CN110833543A - 一种促进慢性脊髓损伤恢复的药物及其制备方法、用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促进慢性脊髓损伤恢复的药物及其制备方法、用途。本发明要解决的技术问题是脊髓损伤的治疗提供一种新选择。本发明的技术方案是一种促进脊髓损伤恢复的药物，其主要活性成分为特异性组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966。本发明揭示了RGFP966治疗通过抑制HDAC3抑制炎症反应、促进抗炎反应、促进轴突再生、促进慢性脊髓损伤后功能恢复的新功能，从而为脊髓损伤修复的免疫调节指明了新的方向。

Description

一种促进慢性脊髓损伤恢复的药物及其制备方法、用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种促进慢性脊髓损伤恢复的药物及其制备方法、用途。
背景技术
脊髓损伤是最严重的疾病之一，会导致严重的后遗症，如瘫痪、剧烈疼痛和进行性神经损伤。脊髓损伤主要是脊髓组织的直接破坏，包括血-脊髓屏障，而继发性损伤的特点是炎症，炎症可能导致反应性胶质增生、水肿和脊髓实质空化[1]。脊髓损伤可分为三个阶段：(1)急性(伤后几秒至几分钟)，(2)继发性(伤后数分钟至数周)，(3)慢性(伤后数月至数年)[2]。现阶段对于脊髓损伤后病症的药物治疗有许多种，但是由于脊髓损伤后炎症的调控机理尚未阐明以及中枢神经系统再生的困难，多为抑制炎症，保护神经和促进神经再生等功能的药物。目前公认有疗效的是甲泼尼龙，在临床大量使用，主要是通过增加损伤脊髓阶段血流量，促进冲动和传导，降低脂质过氧化，减少白质水肿，增加钠/钾-ATP酶活性和对抗继发炎症[3]。
目前这些治疗脊髓损伤的药物，除了甲泼尼松，其他的药物治疗大多局限于动物实验，真正能在临床上实现中枢神经系统再生的药物尚未被发现。即使作为有明确疗效的甲泼尼松治疗，其使用有很大的局限性。甲泼尼松疗法只能用于损伤后8小时的非穿透性急性脊髓损伤。穿透性急性脊髓损伤、损伤后超过8小时的脊髓损伤和慢性脊髓损伤均不适用于甲泼尼松疗法。且对于甲泼尼松的治疗效果近年也有学者提出争议。
发明内容
本发明要解决的技术问题是脊髓损伤的治疗提供一种新选择。
本发明的技术方案是一种促进脊髓损伤恢复的药物，其主要活性成分为特异性组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966，化学式：C21H19FN4O，分子式如下：
Figure BDA0002325939140000021
具体的，所述的脊髓损伤为慢性损伤，所述的慢性损伤为脊髓损伤后时间超过2周。
具体的，所述的药物为静脉注射剂。
本发明还提供了所述药物的制备方法，包括如下步骤：
a、将组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966溶于DMSO，制备便于储存和运输的储存溶液，浓度50～70mg/mL；
b、制备载体溶剂：将30％的羟丙基-β-环状糊精2-Hydroxypropyl-β -cyclodextrin溶于100mM醋酸钠，调节pH至5.6；或，依次将DMSO、PEG300、 Tween、生理盐水混合，终溶液体积比为5％DMSO、40％PEG300、10％Tween 80 和45％生理盐水；现配现用：
c、将药物的储存溶液稀释于载体溶剂中，获得注射溶液，稀释后注射溶液中药物RGFP966的浓度为0.5～2mg/mL。
具体的，步骤b中醋酸钠用生理盐水稀释。
优选的，步骤c中稀释后注射溶液中药物RGFP966的浓度为1mg/mL。
具体的，所述的方法还包括步骤d：将配置好的药物进行静脉注射，每次给予的静脉注射药物用量为：每次每公斤体重所用的
Figure BDA0002325939140000022
Figure BDA0002325939140000023
具体的，步骤d中，对于慢性脊髓损伤，连续每天给予静脉注射药物一次， 7天为一个疗程，每个疗程之间间隔至少7天。
本发明还提供了特异性组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966制备治疗脊髓损伤的药物中的用途。
