KR100479362B1

KR100479362B1 - 중추또는말초신경계장애및싸이토카인과잉생산치료를위한k-252a유도체

Info

Publication number: KR100479362B1
Application number: KR10-1998-0710637A
Authority: KR
Inventors: 엠. 엔져 토마스; 에이. 호운 포레스트; 에스. 세포리토 마이클; 디. 에이몬 리사; 에스. 밀러 매튜; 쥬니어. 나이트 어니스트
Original assignee: 세파론, 인코포레이티드
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1997-06-24
Publication date: 2005-10-06
Also published as: KR20000022217A

Abstract

본원에는 인돌로카르바졸 K-252a의 고리 치환 유도체 및 하기 화학식으로 표현되는 유도체를 이용하는 치료방법이 개시된다. 상기 화합물은 말초 신경병증, 중추뉴론 퇘행 및 싸이토카인 과잉생산에 유용하다. 상기 장애들의 대표적인 질병으로는 말초 신경병증, 알쯔하이머병, 파킨슨병, 및 자가면역 및 알러지 이환상태들이다.

Description

중추 또는 말초신경계 장애 및 싸이토카인 과잉생산 치료를 위한 Ｋ-252Ａ 유도체

본 발명은 여러 가지 질병, 장애 및 이환상태(condition)의 해로운 영향을 개선시키는 방법에 유용하게 이용될 수 있는 인돌로카르바졸 K-252a의 고리 치환 유도체에 관계한다.

Ⅰ. 인돌로카르바졸 K-252a

K-252a는 하기 화학식으로 표현되는 인돌로카르바졸 골격을 갖는 화합물이다(일본특허공개 85-41489(미국특허 제 4,555,402호).

K-252a는 세포 기능의 조절에 있어 중요한 역할을 담당하는 단백질 키나제 C(PCK)를 강하게 억제하고, 평활근 수축억제활성(Jpn. J. Pharmacol. 43(suppl.):284, 1987), 세로토닌 분비 억제활성(Biochem. Biophys, Res. Commun., 144:35, 1987), 뉴락손의 신장 억제활성(J. Neuroscience 8:715, 1988), 히스타민 분비 억제활성(Allergy, 43:100, 1988), 평활근 MLCK 억제활성(J. Biol. Chem., 263:6215, 1988), 소염작용(Acta Physiol. Hung., 80:423, 1992), 세포생존의 활성 (J. Neurochemistry, 64:1502, 1995) 등과 같은 다양한 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한 Experimental Cell Research, 193: 175-182, 1991에는 K-252a가 IL-2 생산을 억제하는 활성을 갖는 것으로 보고되어 있다.

또한, K-252a의 유도체들이 PKC 억제 활성, 히스타민 분비 억제 활성(일본특허공개 88-295588호), 항종양 활성(일본특허공개 89-168689호(미국특허 제 4,877,776호), 국제 공개 WO88/07045호 (미국특허 4,923,986호) , 국제공개WO94/04541호), 혈소판 증가 활성 (WO94/06799호(유럽특허 630898A)), 혈관억제활성(일본특허공개 87-120388호), 콜린성 뉴론의 촉진 작용(WO 94/02488호(미국특허 5,461,146호)), 전립선 암에 대한 치료효과(WO94/27982호(미국특허 5,516, 771호)) 등의 활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 선택된 아미노산-함유 트린덴(trindene) 화합물들은 대응하는 스타우로스포린 옥심(국제공개 WO97/05140)의 베크만 재배열(Beckman rearrangment)에 의해 제조되었다.

인돌로카르바졸들은 일반적으로 친유성이다. 이러한 특성 때문에, 인돌로카르바졸들은 단백질에 비해 비교적 쉽게 생물막(biological membrane)을 통과할 수 있고, 또 단백질에 비해 긴 생체내 반감기(in vivo half lives)를 갖는다.

K-252a 이외에, 다양한 K-252a 유도체들이 합성되고 그들의 생물학적 활성에 대해 시험되었다. 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려진 K-252a 유도체들 가운데 하나는 루이스 등에 의해 미국특허 제 5,461,146호, 및 동 5,621,100호 및 국제공개 WO94/02488호에 개시되어 있으며 "화합물 Ⅱ-51"이라 명명된 화합물이다. 화합물 Ⅱ-51은 콜린성 뉴론, 선조체 뉴론(striatal neuron) 및 감각뉴론의 기능을 향상시키는 것으로 확인되었다.

Ⅱ. 신경퇴행성 질병 및 장애

파킨슨병은 흑질선조체 경로(nigro-striatal pathway)의 도파민작용성 뉴론의 점진적인 또는 선택적인 손실을 포함하는 신경퇴행성 장애이다(Agid, Lancet: 337:1991). 마우스에 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP)을 투여하면, 도파민작용성 뉴론이 퇴행되는데, 이러한 마우스는 파킨슨병에서 관찰되는 도파민작용성 뉴론 손실 및 행동 결손(behavioral deficits)에 대한 동물 모델로 기능한다. MPTP의 말초 투여는 사람, 원숭이, 및 마우스에서 고도로 선택적인 흑질선조체 도파민작용성 뉴론 시스템의 퇴행을 초래한다(Heikkila et al., Science 224:1451-1453, 1984: Burns et al., Proc. Natl. Acad. Sct. USA 80:4546-4550, 1983).

MPTP 마우스 모델에서의 신경퇴행은 잘 규명되어 있다. MPTP의 전신투여는 쥐 선조체의 도파민작용성 뉴론에서 도파민(및 그의 대사산물) 함량, 티로신 히드록실라제 활성, 및 도파민 흡수 부위의 선택적인 손실을 초래한다(Heikkila et al., Nature 311:467-469, 1984a, b: Tipton et al., J. Neurochem. 61:1191-1206, 1993). 이러한 효과는 도스-의존적이다. 최대 손실은 손상후 제 3일과 제 7일 사이에 일어난다(Jackson-Lewis et al., Neurodegeneration 4:257-269, 1995). 흑질선조체내의 도파민작용성 세포체들은 그들의 대응하는 신경말단에 비해 MPTP 독성에 대해 덜 민감하다. 높은 도스의 MPTP에서 또는 여러 차례의 MPTP 주사시에, 흑색질의 TH 면역양성세포들의 상당한 손실이 1주일 이내에 일어난다(Heikkila et al., Science 224:1451-1453, 1984: Jackson-Lewis et al., Neurodegeneration 4:257-269, 1995). 낮은 도스의 MPTP에서 또는 한차례의 MPTP 주사시에 흑색질 티로신 히드록실라제 양성 세포들의 손실은 더 뒤늦게 일어난다(Tatton et al., J. Neuroscience. Res. 30:666-672, 1991). 따라서, 낮은 도스의 MPTP에서 그리고 손상후 단기간 경과시, 선조체 손상은 흑색질 티로신 히드록실라제 세포 손상이 없는 상태하에서 일어날 수 있다. 이러한 신경퇴행 수순은 질병에서 관찰되는 그것과 유사하다. MPTP 마우스는 파킨슨병의 연구를 위한 모델로 알려져 있고 광범위하게 이용되고 있다.

