈의 관련이 시사되어 있다. 그리고, 엽산, 비타민 B6, B12 투여에서 혈중 호모시스테인 농도가 감소하는 것이 명확하게 되어 있으며, 호모시스테인 농도 저하가 뇌허혈의 리스크를 저하시킬 가능성이 시사되어 있다(비특허문헌 1).
또한, 액티빈류가 M2 마크로파지 유도에 의해 항염증 작용을 나타내는 것(특허문헌 2), 지방 조직 유래 간엽계 간세포를 함유하는 면역 억제제가 M2 마크로파지 유도 작용을 나타내는 것(특허문헌 3)이 알려져 있다.
그러나, 비타민 B12에 의해 M2 마크로파지/마이크로글리아 유도가 촉진되고, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도가 억제되는 것, 및 뇌경색 등의 신경 질환을 개선하는 것은 개시되어 있지 않다.
Current Medicinal Chemistry, 2007, Vol.14, No.3, p249-263
본 발명은 신경계 질환 치료제를 제공하는 것을 과제로 한다. 바람직하게는, 본 발명은 아폽토시스 억제 작용, 네크로시스 억제 작용, 축색 신전 촉진 작용, M2마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 및 신경 재생 촉진 작용으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종을 갖는 신경계 질환 치료제를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는 상기 과제를 감안하여 예의 연구를 진행시킨 결과, 비타민 B12가 신경계 질환 치료 효과를 갖는 것을 발견했다. 또한, 비타민 B12가 아폽토시스 억제 작용, 네크로시스 억제 작용, 축색 신전 촉진 작용, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 신경 재생 촉진 작용 등을 갖는 것도 발견했다. 이들의 지견에 의거해서 또한 연구를 진행시킨 결과, 본 발명이 완성되었다.
즉, 본 발명은 하기 형태를 포함한다:
항 1.
비타민 B12를 함유하는, 신경계 질환 치료제.
항 1A.
신경계 질환 치료를 필요로 하는 환자에 비타민 B12를 투여하는 것을 포함하는, 신경계 질환의 치료 방법.
항 1B1.
신경계 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, 비타민 B12.
항 1B2.
신경계 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, 비타민 B12 함유 조성물.
항 1C．
신경계 질환 치료제의 제조를 위한, 비타민 B12의 사용.
항 2. 항 1에 있어서,
M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진제인, 신경계 질환 치료제.
항 3. 항 1에 있어서,
M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제제인, 신경계 질환 치료제.
항 4. 항 1 내지 항 3 중 어느 하나에 있어서,
신경 재생 촉진제인, 신경계 질환 치료제.
항 5. 항 1 내지 항 4 중 어느 하나에 있어서,
상기 신경계 질환이 중추신경계 질환인, 신경계 질환 치료제.
항 6. 항 5에 있어서,
상기 중추신경계 질환이 뇌혈관 질환인, 신경계 질환 치료제.
항 7. 항 6에 있어서,
상기 뇌혈관 질환이 뇌경색, 뇌출혈, 뇌혈전증, 뇌동맥경화증 및 인지증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 신경계 질환 치료제.
항 8. 항 1 내지 항 4 중 어느 하나에 있어서,
상기 신경계 질환이 신경 손상인, 신경계 질환 치료제.
항 9. 항 8에 있어서,
상기 신경 손상이 중추신경 손상인, 신경계 질환 치료제.
항 10. 항 9에 있어서,
상기 중추신경 손상이 척수 손상인, 신경계 질환 치료제.
항 11. 항 1 내지 항 10 중 어느 하나에 있어서,
상기 비타민 B12가 메틸코발라민, 시아노코발라민, 히드록소코발라민, 술피드코발라민, 아데노실코발라민, 및 그것들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 신경계 질환 치료제.
항 12. 항 1 내지 항 11 중 어느 하나에 있어서,
상기 비타민 B12가 메틸코발라민인, 신경계 질환 치료제.
항 13. 항 1 내지 항 12 중 어느 하나에 있어서,
지속적으로 투여해서 사용되는, 신경계 질환 치료제.
항 14. 항 13에 있어서,
점적정주용 제제인, 신경계 질환 치료제.
항 15. 항 1 내지 항 14 중 어느 하나에 있어서,
발증으로부터 12∼24시간 경과 이후에 투여를 개시하도록 사용되는, 신경계 질환 치료제.
항 16. 항 1 내지 항 14 중 어느 하나에 있어서,
발증 직후로부터 12시간 이내에 투여를 개시하도록 사용되는, 신경계 질환 치료제.
도 1은 실시예 1의 TUNEL 어세이의 결과를 나타낸다. 세로축은 아폽토시스 세포 비율을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+)무(-)를 나타낸다. **는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 2는 실시예 2의 LDH 어세이의 결과를 나타낸다. 세로축은 네크로시스의 지표가 되는 LDH 활성의 고컨트롤에 대한 비율을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(10μM)무(-)를 나타낸다. *는 Student T 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 3은 실시예 3의 신경 돌기 신전 어세이의 결과를 나타낸다. 세로축은 30개 이상의 신경 축색의 평균값을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 농도(CTR은 미첨가)를 나타낸다. *는 CTR에 대한 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 4는 실시예 4의 TTC 염색 결과를 나타낸다. 세로축은 경색 체적을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(MeCbl)무(Control)를 나타낸다. **는 Student T 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 5는 실시예 5의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 GAPDH 단백질량에 대한 M1 마커(좌측 도면: IL-1β 단백질, 우측 도면: iNOS 단백질)량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 6은 실시예 5의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 GAPDH 단백질량에 대한 M2 마커(좌측 도면: Arginase I(Arg1) 단백질, 우측 도면: CD206 단백질)량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 7은 실시예 5의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 세로축은 좌측 도면: M1 마크로파지의 비율(iNOS 양성 세포의 비율), 우측 도면: M2 마크로파지의 비율(Arg1 양성 세포의 비율)을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. **는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 8a는 실시예 6의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 AKT 단백질량에 대한 인산화 AKT 단백질량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타내고, ***는 동 결과의 p값이 0.001 미만이었던 것을 나타낸다.
도 8b는 실시예 6의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 4EBP1 단백질량에 대한 인산화 4EBP1 단백질량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타내고, ***는 동 결과의 p값이 0.001 미만이었던 것을 나타낸다.
도 8c는 실시예 6의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 S6K 단백질량에 대한 인산화 S6K 단백질량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타내고, ***는 동 결과의 p값이 0.001 미만이었던 것을 나타낸다.
도 9는 실시예 7의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 각 열의 도면은 좌측으로부터 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M1 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M1 마크로파지 비율을 나타낸다. 가로축은 좌골신경 손상 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, #은 Student T 검정법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 10은 실시예 7의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 각 열의 도면은, 좌측으로부터 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은, 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M2 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M2 마크로파지 비율을 나타낸다. 가로축은 좌골신경 손상 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, #은 Student T 검정법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 11은 실시예 8의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 축색수를 나타내고, 중단의 도면은 수초화 축색수를 나타내고, 하단의 도면은 수초화율을 나타낸다. 가로축은 신경 횡단 절편을 제작한 위치(좌측으로부터, 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜)를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 12는 실시예 9의 BBB 스코어 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 BBB 스코어를 나타낸다. 가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수(0은 수술 전)를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Steel-Dwass test법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 13은 실시예 9의 Thermal algesimetry test의 결과를 나타낸다. 세로축은 우족저에 적외선 열자극을 주고, 뜨거움에 의해 뒷다리를 뺄 때까지의 시간을 나타낸다. 가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수(0은 수술 전)를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Steel-Dwass test법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 14는 실시예 10의 M1 마커(IL-1β 단백질 및 iNOS 단백질)의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 GAPDH 단백질량에 대한 M1 마커(IL-1β 단백질 또는iNOS 단백질)량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 15는 실시예 10의 M2 마커(Arg1 단백질 및 CD206 단백질)의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축, 가로축, 각 기호에 대해서는 도 14와 마찬가지이다.