具体的，所述的脊髓损伤为慢性脊髓损伤，所述的慢性损伤为脊髓损伤后时间超过2周。
脊髓损伤(SCI)后，小胶质细胞和浸润的巨噬细胞的先天免疫反应清除细胞碎片并促进组织修复，但也造成炎症反应的继发性损伤。旨在最大化有益作用同时最小化先天免疫的有害作用的免疫调节可能有助于脊髓损伤后的功能恢复。然而，对于先天免疫细胞中炎症基因网络的全局重编程的细胞内驱动因素知之甚少。本申请显示脊髓损伤后28天，损伤部位中的天然免疫细胞中组蛋白去乙酰化酶3(HDAC3)显著上调。值得注意的是，在慢性脊髓损伤中使用选择性小分子抑制剂RGFP966阻断HDAC3能使小胶质细胞/巨噬细胞的反应偏向于炎症抑制，从而产生神经保护表型并改善慢性脊髓损伤模型的功能恢复。从机制上讲，HDAC3活性在很大程度上负责组蛋白去乙酰化和原代小胶质细胞对经典炎症刺激的炎症反应。本申请揭示了RGFP966治疗通过抑制HDAC3抑制炎症反应、促进抗炎反应、促进慢性脊髓损伤后功能恢复的新功能，从而为脊髓损伤修复的免疫调节指明了新的方向。
成年哺乳动物神经元在中枢神经系统损伤后面临多种功能恢复障碍。早期的研究集中在髓鞘碎片和星形胶质瘢痕的抑制分子上[6,7]；对于构成神经修复的另一个障碍的炎症免疫反应的了解要少得多。脊髓损伤(SCI)触发多相免疫反应。损伤后不久，常驻小胶质细胞被激活，而血源性单核细胞开始渗入损伤部位，分化为吞噬巨噬细胞，通过形态学和细胞表面标记，这些巨噬细胞很大程度上可从激活的小胶质细胞中分离出来。它们共同构成了先天免疫，清除细胞碎片[2]，但它们也释放炎性细胞因子，蛋白酶和游离射线来引发继发性损伤。因此，小胶质细胞/巨噬细胞在脊髓损伤修复中起着双重作用[2]。
M1和M2常被视为损伤部位小胶质细胞/巨噬细胞的两个主要亚群[7]。根据小胶质细胞/巨噬细胞的表型和激活状态，它们不仅可以引发继发性损伤，还可以启动修复。损伤脊髓中小胶质细胞/巨噬细胞的表型和功能是动态的，可以根据脊髓损伤的微环境而变化。据报道，在脊髓损伤后的第一周，M1型(CD86 阳性)和M2型(arginase-1阳性)巨噬细胞在损伤中心共存，但在小鼠损伤后第28天，只有M1型巨噬细胞持续存在。单细胞RNA-Seq分析表明，小胶质细胞经常在单个细胞中同时表达M1和M2的典型标记，或者两者都不表达，而极化标记的表达并不能预测其他极化基因的表达[8]。
不同细胞类型的转录特性是由独特的染色质景观形成的。由于巨噬细胞的激活与基因表达的全局重编程有关，由表观遗传因子调节的染色质结构改变将为转录因子以协调的方式获得大量基因组位点奠定基础。与这一概念一致的是，组蛋白乙酰化参与了巨噬细胞反应[9,10]的调节。组蛋白乙酰化受组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的相反活性调节[9,11]。在四类 HDAC中，I类HDAC(1，2，3和8)主要是核酶，在特定基因组位点上起转录共抑制因子的作用[12]。主要负责调节脊髓损伤后免疫反应的特定HDAC亚型尚不清楚。在这里，本申请确定了脊髓损伤28天后先天性免疫细胞中HDAC3 的显著上调。重要的是，慢性脊髓损伤后给予特异性针对HDAC3的小分子抑制剂RGFP966导致导致神经保护表型和脊髓损伤后功能恢复的改善。
本发明的有益效果：本发明揭示了RGFP966治疗通过抑制HDAC3抑制炎症反应、促进抗炎反应、促进慢性脊髓损伤后功能恢复的新功能，从而为脊髓损伤修复的免疫调节指明了新的方向。本发明中所述药物具有阻断组蛋白去乙酰化酶3、调控内源性免疫反应、促活化小胶质细胞/巨噬细胞转向炎症抑制及神经保护表型、改善脊髓损伤处及周边的微环境、抑制损失环境中的炎症、促进神经元保护和轴突再生、改善急慢性脊髓损伤后的功能恢复。对于急慢性脊髓损伤的治疗均有疗效，在脊髓损伤环境中抑制炎症，促进神经元保护/轴突再生和改善脊髓损伤后的功能恢复。治疗措施方便，仅需静脉注射。
附图说明
图1、急慢性脊髓损伤后hdac3在巨噬细胞/小胶质细胞中的高表达
a、通过T8脊髓背侧束横断手术，矢状面免疫组织化学图像和量化显示损伤后28天(28dpi)病变中心HDAC3(绿色)上调；b、急性脊髓损伤后不同时间点HDAC3的免疫组织化学图像；c、共免疫标记显示慢性脊髓损伤中Cd11b 染色和HDAC3染色的重叠。