신경전달물질로 γ-아미노부티르산(GABA)을 이용하는 비-콜린작동성 뉴론들(예컨대, GABA-작용성 뉴론들)은 뇌에 전반적으로 분포되어 있다. 예를 들어, 이들은 주의력 및 기억 기능에 중요한 기저전뇌의 하나의 구역인, 설치류의 핵 기저 확대세포소(nucleus basalis magnocellularis)(사람 뇌의 경우에 이에 해당하는 부위는 Meynert의 핵 기저이다)에서 발견된다. 기저전뇌에서 GABA-작용성 뉴론들에 대한 손상은 알쯔하이머병과 같은 신경퇴행성 질병에 있어서 행동 결손의 원인이 될 수 있다(Dekker et al., Neurosci. and Biobehav. Rev. 15.:299-317, 1991; Gallagher et al., Seminars in Neuroscience, 6:351-358, 1994; Torres et al., Neuroscience, 63:95-122, 1994).

기저전뇌에 있는 뉴론들은 몇몇 중추신경계 질병, 특히 알쯔하이머병(Arendt et al., Acta Neuropathol. (Berl) 61:101-108, (1983); Iraizoz et al., Neurosciencc, 41:33-40, 1991, Vogels et al., Neurobiol. Aging, 11:3-13, 1990) 에서 죽는다. 이러한 뉴론의 죽음에서 원인이 되는 요인은 글루타메이트 흥분신경독성(glutamate excitotoxicity), 즉, 과잉의 글루타메이트에 의한 뉴론의 과잉-자극이다(Choi, Neuron, 1:623-634, 1988). 따라서, 알쯔하이머병의 몇몇 동물 모델들은 글루타메이트 또는 글루타메이트 유사체를 이용하여 뉴론이 죽는 기저전뇌 부위, 즉, 핵 기저 확대세포소에서 흥분신경독성 죽음(excitotoxic death)을 유발한다(Wenk, Bgh, Eratin Res. 72:17-24, 1996).

알쯔하이머병에서 뉴론의 병리는 최초로 엔토르히날 피질(entorhinal cortex)에서 발견되었고, 이 부위에서 뉴론의 손실은 병의 진행에 매우 심각한 영향을 미쳤다(Braak et al., Acta Neuropathol. 82:239-259, 1991; Hyman et al., Ann. Neruol. 20:472-481, 1986). 엔토르히날 피질의 층 2에 있는 뉴론들은 해마의 치상회(dentate gyrus)쪽으로 돌기되어 있고, 이러한 뉴론 경로는 기억 형성에 매우 중요한 역할을 담당한다(Levisohn et al., Brain Res. 564:230-244, 1991; Olton et al., Brain Res. 139:295-308, 1978; Steward et al., Brain Res. Bull. 2:41-48, 1977). 엔토르히날 피질의 층 2의 뉴론들은 대뇌피질에 있는 다른 뉴론들과 마찬가지로, 신경전달물질로 글루타메이트를 이용한다(Mattson et al., Neuron 1:865-876, 1988; White et al., Nature 270:356-357, 1977). 따라서, 엔토르히날 피질에서 글루타메이트 뉴론의 손실은 알쯔하이머병 및 기타의 신경장애에서 발견되는 행동 결손의 원인이 된다.

Ⅲ. 말초 신경병증( Peripheral Neuropathy)

말초신경병증은 일반적으로 대부분 운동뉴론, 감각뉴론, 감각운동뉴론, 또는 자율신경기능부전 또는 이들의 조합으로 나타나는 말초 신경에 영향을 미치는 장애를 말한다. 말초신경병증에 의해 나타나는 모폴러지의 다양성들은 각각 그만큼 다양한 원인에 의해 비롯된다. 사실상, 말초신경병증은 유전적으로 획득되거나, 전신질환(systemic disease)에 의해 일어나거나 또는 독성 약제에 의해서도 유발될 수 있다. 신경독성을 나타내는 일부 독성 약제들은 치료약물이거나, 항종양약제, 음식물 및 약품의 오염물질, 및 환경 및 산업 오염물질이다.

특히, 감각 및/또는 운동 신경병증을 유발하는 것으로 알려진 화학치료요법 약제들은 조직학적 악성종양 및 육종의 치료에 이용되는 항종양제인, 빈크리스틴을 포함한다. 신경독성은 도스-관련성이고, 장 자동성의 감소, 말초신경병증, 특히, 손과 발의 말단 근육에서, 체위성 저혈압, 및 방광의 이완으로 나타난다. 유사한 문제들이 탁솔 및 시스플라틴(Mollman, 1990, New Eng. Jour. Med. 322:126-127)에 대해서도 보고된 바 있는데, 시스플라틴-관련 신경독성은 신경성장인자(NGF)에 의해 완화될 수 있다. 신경독성은 때로 신경독성 약제의 제거 이후에 원상태로 회복된다고해도, 회복은 매우 느린 과정이다.(Legha, 1996, Medical Toxicology 1:421-427; Olesen et al., 1991, Drug Safety 6:302-314).

유전되는 다수의 말초 신경병증들이 존재하는데, 이들은 레프섬병(Refsum's disease, A-베타지단백혈증, 탠지어병(Tangier disease), 크라베병(Krabbe's disease), 이염류코디스트로피(metachromatic leukodystrophy), 패브리병(Fabry's disease), 데제린-솟타스 증후군(Dejerine-Sottas syndrome) 등을 포함한다. 유전되는 모든 신경병증 가운데, 가장 흔한 것은 샤르코-마리-투쓰병(Charcot-Marie-Tooth disease)이다.(말초신경병증에 대한 추가 정보는 미국 특허 제 5,420,112호 참조).

Ⅳ. 싸이토카인

종양괴사인자 α(TNF-α) 및 인터루킨 Ⅰβ( IL-β)는 생체내에서 다수의 염증을 일으키는 과정 및 대사과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. TNF-α의 패혈증성 쇼크를 포함하는, 염증성 질병에 있어서의 역할에 대한 고찰은 Ann. Rev. Immunol. 7:625 (1980) 및 Clinical Trials for the Treatment of Sepsis, Sibbald, W.J. and Vincent, J.-L.(Eds), Springer-Verlag Berlin Heidelberg 1995를 참고하라. 일반적으로 TNF-α의 과잉생산 또는 부적절한 생산은 패혈증성 쇼크(Spooner et al., Clinical Immunology and Immunopathology, 62:p S11(1992))와 같은 몇몇 병리적 이환상태 및 다양한 기타의 알러지성 및 염증성 이환상태 또는 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이들 이환상태 및 질병들은 반드시 이들로 국한되는 것은 아니나, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지성 비염, 피부염, 및 염증성 장질환 및 기타의 자가면역질환들을 포함한다(Immuno's Res 10:122 (1991), Science 229:896(1985) 및 Proc. Natl. Acad. Sci. 89:7375 (1992).

[발명의 요약]

일반적으로, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 치료유효량의 화합물 A를 처치함으로써, 여러 가지 질병, 장애, 및 이환상태의 해로운 효과를 개선할 수 있는 방법을 특징으로 한다.

