RU2288716C2

RU2288716C2 - Нейротропные аналоги такролимуса

Info

Publication number: RU2288716C2
Application number: RU2003123493/15A
Authority: RU
Inventors: Нобу МАЦУОКА (JP); Нобуя МАЦУОКА; Такаюки ЯМАДЗИ (JP); Такаюки ЯМАДЗИ; Брюс ГОЛД (US); Брюс ГОЛД
Original assignee: Астеллас Фарма Инк.
Priority date: 2000-12-29
Filing date: 2001-12-31
Publication date: 2006-12-10
Also published as: KR100794204B1; PL366301A1; EP1353671A1; NZ527209A; WO2002053159A1; AR035411A1; CN1293877C; CZ20032060A3; BR0116762A; JP2004527472A; KR20070030331A; CN1538843A; ZA200305806B; EP1353671A4; HUP0302521A3; RU2003123493A; IL156664A0; MXPA03005941A; CA2433384A1; AU2002231277B2

Abstract

Предложено: способ содействия росту или регенерации нервных клеток, включающий введение производного такролимуса - соединения формулы (I), а также способ содействия функциональному восстановлению нерва, способ восстановления пересеченного периферического нерва или спинного мозга путем контактирования пересеченных концов нерва или спинного мозга с соединением (I) или путем введения соединения (I) указанному субъекту и трансплантации в периферический нерв или спинной мозг трансплантата. Выявлено резкое увеличение количества регенерировавших миелинизированных аксонов и улучшение нарушенной двигательной функции стоп после применения соединения формулы (I), которое сочетало высокие уровни нейротропной и низкие уровни иммуносупрессивной активности. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 8 табл.

Description

Данное изобретение относится к производному такролимуса, имеющему высокий уровень нейротропной активности и низкий уровень иммуносуппрессивной активности.

Известно, что определенные макролидные соединения, например такролимус и родственные соединения, помогают предотвратить или лечить церебральную ишемию (WO 94/14443). Известно, что определенные производные пипеколевой кислоты, которые обладают аффинитетом к иммунофилинам типа FKBP, такие как такролимус, стимулируют рост поврежденных периферических нервов или способствуют регенерации нейронов (WO 96/40140). Показано, что определенные не иммуносуппрессивные соединения, т.е. гелданамицин и его аналоги, прерывают комплекс стероидных рецепторов и способствуют росту нервов (WO 99/21552).

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что определенный аналог такролимуса, т.е. соединение (I), указанное ниже, обладает отличной нейротропной активностью, но в отличие от такролимуса имеет небольшую или вообще не имеет иммуносуппрессивную активность. Как показано ниже, соединение (I) имеет более высокие уровни нейротропной активности, по сравнению с такролимусом, например, по данным измерения его способности увеличивать длину нейрита. Аналогичным образом было показано, что введение соединения (I) вызывает аксональную регенерацию и ускоряет восстановление после раздавливания нерва или повреждения спинного мозга. Кроме того, указанные преимущественные нейротропные эффекты соединения (I) проявляются при небольшой или отсутствующей иммуносуппрессивной активности по сравнению с такролимусом.

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет новые способы применения соединения (I) в качестве нейротропного средства с улучшенными свойствами, а также нейротропного средства с небольшой или отсутствующей иммуносуппрессивной активностью.

Далее изобретение предоставляет нейротропное средство или композицию, которая включает соединение (I).

Данное изобретение также предоставляет способ профилактики или лечения повреждения/дисфункции нейронов, который включает введение млекопитающему соединения (I).

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что соединение (I) можно применять для облегчения, профилактики или лечения неврологического повреждения или дисфункции, вызванной поражением или травмой, расстройством или заболеванием нервной системы, в то же самое время преимущественно оказывая небольшой иммуносуппрессивный эффект или вообще не оказывая его.

Соединение (I) можно применять для лечения повреждения, расстройства или дисфункции, вызванных физической травмой, нарушениями питания, ишемией, дегенеративными заболеваниями, злокачественными заболеваниями, инфекционными заболеваниями и взаимодействиями лекарственных препаратов, токсинами или ядами. Например, соединение (I) можно применять для лечения неврологического повреждения или дисфункции, вызванных нейрохирургической операцией, травмой периферического нерва, ожогами, энцефаломиелитом, ВИЧ, герпесом, раком, лучевой терапией, взаимодействием лекарственных препаратов, недостаточностью фолиевой кислоты или витамина В-12 и контактом с нейротоксинами или химическими веществами, такими как свинец.