도 16은 실시예 11의 수술 후 7일의 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각그래프는 부위에 따른 변화를 나타낸다. 각 도면의 가로축은 손상부로부터의 방향 및 거리를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M1 또는 M2 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M1 또는 M2 마크로파지 비율을 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 17은 실시예 11의 수술 후 14일의 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 그 밖에는, 도 16과 마찬가지이다.
도 18은 실시예 11의 수술 후 28일의 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 그 밖에는, 도 16과 마찬가지이다.
도 19는 실시예 11의 M1 마크로파지에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각 그래프는 수술 후의 경과일수에 의한 변화를 나타낸다. 각 열의 도면은 좌측으로부터, 손상부로부터의 방향 및 거리에 대해서 머리측 2㎜, 머리측 1㎜, 꼬리측 1㎜, 꼬리측 2㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M1 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M1 마크로파지 비율을 나타낸다. 가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 20은 실시예 11의 M2 마크로파지에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 그 밖에는 도 19와 마찬가지이다.
도 21은 실시예 11의 M1/M2비에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각그래프는 수술 후의 경과일수에 따른 변화를 나타낸다. 좌측으로부터, 손상부로부터의 방향 및 거리에 대해서 머리측 2㎜, 머리측 1㎜, 꼬리측 1㎜, 꼬리측 2㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은 M1/M2비를 나타낸다. 가로축은, 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 22는 실시예 11의 M1/M2비에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각그래프는 부위에 따른 변화를 나타낸다. 좌측으로부터, 척수 손상 모델 제작의 수술 후 7일, 14일, 28일 경과 후의 결과를 나타낸다. 세로축은 M1/M2비를 나타낸다.가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수를 나타낸다. 가로축은 손상부로부터의 방향 및 거리를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 23은 실시예 12의 로타로드 테스트의 결과를 나타낸다. 가로축은 뇌경색 수술 후의 경과일수를 나타내고, 세로축은 로타로드로부터 떨어질 때까지의 시간의 상대값을 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. **는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 2는 실시예 2의 LDH 어세이의 결과를 나타낸다. 세로축은 네크로시스의 지표가 되는 LDH 활성의 고컨트롤에 대한 비율을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(10μM)무(-)를 나타낸다. *는 Student T 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 3은 실시예 3의 신경 돌기 신전 어세이의 결과를 나타낸다. 세로축은 30개 이상의 신경 축색의 평균값을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 농도(CTR은 미첨가)를 나타낸다. *는 CTR에 대한 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 4는 실시예 4의 TTC 염색 결과를 나타낸다. 세로축은 경색 체적을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(MeCbl)무(Control)를 나타낸다. **는 Student T 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 5는 실시예 5의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 GAPDH 단백질량에 대한 M1 마커(좌측 도면: IL-1β 단백질, 우측 도면: iNOS 단백질)량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 6은 실시예 5의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 GAPDH 단백질량에 대한 M2 마커(좌측 도면: Arginase I(Arg1) 단백질, 우측 도면: CD206 단백질)량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 7은 실시예 5의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 세로축은 좌측 도면: M1 마크로파지의 비율(iNOS 양성 세포의 비율), 우측 도면: M2 마크로파지의 비율(Arg1 양성 세포의 비율)을 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. **는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 8a는 실시예 6의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 AKT 단백질량에 대한 인산화 AKT 단백질량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타내고, ***는 동 결과의 p값이 0.001 미만이었던 것을 나타낸다.
도 8b는 실시예 6의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 4EBP1 단백질량에 대한 인산화 4EBP1 단백질량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타내고, ***는 동 결과의 p값이 0.001 미만이었던 것을 나타낸다.
도 8c는 실시예 6의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 S6K 단백질량에 대한 인산화 S6K 단백질량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타내고, ***는 동 결과의 p값이 0.001 미만이었던 것을 나타낸다.
도 9는 실시예 7의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 각 열의 도면은 좌측으로부터 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M1 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M1 마크로파지 비율을 나타낸다. 가로축은 좌골신경 손상 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, #은 Student T 검정법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 10은 실시예 7의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 각 열의 도면은, 좌측으로부터 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은, 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M2 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M2 마크로파지 비율을 나타낸다. 가로축은 좌골신경 손상 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, #은 Student T 검정법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 11은 실시예 8의 면역조직학적 평가의 결과를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 축색수를 나타내고, 중단의 도면은 수초화 축색수를 나타내고, 하단의 도면은 수초화율을 나타낸다. 가로축은 신경 횡단 절편을 제작한 위치(좌측으로부터, 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜)를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Tukey-Kramer법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 12는 실시예 9의 BBB 스코어 측정 결과를 나타낸다. 세로축은 BBB 스코어를 나타낸다. 가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수(0은 수술 전)를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Steel-Dwass test법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 13은 실시예 9의 Thermal algesimetry test의 결과를 나타낸다. 세로축은 우족저에 적외선 열자극을 주고, 뜨거움에 의해 뒷다리를 뺄 때까지의 시간을 나타낸다. 가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수(0은 수술 전)를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타내고, Sham은 좌골신경 전개만을 행한 비손상군을 나타낸다. *는 Steel-Dwass test법에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타낸다.
도 14는 실시예 10의 M1 마커(IL-1β 단백질 및 iNOS 단백질)의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축은 GAPDH 단백질량에 대한 M1 마커(IL-1β 단백질 또는iNOS 단백질)량의 비를 나타낸다. 가로축은 첨가한 약제의 종류 및 그 유(+ 또는 농도)무(-)를 나타낸다. *는 Dunnet 검정법에 의한 통계 해석의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 동 결과의 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 15는 실시예 10의 M2 마커(Arg1 단백질 및 CD206 단백질)의 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다. 세로축, 가로축, 각 기호에 대해서는 도 14와 마찬가지이다.
도 16은 실시예 11의 수술 후 7일의 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각그래프는 부위에 따른 변화를 나타낸다. 각 도면의 가로축은 손상부로부터의 방향 및 거리를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M1 또는 M2 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M1 또는 M2 마크로파지 비율을 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 17은 실시예 11의 수술 후 14일의 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 그 밖에는, 도 16과 마찬가지이다.
도 18은 실시예 11의 수술 후 28일의 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 그 밖에는, 도 16과 마찬가지이다.
도 19는 실시예 11의 M1 마크로파지에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각 그래프는 수술 후의 경과일수에 의한 변화를 나타낸다. 각 열의 도면은 좌측으로부터, 손상부로부터의 방향 및 거리에 대해서 머리측 2㎜, 머리측 1㎜, 꼬리측 1㎜, 꼬리측 2㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은 상단의 도면은 마크로파지수를 나타내고, 중단의 도면은 M1 마크로파지수를 나타내고, 하단의 도면은 M1 마크로파지 비율을 나타낸다. 가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 20은 실시예 11의 M2 마크로파지에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 그 밖에는 도 19와 마찬가지이다.
