KR100794204B1

KR100794204B1 - 신경 친화성 타크로리무스 유사체

Info

Publication number: KR100794204B1
Application number: KR1020037008787A
Authority: KR
Inventors: 마츠오카노부야; 야마지다카유키; 골드브루스
Original assignee: 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-12-31
Publication date: 2008-01-14
Also published as: CA2433384A1; HUP0302521A2; AR035411A1; NZ527209A; KR20040007431A; CN1293877C; RU2003123493A; HUP0302521A3; RU2288716C2; AU2002231277B2; EP1353671A4; PL366301A1; NO20032913D0; KR20070030331A; ZA200305806B; IL156664A0; CZ20032060A3; BR0116762A; EP1353671A1; WO2002053159A1

Abstract

본 발명은 고 수준의 신경 친화성 활성 및 저 수준의 면역억제성 활성을 갖는 타크로리무스 유도체. 화합물은 특히 신경세포 손상/기능장애를 예방하거나 치료하기 위한 신경 친화성 약제로서 유용하다.

Description

신경 친화성 타크로리무스 유사체{Neurotrophic tacrolimus analogs}

본 발명은 고 수준의 신경 친화성 활성 및 저 수준의 면역억제성 활성을 갖는 타크로리무스 유도체에 관한 것이다.

특정 마크로리드 화합물, 예를 들면, 타크로리무스 및 관련 화합물이 뇌경색 치료 또는 예방을 돕는다고 공지되어 있다(W094/14443). FKBP형 이뮤노필린, 예로서 타크로리무스에 대한 친화성을 갖는 특정 피페콜산 유도체는 손상된 말초 신경을 자극하거나 신경 세포 재생을 촉진한다고 공지되어 있다(W096/40140). 특정 비-면역억제성 화합물, 즉, 겔다나마이신 및 그의 유사체는 스테로이드성 수용체 컴플렉스를 파괴하고 신경 성장을 촉진하는 것으로 공지되어 있다(W099/21552).

발명의 요약

본 발명자들은 하기 언급되는 화학물(I)의 특정 타크로리무스 유사체가 탁월한 신경 친화성 활성을 갖지만 타크로리무스와는 달리 면역억제성 활성은 거의 없거나 전혀 없음을 발견하였다. 이하 나타내는 바, 화합물(I)은 예를 들면, 신경돌기의 길이를 증가시키는 그의 능력을 측정한 바 타크로리무스와 비교하여 신경 친화성 활성의 우수한 수준으로 작용한다. 유사하게, 화합물(I)의 투여는 축삭 재생을 유도하고 신경 압궤손상 또는 척수 손상으로부터의 회복을 가속화시키는 것으로 보인다. 또한, 화합물(I)은 타크로리무스와 비교하여 면역억제성 활성이 거의 없거나 전혀 없이 이들 이로운 신경 친화성 효능에 작용한다.

따라서, 본 발명은 우수한 신경 친화성 약제 및 면역억제성 활성이 거의 없거나 전혀 없는 신경 친화성 약제로서 화합물(I)의 신규한 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 화합물(I)을 포함하는 신경 친화성 약제 또는 조성물을 제공한다.

추가로, 본 발명은 포유 동물에 화합물(I)을 투여하는 것을 포함하는 신경 세포 손상/기능장애를 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.

예상밖으로, 본 발명자들은 화합물(I)이 유리하게는 면역억제성 효능이 거의 없거나 전혀 없이 신경계에 대한 상해 또는 손상에 의해 유발된 신경 손상 또는 기능장애, 신경계 쇠약, 또는 신경계 질환을 호전시키고, 예방하거나 치료하는데 유용하다는 것을 발견하였다.

화합물(I)은 신체적 손상, 영양이상, 허혈, 퇴행성 질환, 악성 질환, 감염성 질환, 및 약물상호작용, 독소 또는 독극물에 의해 유발된 상해, 쇠약 또는 기능장애의 치료에 유용하다. 예를 들면, 화합물(I)은 뇌수술, 말초신경 손상, 화상, 뇌척수염, HIV, 헤르페스, 암, 방사선 치료, 약물상호작용, 폴산 또는 비타민B-12 결핍, 및 신경독 또는 납과 같은 화학물질의 노출에 의해 유발되는 신경 손상 또는 기능장애를 치료하는데 유용하다.