더욱 상세하게, 본 발명은 뉴론을 화합물 A와 접촉시키는 단계를 포함하는, 사람에서 도파민작용성, GABA-작용성, 또는 글루타메이트작용성 뉴론의 생존을 증가시키거나 기능을 향상시킴으로써 특정 뉴론의 죽음을 초래하거나 그의 원인이 되거나 기능을 억제하는 여러 가지 질병, 장애, 및 이환상태의 해로운 효과를 치료할 수 있는 방법을 특징으로 한다. 전형적으로, 상기 뉴론이 발견되는 포유동물은 사람이다. 일반적으로 화합물 A와 접촉된, 도파민작용성, GABA-작용성, 또는 글루타메이트작용성 뉴론들은 신경퇴행성 질병 때문에 기능이 손상되었거나 죽을 우려가 있는 상황에 처한 것들이다. 일반적으로 신경퇴행성 질병들은 파킨슨병 또는 알쯔하이머병이다.

더욱 상세하게, 본 발명은 포유동물에 신경병증-감소량의 화합물 A를 투여하는 과정을 포함하는 말초 신경병증의 완화방법도 특징으로 한다.

인돌로카르바졸 화합물 K-252a가 엔도톡신 투여에 의한 치명성을 감소시킨다는 사실이 보고된 바 있는데, 이러한 능력은 K-252a의 단백질 키나제, 특히 단백질 키나제 C를 억제하는 능력에 기인한다(Inaba et al., Jpn. J. Surg 23:234 (1993)). 의외로, PKC에 대해 억제활성이 거의 없거나 전혀 없는 화합물 A가 TNF-α 생성 및 싸이토카인 IL-1β 생성의 억제제로서 놀라울 정도의 탁월한 활성을 제공한다는 사실이 발견되었다. 따라서, 더욱 상세하게 본 발명은 포유동물에 유효량의 화합물 A 및 그의 제약학상 허용가능한 염을 제약학상 허용가능한 담체와 함께 투여하는 과정을 포함하는, 포유동물에서 TNF-α 및 IL-1β의 생성을 억제하는 방법 및 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 패혈증성 쇼크, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지성 비염, 피부염, 및 염증성 장질환 및 기타의 자가면역질환들을 포함하는 염증성 이환상태 또는 질병을 치료하거나 개선시키는 방법을 특징으로 한다.

본원에서 "화합물 A"란 하기 식의 화학적 구조를 갖는 화합물을 의미한다.

화합물 A는 화합물 Ⅱ-51라고도 한다(Lewis et al., 미국특허 제 5,461,146호 및 동5,621,100, 국제공개 제 WO94/02488호).

본원에서 이용될 때, "개선하다(ameliorate)" 또는 "개선함(ameliorating)"이라는 용어는 치료상으로 증진하거나 및/또는 치료상으로 감소시키거나 및/또는 치료상으로 더욱 관용적(tolerable)으로 만드는 것을 의미한다.

본원에서 이용될 때, "해로운(deleterious)"이라 함은 해를 가하고/하거나 유해하고/하거나 부정적인 영향을 미치는 것을 의미한다.

본원에서 이용될 때 "과잉생산"이란 용어는 TNF-α 및 IL-1β의 생산을 수식하기 위해 이용되는 경우에, TNF-α 및 IL-1β의 생산이 패혈증성 쇼크, 알러지성 이환상태, 염증성 이환상태 등과 같은 해로운 이환상태를 초래하는 것을 의미한다.

본원에서, "억제하다(inhibit)" 또는 "억제함(inhibiting)"이란 용어는 화합물 A의 존재가 화합물 A와 접촉되지 않은 대조 물질에 비해 화합물 A와 접촉된 물질의 생산의 감소 및/또는 억제 및/또는 방해에 대해 훨씬 현저한 효과를 갖는 것을 의미한다.

본원에서, "향상시키다(enhance)" 또는 "향상시킴(enhancing)"이란 용어는 "기능(function)" 또는 "생존(survival)"이란 용어를 수식하기 위해 이용되는 경우에, 화합물 A의 존재가 화합물 A가 제공되지 않은 대조 뉴론에 비해, 특정한 뉴론의 기능 및/또는 생존에 대해 훨씬 큰 효과를 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, 반드시 제한적인 것은 아니지만, 도파민작용성 뉴론의 생존과 관련해서, 화합물 A는 처리된 집단이 비처리 집단에 비해 훨씬 긴 작용(functionality) 기간을 갖는다면, 화합물 A가 제공되지 않은 도파민작용성 뉴론 집단에 비해, 죽을 우려가 있는 (예컨대, 부상, 질병, 퇴행성 이환상태, 또는 자연적인 노화에 의해) 도파민작용성 뉴론 집단의 기능을 확실하게 향상시킬 것이다.

본원에서 이용될 때, "도파민작용성 뉴론"은 신경전달물질로 도파민을 이용하는 뉴론을 의미한다.

본원에서 이용될 때, "GABA작용성 뉴론"은 신경전달물질로 γ-아미노부티르산을 이용하는 뉴론을 의미한다.

본원에서 이용될 때, "글루타메이트작용성 뉴론"은 신경전달물질로 글루타메이트를 이용하는 뉴론을 의미한다.

본원에서 이용될 때, "nbm"은 핵 기저 확대세포소(nucleus basalis magnocellularis)를 의미한다.

다른 언급이 없는한, 본원에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들에 의해 이해되는 통상의 의미를 갖는다. 본원에 개시된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 재료들이 본 발명의 실시 및 시험에 이용될 수 있다고 해도, 바람직한 방법 및 재료들은 후술하는 것이다. 본원에서 언급된 모든 문헌, 특허출원, 특허 및 기타의 자료들은 본원에 전문 첨부된다. 모순되는 경우에, 정의를 포함하는 본 문서가 기준이 될 것이다. 특별히 지적하지 않는한, 본원에 기술된 재료, 방법 및 실시예들은 설명의 목적만을 위한 것으로 제한적인 의미를 갖는 것은 아니다. 본 발명의 다양한 특징 및 이점들은 후술하는 발명의상세한 설명 및 첨부된 청구범위로부터 더욱 자명해질 것이다.

도 1은 화합물 A가 모노아민 옥시다제 A 억제제가 아님을 보여주는 데이터의 그래프도이다. 클로르길라인(Clorgyline)의 IC₅₀은 21㎚이다. 삼각형, 클로르길라인; 역삼각형, 화합물 A; 사각형, L-디프레닐.

도 2는 화합물 A가 모노아민 옥시다제 B 억제제가 아님을 보여주는 데이터의 그래프도이다. 클로르길라인(Clorgyline)의 IC₅₀은 21㎚이다. 삼각형, 클로르길라인; 역삼각형, 화합물 A; 사각형, L-디프레닐.

도 3은 화합물 A를 제공받은 동물(색칠하지 않은 막대)이, 부형제만이 투여된 손상 동물(색칠된 막대)에 비해, 손상된 nbm의 문측 부위(rostral portion)[상해 부위의 중간지점으로부터 400㎛ 위]에 상당히 많은 플루오로-골드 (Fluoro-Gold) 표지된 뉴론들을 가짐을 보여주는 막대그래프도이다. *=P<0.05 뉴만-큘스 테스트(Newman Keuls test).

