CN115397443A - 包含疼痛调节剂的干细胞来源的外排体及其用途 - Google Patents

包含疼痛调节剂的干细胞来源的外排体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于减轻和治疗疼痛的基于外排体的药物组合物。根据本发明的外排体包含细胞增殖和细胞行为过程中分泌的与神经细胞再生和疼痛减轻相关的多种细胞因子、基因、生物活性因子、蛋白质等，并因此可治疗疼痛的内在原因。

Description

包含疼痛调节剂的干细胞来源的外排体及其用途
技术领域
本申请要求基于2020年04月07日提交的韩国专利申请号10-2020-0042397的优先权，并且在本申请中引用了相应申请的说明书和附图中公开的全部内容。
本公开内容涉及用于缓解或治愈多种神经性疼痛例如炎性疼痛等的药物组合物。
背景技术
神经性疼痛是由多种因素(由于疾病的因素：脑出血/脑梗死、糖尿病、带状疱疹、关节炎等/药物治疗因素：多种抗癌治疗)导致的中枢或周围神经组织的损伤(由于参与疼痛传递的主要神经细胞体的炎性应答、细胞(例如中间神经元与胶质细胞)之间的突触结构改变、神经细胞的损伤或死亡等引起的持续性兴奋)所引起的难治性疼痛，并且如果损伤持续则可发展为慢性疼痛。有多种类型的疼痛，例如在没有外部刺激的情况下频繁发生的自发性疼痛、其中由于疼痛阈值降低而导致响应于疼痛刺激引起的疼痛比正常情况更严重的痛觉过敏、以及其中甚至响应于非疼痛刺激也感到疼痛的异常性疼痛等。
为缓解或治愈疼痛而开发的治疗方法根据疼痛的严重程度分为非药物治疗和药物治疗。对于轻度疼痛的轻度情况，主要通过非药物治疗引起疼痛缓解，所述非药物治疗使用阻止疼痛扩散的交感神经阻断或切除方法或者用于通过用电信号暂时刺激相应部位来控制疼痛信号传递的方法来减轻疼痛。另一方面，在剧烈疼痛的情况下通过药物治疗引起疼痛缓解，并且主要是通过使用抗炎药(阿司匹林、对乙酰氨基酚、布洛芬、非甾体药物等)、抗惊厥药(卡马西平、加巴喷丁等)、抗抑郁药(苯二氮
Figure BDA0003874868860000011
类等)等控制疼痛在各个部位的信号传递来减轻症状。最终，虽然在疼痛程度方面存在不同，但基本原理是阻断简单的信号传递，并且可见仍没有基础治疗。
最近，使用干细胞治疗疼痛的研究被报道为基础方法，但这些干细胞有局限性，例如体内安全性(可能突变为癌细胞)和低体内移植率，使得难以看到明显的治疗效果。另外，作为使用外排体的唯一组合物，已经报道了使用从血液中收集的外排体和皮质类固醇来处理关节炎疼痛的研究，但在此，外排体是作为组合使用以提高皮质类固醇的治疗效果，而没有确定单独外排体的疼痛治疗效果，而且从血液中收集的外排体是自体外排体，并且可从患者自身回收的样品量有限制(国际专利申请No.PCT/EP2010/069426)。
在整个说明书中引用了许多文献，并指出了其引用文献。所引用的文献的公开内容通过引用整体并入本文以更清楚地说明本公开内容的内容和本公开内容所属技术领域的水平。
公开内容
技术问题
本公开内容通过使用来源于干细胞的外排体来确定疼痛缓解和治愈作用而完成了本公开内容，作为补充多种先前开发的用于疼痛治疗的治疗的缺点的研究努力的结果。
因此，本公开内容的一个目的是提供包含疼痛控制因子的基于干细胞外排体的药物组合物，其可替代可商购的用于疼痛缓解、改善或治愈的常规目的的药物组合物，并提供使用其用于缓解、改善或治愈多种神经性疼痛例如炎性疼痛等的用途。
特别地，本公开内容的一个目的是提供以下实施方案。
实施方案1.用于缓解和治疗疼痛的药物组合物，其包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分；包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分的组合物在制备用于缓解和治疗疼痛的药物中的用途；或缓解和治疗疼痛的方法，包括向有此需要的对象施用包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分的组合物。
实施方案2.根据实施方案1所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述脂肪来源干细胞是人脂肪来源干细胞。