Соответственно, соединение (I) можно применять для профилактики или лечения повреждения и дисфункции нейронов, такого как полимиозит (множественный миозит), синдром Гийена-Барре, болезнь Миньера, полиневрит (множественный неврит), мононеврит (неврит одного нерва), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз (БАС), болезнь Хантингтона, радикулопатия, нейропатии (такой как диабетическая нейропатия, нейропатия, вызванная химиотерапией, и т.д.), травмы спинного мозга, старческой деменции, сосудистой деменции, рассеянного склероза, физического паралича и т.д.

Соединение (I), аналог такролимуса, применяемое в настоящем изобретении, имеет следующую химическую формулу:

Данное соединение можно получить, как описано в патенте США № 5376663, пример 29. В отношении соединения (I), применяемого в настоящем изобретении, следует понимать, что могут быть конформеры и один или несколько стереоизомеров, таких как оптические и геометрические изомеры вследствие асимметричного атома (атомов) углерода или двойной связи (связей), и такие конформеры и изомеры также включены в диапазон притязаний соединения настоящего изобретения.

Соединение (I) может быть также в виде фармацевтически приемлемой соли, производного, сольвата или пролекарства, все из которых включены в объем притязаний настоящего изобретения. Сольват предпочтительно включает гидрат и этанолат.

Предпочтительной формой соединения (I) является следующая:

Соединение (I) по настоящему изобретению можно вводить в виде чистого соединения или в виде смеси с другим соединением или другими ингредиентами, предпочтительно с фармацевтическими накопителем или носителем. Когда соединение (I) применяют в виде фармацевтического препарата или композиции, оно может смешиваться с органическим или неорганическим носителем, основой или наполнителем, пригодным для наружного (местного), орального, энтерального, подкожного, внутривенного, внутримышечного или парентерального применения. Например, оно может присутствовать в твердой, полутвердой или жидкой композиции, которая содержит соединение (I) в качестве активного ингредиента и один или несколько носителей, основ или наполнителей. Типичные носители, основы или наполнители включают, но не ограничиваются, обычные фармацевтические носители, лекарственные или фармацевтические средства, буферы, диспергирующие агенты, эмульгирующие агенты и адъюванты.

Соединение (I) может также составляться в композицию с обычными нетоксичными, фармацевтически приемлемыми носителями для таблеток, пилюль, капсул, глазных капель, суппозиторий, растворов (солевого, например), эмульсий, суспензий (например, с оливковым маслом), мазей, аэрозольных спреев, кремов, кожных пластырей, накладок и любой другой формы, пригодной для применения.

Подходящие носители включают воду, водный солевой и декстрозный растворы, масла, включая животные, растительные и синтетические масла и продукты нефти. Другие носители, которые можно применять, включают глюкозу, лактозу, смолу акации, желатин, маннит, крахмальную пасту, трисиликат магния, тальк, кукурузный крахмал, кератин, коллоидную двуокись кремния, картофельный крахмал, мочевину и другие носители, пригодные для использования при изготовлении препаратов, в твердой, полутвердой или жидкой форме. Кроме того, можно использовать дополнительные, стабилизирующие, эмульгирующие вещества, загустители, красящие агенты, ароматизирующие агенты и отдушки.

Соединение (I) содержится в фармацевтической композиции в количестве, эффективном для создания желаемого эффекта на конкретный патологический процесс или состояние. Предпочтительно, соединение (I) вводится в количестве, эффективном для обеспечения нейротропного эффекта или стимуляции роста нервных клеток.

К млекопитающим, которых можно лечить с использованием способа настоящего изобретения, относят домашний скот, такой как коровы, лошади, свиньи и т.д., домашние животные, такие как собаки, кошки, крысы, мыши, кролики, хомяки и т.д., приматы и люди.

Предпочтительные способы введения или применения продуктов или композиций, содержащих соединение (I), людям включают инъекцию или пероральное введение.

Хотя терапевтически эффективное количество или дозировка соединения (I) может варьировать среди отдельных пациентов и также зависит от возраста и состояния каждого отдельного пациента, которого предстоит лечить, для лечения заболеваний в целом назначают суточную дозу в диапазоне приблизительно от 0,0001 до 1000 мг, предпочтительно от 0,001 до 500 мг, а предпочтительнее от 0,01 до 100 мг активного ингредиента, и в целом вводят среднюю однократную дозу приблизительно 0,001-0,01 мг, 0,2-0,5 мг, 1 мг, 5 мг, 10 мг, 50 мг, 100 мг, 250 мг и 500 мг. Суточные дозы для хронического введения людям должны быть в диапазоне приблизительно от 1 до 30 мг/кг/д. Соединение (I) можно также вводить или применять одновременно, отдельно или последовательно с другими средствами, обладающими нейротропной или стимулирующей рост нервных клеток активностью.