따라서, 화합물(I)은 신경 세포 손상 및 기능장애, 예를 들면, 여러근육염( 다발근육염), 길리안-바르(Guillan-Barre) 증후군, 메니에르 질환, 여러신경염(다발신경염), 홑신경염 (고립 신경염), 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤 병, 신경근병증, 신경병증(예: 당뇨병신경병증, 화학요법-유도성 신경병증 등), 척수손상, 노인성치매, 혈관치매, 다발경화증, 신체 마비 등을 치료하거나 예방하는데 유용하다.

본 발명에서 사용되는 타크로리무스 유사체, 화합물(I)은 하기 화학식을 갖는다:

이 화합물은 미국특허 제 5,376,663 호중 실시예 29에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 화합물(I)와 관련하여, 비대칭 탄소원자(들) 또는 이중 결합(들)에 기인하는 광학 및 기하학적 이성체와 같은 형태 이성질체 및 하나 이상의 입체이성체가 존재할 수 있고, 상기 형태 이성질체 및 입체이성체 또한 본 발명에서 화합물 범위에 포함된다고 이해되어야 한다.

화합물(I)은 약제학적으로 허용가능한 염, 유도체, 용매화물 또는 프로드럭 의 형태로 존재할 수 있고, 이 모두는 본 발명의 범위내 포함된다. 용매화물은 바람직하게 수화물 및 에탄올레이트를 포함한다.

화합물(I)의 바람직한 형태는 하기의 것이다:

본 발명에서 화합물(I)은 순수한 화합물 또는 또다른 화합물 또는 다른 성분과의 혼합물로서 바람직하게 약제학적 비히클 또는 담체중에서 투여될 수 있다. 화합물(I)이 약제학적 제제 또는 조성물의 형태로 사용되는 경우 이는 외용(국소), 경구, 장용, 피하, 정맥내, 근육내 또는 비경구 투여에 적절한유기 또는 무기 담체, 비히클 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 예를 들면, 활성 성분으로서 화합물(I) 및 하나 이상의 담체, 비히클 또는 부형제를 포함하는 고형, 반고형 또는 액상 조성물로 존재할 수 있다. 전형적인 담체, 비히클 또는 부형제는 제한하는 것은 아니지만 통상의 약제학적 담체, 약용 또는 약제학적 제제, 완충제, 분산제, 유화제 및 어쥬번트를 포함한다.

화합물(I)은 또한 정제, 펠릿, 캡슐제, 점안제, 좌제, 액제(예: 염수), 유 제, 현탁제(예: 올리브오일), 연고, 에어로졸 스프레이, 크림제, 피부용 반창고 및 패취 및 사용하기 적절한 다른 형태용의 통상의 비독성, 약제학적으로 허용가능한 담체와 함께 혼합될 수 있다.

적절한 담체는 물, 수성 염수 및 덱스트로스 용액, 동물성, 식물성 및 합성 오일을 포함하는 오일, 및 석유 산물을 포함한다. 다른 유용한 담체는 글루코스, 락토스, 아라비아 검, 젤라틴, 만닛톨, 전분 페이스트, 마그네슘 트리실리케이트 탈크, 옥수수 전분, 케라틴, 콜로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아, 및 고형, 반고형, 또는 액상 형태로 제제의 제조에 사용하기 적절한 다른 담체를 포함한다. 추가로 보조제, 안정화제, 유화제, 점증제, 착색제, 향미체 및 퍼퓸을 사용할 수 있다.

화합물(I)은 특정 질환 진행 또는 이상에 대하여 바람직한 효능을 얻기 위한 유효량으로 약제학적 조성물중에 포함된다. 바람직하게, 화합물(I)은 신경 친화성 효능을 제공하거나 신경 세포 성장을 자극하기에 충분한 양으로 포함된다.

본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 포유동물은 가축, 예로서 소, 말, 돼지 등, 애완동물, 개, 고양이, 래트, 마우스, 토끼, 햄스터 등, 영장류 및 인간을 포함한다.

화합물(I)을 포함하는 제품 또는 조성물을 인간에게 투여 또는 적용시키는 바람직한 방법은 주사 또는 경구 투여를 포함하였다.