도 21은 실시예 11의 M1/M2비에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각그래프는 수술 후의 경과일수에 따른 변화를 나타낸다. 좌측으로부터, 손상부로부터의 방향 및 거리에 대해서 머리측 2㎜, 머리측 1㎜, 꼬리측 1㎜, 꼬리측 2㎜의 결과를 나타낸다. 세로축은 M1/M2비를 나타낸다. 가로축은, 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 22는 실시예 11의 M1/M2비에 관한 면역 형광 염색의 결과를 나타낸다. 각그래프는 부위에 따른 변화를 나타낸다. 좌측으로부터, 척수 손상 모델 제작의 수술 후 7일, 14일, 28일 경과 후의 결과를 나타낸다. 세로축은 M1/M2비를 나타낸다.가로축은 척수 손상 모델 제작의 수술 후의 경과일수를 나타낸다. 가로축은 손상부로부터의 방향 및 거리를 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. *는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.05 미만이었던 것을 나타내고, **는 p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
도 23은 실시예 12의 로타로드 테스트의 결과를 나타낸다. 가로축은 뇌경색 수술 후의 경과일수를 나타내고, 세로축은 로타로드로부터 떨어질 때까지의 시간의 상대값을 나타낸다. CTR은 미치료군을 나타내고, MeCbl은 메틸코발라민 투여군을 나타낸다. **는 Mann Whitney U test에 의한 통계 해석(CTR v.s. MeCbl)의 결과, p값이 0.01 미만이었던 것을 나타낸다.
본원에 있어서, 「함유」 및 「포함한다」라는 표현에 대해서는, 「함유」, 「포함한다」, 「실질적으로 이루어진다」 및 「만으로 이루어진다」라고 하는 개념을 포함한다.
본원에 있어서, 「마크로파지/마이크로글리아」는 「마크로파지 및/또는 마이크로글리아」를 의미하고, 「마크로파지 및 마이크로글리아」의 의미, 「마크로파지 또는 마이크로글리아」의 의미의 양쪽을 포함하는 용어이다.
본 발명은, 그 일 형태에 있어서, 비타민 B12를 함유하는 신경계 질환 치료제, 아폽토시스 억제제, 네크로시스 억제제, 축색 신전 촉진제, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진제, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제제, 신경 재생 촉진제 등(본 명세서에 있어서, 「본 발명의 제」라고 나타내는 것도 있음)에 관한 것이다. 이하, 이것들에 대해여 설명한다.
1. 유효성분
비타민 B12에는 코발라민, 그 유도체, 및 그것들의 염이 포함된다. 비타민 B12로서, 구체적으로는 코발라민, 코발라민의 코발트 이온이 치환된 것, 및 그것들의 유도체가 예시된다. 보다 구체적인 예로서는, 메틸코발라민, 시아노코발라민, 히드록소코발라민, 술피드코발라민, 아데노실코발라민, 그것들의 염 등이 예시된다. 이들 중에서도, 메틸코발라민, 시아노코발라민, 히드록소코발라민, 그것들의 염이 바람직하고, 메틸코발라민, 그 염이 보다 바람직하다.
코발라민 및 그 유도체의 염은 약학적으로 허용되는 염인 한 특별히 한정되지 않고, 산성 염, 염기성 염 중 어느 것이나 채용할 수 있다. 예를 들면, 산성염의 예로서는, 염산염, 브롬화수소산염, 황산염, 질산염, 인산염 등의 무기산염;초산염, 프로피온산염, 주석산염, 푸마르산염, 말레산염, 말산염, 구연산염, 메탄술폰산염, 파라톨루엔술폰산염 등의 유기산염; 아스파라긴산염, 글루타민산염 등의 아미노산염 등이 예시된다. 또한, 염기성 염의 예로서 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리 토류 금속염 등이 예시된다.
비타민 B12는 용매화물의 형태여도 좋다. 용매는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 물, 에탄올, 글리세롤, 아세트산 등이 예시된다.
비타민 B12는 1종 단독이어도 좋고, 2종 이상의 조합이어도 좋다.
2. 용도
비타민 B12는 신경계 질환 치료 효과를 갖는다. 이 때문에, 비타민 B12는 신경계 질환 치료제의 유효성분으로서 이용할 수 있다.
비타민 B12는 아폽토시스 억제 작용, 네크로시스 억제 작용, 축색 신전 촉진 작용, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 신경 재생 촉진 작용 등을 갖는다. 이 때문에, 비타민 B12는 아폽토시스 억제제, 네크로시스 억제제, 축색 신전 촉진제, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진제, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제제, M1:M2비(M2 마크로파지/마이크로글리아에 대한 M1 마크로파지/마이크로글리아의 비) 억제제, 신경 재생 촉진제 등의 유효성분으로서 이용할 수 있다.
또한, 비타민 B12는 신경계 질환 치료제의 바람직한 일 형태, 즉 아폽토시스 억제 작용, 네크로시스 억제 작용, 축색 신전 촉진 작용, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 및 신경 재생 촉진 작용으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종에 의거한 신경계 질환 치료제의 유효성분으로서 이용할 수 있다.
신경계 질환으로서는, 특별히 제한되지 않고, 중추신경계 질환, 말초신경계 질환이 포함된다. 중추신경계 질환으로서는, 예를 들면 뇌혈관 질환, 신경 손상 등이 예시된다.
뇌혈관 질환으로서는 뇌경색, 뇌출혈, 뇌혈전증, 뇌동맥경화증, 인지증 등이 예시된다.
신경 손상은 말초신경 손상 및 중추신경 손상 중 어느 것이라도 좋다.
중추신경 손상에는 척수 손상도 포함된다. 신경 손상의 원인도 특별히 한정되지 않고, 외상, 깁스에 의한 압박, 전격상, 추간판 헤르니아, 방사선 폭로 등의 각종 원인에 의한 신경 손상이 적용 대상이 된다. 또한, 적용 대상이 되는 신경 손상의 정도도 특별히 한정되지 않고, 축색은 온존되어 있지만 탈수가 일어나고 있는 경우, 왈러 변성을 수반하는 경우, 신경이 해부학적으로 단열되어 있는 경우 등의 어느 것이나 적용 대상이 된다. 또한, 신경 손상에는 이것에 수반하는 각종 증상, 예를 들면 손상을 받은 신경 지배 영역에서의 운동 장해(상하지의 운동 마비·근력 저하 등), 감각 장해(감각 둔마, 저림, 동통 등), 자율 신경 장해(발한 이상, 피부의 색조 변화 등) 등도 포함된다.
신경계 질환은, 바람직하게는 아폽토시스 억제 작용, 네크로시스 억제 작용, 축색 신전 촉진 작용, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 및 신경 재생 촉진 작용으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종에 의거해서 치료 가능한 신경계 질환이다.
본 발명의 제제는 비타민 B12(본 명세서에 있어서, 단지 「유효성분」이라고 하는 경우가 있음)를 함유하는 한에 있어서 특별히 제한되지 않고, 필요에 따라서 또 다른 성분을 포함하고 있어도 좋다. 다른 성분으로서는, 약학적으로 허용되는 성분이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 다른 성분으로서는, 약리 작용을 갖는 성분의 외에, 첨가제도 포함된다. 첨가제로서는, 예를 들면 기제, 담체, 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 증점제, 보습제, 착색료, 향료, 킬레이트제 등이 예시된다.
또한, 비타민 B12는 단독으로, 신경계 질환 치료 효과, 아폽토시스 억제 작용, 네크로시스 억제 작용, 축색 신전 촉진 작용, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용(또한, M1 마크로파지/마이크로글리아로부터 M2 마크로파지/마이크로글리아에의 시프트 작용인 것도 부정되지 않는다.), 신경 재생 촉진 작용 등을 발휘할 수 있다. 그 때문에, 본 발명의 제제는 이들 효과 및/또는 작용을 갖는 것 이외의 성분을 포함하지 않더라도, 그 소망의 효과를 발휘할 수 있지만, 약리 작용을 갖는 것 이외의 성분이 함유되어 있어도 좋다.