Фармацевтические композиции в соответствии с изобретением можно периодически вводить субъекту-млекопитающему (например, человеку-пациенту), нуждающемуся в таком лечении, для содействия регенерации нейронов и функциональному восстановлению и для стимуляции разрастания невритов и, посредством этого, для лечения различных невропатологических состояний, включающих повреждение периферических нервов и центральной нервной системы, вызванное физической травмой (например, повреждение и травма спинного мозга, поражение или травма седалищного или лицевого нерва, трансплантация конечностей после ампутации); заболевания (например, диабетической нейропатией); химиотерапию рака (например, нейропатию, вызванную акриламидом, таксолом, алкалоидами винки и доксорубицином); последствия - например, аллофазии (такой как расстройства артикуляции), помутнения сознания, дискинезии и т.д., связанные с инфарктом мозга, геморрагическим инфарктом и т.д.; и неврологические расстройства, включающие, но не ограничивающиеся, различные периферические нейропатические и неврологические расстройства, включающие, но не ограничивающиеся: невралгию тройничного нерва, паралич Белла, генерализованную миастению, мышечную дистрофию, боковой амиотрофический склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, прогрессирующую бульбарную наследственную мышечную атрофию, синдромы грыжевого выпячивания, разрыва или пролапса межпозвонковых дисков, шейный спондилез, расстройства сплетений, синдромы деструкции торакального отверстия, периферические нейропатии, такие как нейропатии, вызванные свинцом, акриламидами, гамма-дикетонами (нейропатия нюхающих клей), дисульфидом углерода, дапсоном, клещами, порфирией, синдромом Гийена-Барре, болезнью Альцгеймера, болезнью Паркинсона и хореей Хантингтона.

Пересечение периферического нерва или травму спинного мозга можно лечить введением стимулирующего роста нерва количества средства млекопитающему и пересадкой в периферический нерв или спинной мозг трансплантата нерва, такого как аллотрансплантат (Osawa et al., J. Neurocytol. 19:833-849, 1990; Buttemeyer et al., Ann. Plastic Surgery 35:396-401, 1995) или искусственного трансплантата нерва (Madison and Archibald, Exp. Neurol. 128:266-275, 1994; Wells et al., Exp. Neurol. 146:395-402, 1997). Пространство между отсеченными концами периферического нерва или спинного мозга предпочтительно заполняют неклеточным, заполняющим промежутки материалом, таким как коллаген, метилцеллюлоза и т.д.; или клеточными суспензиями, которые способствуют росту нервных клеток, такими как шванновские клетки (Xu et al., J.Neurocytol. 26:1-16, 1997), обонятельные клетки и клетки нервного влагалища (Li et al. Science 277:2000-2002, 1997). Средство, способствующее росту нерва, можно включать вместе с такими клеточными или неклеточными материалами, заполняющими промежутки, или системно вводить до, во время или после процедуры трансплантации нерва.

В частности, соединение (I) можно применять для лечения или профилактики полимиозита, связанного с повреждением/дисфункцией нейронов (множественный миозит), синдрома Гийена-Барре, болезни Миньера, полиневрита (множественного неврита), мононеврита (одиночного неврита), болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, бокового амиотрофического склероза (БАС), болезни Хантингтона, радикулопатии, диабетической нейропатии, нейропатии, вызванной химиотерапией, старческой деменции, сосудистой деменции, рассеянного склероза, физического паралича или травмы спинного мозга.

Следующие примеры еще подробнее иллюстрируют настоящее изобретение. Следует понимать, что данные примеры описывают определенные аспекты или варианты реализации изобретения, но не предназначены для ограничения диапазона притязаний изобретения.

Пример 1: Лечение соединением (I) значимо увеличивает длину нейритов нейронов гиппокампа

Получение клеточных культур:

Эмбриональные нейроны гиппокампа получали у крысят на 18,5 эмбриональный день ("Е18,5"), в соответствии со способом Banker and Cowan (Brain Research, 1977, 126: 397-425). Вкратце, удаляли области гиппокампа, пропускали через мясорубку и инкубировали в 100 МЕ папаина при 37°С в течение 45 мин, и клетки ресуспендировали в полной нейронной среде: минимальной, содержащей незаменимые аминокислоты среде без L-глутамина (GIBCO, Grand Island, NY), 1,5 мл/100 мл среды минимальной, содержащей незаменимые аминокислоты среды с высоким содержанием глюкозы (GIBCO), 0,1 мл/100 мл среды сывороточного наполнителя (Hito + Tm; Collaborative Research Inc, Lexington, MA), глутамина (GIBCO), 5% фетальной телячьей выворотки (GIBCO).