图2、RGFP966治疗改善慢性脊髓损伤的功能恢复并增强神经保护表型
a.RGFP966治疗慢性脊髓挫伤的示意图；b.RGFP966治疗后慢性脊髓挫伤的BMS和TMS评分均可改善；c.RGFP966治疗不影响动物体重。
图3、RGFP966治疗促进轴突再生、增强慢性脊髓损伤中的神经保护表型
a：RGFP966治疗后损伤中心轴突纤维密度增加，由NF-H免疫标记(绿色) 确定，***p<0.001,Mann Whitney test,n＝3；b:治疗28天后损伤中心 CSPG/GFAP的表达；c.通过细胞因子阵列测定各组治疗28天后脊髓组织中相对细胞因子/趋化因子水平，***p<0.001,Two-wayANOVA,n＝3；d.治疗28天后各组脊髓组织中抗炎基因的相对表达水平，管家基因为GAPDH。***p<0.001, Two-wayANOVA,n＝3。
具体实施方式
实施例1实验材料及方法
1、实验材料:
1.1药品：RGFP966(由上海意杰生物科技有限公司提供)
1.2动物野生型小鼠(C57BL6，西安交通大学医学部动物实验中学提供)
2、实验方法
2.1脊髓损伤模型制备
脊髓挫伤模型：随机选取4-6周龄野生型小鼠(C57BL6，西安交通大学医学部动物实验中学提供)称量体重后，经异氟醚吸入麻醉。麻醉成功后，剪去术区毛发，取俯卧位，使用碘伏、酒精对术区进行消毒。作背部正中口，逐层切开，钝性分离椎旁肌肉组织并咬除T8-9，充分暴露T8-9节段椎板后，轻轻切除T8-9整个节段，充分暴露T8脊髓。将实验小鼠用棘突夹固定牢后，使用NYU Impactor脊髓损伤打击仪，在椎板切除术后，对脊髓将施加瞬间100kDyn的撞击力，导致组织位移～600μm。每天至少进行两次受伤小鼠的膀胱排空。脊髓背侧束横断模型：用微型剪刀双侧横断脊髓背柱，最大深度约0.8mm。术后立即给予1mL生理盐水及止疼药丁丙诺啡0.05mg/kg，抗生素10mg/kg抗生素贝曲利。
2.2qRT-PCR
小鼠经二氧化碳处死后，提取全脊髓，用QIAGEN RNeasy Micro Kit提取核RNA，然后进行实时定量逆转录-聚合酶链式反应(Quantitative Real Time RT-PCR)。qRT-PCR是用PerfeCTa SYBR Green FastMixRox(QuantaBiosciences) 试剂在ABI 7900HT qPCRsystem(AppliedBiosystems)系统下完成的。Tfrc或 Gapdh作为持家基因(housekeepinggene)。
2.3CytokineArray(细胞因子阵列)
在治疗结束后28天后，提取动物的全脊髓，然后用Illustra triplePrep Kit(GEhealthcare)提取出蛋白质。100μg的蛋白提取液被用于cytokine array(ProteomeProfiler antibody assays-Mouse CytokineArray PanelA,R&D Systems).图像是用 GelDoc XR系统(Bio-Rad)采集，并用ImageJ处理。
2.4免疫组化
小鼠经二氧化碳法处死后，用冰冷多聚甲醛(PFA,Thermo ScientificAC416785000)灌注。从小鼠体内解剖出脊髓损伤中心上下5mm处的组织(总长1厘米)，在4℃多聚甲醛中固定整夜，然后包埋进OCT(Tissue-Tek,Thermo Fisher4585)中。在冰冻切片机上，将脊髓组织按照12μm的厚度切片并收集在载玻片(SuperFrost+slides VWR 48311-703)上，保存在-20℃冰箱中。用1×PBS 洗涤切片，然后用含有5％驴血清和0.3％TritonX-100的封闭缓冲液中室温下孵育1小时，再在加有一抗和0.3％TritonX-100的1％BSA抗体稀释缓冲液中4℃孵育整夜。