도 4는 부형제만을 투여한("Les") 정상 대조군 동물, 모의수술된 동물, 수술에 의해 손상된 동물 및 화합물 A를 0.1㎎/㎏의 도스로 q.o.d.로 투여한 수술에 의해 손상된 동물("0.1")에서 T-미로 보상 선택 임무(T-maze rewarded alternation task)에서 범해진 실수의 총수를 나타낸 막대 그래프도이다. 각 그룹의 동물의 수는 괄호안에 나타내었다. *=P<0.05 모의수술에 비해, 11=P<0.01 Les에 비해, 뉴만-큘스 테스트(Newman Keuls test)시.

도 5는 아크릴아미드-유도 말초 신경병증에 대한 화합물 A의 효과를 도시한 도면이다.

일반적으로, 본 발명은 치료를 필요로 하는 환자에게 치료유효량의 화합물 A를 처치함으로써, 여러 가지 질병, 장애, 및 이환상태의 해로운 효과를 개선하는 방법을 특징으로 한다.

본 발명은 포유동물 중추신경계의 특수한 유형의 뉴론들의 기능 또는 생존을 향상시킴으로써 질병 및 장애로 인해 죽을 우려가 있는 뉴론들의 기능 및/또는 생존에 부정적인 효과를 미치는 질병, 장애, 및 이환상태의 해로운 효과를 치료하는 방법을 제공한다. 더욱 상세하게, 본 발명은 포유동물에 하기 화학식의 구조를 갖는 고리-치환 K-252a 유도체인 화합물 A를 투여함으로써 포유동물에서 도파민작용성 뉴론, GABA작용성 뉴론, 및 글루타메이트작용성 뉴론의 기능을 향상시키는 방법을 제공한다:

도파민작용성 뉴론, GABA작용성 뉴론, 및 글루타메이트작용성 뉴론들은 포유동물의 중추신경계에 광범위하게 분포되어 있다. 이들 3 가지 타입의 뉴론들 각각은 하나 이상의 중추신경계의 퇴행성 질환에서 그 기능이 손상되었거나 심지어 죽어 있다. 파킨슨병은 흑질선조체 경로의 도파민작용성 뉴론의 점진적인 손실을 포함한다. 알쯔하이머병은 기저전뇌의 메이너트(Meynert)의 핵기저에 있는 GABA작용성 뉴론들을 포함하는 여러 가지 유형의 뉴론들의 죽음을 포함한다. 알쯔하이머병은 엔토르히날 피질내의 글루타메이트작용성 뉴론들의 죽음도 포함한다.

파킨슨병 및 및 알쯔하이머병의 하나의 치료방법은 도파민작용성 뉴론, GABA작용성 뉴론 또는 글루타메이트작용성 뉴론의 기능 또는 생존을 향상시키는 화합물을 투여하는 것이다. 화합물 A는 생물분석 및 도파민작용성 뉴론, GABA작용성 뉴론 또는 글루타메이트작용성 뉴론에 대한 생체내 모델에서 약물학적 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명은 파킨슨병 또는 알쯔하이머병의 치료에 유용하다. 그러나, 본 발명은 이들 질병의 치료로만 국한되는 것은 아니다. 그 기능이 손상되거나 죽을 우려가 있는 경우 파킨슨병 또는 알쯔하이머병 이외의 질병을 유발하는 도파민작용성 뉴론, GABA작용성 뉴론 또는 글루타메이트작용성 뉴론의 기능 및 생존을 향상시키는데 화합물 A를 이용하는 것도 본 발명의 범위내에 포함된다.

본 발명은 말초신경병증을 감소시키는 방법도 특징으로 한다. 본 발명의 방법은 신경병증 감소량의 화합물 A를 포유동물에 투여하는 과정을 포함한다. 여러 가지 바람직한 구현예에 있어서, 포유동물은 신경병증, 예컨대 화학요법 약제에 의한 종양의 치료의 결과로 신경병증이 발병한 사람, 가축 또는 집짐승이다.

화합물 A는 당업자들에게 효과적인 것으로 생각되는 방법에 의해 투여될 수 있는데, 바람직한 투여 모드는 피하주사이다.

본원에서 이용될 때, "말초 신경병증(peripheral neuropathy)"이란 용어는 말초신경계의 세그멘트를 침범하는 장애를 의미한다. 본 발명은 화합물 A를 이용하여 말초 감각운동신경병증, 또는 위장관의 자동운동성 감소 또는 방광의 무긴장증과 같은 자율신경계 신경병증을 포함하지만, 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 신경독성을 감소시키는 것을 포함한다.

화합물 A에 의해 효과적으로 치료될 수 있는 바람직한 신경병증은 포스트-폴리오 증후군과 같은 전신질환과 관련된 신경병증; 샤르코-마리-투드병과 같은 유전성 신경병증; 및 아크릴아미드 또는 빈크리스틴과 같은 화합요법 약제 등의 독성 약제에 의해 발병되는 신경병증을 포함한다.

화합물 A가 독성 약제에 의해 유발된 신경병증의 치료에 이용되는 경우에, 그것은 독성 약제에 노출되기 전에, 그와 동시에 또는 그 이후에 투여되거나 또는 화합요법 약제의 투여 이전, 도중, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 바람직하게, 화합물 A 및 화학요법 약제는 중복되는 치료기간 중에 각각의 효과적인 시간 간격으로 투여된다. 화합물 A는 신경독성 약제 또는 화학요법에 의해 파괴된 신경기능의 적어도 일부라도 회복시키기 위해, 포유동물에 신경독성 약제를 투여한 다음에 또는 화합요법 다음에 투여될 수 있다. 화학요법 약제는 빈크라스틴, 탁솔, 디데옥시이노신, 또는 시스플라틴과 같은 신경독성을 유발하는 화학요법 약제이다.

"독성 약제(toxic agent)" 또는 "신경독성 약제(neurotoxic agent)"란 그의 화학적 작용을 통해서, 신경계의 구성요소들의 활동을 손상시키거나 훼손하거나 또는 억제하는 물질을 의미한다. 신경병증을 일으키는 신경독성 약제를 일일이 열거하면 매우 많은데, 예를 들어 반드시 이들로 국한되는 것은 아니나, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 시스플라틴, 탁솔 또는 디데옥시이노신과 같은 디데옥시-화합물과 같은 항종양제; 알콜; 금속; 직업상 또는 환경상 노출에 의한 산업 독소; 음식 또는 약물의 오염물질; 또는 비타민 또는 페니실린 또는 클로람페니콜과 같은 항생제 또는 비타민 A, D 및 B6의 대량투여와 같은 치료제의 과량투여를 포함한다. 신경독성 부작용을 갖는 화합물들의 추가의 예를 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표에 신경독성 화합물을 열거해 놓았으나, 이는 설명의 목적만을 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 다른 독성 약제들도 신경병증을 일으킬 수 있고 당업자들에게 알려진 방법에 의해 특성이 규명될 수 있다. "독성 약제에 노출된다"는 것은 본 발명의 포유동물이 독성 약제를 이용할 수 있게 되거나 독성 약제와 접촉되는 것을 뜻한다. 독성 약제에 대한 노출은 직접 투여에 의해, 예컨대, 음식, 약물, 또는 화학요법 약제와 같은 치료제의 섭취에 의해 또는 우연한 오염에 의해 또는 환경노출, 예컨대, 대기중 또는 수중 노출에 의해 일어날 수 있다.

