KR20210136294A - 두부외상의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 두부외상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 피오글리타존을 포함하는 조성물은 인플라마좀 활성을 감소시키고, 성상세포 및 미세아교세포에서 염증 반응을 조절하며, NLRP3의 발현을 억제함으로써 침습성 TBI(open TBI) 후 급성기 뇌부종을 억제하였으므로, 이를 두부외상 및 두부외상 후 뇌부종의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

Description

두부외상의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING TRAUMATIC BRAIN INJURY}

본 발명은 두부외상의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

두부외상 또는 외상성 뇌손상(Tranumatic brain injury, TBI)은 두부에 가해지는 외부의 물리적 힘에 의한 손상으로 의식 저하나 변화를 유발하고, 이로 인한 인지 기능 혹은 육체적 기능의 손상을 야기한다. 또한 행동 장애나 감정적 손상을 유발할 수도 있다. 이러한 손상이나 장애는 일시적 또는 영구적일 수 있으며, 신체 일부의 손상 혹은 전체 기능의 장애나 정신심리학적 문제를 야기할 수 있다. 일반적으로 TBI는 손상의 심한 정도에 따라 경도(mild), 중등도(moderate) 및 중증(severe)으로 분류한다. 경도 TBI를 갖는 사람은 의식을 유지할 수 있거나, 수 초 또는 수 분 동안 의식의 상실을 경험할 수 있다. 또는 두통, 혼돈, 현기증(lightheadedness), 어지러움(dizziness), 흐릿한 시야, 눈의 피로, 귀 울림, 행동 또는 기분 변화, 기억, 집중, 주의, 또는 사고의 곤란을 경험할 수 있다. 중등도 또는 중증 TBI를 갖는 사람은 이와 동일한 증상을 나타낼 수 있으며, 악화되거나 사라지지 않는 두통, 반복된 구토 또는 오심, 경련 또는 발작, 불명료한 언어, 사지의 약화 또는 마비 등의 증상을 나타낼 수 있다. 또한, TBI는 두피 및 두개골 및 뇌에 발생하는 충격 및 손상에 의한 일차적 손상, 및 생체의 병태생리학적 과정의 결과인 이차적 손상으로나 나뉠 수 있는데, 일차적 손상은 침습성 TBI(penetrating, open TBI)과 비침습성 TBI(nonpenetrating, closed-TBI)으로 나눌 수 있고 침습성 TBI가 비침습성 TBI에 비해 손상 정도가 더 심하다. 또한, TBI 후 이차적 손상으로는 급성기 및 만성기로 나뉘어 지는데, 급성기에는 주로 뇌부종의 증상이 있으며, 만성기에는 신경/행동 양식의 손상 또는 변화가 포함된다. TBI에 의하여 초래된 장애는 손상의 정도, 손상의 위치 및 환자의 나이와 건강 상태에 따라 달라질 수 있으며, 일부 공통적으로 나타나는 장애에는 인지장애(사고, 기억 및 추론), 감각 처리 장애(시각, 청각, 촉각, 미각 및 후각), 의사소통장애(표현 및 이해), 및 행동 또는 정신건강장애(우울증, 불안, 인격 변환, 공격 및 사회적 부적합) 등이 있다. 이러한 장애를 치료하기 위하여 TBI 환자는 물리 치료, 작업 요법, 언어 치료 등의 재활 치료를 받게 되나, 상기 재활 치료는 장애 개선 속도가 느린 단점이 있다. 따라서 TBI를 보다 효과적으로 치료할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

침습성 TBI에 의한 급성기 질환인 뇌부종은 세포나 조직에 물이 유입되어 뇌조직이 커지는 현상으로서 뇌내 압력을 증가시켜서 뇌손상 부위에 대한 압력이 증가하게 되고 심하면 뇌 탈출(brain herniation)이 발생하여 사망에 이르게 한다. 뇌부종은 혈관 표적의 연구에서 대체적으로 주목받는 현상으로서, 신경세포와는 관련이 적으며, 혈관과 매우 밀접하게 관련되는 병리 기전의 결과물로 인식될 수 있다. 종래의 보고에 의하면 뇌부종으로 유발된 뇌내 압력을 낮추는 것만으로도 50% 정도의 뇌손상을 감소시킬 수 있다고 알려져 있으나 (Gerriets T et al., 2009, Walberer M et al., 2008), 현재까지 뇌부종에 대한 치료법은 삼투압을 이용한 고삼투압성 용액(hyperosmolar solution), 수술요법인 두개절제술(craniectomy) 및 만니톨(mannitol)과 같은 삼투압 조절제 등이 사용되고 있다 (Papadopoulos et al., 2002, Hutchinson et al., 2007). 그러나, 현재 임상에서 뇌부종에 대하여 만니톨 이외에 특별한 치료제가 아직 없고, 혈액 삼투압 조절을 통한 뇌부종 치료술 밖에 없는 현실에서 뇌부종에 효과적인 물질의 발굴이 절실하다.