화합물(I)의 치료학적 유효량은 각개 환자마다 다양할 수 있고, 또한 치료하는 각 개개 환자의 연령 및 상태에 따라 다르지만, 통상 약 0.0001-1000 mg, 바람 직하게 0.001-500 mg 및 더욱 바람직하게 0.01-100 mg 범위의 일일 투여량으로 질환을 치료하기 위하여 활성 성분을 투여하고, 통상 약 0.001- O.O1mg, 0.2-0.5 mg, 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 250 mg 및 500 mg의 평균 단일 투여량으로 투여된다. 인간에서 만성 투여를 위한 일일 투여량은 약 0.1-30 mg/kg/일의 범위일 것이다. 화합물(I)은 신경 친화성 또는 신경 세포 성장 자극 활성을 갖는 다른 제제와 함께 동시에, 따로따로 또는 순차적으로 투여 또는 적용될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 상기 치료가 필요한 포유동물 대상(예: 인간 환자)에 주기적으로 투여되어 신경 세포 재생 및 기능 회복을 촉진시키고 신경돌기 생성을 자극하여 예를 들면, 신체적 손상 (예: 척수 손상 및 외상, 좌골 또는 얼굴신경 상해 또는 손상, 절단후 사지 이식)에 의해 유발되는 말초 신경 및 중추 신경계에 대한 손상; 질환(예: 당뇨병신경병증); 암 화학요법(예: 아크릴아미드, 탁솔, 빈카 알칼로이드 및 독소루비신에 의해 유발된 신경병증); 후유증(예: 대뇌 경색, 출혈성 경색 등과 관련되는 섬망착어(allophasis)(예: 발음장애), 의식 혼탁, 운동이상증 등; 및 제한하는 것은 아니지만, 및 신경 질환, 제한하는 것은 아니지만 다양한 말초 신경병증 및 신경계 질환, 제한하는 것은 아니지만: 삼차신경통, 혀인두신경통, 얼굴마비, 중증근육무력증, 근육퇴행위축, 근위축성 측삭 경화증, 진행근육위축, 유전성 진행 연수근육위축, 추간판탈출증(herniated), 원반탈출증(ruptured), 또는 척추원반탈출 증후군, 경추증, 신경총질환, 흉곽출구파괴증후군, 말초 신경병증, 예로서 납, 아크릴아미드에 의해 유발된 것, 감마-디케톤 (glue-sniffer's 신경병증), 이황화탄소, 댑손, 진드기, 포르피린증, Gullain- Barre 증후군, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 및 헌팅톤 무도병을 포함하는 다양한 신경 병리학적 상태를 치료할 수 있다.

말초 신경의 절단 또는 척수 손상은 신경 성장 자극량의 약제를 포유동물에 투여하고 말초 신경 또는 척수에 동종이식편과 같은 신경 이식편(Osawa et al., J Neurocytol. 19: 833-849,1990 ; Buttemeyer et al., Ann. Plastic Surgery 35: 396-401,1995) 또는 인공 신경 이식편(Madison and Archibald, Exp. Neurol. 128 : 266-275,1994; Wells et al., Exp. Neurol. 146: 395-402,1997)을 이식시켜 치료할 수 있다. 말초 신경 또는 척수의 절단된 말단사이의 공간은 바람직하게 콜라겐, 메틸 셀룰로오스 등과 같은 비세포성 공간-충진 물질, 또는 슈반세포와 같은 신경 세포 성장을 촉진하는 세포 현탁액 (Xu et al., J. Neurocytol. 26: 1-16,1997), 후각 세포 및 초형성(sheathing) 세포(Li et al. Science 277: 2000-2002,1997)로 충진된다. 신경 성장 촉진제를 상기 세포성 또는 비세포성 공간-충진 물질과 함께 포함할 수 있거나, 신경 이식 처리전후, 또는 처리하는 동안 전신투여할 수 있다.

특히, 화합물(I)은 신경 세포 손상/기능장애 여러근육염(다발근육염), 길리안-바르(Guillan-Barre) 증후군, 메니에르 질환, 여러신경염(다발신경염), 홑신경염 (고립 신경염), 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤 병, 신경근병증, 당뇨병신경병증, 화학요법-유도성 신경병, 노인성치매, 혈관치매, 다발경화증, 신체 마비, 척수 손상을 치료하거나 예방하는데 유용하다.

하기 실시예는 본 발명을 추가로 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니지만 이들 실시예는 본 발명의 특정 일면 또는 일례를 기술한다는 것을 이해하여야 한다.

실시예 1: 화합물(I)을 사용한 치료가 해마 신경 세포 신경돌기 길이를 현저하게 증가시킨다.

세포 배양액의 제조:

Banker and Cowan (Brain Research, 1977,126: 397-425)에 따라 배아일 18.5("E18. 5")째의 래트의 새끼로부터 배야 해마 신경 세포를 수득하였다. 간단하게, 해마 부위를 제거하고, 잘게 썰고 45분동안 37℃에서 100 I. U. 파파인에서 인큐베이션시키고, 세포를 완전 신경 세포 배지: L-글루타민이 결여된 최소 필수 배지(GIBCO, Grand Island, NY), 1.5ml/100ml의 고(high) 글루코스 최소 필수 배지(GIBCO), 0.1ml/100ml의 혈청 증량제 배지(Hito + Tm; Collaborative Research Inc, Lexington, MA), 글루타민 (GIBCO), 5% 우태아 혈청(GIBCO)에서 재현탁시켰다.