본 발명의 제제의 사용 형태는 특별히 제한되지 않고, 그 종류에 따라 적절한 사용 형태를 채용할 수 있다. 본 발명의 제제는 그 용도에 따라, 예를 들면 in vitro에서 사용(예를 들면, 배양 세포의 배지에 첨가함)할 수도 있고, in vivo에서 사용(예를 들면, 동물에 투여함)할 수도 있다.
본 발명의 제제의 적용 대상은 특별히 한정되지 않지만, 포유 동물에서는, 예를 들면 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 말, 소, 양, 염소, 사슴 등이 예시된다. 또한, 세포로서는 동물세포 등이 예시된다. 세포의 종류도 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 혈액세포, 조혈간세포·전구세포, 배우자(정자, 난자), 선유아세포, 상피세포, 혈관내피세포, 신경세포, 간세포, 케라틴 생성 세포, 근육세포, 표피세포, 내분비세포, ES 세포, iPS 세포, 조직간세포, 암세포 등이 예시된다.
본 발명의 제제는 임의의 제형, 예를 들면 정제(구강 내측 붕괴정, 저작 가능정, 발포정, 트로키제, 젤리상 드롭제 등을 포함한다), 환제, 과립제, 세립제, 산제, 경캅셀제, 연캅셀제, 드라이 시럽제, 액제(드링크제, 현탁제, 시럽제를 포함함), 젤리제 등의 경구 제제 형태나, 주사용 제제(예를 들면, 점적주사제(예를 들면, 점적정주용 제제 등), 정맥주사제, 근육주사제, 피하주사제, 피내주사제), 외용제(예를 들면, 연고제, 파프제, 로션제), 좌제흡입제, 안제, 눈연고제, 점비제, 점이제, 리포솜제 등의 비경구 제제 형태를 채용할 수 있다.
본 발명의 제제의 투여 경로로서는, 소망의 효과가 얻어지는 한 특별히 제한되지 않고, 경구투여, 경관영양, 주장투여 등의 경장투여, 경정맥투여, 경동맥투여, 근육내투여, 심장내투여, 피하투여, 피내투여, 복강내투여 등의 비경구투여 등이 예시된다.
본 발명의 제제 중의 유효성분의 함유량은 사용 형태, 적용 대상, 적용 대상의 상태 등에 좌우되는 것이며, 한정은 되지 않지만, 예를 들면 0.0001∼100중량%, 바람직하게는 0.001∼50중량%라고 할 수 있다.
본 발명의 제제를 동물에 투여하는 경우의 투여량은 약효를 발현시키는 유효량이면 특별히 한정되지 않고, 통상은 유효성분의 중량으로서, 일반적으로 경구투여의 경우에는 1일당 0.1∼1000mg/kg체중, 바람직하게는 1일당 0.5∼500mg/kg체중이고, 비경구투여의 경우에는 1일당 0.01∼100mg/kg체중, 바람직하게는 0.05∼50 mg/kg체중이다. 상기 투여량은 연령, 병태, 증상에 의해 적절히 증감할 수도 있다.
본 발명의 제제는 M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 신경 재생 촉진 작용 등을 보다 효과적으로 발휘시킨다고 하는 관점에서, 지속적으로 투여해서 사용되는 것이 바람직하다. 이것에 의해, 투여 대상 내의 세포(예를 들면, 신경계 질환 환부의 세포, 바람직하게는 마크로파지/마이크로글리아)에 작용하는 유효성분 농도를, M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 신경 재생 촉진 작용의 발휘에 적합한 농도(예를 들면, 5nM∼100μM, 바람직하게는 10nM∼50μM, 보다 바람직하게는 20nM∼10μM, 더욱 바람직하게는 50nM∼5μM, 보다 더욱 바람직하게는 100nM∼1μM)로 유지할 수 있고, 보다 효과적으로 이들 작용을 발휘시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 제제는 그 적용 대상에 따라 달라지지만, 점적 주사제인 것이 바람직하고, 점적정주용 제제인 것이 보다 바람직하다.
본 발명의 제제의 투여 타이밍은 특별히 제한되지 않는다.
일례로서, 본 발명의 제제는 발증으로부터, 예를 들면 12∼24시간 경과 이후에 투여를 개시하도록 사용된다. 발증은 그 질환의 증상 또는 그것을 일으키는 직접 요인이 확인 가능한 시점이며, 예를 들면 뇌경색 등의 허혈성 뇌혈관 질환의 경우이면, 허혈 부위의 발생 시점이다. 본 발명의 제제는 허혈 부위 발생으로부터 비교적 느린 타이밍에서 작용할 수 있는 수복 기구에 작용할 수 있으므로(M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진 작용, M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제 작용, 신경 재생 촉진 작용), 뇌경색 등의 허혈성 뇌혈관 질환에 적용하는 경우, 상기 타이밍(발증으로부터 12∼24시간 경과 이후)에서 투여해도, 치료 효과를 발휘하는 것이 가능하다.
다른 일례로서, 본 발명의 제제는 신경 손상(바람직하게는, 척수 손상) 등의 신경계 질환의 급성기(예를 들면, 발증 직후∼발증으로부터 12시간 이내)에 투여를 개시하도록 사용된다. 발증은 그 질환의 증상 또는 그것을 일으키는 직접 요인이 확인 가능한 시점이며, 예를 들면 척수 손상 등의 신경 손상의 경우이면, 신경에 손상이 발생한 시점이다.
실시예
이하에, 실시예에 의거하여 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 대뇌피질신경세포의 아폽토시스 억제 작용
메틸코발라민을 이용하여, 대뇌피질신경세포의 아폽토시스 억제 작용을 TUNEL 어세이에 의해 조사했다. 구체적으로는, 이하와 같다.
<실시예 1-1. 대뇌피질신경의 조제>
대뇌피질신경은 정법을 따라서 채취 배양했다. Sprague Dawley(SD) 랫트(임신 18일째)의 태자로부터 대뇌피질을 절리하고, 10% 소태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하고, 빙랭한 둘베코 개변 이글 배지(DMEM)에 회수했다. 연막 및 혈관을 제거하고, DMEM(FBS 미첨가, 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유)으로 옮겨서 전도로 1㎜ 크기로 세단했다. 세포 혼합액에 파파인(최종 농도 2mg/ml)을 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시켰다. Dnase I(70U/ml)을 첨가해 30초간 반응시킨 후, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM을 첨가해 반응을 정지시켰다. 세포 혼합액을 800rpm에서 원심분리한 후, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM에 의해 재현탁하고, Poly-L lysine(PLL)에 의해 코팅한 dish에 파종했다. 세포 파종 4시간 후에, 배지를 Neurobasal 배지(10% B27 서플먼트, 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유)로 교환했다.
<실시예 1-2. TUNEL 분석>
PLL 코팅한 8well chamber slide에서 배양한 대뇌피질신경(실시예 1-1)에 20mM의 글루탐산, 10μM의 메틸코발라민(MeCbl)을 첨가하고, 18시간 후에 Promega deadend fluorometric TUNEL system에서 아폽토시스 세포 비율을 평가했다. 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 4℃ 25분간 고정했다. 0.2% TritonX-100에서 5분간 투과 처리를 행한 후, incubation buffer를 첨가해서 37℃ 차광 하에 60분간 놓고, 표지를 행했다. 핵은 DAPI로 표지했다. 전체 세포수, TUNEL 양성 세포수를 계측했다.