한편, 핵산-결합 올리고머화 도메인-유사 수용체(NLRs)는 일반적으로 C-말단 고류신 반복(LRR) 도메인 및 N-말단 이펙터 피린 도메인(PYD) 또는 caspase 모집 도메인(CARD)의 측면에 위치하는, 공통의 중앙 핵산 결합 및 올리고머화(NACHT) 도메인을 공유하는 삼자 구조를 가지는 진화론적으로 보존된 시토졸 수용체 군이다. 일단, 병원체 관련 분자 또는 손상 관련 분자에 의해 활성화되면, NSRs은 어댑터 단백질 ASC 및 시스테인 프로테아제 프로파스파제-1을 올리고머화하여 모집함으로써 인플라마좀 복합체 (염증조절복합체, inflammasomes)를 형성하고, 자기촉매작용 및 caspase-1의 활성을 유도한다. 활성 caspase-1은 궁극적으로 전구체 염증전 사이토카인 pro-IL-1β 및 pro-IL-18을 성숙 분비 형태로 절단한다.

본 발명의 목적은 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 뇌부종의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 시험관 내에서 NLRP3 발현을 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 두부외상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 두부외상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 피오글리타존을 유효성분으로 함유하는 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피오글리타존을 유효성분으로 함유하는 뇌부종의 예방 및 치료용 약학적 조성물물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피오글리타존을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 NLRP3 발현을 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 두부외상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은 두부외상 치료제의 효과를 검정하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 피오글리타존이 인플라마좀 활성을 감소시키고, 성상세포 및 미세아교세포에서 염증 반응을 조절하며, NLRP3의 발현을 억제함으로써 침습성 TBI(open TBI) 후 급성기 뇌부종을 억제하였으므로, 이를 두부외상 및 두부외상 후 뇌부종의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 침습성 두부외상(TBI) 모델 마우스 제조 과정을 나타낸 도이다:
A: 두부외상 유발용 중추 낙하 기구;
B: 2g의 강철 중추 낙하 이펙터; 및
C: 두부외상 유발 사진.
도 2는 뇌의 수분 함량 비교 데이터를 나타낸 도이다:
A: TBI 후 날짜에 따른 샴 그룹에서 손상 뇌 (우반구) 및 비손상 뇌 (좌반구)의 수분 함량; 및
B: 샴 그룹, NLRP3 K/O 그룹 및 피오글리타존 처리 그룹에서의 뇌 수분 함량.
도 3은 TBI 유발 후 NLRP3-관련 인플라마좀의 웨스턴 블롯 분석 결과를 나타낸 도이다:
A: TBI 유발 1, 3, 7 및 14일차의 샴 그룹, NLRP3 K/O 그룹 및 피오글리타존 처리 그룹에서의 IL-1β, caspase-1, NLRP3, NF-κB 및 ERK 발현 밴드; 및
B: TBI 유발 1, 3, 7 및 14일차의 샴 그룹, NLRP3 K/O 그룹 및 피오글리타존 처리 그룹에서의 IL-1β, caspase-1, NLRP3, NF-κB 및 ERK 발현량 비교 그래프.
도 4는 피오글리타존을 처리한 NLRP3 K/O 마우스에서 TBI 유발 후 NLRP3 발현 정도를 확인한 도이다.
도 5는 TBI 유발 후 3일차 뇌 조직의 GFAP 및 Iba1에 대한 면역조직화학 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 TBI 유발 후 뇌 조직의 NLRP3, GFAP 및 Iba1에 대한 면역형광 분석 결과를 나타낸 도이다:
A: TBI 유발 모델에서의 NLRP3 염색 결과;
B: TBI 유발 3일 후 NLRP3의 위치를 나타낸 공촛점 현미경 이미지; 및
C: GFAP-양성 성상세포의 활성 확인.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 피오글리타존(Pioglitazone)을 유효성분으로 함유하는 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 침습성 두부외상에 의한 급성기 질환 (증상)인 뇌부종을 예방 또는 치료할 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 침습성 두부외상에 의한 뇌압을 감소시킬 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 NLRP3(leucine-rich repeat family pyrin domain-containing 3 protein)의 발현 또는 인플라마좀의 활성을 억제 또는 감소시킬 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 NLRP3 발현 억제제를 추가로 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 피오글리타존을 유효성분으로 함유하는 뇌부종의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 NLRP3 발현 억제제를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 뇌부종은 침습성 두부외상에 의한 뇌부종일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다.