생체내에서 말초신경병증의 모르폴러지 및 원인이 매우 다양함에도 불구하고, 본 출원인은 화합물 A가 포유동물에서 그러한 신경병증을 예방하거나 치료하는데 매우 유용하다고 가정하였다.

[표 1]

말초신경병증 유발 약제

화합물 A는 PKC에 대해서는 억제활성을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않음에도 불구하고, 싸이토카인 TNF-α의 생산을 억제하는 것으로 확인되었다. 화합물 A는 싸이토카인 IL-1β의 생산도 억제한다. TNF-α의 생산은 화합물 A에 의한 그의 억제가 TNF-α 생산의 억제를 필요로 하는 환자에게 유익한 가치를 제공할 정도로 다양한 질병 및 장애와 연관되어 있다.

따라서, 화합물 A는 포유동물에서 TNF-α의 생산을 억제하기 위해 이용되고/되거나 상기 포유동물에 치료유효량의 화합물 A를 투여하는 과정을 포함하는, 패혈증성 쇼크, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지성 비염, 피부염 및 염증성 장질환, 및 기타의 자가면역질환을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌 염증성 질환 또는 장애의 치료 또는 개선방법에 이용될 수 있다.

본 발명에서 이용하기 위해, 화합물 A는 제약학상 허용가능한 부형제 및 담체와 혼합함으로써 제약학적 조성물로 제제화될 수 있다. 이러한 조성물은 여러 가지 경로중에서 임의의 경로에 의해 투여되도록 제조될 수 있다. 투여 경로 및 바람직한 용량은 다음의 것들을 포함한다: 비경구, 바람직하게, 액상 용액, 또는 현탁액 형태; 경구, 바람직하게 정제 또는 캡슐; 비내, 바람직하게 분말, 비강적제(norsal drop), 또는 에어로졸; 및 피부, 예컨대, 경피 패치(tansdermal-patch).

화합물 A는 단위 제형(unit dosage form)으로 편리하게 투여될 수 있고 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980)에 기술된 바와 같은 제약학 분야에 공지되어 있는 방법중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 비경구투여용 제형들은 예컨대, 통상의 부형제로서 멸균수 또는 염수, 폴리에틸렌글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 오일, 식물로터 추출한 수소첨가 나프탈렌 등을 포함할 수 있다. 특히, 생체적합성, 생물분해성 락티드 폴리머, 락티드/글리콜리드 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체들은 활성 화합물의 방출을 조절하기 위한 유용한 부형제가 될 수 있다. 화합물 A의 다른 이용가능한 비경구적 전달 시스템은 에틸렌-비닐아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 및 리포좀을 포함한다. 흡입투여용 제형(inhalation administration)은 부형제로서 예컨대 락토오스를 포함하거나, 또는 예컨대 락토오스를 포함하는 수용액이거나, 또는 예컨대 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 글리코콜레이트 및 디옥시콜레이트를 포함하는 수용액이거나, 또는 비강 적제(nasal drop) 형태 또는 비강내에 투여되는 겔 형태로 투여하기 위한 유성 용액(oily solution)일 수 있다. 비경구투여용 제형들은 또한 구강투여를 위해 글리코콜레이트, 직장투여를 위해 살리실레이트, 또는 질투여를 위해 시트르산을 포함할 수도 있다. 경피 패치용 제형들은 바람직하게 친유성 에먼젼이다.

화합물 A는 약학적 조성물중에 유일한 유효성분으로 사용될 수 있다. 그렇지 않으면, 다른 활성성분들, 예컨대, 질병 또는 장애에 있어서 뉴론의 생존 또는 축삭 재생을 촉진할 수 있는 다른 성장인자들과 함께 이용될 수도 있다.

치료 조성물중 화합물 A의 농도는 달라질 수 있다. 이러한 농도는 투여되어야 하는 약물의 총용량, 투여경로와 같은 여러가지 요소에 따라 달라질 수 있을 것이다. 일반적으로, 화합물 A는 비경구투여의 경우에 약 0.1%-10% w/v의 화합물을 포함하는 생리적 완충수용액으로 제공될 수 있다. 전형적인 용량 범위는 단위체중당(㎏) 약 1㎍/㎏/day 내지 약 1g/㎏/day이고; 바람직한 용량 범위는 단위체중의 약 0.01 ㎎/㎏/day 내지 100㎎/㎏/day이다. 투여되어야 하는 약물의 바람직한 용량은 질병 또는 장애의 유형 및 진행정도, 특정 환자의 전체적인 건강상태, 처치되어야 하는 특정 질병 또는 장애에 대한 화합물 A의 상대적인 효능, 사용되는 특정 제형 및 그의 투여경로와 같은 변수에 의존할 것이다.

본 발명에 이용하기 위한 화합물 A는 바람직하게 루이스 등의 미국특허 제 5,461,146호에 기재된 방법에 따라 수득된다.

이하에서 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하거나 첨부된 청구범위의 보호범위를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1

도파민작용성 뉴론에 대한 약물활성

마우스의 MPTP-손상 도파민작용성 뉴론(MPTP 마우스 모델)에 대해 화합물 A를 가지고 실험하였다. C57 블랙 마우스에게 단일 도스의 MPTP(20㎎/㎏, s.c.)를 투여한 결과 약 60% 정도 선조체 티로신 히드록실라제 활성이 상실되었다. 이와 같이 MPTP-처리된 마우스에 화합물 A를 0.01 내지 10 ㎎/㎏(s.c.) 범위의 일일 도스로 투여하였더니 선조체 티로신 히드록실라제 활성의 상실이 감소되었다. 이들 데이터들을 하기 표 2에 나타내었다.

[표 2]

낮은-도스 MPTP-처리된 마우스^a에서의 선조체 티로신 히드록실라제(TH) 활성

^a3회 투약반응실험의 평균

화합물 A의 최초 주사후 4-6시간 경과후에 마우스들을 MPTP(20㎎/㎏; s.c.)로 처리하였다. 이어서 화합물 A를 실험이 끝날 때까지 7일간 매일 주사하였다. 선조체를 티로신 히드록실라제(TH) 활성에 대해 평가하였다. 애스터리스크는 MPTP-비히클 처리된 동물과 통계학상으로 현저한 차이(p<0.05)를 보이는 경우를 뜻한다.

별도의 실험에서, 화합물 A의 활성을 높은 도스의 MPTP-마우스 모델에서 평가하였다. MPTP를 1회 40㎎/㎏ 주사하였더니 주사후 제 7일에 선조체 티로신 히드록실라제 효소 활성이 95% 고갈되었다. 0.03과 3.0㎎/㎏ 사이의 일일 도스로 화합물 A를 투여한 결과 손상의 크기가 도스-의존적 양식으로 감소되었다. 이들 결과들을 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

높은-도스 MPTP-처리된 마우스에서의 선조체 티로신 히드록실라제(TH) 활성^a

^a 1회 실험의 결과

최초의 화합물 A의 주사후 4-6시간 경과후에 마우스들을 MPTP(40㎎/㎏; s.c.)로 처리하였다. 이어서 화합물 A를 실험이 끝날 때까지 7일간 매일 주사하였다. 선조체를 티로신 히드록실라제(TH) 활성에 대해 평가하였다. 애스터리스크는 MPTP-비히클 처리된 동물과 통계학상으로 현저한 차이(p<0.05)를 보이는 경우를 뜻한다.