Клетки засевали на покровные стекла (500 клеток / покровное стекло), покрытые поли-L-лизином. Покровные стекла переворачивали на чашки, которые были предварительно покрыты монослоем корковых астроцитов.

Анализ длины аксонов нейронов гиппокампа:

Нейроны гиппокампа (идентифицированные по их характерной полярности и дендритам) исследовали ежедневно и фотографировали методом случайной выборки (9-12 рамок/покровное стекло) через 72 ч. Длину аксонов (определяемую как самый длинный отросток) измеряли на фотографических отпечатках с использованием преобразующего в цифры блокнота Houston Instrument HI-PAD, соединенного с компьютером IBM XT, с соответствующим программным обеспечением (Bioquant IV, R&M Biometrics, Nashville, TN); измеряли только отростки, имеющие длину, втрое превышающую длину тела клетки. Данные от идентично обработанных покровных стекол (3 или 4 на группу) не отличались и поэтому объединялись. Средние величины рассчитывали и сравнивали с использованием одностороннего (группы, обработанные соединением (Ia) или такролимусом в сравнении с необработанной контрольной группой) вариационного анализа с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels (WINKS 4.62 профессиональное издание).

Результаты:

Через 72 ч не было значимого различия между необработанной контрольной группой и группой, обработанной 10 нмоль такролимуса. Однако группа, обработанная соединением (Ia) в концентрации 10 нмоль, проявила значимое увеличение длины нейритов (см. результаты, представленные в таблице 1):

Таблица 1 Воздействия соединения (Ia) и такролимуса на средние величины длины нейритов в первичной кульутре клеток гиппокампа у крыс через 72 ч
	Длины нейритов (мкм)
Без обработки	372,3±18,23
Такролимус (10 нмоль)	423,4±19,50
Соединение (Ia) (10 нмоль)	502,2±23,61*
*: P<0,05 в сравнении с отсутствием обработки (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)

Пример 2: Обработка соединением (I) увеличивает средние величины длины нейритов у клеток нейробластомы человека SH-SYSY

Получение культур клеток нейробластомы человека SH-SYSY:

Клетки нейробластомы человека SH-SYSY поддерживали в среде DMEM (GIBCO) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (SIGMA), 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (GIBCO) при 37°С в 7% СО₂. Клетки высевали на шестилуночные планшеты в количестве 15000 клеток/лунку и обрабатывали 0,4 мкмоль афидиколина (SIGMA). Через 5 суток клетки промывали и обрабатывали фактором роста нервов (NGF) при концентрации 10 нг/мл (для индукции выроста отростка) в присутствии или отсутствии такролимуса (10 нмоль) или соединения (IA). Среду меняли через 96 ч и замещали свежей средой еще на 72 ч (общее время 169 ч). По две лунки использовали во всех экспериментах и данные усредняли для каждой группы обработки.

Анализ длины нейритов у клеток нейробластомы SH-SY5Y:

Для анализа длины отростка клетки (20 полей на лунку) методом случайной выборки фотографировали через 168 ч. Длину нейритов измеряли на фотографических отпечатках с использованием преобразующего в цифры блокнота Houston Instrument HI-PAD, соединенного с компьютером IBM XT, с соответствующим программным обеспечением (Bioquant IV, R&M Biometrics, Nashville, TN); измеряли только отростки, имеющие длину, вдвое превышающую длину тела клетки. Данные от идентично обработанных лунок не отличались и поэтому объединялись. Средние величины рассчитывали и сравнивали с использованием одностороннего (группы, обработанные соединением (Ia) или такролимусом в сравнении с образцами, обработанными только NGF) вариационного анализа с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels (WINKS 4.62 профессиональное издание).

Результаты:

Измерение длины отростков нейритов показало, что и соединение (Ia) (1 нмоль) и такролимус (10 нмоль) значимо увеличивали длину отростков нейритов через 168 ч в сравнении с одним NGF (10 нг/мл). Однако эффекты 1 нмоль соединения (Ia) в комбинации с NGF были выше, чем эффекты 10 нмоль такролимуса в комбинации с NGF.