또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 두부외상의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 두부외상의 발달을 저해함,

(2) 두부외상의 확산을 예방함,

(3) 두부외상을 경감시킴, 및

(4) 두부외상의 증상을 완화함(palliating).

만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

본 명세서에서 사용되는 "유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 촉진제의 유효량은 관련 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의해 두부외상 또는 뇌부종의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.

본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.

일 측면에서, 본 발명은 피오글리타존을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관(in vitro)내에서 NLRP3 발현을 감소 또는 억제하는 방법에 관한 것이다.

일 측면에서, 본 발명은 두부외상 동물모델에 검정 목적 두부외상 치료 후보 물질을 주입하는 단계; 상기 검정 목적 두부외상 치료 후보 물질을 주입한 실험군 동물과 이를 투여하지 않은 대조군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성을 측정하는 단계; 및 상기 실험군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성이 대조군 동물에 비하여 감소 또는 억제된 경우, 두부외상 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 두부외상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 두부외상은 침습성 두부외상에 의한 뇌부종일 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 두부외상 동물모델에 검정 목적 두부외상 치료제를 주입하는 단계; 상기 검정 목적 두부외상 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 두부외상 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성을 측정하는 단계; 및 상기 실험군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성의 감소 또는 억제 정도를 양성 대조군 동물과 비교하는 단계를 포함하는, 두부외상 치료제의 효과를 검정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "검출" 또는 "측정"은 검출 또는 측정된 대상의 농도를 정량하는 것을 의미한다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 급성 침습성 두부외상에 대한 피오글리타존(Pioglitazone)의 치료 효과 확인

마우스들은 수컷 C57BL/6 마우스 (6-8주령) 및 NLRP3 낙아웃 (K/O) 수컷 마우스 (K. U. Lee로부터 제공받음)를 이용하였으며, 마우스들을 C57BL/6 (샴 그룹), NLRP3 K/O (K/O 그룹) 및 피오글리타존-처리 마우스 (처리 그룹) (10, 20 또는 40 mg/kg)으로 나누고 (각 그룹당 16마리), TBI(Traumatic brain injury)를 유발하기 위해, 중추 낙하 기구의 머리 고정 시스템에 마우스를 놓고 끝이 평평한 2g의 강철을 높이 18cm에서 두개골에 낙하시켜 침습성 TBI를 유도하였다 (도 1). 샴 그룹은 중추 낙하 없이 오른쪽 정수리 개두술만을 수행하였다. TBI 유도 후 피오글리타존 처리 마우스 군에는 피오글리타존을 매일 20 mg/kg로 복강주사하였다. 그 후 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 머리의 중간선을 절개한 뒤, 치과 드릴을 이용하여 경막이 손상되지 않은 정수리 두개골의 오른쪽에 직경 5mm의 bone window를 만들어 열었다. bone window는 브레그마(bregma)에서 3mm 후방 및 3mm 측면에 위치하였다. 그 후, 마우스들을 TBI 유도 1, 3, 7 및 14일에 희생시켰다. 이 모든 절차는 가톨릭대학교 성 빈센트 병원 동물관리위원회 (승인 번호 16-15)의 승인을 받아 진행하였다. 또한, 모든 실험 기간 동안 각 그룹의 마우스들의 6-시간 공복 혈당 수준을 심외 혈액 샘플링(transcardial blood sampling) (AccuChek; Roche) 후에 측정하였다. 아울러, TBI 유도에 의한 급성기의 주요 증상인 뇌부종을 수분 함량에 기반하여 평가하였다. 구체적으로, CO₂로 마우스들을 안락사시킨 뒤 뇌를 제거하고 오른쪽 (손상된) 및 왼쪽 (손상되지 않은) 반구의 뇌 수분 함량을 측정하기 위해 뇌줄기(brain stem)에서 대뇌(cerebrum)를 절개하여 이의 함수 중량(wet weight)을 측정하였다. 그 후 이를 100℃ 오븐에서 건조시키고 건조 중량(dry weight)을 측정하였다. 이에 따라 뇌의 수분 함량을 하기의 수학식 1로 계산하였다.