세포를 폴리-L-리신으로 코팅된 커버슬립(500 세포/커버슬립)상에 시딩하였다. 커버슬립을 피질 성상교세포의 모노레이어로 프리코팅된 디쉬상으로 뒤집었다.

해마 신경 세포에서 축삭 길이 분석:

해마 신경 세포(그의 특성상 극성 및 수상돌기에 의해 동정됨)를 매일 조사하고 72시간째 무작위적으로 사진촬영하였다(9-12 프레임/커버슬립). 축삭(가장 긴 돌기로서 정의됨)의 길이를 적절한 소프트웨어 (Bioquant IV, R & M Biometrics, Nashville, TN)를 포함하는 IBM XT 컴퓨터에 연결된 Houston Instrument HI-PAD 디 지털화 타블릿(Tablet)을 사용하여 사진위에서 신경돌기의 길이를 측정하였다; 단지 3배 이상의 세포체 길이를 갖는 돌기만을 측정하였다. 동일하게 처리된 커버슬립으로부터의 데이타(그룹단 3 또는 4)는 상이하지 않았고 따라서, 콤바인시켰다. 평균값을 계산하고 일원(화합물 (Ia) 또는 타크로리무스 처리 샘플 대 NGF만을 처리한 샘플) ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험 (WINKS 4.62 professional edition)을 사용하여 비교하였다.

결과:

72시간째, 비처리 대조군과 10 nM 타크로리무스로 처리된 그룹 사이에 현저한 차이는 없었다. 그러나, 10 nM 농도의 화합물 (Ia)로 처리된 그룹의 신경돌기의 길이가 통계학적으로 현저하게 증가하였다. 하기 표 I의 결과를 참조하라:

표 1: 72시간째 일차 해마 세포 배양액에서 평균 신경돌기 길이에 대한 화합물 (Ia) 및 타크로리무스의 효능

	신경돌기 길이(μm)
비처리군	372.3±18.23
타크로리무스(10nM)	423.4±19.50
화합물 (Ia)(10nM)	502.2±23.61^*

^*: P < 0.05 대 비처리군(일원 ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험)

실시예 2: 화합물(I)을 사용한 치료가 SH-SYSY 인간 신경모세포종 세포에서 평균 신경돌기 길이를 증가시킨다

SH-SYSY 신경모세포종 세포 배양액의 제조:

SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포를 37℃에 7% CO₂에서 10% 우태아 혈청 (SIGMA), 50 I. U./ml의 페니실린, 및 50㎍/㎖ 스트렙토마이신 (GIBCO)으로 보충된 DMEM 배지 (GIBCO) 중에 유지시켰다. 세포를 6개의 웰 플레이트에 15,000 세포/웰로 플레이팅하고 0.4μM 아피디콜린 (SIGMA)으로 처리하였다. 5일째, 세포를 세척하고 타크로리무스 (10 nM) 또는 화합물 (Ia) (1 nM)가 존재하거나 존재하지 않는 상태에서 10 ng/ml으로 신경성장인자 (NGF)(돌기 생성을 유도하기 위하여)로 처리하였다. 96시간째 배지를 교환하고 추가의 72시간(총 시간, 168시간)동안 새로운 배지로 대체하였다. 모든 시험은 두개의 웰로 진행하고 데이타는 각 처리군에 대하여 평균화하였다. SH-SY5Y 신경모세포종 세포의 신경돌기 길이 분석:

돌기 길이 분석을 위해, 세포(20필드/웰)를 168시간째 무작위적으로 사진촬영하였다. 적절한 소프트웨어 (Bioquant IV, R & M Biometrics, Nashville, TN)를 포함하는 IBM XT 컴퓨터에 연결된 Houston Instrument HI-PAD 디지털화 타블릿(표t)를 사용하여 사진상에서 신경돌기의 길이를 측정하였다; 단지 2배 이상의 세포체 길이를 갖는 돌기만을 측정하였다. 동일하게 처리된 웰로부터의 데이타는 상이하지 않았고 따라서, 콤바인시켰다. 평균값을 계산하고 일원 (화합물 (Ia) 또는 타크로리무스 처리 샘플 대 NGF만을 처리한 샘플) ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험 (WINKS 4.62 professional edition)을 사용하여 비교하였다.