Таблица 2 Воздействие соединения (Ia) и такролимуса на среднюю длину нейритов у клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y через 168 ч
	Длина нейритов (мкм)
Без обработки	94,75±3,734
NGF (10 нг/мл)	198,8±8,991
Такролимус (10 нмоль) + NGF (10 нг/мл)	227,6±9,130*
Соединение (Ia) (1 нмоль) + NGF (10 нг/мл)	256,0±9,067*
*: P<0,05 в сравнении с NGF (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)

Пример 3: Обработка соединением (I) способствует функциональному восстановлению на модели раздавливания седалищного нерва крыс

Животные и хирургическая процедура:

9 6-недельных самцов крыс Sprague-Dawley наркотизировали 2% галотаном, выделяли правый седалищный нерв и нерв дважды раздавливали (всего в течение 60 секунд с использованием ювелирных щипцов Dumont №7) на уровне бедра. Участок раздавливания отмечали завязыванием стерильной шовной нити 9-О через эпиневральное влагалище.

Получение и введение соединения (Ia):

Соединение (Ia) растворяли в носителе, включающем 30% диметилсульфоксид (DMSO):70% солевом растворе. 3 крысы, подвергнутые аксотомии, получали подкожные ежедневные инъекции или соединения (Ia) (1 или 5 мг/кг) или эквивалентный объем носителя (30% DMSO в солевом растворе) (5 мг/кг).

Поведенческая оценка:

Животных обследовали ежедневно до дня перфузии (18 суток). Следующую полуколичественную шкалу использовали для оценки функционального восстановления животных:

0: паралич со стопой, вывернутой при ходьбе и искривленными пальцами стоп;

1: способность выпрямлять стопу и двигать пальцами стопы;

2: способность постоянно ходить на стопе;

3: демонстрирует разведение пальцев стоп во время ходьбы;

4: ходит от пятки и проявляет почти нормальное разведение пальцев стоп.

Животным, проявляющим промежуточные возможности, присваивали частичные балльные оценки: +, 0,25; ++, 0,5; +++, 0,75.

Фиксация и подготовка ткани:

На 18-е сутки после раздавливания нерва крыс глубоко наркотизировали 4% галотаном, гепаринизировали и перфузировали 4% параформальдегидом в 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН 7,4) в течение 10 секунд последующей перфузией 5% глутаральдегидом (1 л) в 0,1 М натрийфосфатном буфере (рН 7,4) и фиксировали при 4°С в течение 24 ч. Образцы ткани брали из седалищного нерва на известном (5 мм) расстоянии от участка раздавливания. В настоящем исследовании представлены только данные, полученные на ветви заднего большеберцового нерва, иннервирующей подошвенную мышцу. Ткани помещали в 0,1 М натрийфосфатный буфер (рН 7,4), затем фиксировали 1% тетроксидом осмия (в 0,1 М фосфатном буфере) в течение 2,5 ч, дегидратировали в этаноле и заливали в пластик. Полутонкие срезы окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца, устанавливали на решетки с 75 отверстиями на 1 кв. дюйм и исследовали в электронном микроскопе JEOL 100 CX.

Морфометрический анализ:

Анализ калибра аксонов выполняли на подошвенном нерве. Количества регенерирующихся миелинизированных аксонов подсчитывали с использованием электронной микроскопии. Средние величины и стандартные ошибки рассчитывали для группы, леченой носителем, группы, леченой соединением (Ia) (1 мг/кг) и группы, леченой соединением (Ia) (5 мг/кг).

Статистический анализ:

Для поведенческого анализа средние величины восстановления функции сравнивали с использованием вариационного анализа с последующим критерием множественных сравнений Newman-Keuls для сравнения отдельных величин. Для морфометрического анализа средние величины для ряда аксонов сравнивали с использованием одностороннего вариационного анализа с последующим критерием множественных сравнений Newman-Keuls для сравнения отдельных величин.

Результаты:

Функциональное восстановление:

Функциональное восстановление наблюдали на 15-17 сутки, и оно происходило раньше и у крыс, получавших 1 мг/кг, и у крыс, получавших 5 мг/кг препарата, чем у крыс, получавших носитель (см. таблицу 3).

Таблица 3 Влияние соединения (Ia) на функциональное восстановление после травмы седалищного нерва у крыс
	Функциональная бальная оценка
	Носитель (подкожно) (30% DMSO в солевом растворе)	Соединение (Ia)
		1 мг/кг (подкожно)	5 мг/кг (подкожно)
15 сутки	1,67±0,08	2,58±0,17*	3,17±0,08*
16 сутки	1,83±0,08	2,83±0,17*	3,50±0,00*
17 сутки	2,50±0,00	3,08±0,22*	3,50±0,00*
*: Р<0,05 в сравнении с носителем (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)

Электронная микроскопия

Морфологическое исследование животных проводили на 18-е сутки после аксотомии.