그 결과, 샴 그룹에서 우반구의 수분 함량이 TBI 유도 3일 후가 가장 높게 나타났고 (72.06% ± 2.06%), 그 이후 감소하는 것으로 나타났으며, TBI 유도 3일 후를 제외하고는 우반구와 좌반구 사이의 수분 함량에 통계적으로 유의한 차이는 없는 것으로 나타났다 (도 2A). NLRP3 K/O 그룹에서 TBI 유도 3일 후 손상된 반구의 수분 함량 (65.70% ± 1.20%)은 샴 그룹에 비해 현저히 적은 것으로 나타났다 (p = 0.028). 피오글리타존 처리 그룹에서 TBI 유도 3일 후 손상된 반구의 수분 함량 (65.77% ± 3.10%)은 샴 그룹에 비해 현저히 적은 것으로 나타났으며, 특히 다른 날보다 TBI 유도 3일차에 더 낮은 것으로 나타났다 (도 2B).

실시예 2. 피오글리타존의 TBI 유발 뇌부종 치료 효과 기전 확인

상기 실시예의 TBI 유도 1, 3, 7 및 14일차에 희생된 샴 그룹, NLRP3 K/O 그룹 및 피오글리타존 처리 그룹의 각 마우스에서 IL-1β, caspase-1, NLRP3, NF-κ 및 ERK의 발현을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다. 구체적으로, 각 마우스 시료에서 단백질을 SDS-PAGE 젤을 통해 분리한 뒤 니트로셀룰로오스 막에 옮기고 NLRP3, caspase-1, IL-1β, ERK 및 NF-κ에 대한 항체 (Cell Signaling Technology) 및 대조군 항체 β-actin (Sigma-Aldrich)로 이를 검출하고 ELC(enhanced chemiluminescence)로 면역반응성(immunoreactivity)을 검출한 뒤 광학농도계(imaging densitometer)를 이용하여 이를 분석하였다. 각 밴드의 밀도는 Quantity One software (Bio-Rad)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 샴 그룹에서 IL-1β 및 NLRP3의 발현은 TBI 유발 3일차에 증가하였고, caspase-1, NF-κ 및 ERK의 발현량은 3, 7 및 14일차보다 1일차에 더 높게 나타났다 (도 3). K/O 그룹에서는 IL-1β, caspase-1 및 NLRP3의 발현이 낮은 반면, 14일차에 피오글리타존 처리 그룹에서 IL-1β의 발현이 샴 그룹에 비해 현저히 낮게 나타났고 (p = 0.047), 1, 3, 7 및 14일차에 caspase-1 발현이 샴 그룹에 비해 현저히 낮은 것으로 나타났다 (각각 p = 0.006, 0.008, 0.007 및 0.002). 3일차 및 14일차에 NLRP3 발현 정도는 샴 그룹에 비해 처리 그룹에서 현저히 낮게 나타났다 (각각 p = 0.026 및 0.024). 또한, 피오글리타존 처리에 의해 NF-κB 및 ERK의 발현이 감소하지 않은 것으로 나타났다. 이들 결과를 통해, TBI가 NLRP3-관련 인플라마좀(Inflammasome)과 관련되어 있고, 피오글리타존 투여가 인플라마좀 활성을 감소시키는 것을 유추할 수 있다 (도 3B).

실시예 3. TBI에 의한 뇌부종에서의 NLRP3 조절

TBI에서 발생한 뇌부종에 대한 피오글리타존의 치료 효과가 NLRP3와 중요하게 관련되어 있는 것으로 판단되어, 피오글리타존을 20mg/kg로 14일 동안 처리한 C57BL/6 마우스와 피오글리타존을 20mg/kg로 1, 3, 7 또는 14일 동안 처리한 NLRP3 K/O 마우스에 TBI 유발 후 NLRP3 발현을 측정하였다.

그 결과, 피오글리타존을 처리한 NLRP3 K/O 마우스에서 NLRP3 발현이 나타나지 않아 (도 4), 피오글리타존이 이의 뇌부종 치료 효과를 NLRP3를 통해 발휘하는 것을 알 수 있다.