결과:

신경 돌기 길이 측정에 의해 168시간째 두개의 화합물(Ia) (1 nM) 및 타크로리무스 (10 nM)이 NGF (10 ng/ml)만으로 처리된 것과 비교하여 신경돌기의 길이를 현저하게 증가시킨다고 입증되었다. 그러나, NGF와 배합된 1 nM 화합물 (Ia)이 NGF와 배합된 10 nM 타크로리무스의 효능보다 우수하였다.

표 2: 168시간째 SH-SY5Y 인간 신경모세포종 세포에서 평균 신경돌기 길이에 대한 화합물 (Ia) 및 타크로리무스의 효능

	신경돌기 길이(μm)
NT	94.75±3.734
NGF(10ng/ml)	198.8±8.991
타크로리무스(10nM) +NGF(10ng/ml)	227.6±9.130^*
화합물 (Ia)(1nM) +NGF(10ng/ml)	256.0±9.067^*

^*: P < 0.05 대 NGF(일원 ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험)

실시예 3: 화합물(I)을 사용한 치료가 래트의 좌골신경 압궤(crush) 모델에서 기능 회복을 촉진한다

동물 및 수술법:

9마리의 6주령된 수컷 Sprague-Dawley 래트를 2% 할로탄으로 마취시키고, 우측 좌골신경을 노출시키고 2회에 걸쳐 힙 수준에서 신경을 압착시켰다(No. 7 Dumont jeweler's 핀셋을 사용하여 총 60초동안). 압착 부위를 신경외막 피포(epineurial sheath)를 통해 멸균 9-0 봉합선으로 묶어 마크하였다.

화합물 (Ia)의 제조 및 투여:

화합물 (Ia)를 30% 디메틸설폭시드 (DMSO) : 70% 염수를 포함하는 비히클에 용해시켰다. 3마리의 액소토미화된(axotomized) 래트에 화합물 (Ia) (1 또는 5 mg/kg) 또는 동량의 비히클(염수중 30% DMSO) (5ml/kg)중 하나를 매일 피하 주사하였다.

행동 평가:

관류일(18일)까지 동물을 매일 조사하였다. 하기의 반-정량적 스케일을 사용하여 동물의 기능 회복을 평가하였다:

0: 보행시 밖으로 구부러진 발 및 구부러진 발가락을 포함하는 마비;

1: 발을 세우고 발가락을 움직일 수 있는 능력;

2: 계속하여 보행할 수 있는 능력;

3: 보행시 발가락을 펼치는 것을 보임;

4: 뒤꿈치로 보행하고 정상에 가까운 발가락 펼침을 보임.

중간의 능력을 보이는 동물은 부분 점수를 주었다: +, 0.25; ++, 0.5; +++, 0.75.

조직 고정 및 제조:

신경 압착후 18일째, 4% 할로탄을 사용하여 래트를 강력하게 마취시키고, 헤파린화하고, 10초동안 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.4)중 4% 파라포름알데히드 이어서 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.4)중 5% 글루타알데히드(1L)으로 관류시키고 24시간동안 4℃에서 고정시켰다. 압착 부위로부터 공지된(5mm) 위치의 좌골신경으로부터 조직을 샘플링하였다. 본 연구에서, 가자미근을 공급하는 후방 흉골신경 가지로부터의 데이타만을 기록하였다. 조직을 0.1 M 인산나트륨 완충액 (pH 7.4)에 놓고, 2.5시간동안 1 % 오스뮴 테트록시드(0.1 M 인상 완충액중)을 최종적으로 첨가하고 에탄올로 탈수시키고 플라스틱에 묻었다. 우라닐 아세테이트 및 시트레이트로 준초박절(Semithin sections)를 염색하고 필름-지지된 75 메쉬 그리드상에 탑재하고 JEOL 100 CX 전자 현미경으로 조사하였다.

형태계측학적 분석:

축삭구경(axonal calibers)의 분석을 가자미근 신경에서 수행하였다. 재생 수초 축삭의 수를 전자 현미경을 사용하여 계수하였다. 평균값 및 표준 오차를 비히클 처리군, 화합물 (Ia) (1 mg/kg)-처리군, 및 화합물 (Ia) (5 mg/kg)-처리군에 대하여 게산하였다.

통계학적 분석:

행동 분석에 대하여, 기능 회복에 대한 평균값을 개개의 값에 대한 비교를 위해 일원 ANOVA 이어서 Newman-Keuls 다중 비교 시험을 사용하여 비교하였다. 형태계측학적 분석을 위해 축삭 수의 평균값을 개개의 값에 대한 비교를 위해 일원 ANOVA 이어서 Newman-Keuls 다중 비교 시험을 사용하여 비교하였다.