Количество регенерировавших миелинизированных аксонов на площадь нерва (5000 мкм²) резко увеличилось от 5,5±2,7 (средняя величина ± стандартная ошибка средней) у крыс, получавших носитель, до 19±2,4 и 20±2,9 у крыс, получавших соответственно 1 и 5 мг/кг препарата (P<0,05) (см. таблицу 4).

Таблица 4 Эффект соединения (Ia) на количество регенерирующихся миелинизированных аксонов на площадь нерва (5000 мкм²) в подошвенном нерве через 18 суток после раздавливания седалищного нерва у крыс
	Носитель (подкожно) (30% DMSO в солевом растворе)	Соединение (Ia)
		1 мг/кг (подкожно)	5 мг/кг (подкожно)
Регенерировавшиеся миелинизированные аксоны	5,5±2,7	19±2,4*	20±2,9*
*: Р<0,05 в сравнении с носителем (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)

Пример 4: Лечение соединением (I) способствует функциональному восстановлению на модели травмы спинного мозга у крыс

(1) Методы

Животные и хирургическая процедура

28 6-недельных самцов крыс Sprague-Dawley наркотизировали 2% галотаном, выполняли ламиноэктомию на уровне Т10/Т11 и производили повреждение половинным рассечением спинного мозга на уровне Т10/Т11 спинного мозга.

Получение и введение соединения (Ia)

Соединение (Ia) растворяли в носителе, включающем 30% диметилсульфоксид (DMSO); 70% солевой раствор. Крысы с поражением спинного мозга получали подкожные ежедневные инъекции соединения (Ia) (2 мг/кг) или эквивалентного объема носителя (30% DMSO в солевом растворе) (5 мл/кг) в течение 7 недель после операции.

Оценка функционального восстановления

Функциональное восстановление оценивали с использованием модифицированной шкалы Tarlov/Kinger, теста с узкой балкой и следов стоп через 2 недели после повреждения.

А. Модифицированная шкала Tarlov/Kinger

Крысам давали возможность свободно двигаться в открытом поле в течение 1 мин и проводили рейтинг от 0 до 6 в соответствии с представленной ниже шкалой.

0: Отсутствие движения поврежденной задней конечности

1: Едва воспринимаемое движение поврежденной задней конечности

2: Активные движения в суставах поврежденной задней конечности (тазобедренном, коленном или голеностопном), но отсутствие координации, отсутствие опоры массы тела

3: Перемежающиеся шаги и движения толчками пораженной задней конечности, отсутствие опоры массы тела

4: Может обеспечить опору массе тела травмированной задней конечностью

5: Ходит лишь с незначительным дефицитом

6: Нормальная ходьба

В. Тест с узкой балкой

Крыс испытывали на деревянных балках (длиной 1,5 м) с уменьшающейся шириной: 7,7 см, 4,7 см, 2,7 см и 1,7 см. Крысам давали возможность ходить на брусках и регистрировали самый узкий брусок, по которому они могли пройти без какого-либо соскальзывания, по меньшей мере, два прохода.

0: Отсутствие ходьбы по любой балке

1: Может ходить по балке шириной 7,7 см

2: Может ходить по балке шириной 4,7 см

3: Может ходить по балке шириной 2,7 см

4: Может ходить по балке шириной 1,7 см

С. Тест следов стоп

Задние конечности крыс опускали в чернила и делали отпечатки следов стоп на бумаге, покрывающей узкую дорожку длиной 60 см и шириной 7,5 см. Серию, по меньшей мере, шести последовательных шагов использовали для определения 5-точечной балльной оценки следов стоп.

0: Постоянная тыльная походка или волочение задних конечностей, т.е. следы стоп не видны

1: Имеет видимые следы пальцев стоп, по меньшей мере, трех пальцев стоп, по меньшей мере, на трех следах стоп

2: Проявляет экзо- или эндоротацию стопы более чем двойных величин по сравнению с ее собственными исходными величинами

3: Не проявляет признаков волочения пальцев стоп, но ротацию стоп

4: Не проявляет признаков экзо- или эндоротации (менее чем вдвое угла исходных величин), но виден более чем один след пятки

5: Следы пятки не видны

Статистический анализ

Для поведенческого анализа средние величины бальной оценки каждого функционального теста сравнивали с использованием одностороннего вариационного анализа с последующим критерием множественных сравнений Newman-Keuls для сравнения отдельных величин.