实施方案3.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述外排体包含炎性细胞因子。
实施方案4.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述炎性细胞因子是选自TIMP-1、TIMP-2、IL-1ra、IL-4和IL-10中的一种或更多种。
实施方案5.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述疼痛包括炎性疼痛和神经性疼痛。
实施方案6.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述神经性疼痛是选自抗癌治疗伴随的疼痛、炎性疼痛、肌肉疼痛和由周围神经损伤引起的疼痛中的一种或更多种。
实施方案7.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述脂肪来源干细胞来源于待施用所述组合物的患者的自体脂肪组织。
实施方案8.根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物、用途、或方法，其中所述组合物是可注射制剂。
实施方案9.可注射制剂，其包含根据前述实施方案中任一项所述的药物组合物。
本公开内容的其他目的和优点将通过以下详细描述、所附权利要求书和附图而变得更加明显。
技术方案
本公开内容的一个方面是提供用于缓解和治疗疼痛的药物组合物，其包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分。
本文中使用的术语“干细胞”是指不仅具有自我复制能力，而且当在细胞所处环境的影响下根据需要给出适当的信号时具有通过多潜能特性来分化成多种细胞的特征的细胞。
本公开内容的干细胞可以是自体或同源来源的干细胞，并且可来源于任何类型的动物，包括人和非人哺乳动物。优选地，干细胞可来源于患者的自体脂肪组织。
本文中使用的术语“脂肪来源干细胞”是指来源于脂肪组织的干细胞，并且脂肪组织由于其易于收集大量组织而具有收获干细胞的良好条件，并且脂肪来源干细胞在培养期间表现出稳定的生长和增殖，并且当诱导分化时可分化成多种细胞。
本文中使用的术语“外排体”是由多种类型的细胞分泌的膜结构囊泡，并且已知发挥诱导强烈的抗肿瘤免疫应答的多种作用，所述外排体包含免疫学上重要的蛋白质、主要组织相容性复合体和热休克蛋白，并且与其他细胞和组织结合以递送膜成分、蛋白质、RNA等。因此，包含与疼痛缓解相关的多种遗传信息、蛋白质和生长因子的外排体可用作用于疼痛治疗剂的组合物。
本公开内容的来源于脂肪来源干细胞的外排体包含疼痛控制因子，并因此可在疼痛缓解和治疗中发挥重要作用，并且特别地其包括TIMP-1(金属蛋白酶-1的组织抑制剂)、TIMP-2、IL-1ra(白介素-1受体拮抗剂)、IL-4(白介素-4)、IL-10(白介素-10)、TGF-β(转化生长因子-β)等作为与疼痛和炎症缓解相关的分泌的代表性细胞因子，并且这些细胞因子发挥诱导炎性应答的抑制和诱导炎性细胞因子的抑制的作用。
外排体可使用本领域已知的外排体分离方法获得，但不限于此，而是可通过包括以下步骤的分离方法获得：
1)在培养基中培养人脂肪干细胞进行增殖，并随后将它们在无血清且无抗生素的培养基中培养一天；
2)回收细胞培养上清液；
3)将回收的细胞培养上清液离心；以及
4)分离和纯化外排体。
如上制备的外排体在使用人脂肪干细胞培养过程中获得的培养溶液方面与常规技术类似，但区别是使用通过分离和纯化以纳米囊泡形式存在于培养溶液中的外排体而得到的疼痛治疗剂。在这种情况下，可有效地仅使用外排体中加载的再生相关蛋白质和多种生长因子，从而解决由包含抗生素和血清的培养基组分引起的问题。
在如上制备的外排体中，不仅加载干细胞、蛋白质和生长因子的遗传信息，而且外排体本身甚至可发挥载体作用。由尺寸为约50至200nm的脂质构成的外排体是细胞来源的物质，并且因此它们是生物相容的并且细胞的吸收率也非常好。
本公开内容中，术语“疼痛”意指伴随实际或潜在组织损伤的不愉快感觉和体验，并且包括神经性疼痛、急性疼痛、慢性疼痛、躯体痛、相关疼痛、内脏疼痛和心因性疼痛等。