实验中所用的一抗及其稀释比例如下：山羊抗-CD11b抗体(MyBioSource MBS420973)(1:300)；兔抗-HDAC3抗体(1:100,sc-11417, Santa Cruz)；鸡抗neurofilament-H抗体(NF-H,1:1000,AB5539,Millipore)；绵羊抗-chondroitinsulfate proteoglycan抗体(CSPG,1:100,clone CS56,C8035, Sigma),鸡抗-glialfibrillary acidic protein抗体(GFAP,1:1000,clone GA5, MAB360,Millipore)一抗孵育结束后用AlexaFluor 488-,AlexaFluor 594-, AlexaFluor 647-共价二抗(1:300,Jackson ImmunoResearch)和DAPI孵育1小时。 1×PBS洗涤3次，每次10分钟。在Zeissmicroscopes(AxioCamMRc)显微镜下观片并拍照。
实施例2药物用法用量
用法一：
1、药物制备：
(1)100mg RGFP966溶于2mL DMSO制备储存溶液，浓度50mg/mL
(2)配置载体溶剂，将30％的羟丙基-β-环状糊精(2-Hydroxypropyl-β -cyclodextrin)溶于100mM醋酸钠(Sodium acetate)，调节pH至5.6；载体溶剂也可采用依次将DMSO、PEG300、Tween、生理盐水混合，终溶液体积比为5％DMSO、40％PEG300、10％Tween80和45％生理盐水；现配现用；
(3)按1份储存溶液及49份载体溶液的比例混合，获得注射溶液，RGFP966 浓度为分别为1mg/mL。
2、药物注射：
(1)RGFP966处理组每次给予注射溶液10mL/kg，皮下注射(即RGFP966 用量为10mg/kg)
(2)对照组给予皮下注射载体溶剂，每次为10mL/kg。
用法二：
1、药物制备：
(1)140mg RGFP966溶于2mL DMSO制备储存溶液，浓度70mg/mL
(2)配置载体溶剂，将30％的羟丙基-β-环状糊精(2-Hydroxypropyl-β -cyclodextrin)溶于100mM醋酸钠(Sodium acetate)，调节pH至5.6；载体溶剂也可采用依次将DMSO、PEG300、Tween、生理盐水混合，终溶液体积比为 5％DMSO、40％PEG300、10％Tween80和45％生理盐水；现配现用；
(3)按1份储存溶液及139份载体溶液的比例混合，获得注射溶液， RGFP966浓度为0.5mg/mL。
2、药物注射：
(1)RGFP966处理组每次给予注射溶液20mL/kg，皮下注射(即RGFP966 用量为10mg/kg)
(2)对照组给予皮下注射载体溶剂，每次为10mL/kg。
用法三：
1、药物制备：
(1)120mg RGFP966溶于2mL DMSO制备储存溶液，浓度60mg/mL
(2)配置载体溶剂，将30％的羟丙基-β-环状糊精(2-Hydroxypropyl-β -cyclodextrin)溶于100mM醋酸钠(Sodium acetate)，调节pH至5.6；载体溶剂也可采用依次将DMSO、PEG300、Tween、生理盐水混合，终溶液体积比为 5％DMSO、40％PEG300、10％Tween80和45％生理盐水；现配现用；
(3)按1份储存溶液及29份载体溶液的比例混合，获得注射溶液，RGFP966 浓度为分别为2mg/mL。
2、药物注射：
(1)RGFP966处理组每次给予注射溶液5mL/kg，皮下注射(即RGFP966 用量为10mg/kg)
(2)对照组给予皮下注射载体溶剂，每次为10mL/kg。
实施例3急慢性脊髓损伤后HDAC3在巨噬细胞/小胶质细胞中的高表达
首先通过免疫组织化学检测脊髓损伤28天(28dpi)时HDAC3的表达动态。在脊髓损伤背侧束横断的体内模型中，发现在损伤后28天在病变中心有一个显著的HDAC3高表达(图1a)。时间分析表明，HDAC3上调在2dpi时可检测到，在14dpi达到峰值，并且持续到28dpi轻微减弱(图1b)。在慢性脊髓损伤中，当用CD11b(中枢神经系统中小胶质细胞和单核细胞来源的炎性巨噬细胞的细胞表面标记)覆盖时，HDAC3在CD11b阳性细胞的细胞核中显著上调(图1c)。因此，不同的I类HDAC似乎在脊髓损伤后的不同细胞类型中受到差异调节。HDAC3和IBA1共同免疫染色证实了慢性脊髓损伤中先天免疫细胞中HDAC3 的诱导，损伤部位的大多数Iba1阳性细胞显示出明显的核HDAC3免疫信号，类似于CD11b阳性细胞。