MPTP-매개 도파민작용성 독성은 MA0 매개 MPTP의 MPP⁺(1-메틸-4-페닐피리디늄 이온)로의 전환 및 MPP⁺의 도파민작용성 뉴론내로의 흡수에 의존한다. MPTP-마우스 모델에서 활성적인 것으로 밝혀진 화합물들은 MAO 또는 도파민 흡수의 억제제가 아닌 것으로 결정되어야 한다. 화합물 A는 생체외에서 모노아민 옥시다제 A 또는 B를 억제하지 않거나(도 1 및 2) 신경말단내로의 카테콜아민의 흡수를 차단하지 않는 것으로 밝혀졌는데, 이것은 이 화합물이 MPTP의 MPP⁺로의 전환을 억제하지 않거나 MPP⁺의 도파민작용성 뉴론내로의 능동적인 흡수를 억제하지 않는다는 것을 의미한다.

MPTP-마우스 도파민 작용성 손상 모델에서 화합물 A의 효능을 증명하는 이들 데이터들은 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환에서의 화합물 A의 효용을 입증한다.

실시예 2

GABA-작용성 뉴론에서의 약물활성

화합물 A의 핵 기저 확대세포소에서 GABA-작용성 뉴론들의 고갈을 억제하는 능력(예컨대, 생존의 증가)을 잘 알려진 이보테닉 애시드(ibotenic acid) 손상 모델을 이용하여 시험하였다. 흥분신경독소(excitotoxins)의 일종인, 이보테닉 애시드는 nbm 부위에서 GABA-작용성 뉴론들의 수를 감소시키는 것으로 알려져 있다(Lindefors et al., Neurosci. Lett., 135:262-264, 1992; Shaugnessy et al., Brain Res., 637:15-26, 1994).

성체 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐들의 nbm 일측에 이보테닉 애시드(5.0 g)를 주사하였다. 이어서 쥐들에게 손상을 유발한 후 처음 18시간 동안 화합물 A(0.03 ㎎/㎏)를 피하 주사에 의해 투약하고, 손상후 18일까지 q.o.d를 계속하였다. 이어서 nbm의 문측-미측 지역 전체에 걸쳐 조직 단편을 회수하여 GABA의 생합성에 요구되는 효소인 글루탐산 디카르복실라제를 검출하는 과정을 수행하였다. 그 다음으로 글루탐산 디카르복실라제 활성을 시현하는 뉴론들의 수를 nbm의 글루탐산 디카르복실라제-발현 뉴론들이 인접한 구조물(담창구의 내측 및 복측 백색질)의 글루탐산 디카르복실라제-발현 뉴론들과 쉽게 구별되는 지역인, nbm의 문측-미측 지역 전체에 걸쳐서 계수하였다. 이 결과들을 무손상 반대측에서의 수에 대한 글루탐산-발현 뉴론들의 퍼센트로 나타내었다. 결과들을 문측 nbm, 중앙-nbm 및 미측 nbm에 대해 각각 따로따로 계산하였다.

부형제만을 투여한 동물에서는 34(±19 s.e.m.)%의 글루탐산 디카르복실라제 뉴론들이 계수된 반면에, 화합물 A를 투여한 동물의 문측 nbm에서는 평균 78%(±15 s.e.m.)의 글루탐산 디카르복실라제 뉴론들이 계수되어, t 테스트시 통계상으로 유의할만한 차이를 보였다(p<0.05). 중앙-nbm 및 미측 nbm에서는 화합물 A 처리-동물과 부형제만을 처리한(대조군) 동물들 사이에 통계상 유의할만한 차이가 나타나지 않았다.

이들 결과들은 화합물 A가 흥분신경독성 손상으로부터 유발되는 GABA-작용성 뉴론 상실을 방지할 수 있어, 뉴론 집단에 대한 신경영양성 효과를 갖는다는 것을 입증한다.

실시예 3

nbm 뉴론에 대한 약물활성

화합물 A의 흥분신경독성 뉴론의 죽음에 대한 효과를 직접적으로 시험하기 위해서, 우선 성체 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐들의 nbm 뉴론들을 오래 지속되는 마커로 표지하였다. 이러한 표지과정은 신경말단에 의해 흡수되어 다시 세포체로 이송되는 뉴론 추적자인 플루오로-골드(FG)를 전두 및 두정부 피질에 있는 nbm 뉴론들의 표적부위에 주사함으로써 행하였다(Book et al., J. Neuropath. Exp. Neurology, 53:95-102, 1994). 7-10일 경과후, 동물들을 5㎍ 이보테닉 애시드를 이용하여 nbm의 일측에 손상을 일으켰다. 이러한 손상 유발후 처음 18시간 동안 동물들에게 화합물 A(0.03 ㎎/㎏)을 피하주사에 의해 투여하고, 손상후 18일까지 매일 주사하였다. 뇌의 양측에 있는 nbm의 전체 문측-미측 지역으로부터 조직 단편을 회수하여 FG 표지를 갖는 nbm 뉴론들의 수를 카운트하였다. 총수를 표준방법을 이용하여 크기 차이에 대해 보정하고, 그 결과들을 각 동물에서 뇌의 손상이 없는 반대쪽에 있는 nbm내의 표지된 뉴론들의 수에 대한 손상이 있는 측면의 nbm내의 표지된 뉴론들의 수의 퍼센트로 나타내었다.

부형제만을 투여한 손상 동물에 비해 화합물 A를 투여받은 동물들은 손상 nbm의 문측(병소 중앙으로부터 400㎛ 위)에 훨씬 많은 FG-표지된 뉴론들을 포함하였다(도 3). 병소 중앙 및 미측에서 화합물 A는 감소하는 효과를 시현하였다.

이러한 결과들은 화합물 A가 흥분신경독성 손상으로부터 결과되는 nbm내의 사전에 표지된 뉴론들의 손실을 억제한다는 사실을 직접적으로 증명한다.

실시예 4

화합물 A의 단기 투약시의 장기지속 작용성 향상

성체 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐를 먼저 표준 보상-선택 T-미로 임무(Helper et al., J. Neurosci. 5:866-873, 1996)를 반복시켜 훈련시켰다. 이어서 동물들의 핵 기저 확대세포소의 양쪽에 손상을 일으켜 T-미로 임무를 잘 수행하지 못하게 만들었다(예컨대, Salamone et al., Behav. Brain. Res. 13:63-70, 1984). 이러한 손상 유발후 처음 18시간 동안 동물들에게 화합물 A(0.1 ㎎/㎏)을 피하주사에 의해 투여하고, 손상 유발후 12일까지 매일 주사하였다. 그들의 선택능력이 수술 이전의 수준으로 회복될 때까지 마지막 주사후 24시간후에 모든 동물을 하루에 한 번씩 T-미로에 넣었는데, 이것은 어디로 가든지 3-10일이 소요되었다. 기준에 도달한 후, 쥐들을 8-10일간은 더 이상 시험하지 않았다. 이 시점에서 동물들을 다시 T-미로에 넣고 그들이 수술전 능력에 도달할 때 까지 하루에 한 번씩 실험하였다. 이 시험중에 쥐들이 범한 실수의 총수를 도 4에 나타내었다. 부형제만을 투여받은 손상 동물은 수술받지 않은 정상 동물 또는 모의수술받은 동물에 비해 훨씬 많은 실수를 범한데 반해, 10-12주 전에 화합물 A를 투여받은 손상 동물들은 정상과 다름이 없었다.