결과:

기능 회복:

기능 회복은 15-17일째 관찰되었고, 비히클-처리된 래트에서보다 1 mg/kg-처리된 래트 및 5 mg/kg-처리된 래트에서 일찍 발생하였다. 하기 표 3을 참조하라.

표 3: 래트에서 좌골신경의 기능 회복에 대한 화합물(Ia)의 효능

	기능 스코어
	비히클(s.c.) (염수중30% DMSO)	화합물(Ia)
	비히클(s.c.) (염수중30% DMSO)	1 mg/kg(s.c.)	5 mg/kg(s.c.)
15일	1.67±0.08	2.58±0.17 *	3. 17±0. 08 *
16일	1.83±0.08	2.83±0.17 *	3.50±0.00 *
17일	2.50±0.00	3.08±0.22 *	3.50±0.00 *

^*: P < 0.05 대 NGF(일원 ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험)

전자현미경검사

동물의 형태학적 조사를 액소토미화(axotomy) 18일후 수행하였다.

신경 부위당(5,000㎛²) 재생 수초 축삭의 수는 각각 비히클-처리된 래트에서의 5.5±2.7(평균±SEM)으로부터 1 및 5 mg/kg-처리된 래트에서의 19 ± 2.4 및 20±2.9으로(P < 0.05) 현저하게 증가하였다. 하기 표 4를 참조하라.

표 4: 래트에서 좌골신경 압착 18일후 가자미근에서 신경 부위당(5,000㎛ ² ) 재생 수초 축삭의 수에 대한 화합물(Ia)의 효능

	비히클(s.c.) (염수중 30% DMSO)	화합물(Ia)
재생 수초 축삭	비히클(s.c.) (염수중 30% DMSO)	1 mg/kg(s.c.)	5 mg/kg(s.c.)
재생 수초 축삭	5.5±2.7	19 ± 2.4	20±2.9

실시예 4: 화합물(I)의 처리가 래트의 척수 손상 모델에서 기능 회복을 촉진시킨다.

(1) 방법

동물 및 수술처리

28마리의 6주령 수컷 Sprague-Dawley 래트를 2% 할로탄으로 마취하고 TlO/T11에서 척추후궁절제술을 수행하고 척수의 반절단 손상을 TlO/T11 척수 수준에서 수행하였다.

화합물 (Ia)의 제조 및 투여

화합물 (Ia)를 30% 디메틸설폭시드 (DMSO) : 70% 염수를 포함하는 비히클에 용해시켰다. 수술 7주동안 척수 손상된 래트에 화합물 (Ia) (2 mg/kg) 또는 동량의 비히클(염수중 30% DMSO) (5ml/kg)중 하나를 매일 피하 주사하였다.

기능 회복 평가

손상후 2주째 변형된 Tarlov/Klinger 스케일, 협빔 시험 및 족문시험을 사용하여 평가하였다.

A. 변형된 Tarlov/Klinger 스케일

래트는 1분동안 개방된 필드에서 자유롭게 활동할 수 있도록 하고 하기 나타낸 스케일에 따라 0-6으로 평가하였다.

0: 손상된 뒷다리는 움직이지 않음

1: 손상된 뒷다리에서의 거의 인식할 수 없는 움직임

2: 손상된 뒷다리 관절에서 활발한 움직임(힙, 무릎 또는 발목) 공동작용은 없고, 무게를 지지하지 못한다

3: 손상된 뒷다리의 교대 보행 및 추진운동, 무게를 지탱하지 못한다

4: 손상된 뒷다리로 무게를 지탱할 수 없다

5: 유일하게 경미한 결합을 포함하는 보행

6: 정상적인 보행

B. 협빔 시험

래트를 너비가 감소된 7.7cm, 4.7cm, 2.7cm 및 1.7cm을 갖는 목제 빔(길이 1. 5m)상에서 시험하였다. 래트를 바상에서 걷도록 하고, 적어도 두번의 시도에서 미끄러지지 않고 걸을 수 있는 가장 좁은 바를 기록하였다.

0: 어느 빔상에서도 걷지 못함

1: 7.7cm 빔상에서 걷을 수 있음

2: 4.7cm 빔상에서 걷을 수 있음

3: 2.7cm 빔상에서 걷을 수 있음

4: 1.7cm 빔상에서 걷을 수 있음

C. 족문시험

래트의 뒷다리에 잉크칠하고 족문을 길이 60cm 및 7.5cm 너비의 좁은 런어웨이(runway)로 커버된 종이상에서 만들었다. 일련의 적어도 6번의 순차적인 단계를 사용하여 5-포인트 족문 스코어를 결정하였다.