实施例4RGFP966抑制HDAC3可改善慢性脊髓损伤的功能恢复
首先通过重度挫伤脊髓损伤模型(打击值120kDyn)造模，在损伤后28天就获得慢性脊髓损伤模型，对于慢性脊髓损伤的小鼠，治疗组连续7天给予 RGFP966(10mg/kg，每天两侧，皮下注射)，对照组给予同等量盐水，每组6 只野生型小鼠(C57BL6，脊髓损伤造模时6-8周龄，体重20-25克，全为母鼠)，在随后的28天(命名为daypost treatment，即dpt，7天疗程结束当天为0dpt)，每4天使用Basso小鼠评分(BMS)和Toyama小鼠评分(TMS)测量运动恢复 (图2a)。0-9分BMS评分提供了后肢运动恢复的量度，评分3反映动物能够支撑自己体重的阈值，超过3分主要反映提高的步频和一致性。TMS是一种改进的评分系统，强调后肢躯干支持。TMS考虑到踝关节的移动，以及膝盖、大腿和脚趾的移动，这些在BMS中是不会被观察到的。相对于BMS，TMS提供更低的变化和更高的灵敏度。
在1dpt时，RGFP966和安慰剂处理的队列中的SCI动物表现出较低的BMS 和TMS评分，证实了相似的损伤程度(图2b)。随后，通过BMS和TMS评分， RGFP966处理的动物显示出比对照组更好的后肢运动恢复(p<0.001，双向方差分析，图2b)。具体地说，在7dpt时，RGFP966处理队列中的小鼠通过BMS 评分开始表现出改善的后肢功能。RGFP966的作用维持在28dpt，RGFP966队列达到BMS评分在6到8之间(重力负荷)，而对照队列的BMS评分保持在4以下(图2b)。未观察到RGFP966对动物健康(包括体重)的明显不良影响(图 2c)。
实施例5RGFP966治疗增强慢性脊髓损伤中的神经保护表型
为了进一步研究RGFP966对慢性脊髓损伤功能恢复的有益作用的基础，通过比较挫伤后损伤核心中轴突纤维的数量来评估抑制HDAC3对神经保护表型的影响。在28dpt，RGFP966处理的动物在病变中心显示出明显高于对照组小鼠的NF-H轴突纤维密度(p<0.01，图3a)。考虑到检查点是脊髓损伤后的72天，这一发现可能反映了轴突的再生，而不是轴突的保存。小胶质细胞/巨噬细胞也可以影响成纤维细胞和胶质细胞的功能状态，例如通过表达基质降解酶 MMP-1328来调节瘢痕成分中的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)。因此，我们比较了损伤部位纤维胶质瘢痕的大小和构成。实验发现，在RGFP966治疗组中，CSPG 的表达减少(p＝0.028，MannWhitneytest)，而纤维连接蛋白水平的变化似乎更温和，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP)无显著变化(图3b)。两个队列之间星形胶质瘢痕的相对大小也是可比较的。值得注意的是，通过这些措施，挫伤导致纤维胶质瘢痕的变异性很大，从而影响了统计值。
为了进一步了解RGFP966广泛抑制细胞因子图谱的基础，研究了HDAC3 抑制是否会影响巨噬细胞/小胶质细胞炎症基因的转录。对慢性脊髓损伤的全脊髓组织裂解物提取蛋白的proteome profiler assay分析显示两个队列之间有明显差别，RGFP966治疗组比对照组表现出更强的抗炎因子分泌，同时更低的促炎因子分泌(图3c)，这可能反映了抑制HDAC3对促进小胶质细胞/巨噬细胞抗炎反应的有效作用。通过转录分析，发现HDAC3抑制导致免疫相关基因的广泛抑制(p<0.01，图3d)。根据细胞因子/趋化因子抗体阵列数据，与M1状态(例如 iNOS，Ciita(MHCII)收到控制和M2状态(CD163，Arg1，Vim)相关的基因的表达有增强，进一步支持广泛的炎症抑制。细胞表面标记的表达与IHC结果总体上一致：例如，ITGAM(CD11b)转录水平与RGFP966没有变化。
参考文献
[1]Fleming JC,Norenberg MD,Ramsay DA,et al.The cellular inflammatoryresponse inhuman spinal cords after injury[J].Brain,2006.