<실시예 1-3. 결과>
결과를 도 1에 나타낸다. 또한, 도 1의 수치를 표 1에 나타낸다. TUNEL 어세이에 있어서, 메틸코발라민 단독 첨가에서는 아폽토시스 세포 비율(%)은 컨트롤과 마찬가지였다. 글루탐산 단독 첨가에서는 아폽토시스 세포 비율의 유의한 증가가 보여졌지만, 글루탐산에 메틸코발라민을 병용함으로써 컨트롤 레벨까지 유의하게 아폽토시스 세포 비율이 감소했다.
[표 1]
실시예 2. 대뇌피질신경세포의 네크로시스 억제 작용
메틸코발라민을 이용하여, 대뇌피질신경세포의 네크로시스 억제 작용을 LDH어세이에 의해 조사했다. 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 2-1. LDH 어세이>
PLL 코팅한 6well chamber slide에서 배양한 대뇌피질신경(실시예 1-1)에, 산소-글루코오스 결핍(OGD) 부하를 행하기 30분 전에 10μM의 메틸코발라민을 첨가했다. 기준이 되는 고컨트롤에는 N-메틸-D아스파라긴산(NMDA)을 첨가했다. 배지를 earle's balanced salt solution(EBSS)으로 교환하고, 산소 농도 1%의 환경 하에 3시간의 OGD 부하를 행했다. 통상의 배지, 산소 농도 환경 하로 되돌려서 24시간 후에 상청을 채취, cytotoxicity detection kit plus(SIGMA)를 이용하여 LDH 활성을 측정했다. 컨트롤군, 메틸코발라민 첨가군의 LDH 활성도는 고컨트롤의 LDH 활성에 대한 비율(%)로 산출했다.
<실시예 2-2. 결과>
결과를 도 2에 나타낸다. 또한, 도 2의 수치를 표 2에 나타낸다. OGD 부하에 의한 LDH 어세이에 있어서, 네크로시스의 지표가 되는 LDH 활성의 고컨트롤에 대한 비율이 메틸코발라민 첨가군에서 컨트롤군에 비해 유의한 저하가 얻어졌다.
[표 2]
실시예 3. 대뇌피질신경세포의 축색 신전 촉진 작용
메틸코발라민을 이용하여, 대뇌피질신경세포의 축색 신전 촉진 작용을 신경돌기 신전 어세이에 의해 조사했다. 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 3-1. 신경 돌기 신전 어세이>
대뇌피질신경(실시예 1-1)을 파종해서 24시간 후에 각종약제를 첨가했다. 첨가 약제 농도는 메틸코발라민(1nM, 10nM, 100nM, 1μM, 10μM, 100μM)으로 했다. 세포 파종 72시간 후에, 항 TuJ1 항체에서 면역 형광 염색하고, 축색 길이(the longest neurite length per neuron)를 계측했다. 단, 다른 신경과 접하고 있지 않은 세포만을 계측하고, 각 평가에 있어서 적어도 30개 이상의 신경 축색을 측정하고, 그 평균값을 산출해 계측값이라고 했다.
<실시예 3-2. 결과>
결과를 도 3에 나타낸다. 또한, 도 3의 수치를 표 3에 나타낸다. 신경 돌기 신전 어세이에 있어서, 10μM 농도를 피크에 농도 의존성으로 축색 신전이 촉진되는 경향을 확인하고, 1μM 및 10μM에 있어서는 약제 미첨가의 컨트롤군과 비교하여 유의차를 가져서 축색 신전의 촉진을 확인했다.
[표 3]
실시예 4. 뇌경색 체적의 축소 작용
메틸코발라민을 이용하여, 뇌경색 체적의 축소 작용을 TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride) 염색법에 의해 조사했다. 구체적으로는, 이하와 같다.
<실시예 4-1. 일시적 중대뇌동맥폐쇄(tMCAO) 모델의 제작 및 약제 투여>
8-9주령의 수컷의 C57BL/6J 마우스(24g 전후)를 사용했다. 우두개골 상에 레이저 도플러 혈류계용의 프로브를 장착하고, 중대뇌동맥의 혈류를 모니터링할 수 있도록 했다. 우경부를 전개하고, 외경동맥을 결찰 후, 총경동맥에 절개를 추가해 나일론사를 삽입, 혈류 모니터를 보면서 선단을 진행시켰다. 선단이 중대뇌동맥 분기부까지 진행되어 혈류가 저하된 것을 확인하고, 그 상태에서 1시간, 직장 온도 37℃에서 대기한 후, 나일론사를 제거해 총경동맥을 결찰했다. 메틸코발라민은 지속 투여를 위해, 침투압 미니 펌프를 배부 피하에 유치해 1mg/kg/day의 용량으로 모델 완성후에 투여했다. 미치료군에서는 마찬가지의 방법에 의해 생식을 투여했다. 수술 후에는 마취로부터 각성할 때까지 직장 온도 7℃에서 유지했다.
<실시예 4-2. TTC 염색법>
수술 후 2일의 마우스(실시예 4-1)를 새크리파이스하고, 대뇌를 적출했다. 1㎜마다 관상단으로 슬라이스하고, 2% TTC 용액에 30분 담그었다. 실체 현미경에 의해 촬영한 후, 각각의 슬라이스의 경색 면적을 산출, 전대뇌 슬라이스의 경색 면적을 추가함으로써 경색 체적을 산출했다. 1개의 슬라이스에서의 경색 면적은 (건측 반구 면적-환측 건상부 면적)에 의해 계산했다.
<실시예 4-3. 결과>
결과를 도 4에 나타낸다. 또한, 도 4의 수치를 표 4에 나타낸다. 마우스에 대한 tMCAO 수술 후 2일에 TTC 염색에 의해 뇌경색 체적을 평가했다. 메틸코발라민 투여군에서는 컨트롤군에 비해 1/2 정도의 유의한 경색 체적의 축소가 보여졌다.
[표 4]
실시예 5. M2 마크로파지 유도 촉진 작용 및 M1 마크로파지 유도 억제 작용
메틸코발라민을 이용하여, M2 마크로파지 유도 촉진 작용 및 M1 마크로파지 유도 억제 작용을 웨스턴 블롯법 및 면역조직학적 평가법에 의해 조사했다. 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 5-1. 마크로파지 세포주의 준비>
마우스 유래 마크로파지 세포주 J774A.1(JCRB9108)을 오사카후의 Japanese Cancer Research Resources Bank(배양 자원 연구실)로부터 구입했다. 배양은 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM으로 행했다.
<실시예 5-2. 웨스턴 블롯법>
J774A.1 세포(실시예 5-1)를 직경 6cm의 디쉬에 파종하고, 4일 후에 protease inhibitor cocktail을 용해한 cell lysis buffer를 이용하여 단백질을 수집했다. BCA 어세이에서 단백질 농도를 측정한 후, 샘플 50㎍씩을 SDS-PAGE에서 전기영동하고, polyvinylidene difluoride membrane에 전사했다. Blocking buffer에서 1시간의 blocking을 행한 후, 1차 항체와 4℃ over night으로 반응시켰다. 2차 항체는 실온에서 1시간 반응시켜 ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시스템에 의해 검출했다. M1 마커인 iNOS 및 IL-1β의 검출시는 단백질 수집의 24시간 전에 리포다당(LPS)(100ng/ml) 및 메틸코발라민을 첨가했다. M2 마커인 Arg1 및 CD206의 검출시는 단백질 수집의 72시간 전에 IL-4(20ng/ml) 및 메틸코발라민을 첨가했다.