(2) Результаты

Функциональное восстановление

При всех трех измерениях функционального восстановления, проведенных с использованием модифицированной шкалы Tarlov/Klinger (таблица 5), теста ходьбы по балке (таблица 6) и теста следов стоп (таблица 7) соединение (Ia) улучшало нарушенную двигательную функцию при использовании модифицированной шкалы Tarlov/Klinger (таблица 5), теста ходьбы по балке (таблица 6) и теста следов стоп (таблица 7).

Таблица 5 Влияние соединения (Ia) на модифицированную балльную оценку Tarlov/Klinger травмы спинного мозга у крыс
	Модифицированная балльная оценка Tarlov/Klinger
	Носитель (подкожно) (30% DMSO в солевом растворе)	Соединение (Ia) 2 мг/кг (подкожно)
2-я неделя	2,1±0,1	3,7±0,2*
*: Р<0,05 в сравнении с носителем (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)

Таблица 6 Влияние соединения (Ia) на балльную оценку ходьбы по балке при травме спинного мозга у крыс
	Балльная оценка ходьбы по балке
	Носитель (подкожно) (30% DMSO в солевом растворе)	Соединение (Ia) 2 мг/кг (подкожно)
2-я неделя	0,9±0,1	2,0±0,3*
*: Р<0,05 в сравнении с носителем (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)
Таблица 7 Влияние соединения (Ia) на балльную оценку следов стоп при травме спинного мозга у крыс
	Балльная оценка следов стоп
	Носитель (подкожно) (30% DMSO в солевом растворе)	Соединение (Ia) 2 мг/кг (подкожно)
2-я неделя	1,7±0,4	3,6±0,3*
*: Р<0,05 в сравнении с носителем (односторонний вариационный анализ с последующим критерием множественных сравнений Newman-Kuels)

Пример 5: Соединение (Ia) связывается с FKBP12, но в отличие от такролимуса оказывает небольшой иммуносуппрессивный эффект или вообще не оказывает его

(1) Анализ связывания с FKBP12

Анализ связывания выполняли в соответствии с аналогичным способом, описанным Tamura, K., et al (Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 202, No.1, 437-499, 1994). Результаты показаны в таблице 8.

(2) Реакция лимфоцитов в смешанной культуре (MRL)

Тест MRL проводили в соответствии со способом, описанным в патенте США № 4929611.

Результаты показаны в таблице 8.

Таблица 8 Фармакологические профили соединения (Ia) и такролимуса in vitro
	ИК₅₀ связывания с FKBP12 (нмоль)	ИК₅₀ MLR (нмоль)
Соединение (Ia)	<5	>100
Такролимус	<5	<2

Представленные выше результаты показывают, что соединение (Ia) не обладает иммуносуппрессивной активностью, хотя оно может связываться с FKBP12.

Представленные выше результаты иллюстрируют мощные нейротропные эффекты соединения (I) при использовании моделей и in vitro, и in vivo. На двух моделях клеточных культур соединение (I) даже в низких концентрациях увеличивало разрастание нейритов. Более того, системное введение соединения (I) в низких дозах ускоряло функциональное восстановление после повреждения в виде раздавливания нерва и способствовало функциональному восстановлению после травмы спинного мозга.

Кроме того, как показано выше, соединение (I) обеспечивает высокую нейротропную или стимулирующую рост нервных клеток активность, хотя оно не обладает иммуносуппрессивной активностью. Соответственно, настоящее изобретение предоставляет полезное нейротропное средство для стимуляции или содействия росту или регенерации нейронов, в частности, когда иммуносуппрессивный эффект не имеет преимуществ или нежелателен.

Другие аспекты настоящего изобретения включают:

Изделие производства, включающее упаковочный материал и соединение (I), идентифицированное в представленном выше описании, содержащееся внутри указанного упаковочного материала, причем указанное соединение (I) терапевтически эффективно для профилактики или лечения дисфункции нейронов, и причем указанный упаковочный материал включает ярлык или письменный материал, который указывает, что соединение (I) может или должно применяться для профилактики или лечения травмы/дисфункции.

Предназначенную для продажи упаковку, включающую фармацевтическую композицию, содержащую соединение (I), идентифицированное в представленном выше описании, и письменный материал, причем письменный материал указывает, что соединение (I) может или должно применяться для профилактики или лечения травмы/дисфункции.