神经性疼痛是由神经系统的损伤或功能异常引起的疼痛，其是难治性且慢性长期持续的疼痛综合征，因此患者的生活品质显著降低，并且其引起的不仅是疼痛本身还有社会问题，例如由于睡眠障碍引起的生产力下降、情绪障碍例如抑郁以及社会适应性差。神经性疼痛包括化学治疗伴随的疼痛、炎性疼痛、肌肉疼痛和由周围神经损伤引起的疼痛。
急性疼痛是由疾病或创伤引起的组织损伤导致的伤害性刺激引起的疼痛，并且包括产后疼痛、手术后疼痛和组织损伤后疼痛，其一般在3至6个月内消失。慢性疼痛也是由由于多种未知原因的神经损伤和根据其的神经系统的变化所引起的，并且比引起它的疾病或损伤的治愈期持续更长时间。例如，有偏头痛、类风湿性疼痛、糖尿病痛和癌症痛，并且该疼痛可显著降低患者的生活品质并伴随抑郁。
躯体痛包括浅表疼痛(由于皮肤撕裂、瘀伤等引起的痛觉过敏和痛觉超敏)和由关节、韧带、肌肉或筋膜中的伤害性感受器刺激引起的深部疼痛。
相关疼痛是指出现在远离病变部位的躯体组织中的疼痛，以及内脏疼痛是由分布在肠中的伤害性纤维感受到的疼痛，以及心因性疼痛是指无法找到充分的物理原因且无法从解剖学上解释的疼痛。
根据本公开内容的用于缓解和治疗疼痛的药物组合物的不同之处在于，通过施用包含疼痛控制因子的外排体来从根本上治疗疼痛，而不是传统技术中阻断疼痛信号传递的止痛药。
根据本公开内容的药物组合物可包含一种或更多种可药用载体、赋形剂或稀释剂以及药学有效量的来源于脂肪来源干细胞的外排体。
在上文中，药学有效量意指足以改善和治疗疼痛的量。根据本公开内容的来源于脂肪来源干细胞的外排体可以以1×107个颗粒/mL至1×1010个颗粒/kg的浓度，优选地以5×107个颗粒/mL至1×109个颗粒/kg的浓度被包含在药物组合物中。然而，外排体的浓度可根据患者的疼痛程度、年龄、体重、健康状况、性别、施用途径和治疗时间等来适当改变。
此外，“可药用”意指当施用于人时生理上可接受的并且通常不引起变态反应例如胃肠道病症和头晕的组合物。载体、赋形剂和稀释剂的实例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。另外，其还可包含填充剂、抗凝剂、润滑剂、润湿剂、矫味剂、乳化剂和防腐剂等。
另外，本公开内容的组合物可通过根据药物领域中的常用方法配制成适合施用到患者体内的单位施用形式的制剂来施用，并且所述制剂包含能够通过单次或数次施用来缓解或治疗疼痛的有效剂量。作为用于该目的的适当制剂，如肠胃外施用制剂，可注射制剂例如用于注射的安瓿、可注射制剂例如注射袋等是优选的。用于注射的安瓿可在使用之前与注射溶液混合并制备，并且作为注射溶液，可使用生理盐水溶液、葡萄糖、甘露醇、林格溶液等。
药物制剂除了活性成分之外还可包含一种或更多种可药用常用无活性载体，例如，在可注射制剂的情况下的防腐剂、无痛剂、增溶剂或稳定剂等，以及在用于局部施用的制剂的情况下的基质(base)、赋形剂、润滑剂或防腐剂等。
以这种方式制备的本公开内容的组合物或药物制剂可通过多种途径(例如，肠胃外和经口施用等)施用于哺乳动物例如大鼠、小鼠、家畜、人等，并且施用方法可通过本领域常用的所有方法施用。但是不限于此，其可通过经口、直肠内或者静脉内、肌内、皮下、子宫内或脑室内注射等施用。
特别地，施用方法不限于此，而是可施用从脂肪来源干细胞分离的外排体(静脉内注射)，或者将它们施用到疼痛部位(表面施用)。
作为另一方面，本公开内容提供了用于缓解或治疗疼痛的可注射制剂，其包含用于缓解和治疗疼痛的药物组合物，所述药物组合物包含上述来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分。
可注射制剂还可包含磷酸缓冲盐水(phosphate-buffered saline，PBS)。换言之，可通过在磷酸缓冲盐水中加载从脂肪来源干细胞分离的外排体来使用可注射制剂。
可注射制剂可包含水凝胶来代替磷酸缓冲盐水。水凝胶可以是选自透明质酸、明胶、藻酸盐、壳聚糖、纤维蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和甲基纤维素中的一种或更多种，并且具体地可以是透明质酸水凝胶，但不限于此。
有益效果