실시예 4. 피오글리타존 처리에 의한 성상세포 및 미세아교세포 활성 조절 확인

TBI 유발 후 피오글리타존 처리에 의한 성상세포(astrocyte) 및 미세아교세포(microglia)의 활성을 확인하기 위해, TBI 후 3일차에 뇌 반구를 GFAP(glial fibrillary acidic protein), Iba1 (1:1000, Cell Signaling Technology) 및 β-actin (1:2000, Sigma-Aldrich) 항체를 이용한 면역조직화학 분석을 수행하였다. 또한, 이들을 H&E 염색하였다. 또한, tyramide signal amplification fluorescence (Perkin Elmer)를 이용하여 NLRP3 및 GFAP를 면역형광 분석하고, 공촛점 현미경 (CarlZeiss LSM 700)으로 이를 관찰하고 Image ZEN 2009 Light Edition software (version 1.0)를 이용하여 검체를 분석하였다.

그 결과, NLRP3 K/O 그룹 마우스 및 피오글리타존 처리 그룹 마우스에서 성상세포 활성 마커인 GFAP 및 미세아교세포 활성 마커인 Iba1의 발현이 샴 그룹 마우스에 비해 낮은 것으로 나타났다 (도 5). 이를 통해 피오글리타존이 성상세포 및 미세아교세포의 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 손상된 피질의 면역형광 분석 결과, NLRP3 활성이 손상 부위에서 현저한 것으로 나타났다 (도 6A). NLRP3 면역 활성은 피오글리타존 처리 마우스 그룹에서 샴 그룹에 비해 낮게 나타났으며 (도 6B), 이와 유사하게 GFAP 발현도 피오글리타존 처리 그룹에서 더 낮게 나타났다. 샴 그룹에서 GFAP-양성 성상세포가 성상(stellate), 분지형 양극 또는 큰 세포질의 세포로 나타났으나, NLRP3 K/O 마우스 그룹에서는 GFAP-염색된 성상세포가 거의 검출되지 않았다 (도 6C). 이를 통해, 피오글리타존 투여가 성상세포 및 미세아교세포에서 염증 반응을 조절함으로써 NLRP3 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (15)

1. 피오글리타존(Pioglitazone)을 유효성분으로 함유하는 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 침습성 두부외상인, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 급성 두부외상인, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 두부외상은 두부외상 후 뇌부종인, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 급성기 두부외상의 뇌압을 감소시키는, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
6. 제 1항에 있어서, NLRP3(leucine-rich repeat family pyrin domain-containing 3 protein)의 발현을 억제 또는 감소시키는, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
7. 제 1항에 있어서, NLRP3 발현 억제제를 추가로 포함하는, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
8. 제 1항에 있어서, 인플라마좀 활성을 감소시키는, 두부외상의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
9. 피오글리타존을 유효성분으로 함유하는 뇌부종의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
10. 제 9항에 있어서, NLRP3 발현 억제제를 추가로 포함하는, 뇌부종의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
11. 제 9항에 있어서, 침습성 두부외상에 의한 뇌부종인, 뇌부종의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
12. 피오글리타존을 처리하는 단계를 포함하는, 시험관(in vitro)내에서 NLRP3 발현을 감소 또는 억제하는 방법.
13. (a) 두부외상 동물모델에 검정 목적 두부외상 치료 후보 물질을 주입하는 단계;
    (b) 상기 검정 목적 두부외상 치료 후보 물질을 주입한 실험군 동물과 이를 투여하지 않은 대조군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 실험군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성이 대조군 동물에 비하여 감소 또는 억제된 경우, 두부외상 치료제로 판단하는 단계를 포함하는, 두부외상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
14. 제 13항에 있어서, 두부외상은 침습성 두부외상에 의한 뇌부종인, 두부외상 치료 후보 물질을 스크리닝하는 방법.
15. (a) 두부외상 동물모델에 검정 목적 두부외상 치료제를 주입하는 단계;
    (b) 상기 검정 목적 두부외상 치료제를 주입한 실험군 동물과 기존 두부외상 치료제를 투여한 양성 대조군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 실험군 동물의 NLRP3 발현량 또는 인플라마좀 활성의 감소 또는 억제 정도를 양성 대조군 동물과 비교하는 단계를 포함하는, 두부외상 치료제의 효과를 검정하는 방법.

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