0: 일정한 등쪽 보행 또는 뒷다리 견인(dragging), 즉 족문을 볼 수 없다

1: 적어도 3개의 족문에서 적어도 3개의 발가락의 발가락 프린트를 볼 수 있다

2: 그의 기본 값과 비교하여 이중값 이상의 발의 외- 또는 내-회전을 보임

3: 발가락 견인의 징후는 보이지 않고 발 회전을 보인다

4: 외- 또는 내-회전의 징후는 보이지 않지만(기본 값의 2배 미만의 각도), 하나 이상의 발꿈치는 볼 수 있다

5: 발꿈치를 볼 수 없다

통계학적 분석

행동 분석에 대하여, 각 기능 시험에 대한 평균값을 개개의 값에 대한 비교를 위해 일원 ANOVA 이어서 Newman-Keuls 다중 비교 시험을 사용하여 비교하였다.

(2) 결과:

기능 회복:

변형된 Tarlov/Klinger 스케일(표 5), 빔 보행 시험(표 6) 및 족문 시험(표 7)을 사용하여 수행된 3개의 모든 기능 회복 시험에서 화합물 (Ia)은 변형된 Tarlov/Klinger 스케일(표 5), 빔 보행 시험(표 6) 및 족문 시험(표 7)에서 운동성 기능 장애를 개선시켰다.

표 5: 래트에서 척수 손상의 변형된 Tarlov/Klinger 스코어에 대한 화합물(Ia)의 효능

	변형된 Tarlov/Klinger 스코어
	비히클(s.c.) (염수중30% DMSO)	화합물(Ia)
		2 mg/kg(s.c.)
2주	2.1±0.1	3.7±0.2 *

^*: P < 0.05 대 NGF(일원 ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험)

표 6: 래트에서 척수 손상의 빔 보행 스코어에 대한 화합물(Ia)의 효능

	빔 보행 스코어
	비히클(s.c.) (염수중30% DMSO)	화합물(Ia)
		2 mg/kg(s.c.)
2주	0.9±0.1	2.0±0.3 *

^*: P < 0.05 대 NGF(일원 ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험)

표 7: 래트에서 척수 손상의 족문 스코어에 대한 화합물(Ia)의 효능

	족문 스코어
	비히클(s.c.) (염수중30% DMSO)	화합물(Ia)
		2 mg/kg(s.c.)
2주	1.7±0.4	3.6±0.3 *

^*: P < 0.05 대 NGF(일원 ANOVA 이어서 Newman-Kuels 다중 비교 시험)

실시예 5: 화합물 (Ia)는 FKBP12에 결합하지만 타크로리무스와 달리 면역억 제성 효능은 거의 발휘하지 않거나 전혀 발휘하지 않는다

(1) FKBP12에 대한 결합 분석

Tamura, K.등(Biochemical arid Biophysical Research Communications, Vol. 202, No. 1, 437-499, 1994)에 것과 유사한 방식에 따라 결합 분석을 수행하였다. 표 8에 결과를 나타낸다.

(2) 혼합 림프구 시험(MLR)

MLR 시험을 U. S. Patent 4,929,611의 것과 유사한 방식으로 수행하였다.

표 8에 결과를 나타낸다.

표 8 : 시험관내 화합물 (Ia) 및 타크로리무스의 약물학적 프로파일

	FKBP12 결합 IC₅₀(nM)	MLR IC₅₀(nM)
화합물 (Ia)	<5	>100
타크로리무스	<5	<2

상기 결과는 화합물 (Ia)는 FKBP12에 결합할 수 있지만 면역억제성 활성을 갖지 않음을 나타낸다.

상기 나타낸 결과는 시험관내 및 생체내 모델 모두를 사용하여 화합물(I)의 강력한 신경 친화성 효능을 설명한다. 두개의 세포 배양 모델에서, 화합물(I)은 저농도로도 신경돌기 생성을 증가시켰다. 또한, 저농도의 화합물(I)의 전신 투여는 좌골신경에서 축삭의 재생 속도를 증가시켜 신경 압착 손상후의 기능 회복을 가속화하고 척수 손상으로부터의 기능 회복을 촉진시켰다.