이러한 결과들은 화합물 A가 투약 중단후 여러 달후에 주의 및 기억능력의 향상을 반영하는 행동의 만성적인 개선을 초래한다는 것을 증명한다.

실시예 5

엔토르히날 피질 손상 모델에서의 화합물 A의 효능

엔토르히날 피질의 층 2내의 글루타메이트-함유 뉴론들은 치상회(dentate gyrus)의 분자층으로 돌출되어 있고, 그곳에서 그들은 치상회 과립세포들의 수상돌기(dendrite)상에 시냅시스를 형성한다. 손상은 흥분신경독소인 N-메틸-D-아스파르테이트(NMDA)의 정위 주사(stereotaxic injection)에 의해 엔토르히날 피질의 층 2에 만들어질 수 있다. 소디움 펜토바비탈 마취하에서, 쥐들에게 엔토르히날 피질의 2 부위 양쪽에 NMDA(15 nmols/site)를 주사하였다. 2 주후, 쥐들을 죽여 50 mM 소디움 설파이드 용액으로 관류(perfusion)시켰다. 뇌를 적출하여 40㎛ 두께로 수평으로 절단하고 크레실 바이올렛(Cresyl violet) 또는 팀의 염료(Timm's stain)로 염색하였다. 엔토르히날 피질의 층 2의 뉴론들의 생존을 크레실 바이올렛 염색된 섹션에 대해 평가하고, 치상회의 분자층에서 그들의 엑손 말단의 완전성은 팀 염료로 염색된 다른 섹션을 가지고 평가하였다.

NMDA의 주사는 엔토르히날 층 2의 62±11%(s.e.m.)를 파괴하고 치상회 중앙 분자층의 면적을 19±6%(s.e.m.) 정도 감소시켰다. 화합물 A (1㎎/㎏, s.c.)를 NMDA 주사 직후 최초로 주사한 후 이어서 매일 처리한 결과, 엔토르히날 층 2의 손실은 22±10%(s.e.m.) (p<0.05, "t" 테스트) 감소되었고, 중앙 분자층의 면적 감소도 억제되었다(p<0.05, "t" 테스트). 따라서, 화합물 A 는 엔토르히날 피질내의 뉴론들을 흥분신경독성 손상으로부터 보호하였고 치상회에서의 그들 축삭돌기(axon) 말단의 완전성을 유지하였다.

이러한 결과는 화합물 A의 엔토르히날 피질의 글루타메이트작용성 뉴론들을 보호하는 효능을 입증해준다. 동물 모델에서 엔토르히날 피질의 손상은 기억력 저하, 및 알쯔하이머병에서 심각한 이들 뉴론들의 퇴행을 초래하는 것으로 알려져 있다. 이러한 사실은 화합물 A가 알쯔하이머병, 발작, 및 뇌의 외상을 포함하지만 반드시 이들로 국한되는 것은 아닌, 글루타메이트작용성 뉴론 및 대뇌피질 뉴론의 손실 또는 손상으로 인한 각종 신경계질환의 치료에 유용하다는 사실을 뒷받침해준다.

실시예 6

아크릴아미드-유도 말초 신경병증에 대한 화합물 A의 효과

아크릴아미드는 사람 및 동물에 있어서 "시들어 죽어가는(dying back)" 중추-말초 말단 신경병증을 유발한다. 상기 손상은 사람에 있어서 유약(weakness), 진전(tremor), 및 운동실조(ataxia)를 특징으로 하는 혼합 감각/운동 신경병증이다. 동물에서, 아크릴아미드는 행동(감각, 운동, 및 고유수용(proprioceptive)), 조직병리, 전기생리, 체중감소상의 변화를 일으킨다. 말초에서, 큰 직경, 긴 축삭, Ab 섬유들은 우선적으로 아크릴아미드에 의해 영향을 받는다. 쥐에서, 아크릴아미드 투여는 고유수용의 척도인, 증가된 랜딩 푸트 스프레드(LFS; landing foot spread)에 의해 측정되는 바와 같이, 축삭병증(axonopathy)을 유발한다.

아크릴아미드-유도 신경병증은 화학적으로 유도된 독성의 하나의 모델이다. 그것은 다른 화학적으로 유도된 모델들(예컨대, 화학요법 모델들)과 지속기간이 비교적 짧고(3주) 동물들은 비교적 건강하다는 점에서 다르다. 아크릴아미드는 전체적인 전신 독성(gross systemic toxicity)을 유발하지는 않는다.

실험 개시시에 체중이 250그램인 성체 수컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐를 이용하였다. 아크릴아미드(50㎎/㎏, IP)를 3주 동안 주당 3회씩 투여하였다. 동물들을 30㎝ 높이에서 떨어뜨려 뒷발 간의 간격을 기록하였다(Edwards, P.M. and Parker, V.H. (1977) "A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats. "Toxicol Appl. Pharmacol. 40:589-591). 실험 기간중에 매일 1회씩 화합물 A(0.1, 0.3. 또는 1.0 ㎎/㎏ s.c./5% 솔루톨)을 투여하였다.

아크릴아미드-처리된 동무들은 부형제만 처리된 동물들에 비해 LFS에서 긴 거리를 가졌다. 화합물 A(0.03 ㎎/㎏/day)는 아크릴아미드에 의해 생긴 LFS의 증가의 크기를 감소시켰다(도 5).

이들 데이터들은 화합물 A가 말초신경병증의 치료에 유용함을 말해준다.

실시예 7

생체외에서 화합물 A의 단백질 키나제 C의 억제의 실패

단백질 키나제 C 분석 및 K-252a에 의한 단백질 키나제 C의 억제는 미국특허 제 4,923,986호 및 케이스 등의 논문(Kase, H. et al., (eds) Japan Scientific Press, Tokyo, pp293-296, (1988))에 기술되어 있다. 본질적으로 유사한 분석법에 의해, K-252a가 단백질 키나제 C를 0.028 μM의 IC₅₀으로 억제하는 반면에, 화합물 A의 IC₅₀은 16.0μM, 즉, 570배나 활성적이라는 사실이 밝혀졌다. 화합물 A는 TNF-α 생산의 억제제로서 139 nM의 IC₅₀을 갖고, IL-1β 생산의 억제제로서 261 nM의 IC₅₀을 갖는데, 이들 농도에서 화합물 A는 단백질 키나제의 억제제로서는 불활성이다.

실시예 8

화합물 A에 의한 TNF-α 및 IL-1β 생산의 생체외 억제

화합물 A의 TNF-α의 유도를 억제하는 능력은 후술하는 표준 생체외 약물시험 방법의 이용에 의해 확인되었다.