1차 항체는 항IL-1β 토끼 폴리크로날 항체(Santa Cruz), 항iNOS 토끼 모노클로날 항체(Abcam), 항Arg1 토끼 폴리클로날 항체(Santa Cruz), 항CD206 토끼 모노클로날 항체(Abcam), 2차 항체는 anti-rabbit IgG horseradish peroxidase linked whole antibody from donkey(GE Healthcare Life Sciences)를 사용했다.
<실시예 5-3. 면역조직학적 평가법>
J774A.1 세포(실시예 5-1)를 직경 6cm의 디쉬에 파종하고, 4일 후에 4% PFA에서 20분간 고정했다. 30분간 블록킹하고, 1차 항체는 4℃ over night으로 반응시켰다. 2차 항체는 실온에서 1시간 반응시키고, 핵을 DAPI로 표지했다. M1 마커인 iNOS의 검출시는 세포 고정의 24시간 전에 LPS(100ng/ml) 및 메틸코발라민을 첨가했다. M2 마커인 Arg1의 검출시는 세포 고정의 72시간 전에 IL-4(20ng/ml) 및 메틸코발라민을 첨가했다.
1차 항체는 항iNOS 토끼 모노클로날 항체(Abcam), 항Arg1 토끼 폴리클로날 항체(Santa Cruz), 2차 항체는 Alexa 488 표지 염소 항토끼 IgG 항체(Lifetechnologies) 또는 Alexa 568 표지 염소 항토끼 IgG 항체(Lifetechnologies)를 사용했다.
<실시예 5-4. 결과>
웨스턴 블롯법의 결과를 도 5 및 6에 나타낸다. 또한, 도 5의 수치를 표 5에, 도 6의 수치를 표 6에 나타낸다. M1 마커에서는 LPS 단독 첨가에 비해 IL-1β 는 100nM, iNOS는 100nM∼10μM에서 유의한 단백질량의 감소가 보여졌다. M2 마커에서는 IL-4 단독 첨가에 비해, Arg1은 100nM과 1μM에서 유의한 단백질량의 증가가 보여졌다. CD206에서는 100nM로부터 1μM를 피크로 한 경향이 보여졌다.
[표 5]
[표 6]
면역조직학적 평가법의 결과를 도 7에 나타낸다. 또한, 도 7의 수치를 표 7에 나타낸다. M1 마커인 iNOS에서는 LPS 단독 첨가에 비해 메틸코발라민을 10nM∼100μM을 첨가한 것이며 iNOS 양성 세포율이 유의하게 감소했다. 또한, M2 마커인 Arg1에서는 IL-4 단독 첨가에 비해, 메틸코발라민 10nM∼1μM를 첨가한 것이며 Arg1 양성 세포율이 유의에 증가했다.
상술의 웨스턴 블롯과 마찬가지로, 면역 형광 염색에 있어서도 100nM 부근을 피크로 M2 방향으로의 시프트가 보여졌다.
[표 7]
실시예 6. 마크로파지 유도 작용의 메커니즘의 해석
메틸코발라민에 의한 마크로파지 유도 작용(실시예 5)의 메커니즘을 해석했다. 구체적으로는, IL-4, 메틸코발라민(100nM 및 1mM)을 첨가 후 30분의 Akt-mTOR경로(M2 유전자를 유도하는 주된 시그널 경로 중 하나)에 있어서의 Akt, 4EBP1 및 S6K의 활성화를 웨스턴 블롯에 의해 평가했다. 상기 경로에 있어서는, 상류로부터의 시그널에 의해, Akt의 인산화가 일어나고, 또한 하류에서 mTORC1을 통해 4EBP1의 인산화 및 S6K의 인산화가 일어난다. S6K의 인산화는 시그널 상류에 네거티브 피드 백 작용을 초래한다. 웨스턴 블롯은 단백질 수집의 30분 전에 IL-4(20ng/ml), 메틸코발라민, RAD001(200nM)을 첨가하고, 검출하는 1차 항체를 변경하는 것 이외에는 실시예 5-2와 마찬가지로 해서 행했다.
결과를 도 8a, 도 8b, 및 도 8c에 나타낸다. 또한, 도 8a, 도 8b, 및 도 8c의 수치를 표 8에 나타낸다. IL-4 첨가에 의해 Akt, 하류의 4EBP1, S6K도 활성화를 확인했다. IL-4와 메틸코발라민 100nM을 병용하면, IL-4 단독 첨가의 경우보다 각각의 활성화가 증강했지만, 메틸코발라민을 1mM로 하면, 4EBP1과 S6K의 활성화에 반해, 상류의 Akt의 활성은 저하했다. 이것에 mTOR의 억제제인 RAD001을 더 첨가하면, 상류의 Akt의 활성은 레스큐되고, 하류의 4EBP1 및 S6K 활성의 억제가 보여졌다. 이상으로부터, 고농도 메틸코발라민 첨가에서는 하류로부터의 네거티브 피드 백 기구에 의해 M2 유전자 유도를 향하는 상류 Akt 활성이 억제되는 기구가 시사되었다.
[표 8]
실시예 7. 좌골신경 손상 후의 마크로파지 동태의 해석
좌골신경 손상 후의 마크로파지 동태에 메틸코발라민이 주는 영향을 면역조직학적 평가법에 의해 해석했다. 구체적으로는, 좌골신경 손상 후 1, 3, 7, 14일에서의 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 5.0㎜, 7.5㎜의 신경 횡단 절편에서 형광 면역 염색에 의해 마크로파지를 평가했다. 또한, 근위는 축색 상의 손상부로부터 세포체측을 의미하고, 원위는 축색 상의 손상부로부터 축색 말단측을 의미하고, 각각의 거리는 손상부로부터의 거리를 나타낸다(실시예 8에 있어서도 마찬가지임). 마크로파지는 CD68, M1 마커로서 iNOS, M2 마커로서 CD206으로 표지했다. M1 마크로파지 비율(%)=M1 마커 양성 마크로파지수(개/㎟)/마크로파지수(개/㎟)×100으로 산출했다. 보다 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 7-1. 외과적 처치(좌골신경 압좌 손상 모델 랫트)>
6주령의 수컷의 Wistar 랫트(200g 전후)를 사용했다. 좌좌골신경을 전개하고, 좌골신경의 근위측에 핀셋으로 압좌 손상을 가했다. 압좌 시간은 10초간, 압좌 횟수는 3회로 하고, 압좌 조작의 간격은 10초간으로 했다. 근막 및 피부를 3-0 nylon으로 봉합했다. 좌골신경 전개만을 행한 비손상군과 미치료군, 메틸코발라민 투여군을 비교 검토했다. 메틸코발라민은 지속 투여를 위해, 침투압 미니 펌프를 배부 피하에 유치해 1mg/kg/day의 용량으로 투여했다. 미치료군에서는 마찬가지의 방법으로 생식을 투여했다.
<실시예 7-2. Morphological and histological analysis>
수술 후 1일, 3일, 7일, 14일 경과한 랫트를 마취약으로 진정시키고, 좌좌골신경을 채취해서 4% PFA에서 7일간, 20% 수크로오스에서 24시간 고정 후에 동결 포매했다. 포매한 조직을 신경 단축 방향으로 5㎛ 두께로 슬라이스하고, glass slide에 놓았다. 슬라이스 부위로서 손상의 근위 2.5㎜, 손상 부위, 원위 2.5㎜, 원위 5.0㎜, 원위 7.5㎜의 5개소에서 행했다. 1시간 건조시키고, 95% 메탄올로 30분간 고정했다. 블록킹 후에 1차 항체를 4℃ over night으로 반응시켰다. 2차 항체는 실온에서 1시간 반응시켜 핵을 DAPI로 표지했다.