根据本公开内容的干细胞来源外排体包含在细胞增殖和细胞行为过程中分泌的与神经细胞再生和疼痛缓解相关的多种细胞因子、基因、生物活性因子和蛋白质等，并因此可治愈引起疼痛的根本原因。另外，由于它们是细胞来源的脂质载体，因此它们用于疼痛愈合是优异的，因为它们具有渗透到受损或功能失调的神经细胞的优异效率和有效的因子递送。因此，本公开内容中提出的外排体组合物在未来有望应用于多种神经再生领域，例如不仅应用于疼痛缓解和治疗，而且还可作为与神经细胞再生相关的无细胞治疗剂来应用。
附图说明
图1是从人脂肪来源干细胞产生的外排体的基本特征评价的结果。(a)是外排体颗粒数的测量结果，以及(b)是为了确定外排体的形状而通过TEM测量的显微照片，以及(c)是(b)的进一步放大照片，以及(d至f)是在外排体表面表达的表面标志物(CD9/CD63/CD81)。
图2是分析从人脂肪和人脐带来源干细胞产生的外排体的疼痛控制因子(TIMP-1、TIMP-2、IL-1ra、IL-4、IL-10)的结果。
图3是在细胞模型中评价外排体的疼痛缓解效力的结果。确定了疼痛相关基因例如TRPA1、COX-2、MMP1、MMP3等在通过IL-1β处理诱发炎症的人软骨细胞中过表达，并且这是确定通过外排体处理降低基因表达水平的结果。
图4示出了使用MIA大鼠模型的动物实验概要。
图5示出了使用动态足底触觉计(Dynamic Plantar Aesthesiometer)的PWT分析结果。
具体实施方式
在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开内容。这些实施例仅旨在更具体地描述本公开内容，并且对于本公开内容所属领域的技术人员明显的是本公开内容的范围不受这些实施例的限制。
实施例
<实施例1>使用多重过滤系统从人脂肪来源干细胞产生外排体
在人脂肪来源干细胞(human adipose-derived stem cell，ASC)增殖多至第5代的过程中，产生了外排体。换言之，外排体是从增殖的人体脂肪来源干细胞产生的。具体地，将人体脂肪来源干细胞(第5代)在普通培养基(杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco ModifiedEagle Medium)，包含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素的DMEM)中培养。随后，将其替换为是无血清、无抗生素培养基的不含酚红的DMEM培养基，并维持24小时。在24小时之后，回收细胞培养上清液。在回收的细胞培养上清液中，通过经过瓶顶(过滤标准：0.22um)过滤系统来除去一级杂质例如细胞碎片等。对于经过滤的培养溶液，通过其中配备300kDa尺寸的过滤器的切向流过滤(tangential flow filtration，TFF)同时进行二级杂质除去和外排体浓缩。对于最终的杂质除去，通过数次重复TFF对其进行过滤，并随后回收最终的滤液(约10mL)。
<实施例2>产生的外排体的基本特征评价
对于实施例1中产生的外排体，使用纳米粒追踪分析和透射电子显微镜来确定颗粒数目、尺寸和形状，并使用流式细胞术来确定外排体表面上表达的主要蛋白质标志物(CD9、CD63、CD81)(图1)。
<实施例3>对外排体疼痛控制因子的评价
为了确定包含疼痛控制因子的外排体，进行了细胞因子分析(图2)。随后，将从人脐带来源干细胞(人脐带间充质干细胞)产生的外排体(UC-MSC-Exo)用作比较对照组。
作为实验的结果，分析了从增殖的脂肪来源干细胞产生的外排体(ASC-Exo)内的已知抑制在疼痛和炎症发生期间过表达的MMP(基质金属蛋白酶)的TIMP-1和TIMP-2的含量，并且确定了包含大量被称为疼痛控制细胞因子的IL-1ra、IL-4、IL-10和TGF-β1(图2a)。另外，确定了脂肪来源干细胞外排体中TIMP-1、IL-1ra、IL-4和IL-10的含量显著高于脐带来源干细胞外排体(UC-MSC-Exo)中TIMP-1、IL-1ra、IL-4和IL-10的含量(图2b)(*P<0.1，**P<0.01)。
<实施例4>使用细胞模型评价外排体的疼痛缓解效力