Композицию, такую как клеточная суспензия, ткань или трансплантат, включающий клетку, обработанную соединением (I). Такие композиции могут применяться для восстановления повреждения нервной системы. Такие композиции могут также включать другие средства, стимулирующие рост нервных клеток, такие как другие типы клеточных суспензий, которые способствуют или содействуют росту нервных клеток, такие как клетки, продуцирующие миелин, такие как шванновские клетки или олигодендроциты, глиальные клетки и клетки влагалища нерва; внеклеточный матричный материал, такой как коллаген; или другие специфические нейрорегуляторы, такие как цитокины, митогенные факторы, иммунофилины и нейротропины, такие как NGF-1, BDNF, CNTF, NT-3, NT-4 и NT-5.

Трансплантаты, такие как гомотрансплантаты, аллотрансплантаты или ксенотрансплантаты, можно также обрабатывать соединением (I) для содействия разрастанию нейронов и использовать их в качестве трансплантатов и для других видов применения.

Содержание каждого документа, патентной заявки или патентной публикации, которые приводятся или на которые есть ссылки в данном описании, полностью включено в него в качестве ссылки. Содержание любого патентного документа, на который данная заявка заявляет приоритет, также полностью включено сюда в качестве ссылки. В частности, содержание предварительной заявки на патент США №60/258500 включено в качестве ссылки.

Очевидно, что возможны многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения в свете представленных выше положений. Поэтому следует понимать, что в пределах диапазона притязаний прилагаемой формулы изобретения данное изобретение может быть реализовано другим образом, нежели конкретно описано в настоящем описании. Различные модификации и вариации описанных композиций и способов, а также концепция изобретения будут очевидны для специалистов в данной области без отхода от диапазона притязаний и сущности изобретения. Хотя изобретение было описано в связи с конкретными предпочтительными вариантами реализации, следует понимать, что изобретение в заявленном виде не предназначено быть ограниченным такими конкретными вариантами реализации. Имеется ввиду, что различные модификации описанных путей осуществления изобретения, которые очевидны для специалистов в области медицины, биологии, химии или фармакологии или в родственных областях, находятся в пределах диапазона притязаний настоящего изобретения.

Claims

1. Способ содействия росту или регенерации нервных клеток, включающий введение соединения (I) формулы

нуждающемуся в нем субъекту.

2. Способ по п.1, в котором указанным субъектом является млекопитающее.

3. Способ по п.1, в котором указанным субъектом является человек.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что рост или регенерация нервных клеток вызваны в результате травматического повреждения, механического повреждения, хирургического повреждения или патологического повреждения.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанное повреждение нейронов представляет собой диабетическую нейропатию, физический паралич или травму спинного мозга.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, повреждение нейронов представляет собой травму спинного мозга.

7. Способ по п.5, отличающийся тем, повреждение нейронов представляет собой диабетическую нейропатию.

8. Способ по любому одному из пп.1-7, в котором соединение (I) представляет соединение (Ia) формулы

9. Способ увеличения скорости роста или регенерации аксонов или длины нервных клеток, включающий обеспечение контакта нервной клетки с соединением (I), определенным в п.1.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что нервные клетки представляют собой клетки из ткани головного мозга, ткани спинного мозга или ткани периферических нервов.

11. Способ содействия функциональному восстановлению нерва после травматического, механического, хирургического или патологического повреждения, включающий введение эффективного количества соединения (I), определенного в п.1, нуждающемуся в нем субъекту.

12. Способ восстановления пересеченного периферического нерва или спинного мозга, включающий обеспечение контакта пересеченных концов указанного периферического нерва или спинного мозга с эффективным количеством соединения (I), определенного в п.1.

13. Способ восстановления пересеченного периферического нерва или спинного мозга у субъекта, включающий введение стимулирующего рост периферического нерва количества соединения (I), определенного в п.1, указанному субъекту и трансплантацию в периферический нерв или спинной мозг трансплантата нерва, коллагена, метилцеллюлозы или клеточной суспензии.

14. Способ по п.13, в котором указанный трансплантат представляет собой аллотрансплантат.

15. Способ по п.13, в котором указанный трансплантат представляет собой трансплантат искусственного нерва.

16. Способ по п.13, кроме того, включающий заполнение пространства между пересеченными концами периферического нерва или спинного мозга неклеточным материалом, заполняющим промежуток.

17. Способ по п.13, кроме того, включающий заполнение пространства между пересеченными концами периферического нерва или спинного мозга клеточной суспензией.