100% DMSO내의 4mM 화합물 A의 보관용액(stock solution)을 4℃에서 보관하였다. 세포 배양 배지 RPMI 1640 (Media Tech, Herndon, Va) 및 우태아혈청(Hyclone, Logan, UT)을 시험 배지로 하였다. 트리클로로아세트산에 의해 추출된 이. 콜라이 혈청형0111:B4로부터의 리포폴리사카라이드(LPS)(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하였다. LPS의 보관용액을 준비하여 4℃에서 PBS내에서 보관하였다. 종양괴사인자 알파(TNF-α) 및 IL-1β의 분석을 위한 ELISA 키트를 베링거-만하임(Iindianapolis, IN)으로부터 구매하여 제조자의 지시에 따라 이용하였다. 사람 단핵구-유래 세포주인 THP-1 세포들을 미국 배양균 기탁소로부터 입수하였다(ATCC TIB 202). 세포들을 10% 우태아혈청을 포함하는 RPMI 1640(배지)에 넣어 37℃온도, 5% CO₂ 95% 공기의 함습대기하의 조건하에서 배양하였다. 실험을 1 ㎖의 배지당 5×10⁵의 THP-1세포들을 포함하는 24-웰 배양 플레이트(Nunc)내에서 행하였다. 세포들을 2㎍/㎖의 LPS와 함께 인큐베이션하여 TNF-α를 유도하였다. 3시간 인큐베이션한 후, 세포들 및 배지를 1,000×g로 5분간 원심분리하고 그 결과로 수득된 상청액을 즉시 TNF-α에 대해 시험하거나 -70℃에서 보관하였다가 분석하였다. 배지 시료들에 대해서 TNF-α 및 IL-1β의 함량을 ELISA 분석법에 따라 측정하였다.

화합물 A의 TNF-α를 유도하는 능력을 시험하기 위해, LPS를 첨가하기 1시간 전에 세포들을 다양한 농도의 화합물 A와 함께 인큐베이션하였다. 화합물들을 DMSO가 세포 배양배지내에 0.1% 이상의 농도로 존재하지 않도록 희석하였다. 화합물 A를 상술한 바와 같이 TNF-α 및 IL-1β 생산의 억제 능력에 대해 시험 및 분석하였다.

실시예 9

마우스 혈청내의 LPS-유도 TNF-α 및 IL-1β의 억제

60마리의 암컷 C57BL 마우스(4-6주 된)들을 각각 10마리씩 6개의 그룹으로 분류하였다. 3 그룹(1, 3, 5)에는 부형제(0.1% TEA(테트라에틸 암모니움 히드로클로리드)를 포함하는 PBS)만을 200㎕/마우스로 복막내(ip) 투여하였다. 다른 세 그룹(2, 4, 6)에는 부형제(12-히드록시스테아르산의 에틸 에스테르 10 %를 포함하는 PBS; 솔루톨)내의 화합물 A(30 ㎎/㎏/200 ㎕, ip)를 투여하였다. 2시간 후, 동물들에게 0.1 ㎎/㎏의 LPS (그룹 1 및 2), 0.5 ㎎/㎏의 LPS (그룹 3 및 4), 및 1.0 ㎎/㎏의 LPS (그룹 5 및 6)를 투여하였다. LPS 투여후 2시간 후에, 모든 동물들을 죽이고 혈장 시료를 취하여 그들의 TNF-α 및 IL-1β 함량을 분석하였다. 분석은 실시예 8과 동일한 방법으로 실시하였다.

데이터를 하기 표 4에 요약하였다. 괄호안의 숫자는 상술한 그룹의 번호이다. N은 혈장 측정이 행해진 동물의 숫자이다. ND= 측정하지 않음.

[표 4]

^*은 부형제 처리 대조군에 비해 통계학상 차이나는 것을 가리킨다(p〈0.05).

상기 표 4를 통해서 확인되는 바와 같이, 마우스에 대한 LPS 투여는 이들 마우스에 의한 TNF-α의 생산을 초래하였고 생산된 TNF-α의 양은 화합물 A에 의한 2시간 사전 처리에 의해 현저하게 억제되었다. 화합물 A에 의한 사전처리는 1.0 ㎎/㎏의 LPS의 투여에 의해 초래된 IL-1β의 생산도 현저하게 억제하였다.

실시예 10

마우스에서 LPS-유도 죽음의 예방

40마리의 마우스들을 3개의 그룹으로 나누되, 2 그룹은 각각 10마리의 마우스로 구성되고 하나의 그룹은 20 마리의 마우스로 구성되도록 분류하였다. 부형제, LPS, 및 화합물 A를 그룹 1(n=10)의 마우스에 투여하되, 시간 0에서 부형제(LPS/PBS, 200 ㎕/마우스)를 복막내 투여하고 2시간 후 화합물 A(200 ㎕/마우스)를 투여하였다. 그룹 2(n=10)의 마우스들에게는 시간 0에서 화합물 A(200 ㎕/마우스)를 복막내 투여하고, 2시간 후 LPS(200 ㎕내 2 ㎎/마우스)를 복막내 투여하였다. 그룹 3(n=20)에는 시간 0에서 화합물 A(200 ㎕의 부형제 내의 30 ㎎/㎏)를 복막내 투여하고, 2시간 후 LPS(200 ㎕내 2 ㎎/마우스)를 복막내 투여하였다.

LPS의 투여는 20시간내 90%의 사망률을 유발하였고 투여후 42시간에 100% 사망률을 유발하였다. LPS 투여전 2시간 전에 화합물 A를 투여받은 2 그룹들에서는, LPS 투여후 20시간에 사망률이 25%이었고, LPS 투여후 42시간에는 75%이었으며, LPS 투여후 1주일 경과후에는 사망률이 80%가 되었다. 부형제 처리는 잘 관용되었고 사망을 초래하지는 않았다.

당업자들은 본 발명의 바람직한 구현예의 다양한 변형 및 변화들이 만들어질 수 있고, 이러한 변형 및 변화들은 본 발명의 정신을 벗어나지 않도록 만들어질 수 있다는 사실을 이해할 것이다. 따라서, 첨부한 청구범위는 본 발명의 진정한 정신 및 범위에 포함되는 모든 균등한 변형들을 포함하는 것을 의도한다.

Claims

치료유효량의 하기 화학식으로 표현되는 화합물 A를 포함하는 패혈증성 쇼크, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지성 비염, 피부염, 염증성 장질환 및 자가면역질환을 치료하기 위하여 포유동물의 종양괴사인자 알파의 생산을 억제하기 위한 조성물.
치료유효량의 하기 화학식으로 표현되는 화합물 A를 포함하는 패혈증성 쇼크, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지염 비염, 피부염, 염증성 장질환 및 자가면역질환을 치료하기 위해 포유동물의 종양괴사인자 알파의 과잉 생산의 효과를 개선하기 위한 조성물.
치료유효량의 하기 화학식으로 표현되는 화합물 A를 포함하는 패혈증성 쇼크, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지염 비염, 피부염, 염증성 장질환 및 자가면역질환을 치료하기 위해 포유동물의 인터루킨-1 베타의 과잉 생산을 억제하기 위한 조성물.
치료유효량의 하기 화학식으로 표현되는 화합물 A를 포함하는 패혈증성 쇼크, 류마치스성 관절염, 골관절염, 천식, 기관지염, 만성기도폐색질병, 건선, 알러지염 비염, 피부염, 염증성 장질환 및 자가면역질환을 치료하기 위해 포유동물의 인터루킨-1 베타의 과잉 생산의 해로운 효과를 개선하기 위한 조성물.