通过其中引起了疼痛的细胞模型来评价外排体的疼痛基因表达抑制效力。作为细胞模型，制备了其中通过将被称为炎性细胞因子的IL-1β以10ng/mL浓度添加到6孔板中的人软骨细胞中而引起疼痛的模型。在将外排体以2种浓度(1×108个颗粒/mL、5×108个颗粒/mL)处理并将细胞培养2天之后，通过qRT-PCR评价疼痛相关特定基因(TRPA1、COX-2、MMP-1、MMP-3)的表达水平(图3)。在对照组正常人软骨细胞中，疼痛相关基因低表达，而在其中由IL-1β引起疼痛的模型中，所有基因均高表达。在以2种浓度处理外排体之后，可确定所有基因的表达水平均显著降低，并且可确定其在TRPA1的情况下达到正常数值。
<实施例5>使用动物模型评价外排体的疼痛缓解效力
1.使用关节疼痛模型的实验设计
从注射MIA(碘乙酸单钠)药物之后一周开始，以每周间隔关节内注射外排体共4次，并在6周时处死大鼠。在正常模型的情况下，注射0.9％生理盐水溶液代替MIA药物，并且每周两次进行爪退缩测试(图4)。
2.使用MIA药物和测试物质施用诱发关节炎
(1)在使用异氟烷吸入麻醉进行麻醉之后，除去左膝周围的毛发。
(2)用乙醇对施用部位进行消毒，并使用100μL汉密尔顿氏(Hamilton)注射器中的30号针(30gauge needle)将50μL(10mg/mL)骨关节炎诱发物质MIA注射到左膝关节腔中。
(3)在正常模型中，将50μL 0.9％生理盐水注射到左膝关节腔中。
(4)在诱发关节炎之后一周，将外排体以5×107个颗粒/50μL、1×108个颗粒/50μL、5×108个颗粒/50μL的浓度以每周间隔进行注射，持续4周共4次，并且在脂肪来源干细胞(ASC)的情况下，以1×106个细胞/50μL注射一次。
3.分析方法(爪退缩阈值(Paw withdrawal threshold，PWT)分析)
(1)为了测量PWT，将动物转移到测试分析设备并适应10分钟以降低由环境变化引起的应激。
(2)在将“触摸刺激器(Touch stimulator)”的针置于大鼠足底中心之后，通过按压启动键对大鼠足底施加机械刺激。
(3)观察到回避响应阈值，其是引起对机械刺激的回避响应的最低强度。
4.统计分析
通过测试收集的数据以组间的平均值和标准偏差表示，并使用GraphPad prism对分析进行统计分析。使用单因素ANOVA进行统计分析，并使用Dunnett多重比较检验对组间差异进行显著性分析。p值；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
5.测试结果
在没有疼痛的正常动物中，测得对机械刺激的回避响应的阈值最高，而在诱发关节炎之后施用PBS的对照组的该值显示为最低。施用ASC的组与对照组没有显著差异。在测试开始的第41天，发现所有施用外排体的组中的回避响应的阈值均显著高于对照组的回避响应阈值，并且在最后的第55天，发现与对照组相比，外排体1×108个颗粒施用组中的该值显著提高(图5)。

Claims (8)

1.用于缓解和治疗疼痛的药物组合物，其包含来源于脂肪来源干细胞的外排体作为活性成分。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂肪来源干细胞是人脂肪来源干细胞。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述外排体包含抗炎细胞因子。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其中所述抗炎细胞因子是选自TIMP-1、TIMP-2、IL-1ra、IL-4和IL-10中的一种或更多种。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述疼痛包括炎性疼痛和神经性疼痛。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述神经性疼痛是选自抗癌治疗伴随的疼痛、炎性疼痛、肌肉疼痛和由周围神经损伤引起的疼痛中的一种或更多种。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述脂肪来源干细胞来源于待施用所述组合物的患者的自体脂肪组织。
8.可注射制剂，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物。
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