또한, 상기 나타낸 바와 같이, 화합물(I)은 면역억제성 활성없이 강력한 신경 친화성 또는 신경 세포 성장 자극 활성을 제공하였다. 따라서, 본 발명은 특히 면역억제성 효능이 이롭지 않거나 바람직하지 않은 경우 신경 세포 성장 또는 재생을 자극하거나 촉진하기 위한 유용한 항신경성 약제를 제공한다.

본 발명의 다른 일면으로;

화합물(I)은 신경 세포 손상/기능장애를 예방하거나 치료하기 위하여 사용될 수 있거나 사용되어야 함을 가리키는 라벨 또는 서류를 포함하는 포장재, 및 신경 세포 기능장애를 예방하거나 치료하기에 치료학적으로 유효한, 포장재내에 포함된 상기 확인된 화합물(I)을 포함하는 제품;

상기 확인된 화합물(I)을 포함하는 약제학적 조성물 및 상기와 함께 화합물(I)은 신경 세포 손상/기능장애를 예방하거나 치료하기 위하여 사용될 수 있거나 사용되어야 함을 언급하는 문구를 포함하는 상업용 팩키지;

화합물(I)로 치료되는 세포를 포함하는 조성물, 예로서 세포 현탁액, 조직, 이식편. 상기 조성물은 신경계 손상에 대한 수복에 유용하다. 상기 조성물은 또한 다른 신경 세포 성장 자극제, 예로서 다른 유형의 신경 세포 성장을 촉진시키거나 돕는 세포 현탁액, 예로서, 수초생성 세포 예를 들면, 슈반 세포 또는 올리고덴드로사이트, 아교 세포 및 초형성(sheathing) 세포; 세포외 기질 물질, 예로서 콜라겐; 또는 다른 특이성 신경조절인자 예로서 사이토카인, 미토겐 인자, 이뮤노필린, 및 뉴로트로핀, 예로서 NGF-1, BDNF, CNTF, NT-3, NT-4 및 NT-5을 포함할 수 있다.

또한 이식편, 예로서 호모그래프트(homografts), 동종이식편(allograft) 또는 이종이식편(xenograft)을 화합물(I)로 처리하여 신경 세포 성장을 촉진시킬 수 있고 이식조직으로서 및 다른 용도로 사용할 수 있다.

참조문헌에 의한 인용

본 명세서에서 인용된 각 문서, 특허 출원 또는 특허 공개공보의 내용은 전체적으로 본 명세서에서 참고문헌으로 인용된다. 본 출원이 우선권으로 주장하는 특허 명세서의 모든 내용 또한 참조 문헌으로 인용된다. 특히, 미국 특허 제 60/258,500의 내용을 참고문헌으로 인용한다.

변형 및 다른 일면

본 발명의 다수의 변형 및 수정은 상기 교시와 관련하여 가능하다는 것은 명백하다. 따라서, 첨부되는 청구 범위의 범위내에서 본 명세서에 구체적으로 기재하지 않아도 본 발명은 실천될 수 있다. 본 발명의 기술된 개념, 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 수정은 본 발명의 범위 및 정신을 벗어나지 않고 본 분야의 기술자에게 자명할 것이다. 구체적인 바람직한 일례와 관련하여 본 발명을 기술하지만, 청구되는 바와 같은 본 발명을 특정한 일례로 제한하고자 하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 의학, 생물학, 화학 또는 약물학 분야 또는 그와 관련된 분야의 기술자에 자명한 본 발명을 수행하는 기술된 모드의 다양한 변형은 본 발명의 범위내 포함되어야 한다.

Claims

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활성 성분으로서 하기 화학식(I)의 화합물을 포함하는, 다발근육염(polymyositis), 길리안-바르(Guillan-Barre) 증후군, 메니에르 질환, 다발신경염(polyneuritis), 단발신경염(mononeuritis), 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤병, 신경근병증, 당뇨병신경병증, 화학요법-유도성 신경병, 노인성치매, 혈관치매, 다발경화증, 신체 마비 및 척수 손상으로 구성된 그룹 중에서 선택된 신경 세포 손상/기능장애를 예방하거나 치료하기 위한 약제:
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제43항에 있어서, 신경 세포 손상/기능장애가 알쯔하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병신경병증, 화학요법-유도성 신경병 및 척수 손상으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 약제.
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제43항에 있어서, 신경 세포 손상/기능장애가 당뇨병신경병증인 약제.
제43항에 있어서, 신경 세포 손상/기능장애가 척수 손상인 약제.
제43항, 제49항, 제51항 또는 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식(I)의 화합물이 하기 화학식(Ia)의 화합물인 약제:
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