1차 항체는 항CD68 마우스 모노클로날 항체(Abcam), 항iNOS 토끼 모노클로날 항체(Abcam), 항CD206 토끼 모노클로날 항체(Abcam), 항neurofilament 200(NF200) 토끼 폴리클로날 항체(SIGMA) 및 항myelin Basic Protein(MBP) 마우스 모노클로날 항체(CALBIOCHEM), 2차 항체는 Alexa 488 표지 염소 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies), Alexa 488 표지 염소 항토끼 IgG 항체(Lifetechnologies), Alexa 568 표지 염소 항마우스 IgG 항체(Lifetechnologies) 및 Alexa 568 표지 염소 항토끼 IgG 항체(Lifetechnologies)를 사용했다.
<실시예 7-3. 결과>
결과를 도 9 및 10에 나타낸다. 또한, 도 9의 수치를 표 9-1, 표 9-2, 및 표9-3에, 도 10의 수치를 표 10-1, 표 10-2, 및 표 10-3에 나타낸다. 메틸코발라민 투여군은 미치료군과 비교하여, 손상부에 있어서는 수술 후 3, 7, 14일에서 집적 마크로파지수의 유의한 감소를 확인했다. 원위에서는 손상부에 지연되어 마크로파지수가 증가해 갔지만, 수술 후 14일에서 유의차를 확인했다.
M1 마크로파지수는 전체 평가일에서 메틸코발라민 투여군에서 유의한 감소를 확인했다. 원위는 수술 후 7, 14일에서 유의차를 확인했다. M1 마크로파지 비율도 마찬가지의 경향이 보여졌다.
M2 마크로파지수는 손상부에 있어서는 수술 후 1, 7, 14일의 메틸코발라민 투여군에서 유의한 증가를 확인하고, 원위 5㎜에서는 수술 후 7일, 원위 7.5㎜에서는 수술 후 7 및 14일에서 유의차를 확인했다. M2 마크로파지 비율도 마찬가지의 경향이 보여졌다.
[표 9-1]
[표 9-2]
[표 9-3]
[표 10-1]
[표 10-2]
[표 10-3]
실시예 8. 좌골신경 손상 후의 신경 재생 동태의 해석
좌골신경 손상 후의 신경 재생 동태에 메틸코발라민이 주는 영향을 면역조직학적 평가법에 의해 해석했다. 구체적으로는, 좌골신경 손상 2주 후의 손상 좌골신경의 횡단 절편을 평가했다. 평가 부위는 마크로파지 평가와 마찬가지로 근위 2.5㎜, 손상부, 원위 2.5㎜, 5.0㎜, 7.5㎜로 했다. 재생 축색은 NF200으로 표지, 수초를 MBP로 표지했다. 재생 축색의 수초화율을 계산하기 위해, 수초화율(%)=수초화 축색수(개/㎟)/축색수(개/㎟)×100으로서 산출했다. 보다 구체적으로는, 실시예 7과 마찬가지의 방법에 의해 행했다.
결과를 도 11에 나타낸다. 또한, 도 11의 수치를 표 11-1, 표 11-2, 및 표 11-3에 나타낸다. 손상부에서는 축색수 및 수초화 축색수에 있어서 메틸코발라민 투여군에서 유의한 개선을 확인하고, 축색수에서는 원위 5.0㎜ 및 7.5㎜에서, 수초화 축색수에서는 원위 2.5㎜, 5.0㎜ 및 7.5㎜에서, 수초화율에서는 원위 5.0㎜ 및 7.5㎜에서 유의차가 보여졌다. 이 결과와 실시예 7의 결과로부터, 메틸코발라민이 실제의 신경 재생 과정에 있어서 M1 마크로파지를 감소시키고, M2 마크로파지를 증가시켜서 항염증성에 작용함으로써 신경 재생을 촉진하고 있는 것이 시사되었다.
[표 11-1]
[표 11-2]
[표 11-3]
실시예 9. 척수 손상의 치료 작용
메틸코발라민을 이용하여, 척수 손상의 치료 작용을 BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 스코어 및 Thermal algesimetry test에 의해 조사했다. 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 9-1. 랫트 척수 손상 모델(Lateral Hemisection model)의 제작, 및 약제 투여>
6주령, 암컷의 Wistar 랫트를 사용했다. 랫트는 Charles River Laboratories Japan, Inc.(일본 요코하마시)로부터 구입했다. 마취 방법은 3종 혼합 마취약을 생리식염수로 1:10으로 희석해서 복강 내 주사로 투여했다. 1회당의 마취 투여량은 Midazolam 0.2mg/kg, Medetomidine 0.015mg/kg, Butorphanol 0.25mg/kg으로 했다. 수술대에 복와위로 놓고, 배부 정중을 전개했다. T10 추궁을 절제해 척수 후면을 노출시키고, 첨인도로 좌척수를 반절했다. 피부를 4-0 나일론사에 의해 봉합해 수술을 종료했다. 메틸코발라민 투여군, 미치료군 및 Sham군의 3군을 비교했다. 메틸코발라민 투여군, 미치료군은 수술 직후에 좌배부 피하에 각각 메틸코발라민(1mg/kg/day), 생리식염수를 충전한 침투압 미니 펌프를 유치했다. Sham군은 Th10 추궁의 제거만을 행했다.
<실시예 9-2. BBB 스코어의 측정>
랫트를 개별적으로 케이지 내에 넣어 자유롭게 걷게 하고, 5분간 관찰했다.정법을 따라, 좌하지의 기능에서 0점(운동없음)∼21점(통상의 운동)에서 스코어링을 행했다. 평가는 수술 전, 수술 후 1, 7, 14, 21, 28일에 행했다.
<실시예 9-3. Thermal algesimetry test>
랫트를 개별적으로 전용의 케이지 내에 넣고, 좌족저에 적외선 열자극을 주어, 뜨거움에 의해 뒷다리를 뺄 때까지의 시간을 측정했다. 피부에의 데미지를 회피하기 위해, 자극 시간은 최대 15초로 했다. 평가는 수술 전, 수술 후 7, 14, 21, 28일에 행했다.
<실시예 9-4. 결과>
BBB 스코어를 도 12에 나타낸다. 또한, 도 12의 수치를 표 12에 나타낸다. 메틸코발라민 투여군에 있어서 미치료군에 비해, 수술 후 14, 21, 28일째에 좌하지운동 기능의 유의한 개선을 확인했다.
[표 12]
Thermal algesimetry test의 결과를 도 13에 나타낸다. 또한, 도 13의 수치를 표 13에 나타낸다. 메틸코발라민 투여군에서 수술 후 21, 28일째에 우하지지각 과민의 유의한 개선을 확인했다.
[표 13]
실시예 10. M2 마이크로글리아 유도 촉진 작용 및 M1 마이크로글리아 유도 억제 작용
메틸코발라민을 이용하여, M2 마이크로글리아 유도 촉진 작용 및 M1 마이크로글리아 유도 억제 작용을 웨스턴 블롯법에 의해 조사했다. 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 10-1. 웨스턴 블롯법>
마이크로글리아 세포주(6-3 세포)에 대해, LPS(100ng/ml), 항염증성 사이토카인으로서 IL-4(20ng/ml)를 첨가하고, 거기에 각종 농도(1nM∼1mM)로 조정한 메틸코발라민을 첨가하여, 각각 첨가 후 1일, 3일에서 단백질을 회수했다. 전기영동, 멤브레인으로의 전사를 행하고, 블록킹 후, 각각 M1 마커(iNOS, IL-1β), M2 마커(Arg1, CD206)에 대한 1차 항체를 4℃ over night으로 반응시켰다. 2차 항체는 실온에서 1시간 반응시키고, 검출기에서 밴드 검출을 행했다.
1차 항체는 항iNOS 항체, 항IL-1β 항체, 항Arg1 항체, 항CD206 항체(Mannose Receptor), 2차 항체는 Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep을 사용했다.
<실시예 10-2. 결과>
웨스턴 블롯법의 결과를 도 14∼15에 나타낸다. 또한, 도 14의 수치를 표 14에, 도 15의 수치를 표 15에 나타낸다. 마이크로글리아의 염증성(M1) 마커에서는 LPS 단독 첨가에 비해, IL-1β는 1μM, iNOS는 10nM 이상의 메틸코발라민 첨가에서 유의한 단백질량의 감소가 보여졌다. 항염증성(M2) 마커에서는 IL-4 단독 첨가에 비해, Arg1은 1nM∼10μM의 메틸코발라민 첨가에서 유의한 단백질량의 증가가 보여졌다. CD206에서는 10nM로부터 100nM의 메틸코발라민 첨가에서 유의한 증가가 보여졌다.
[표 14]
[표 15]
실시예 11. M2 마크로파지 유도 촉진 작용 및 M1 마크로파지 유도 억제 작용
메틸코발라민을 이용하여, M2 마크로파지 유도 촉진 작용 및 M1 마크로파지 유도 억제 작용을 조사했다. 구체적으로는 이하와 같다.
<실시예 11-1. 면역 형광 염색>
실시예 9-1의 랫트 척수 손상 모델에 대해서, 수술 후 7, 14, 28일 경과한 랫트를 마취약으로 진정시키고, 4% PFA로 관류 고정 후, 손상부를 포함한 척수를 채취하고, 20% 수크로오스에 의해 24시간 고정 후에 동결 포매했다. 포매한 조직을 신경 단축 방향으로 5μM 두께로 슬라이스하여 glass slide에 놓았다. 1시간 건조시키고, 100% 메탄올로 30분간 고정했다. 블록킹 후에 1차 항체를 4℃ over night으로 반응시켰다. 2차 항체는 실온에서 1시간 반응시키고, 핵을 DAPI로 표지했다.
손상부로부터 머리측 2㎜, 머리측 1㎜, 꼬리측 1㎜, 꼬리측 2㎜에 있어서의 환측 척수 횡단 절편에서 단위면적당의 마크로파지수, M1(염증성 타입) 마크로파지수, M1 마크로파지 비율, M2(항염증성 타입) 마크로파지수, M2 마크로파지 비율, M1/M2비를 계측했다.
1차 항체는 항CD68 항체, 항iNOS 항체, 항Arg1 항체, 2차 항체는 Alexa 488 표지 염소 항토끼 IgG 항체와 Alexa 568 표지 염소 항마우스 IgG 항체를 사용했다.
<실시예 11-2. 결과>
면역 형광 염색의 결과를 도 16∼22에 나타낸다. 도 16∼18은 단위면적당의 마크로파지수, M1(염증성 타입) 마크로파지수, M1 마크로파지 비율, M2(항염증성 타입) 마크로파지수, M2 마크로파지 비율에 대한 부위에 의한 변화를 나타내고, 도 19∼20은 이것들의 수술 후의 경과일수에 의한 변화를 나타낸다. 도 21은 M1/M2비에 대한 수술 후의 경과일수에 의한 변화를 나타내고, 도 22는 이 부위에 의한 변화를 나타낸다. 또한, 도 16∼18의 수치를 순서대로 표 16∼18에 나타내고, 도 22의 수치를 표 19에 나타낸다.
메틸코발라민 투여군에서는 미치료군에 비해, 단위면적당의 집적 마크로파지수가 적은 경향이 있고, 또한 그 phenotype에 있어서는 M1 마크로파지가 감소하고, M2 마크로파지가 증가하고 있는 경향이 있었다. 일부에서는 유의차를 확인했다.
[표 16]
[표 17]
[표 18]
[표 19]
실시예 12. 광응고 뇌경색 모델에 있어서의 메틸코발라민의 기능 회복 촉진 효과에 대해서
<실시예 12-1. 대상과 방법>
8∼10주령의 수컷의 C57BL/6J 마우스(24g 전후)를 사용하고, 로즈벵갈을 투여후, 레이저광을 조사하는 것에 의한 광응고 뇌경색 모델을 제작했다. 이 모델에 있어서는 마우스의 두개골을 대천문으로부터 외측 2㎜를 중심으로 해서, 두개골에 드릴 을 이용하여 구멍을 뚫어 개두하고, 광감수성 색소인 로즈벵갈의 투여 5분 후에 우운동야 중심으로 레이저광을 조사하여, 우측 운동야에 뇌경색을 제작한다. 이러한 뇌경색을 제작한 직후로부터, 침투압 펌프(ALZET Osmotic pumps: 2주간용)를 매입하고, 메틸코발라민 투여군(N=3)과 미치료군(N=4)으로 나누고, 뇌경색 수술 후, 2일 후, 4일 후, 7일 후, 9일 후, 11일 후, 14일 후에 로타로드 테스트(accelerating velocity: 가속 방식)를 시행했다. 마우스가 로타로드로부터 떨어질 때까지의 시간을 계측하고, Max 300초를 baseline으로 해서 그 비율을 산출했다.
<실시예 12-2. 결과>
결과를 도 23에 나타낸다. 또한, 도 23의 수치를 표 20에 나타낸다. 뇌경색 수술 후 2, 4, 9일 후에 있어서, 메틸코발라민 투여군은 미치료군에 비해서 유의하게 로타로드 테스트에 의한 뇌기능 개선을 확인했다.
[표 20]
Claims (18)
- 비타민 B12를 함유하는, 신경계 질환 치료제.
- 제 1 항에 있어서,
M2 마크로파지/마이크로글리아 유도 촉진제인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항에 있어서,
M1 마크로파지/마이크로글리아 유도 억제제인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
신경 재생 촉진제인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 신경계 질환이 중추신경계 질환인, 신경계 질환 치료제. - 제 5 항에 있어서,
상기 중추신경계 질환이 뇌혈관 질환인, 신경계 질환 치료제. - 제 6 항에 있어서,
상기 뇌혈관 질환이 뇌경색, 뇌출혈, 뇌혈전증, 뇌동맥경화증 및 인지증으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 신경계 질환이 신경 손상인, 신경계 질환 치료제. - 제 8 항에 있어서,
상기 신경 손상이 중추신경 손상인, 신경계 질환 치료제. - 제 9 항에 있어서,
상기 중추신경 손상이 척수 손상인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비타민 B12가 메틸코발라민, 시아노코발라민, 히드록소코발라민, 술피드코발라민, 아데노실코발라민, 및 그것들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 비타민 B12가 메틸코발라민인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
지속적으로 투여해서 사용되는, 신경계 질환 치료제. - 제 13 항에 있어서,
점적정주용 제제인, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
발증으로부터 12∼24시간 경과 이후에 투여를 개시하도록 사용되는, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
발증 직후로부터 12시간 이내에 투여를 개시하도록 사용되는, 신경계 질환 치료제. - 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 신경계 질환 치료제의 제조를 위한, 비타민 B12의 사용.
- 신경계 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한, 비타민 B12 함유 조성물.
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