[2]Zhou X,He X,Ren Y.Function ofmicroglia and macrophages insecondary damage after spinal cord injury[J].中国神经再生研究(英文版),2014.
[3]Cayli SR,Kocak A,Yilmaz U,et al.Effect of combined treatment withmelatonin and methylprednisolone on neurological recovery after experimentalspinal cord injury[J].European Spine Journal,13(8):724-732.
[4]Mcgee,A.W.and S.M.Strittmatter,The Nogo-66receptor:focusing myelininhibition ofaxonregeneration.Trends inNeurosciences,2003.26(4):p.193-198.
[5]Kuboyama,T.,Wahane,S.,Huang,Y.,Zhou,X.,Wong,J.K.,& Koemeter-Cox,A.,et al.(2017).Hdac3 inhibition ameliorates spinal cord injury byimmunomodulation.Scientific Reports,7(1),8641.)
[6]Silver,J.,CNS regeneration:only on one condition.Current BiologyCb, 2009.19(11):p.R444-R446.
[7]Gordon,S.and F.O.Martinez,Alternative Activation of Macrophages:Mechanism andFunctions.Immunity,2010.32(5):p.593-604.
[8]Morganti,J.M.,L.K.Riparip,and S.Rosi,Call Offthe Dog(ma):M1/M2Polarization Is Concurrent following Traumatic Brain Injury.Plos One,2016.11(1): p.e0148001.
[9]Grabiec,A.M.,et al.,Histone deacetylase inhibitors suppressinflammatory activation ofrheumatoid arthritis patient synovial macrophagesand tissue.Journal of Immunology,2010.184(5):p.2718.
[10]Edwige,N.,et al.,Suppression of inflammation by a synthetichistone mimic.Nature,2010.468(7327):p.1119-1123.
[11]Mullican,S.E.,et al.,Histone deacetylase 3 is an epigenomic brakein macrophage alternative activation.Genes&Development,2011.25(23):p.2480-8.
[12]Kigerl,K.A.,et al.,Identification of two distinct macrophagesubsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regenerationin the injured mouse spinal cord.Journal ofNeuroscience,2009.29(43):p.13435-13444。

Claims (10)

1.一种促进脊髓损伤恢复的药物，其特征在于：其主要活性成分为特异性组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966，化学式：C21H19FN4O，分子式如下：
Figure FDA0002325939130000011
2.如权利要求1所述的促进脊髓损伤恢复的药物，其特征在于：所述的脊髓损伤为慢性损伤，所述的慢性损伤为脊髓损伤后时间超过2周。
3.如权利要求1或2所述的促进脊髓损伤恢复的药物，其特征在于：所述的药物为静脉注射剂。
4.促进脊髓损伤恢复的药物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
a、将组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966溶于DMSO，制备便于储存和运输的储存溶液，浓度50～70mg/mL；
b、制备载体溶剂：将30％的羟丙基-β-环状糊精2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin溶于100mM醋酸钠，调节pH至5.6；或，依次将DMSO、PEG300、Tween、生理盐水混合，终溶液体积比为5％DMSO、40％PEG300、10％Tween 80和45％生理盐水；现配现用：
c、将药物的储存溶液稀释于载体溶剂中，获得注射溶液，稀释后注射溶液中药物RGFP966的浓度为0.5～2mg/mL。
5.如权利要求4所述的促进脊髓损伤恢复的药物的制备方法，其特征在于：步骤b中醋酸钠用生理盐水稀释。
6.如权利要求4或5所述的促进脊髓损伤恢复的药物的制备方法，其特征在于：步骤c中稀释后注射溶液中药物RGFP966的浓度为1mg/mL。
7.如权利要求6所述的促进脊髓损伤恢复的药物的制备方法，其特征在于：所述的方法还包括步骤d：将配置好的药物进行静脉注射，每次给予的静脉注射药物用量为：
Figure FDA0002325939130000021
8.如权利要求7所述的促进脊髓损伤恢复的药物的制备方法，其特征在于：步骤d中，对于慢性脊髓损伤，连续每天给予静脉注射药物一次，7天为一个疗程，每个疗程之间间隔至少7天。
9.特异性组蛋白去乙酰化酶3抑制剂RGFP966制备促进脊髓损伤恢复的药物中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的脊髓损伤为慢性脊髓损伤，所述的慢性损伤为脊髓损伤后时间超过2周。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018132391A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods using an epigenetic inhibitor
WO2019032652A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Children's Hospital Medical Center METHODS OF TREATING DISEASES AND NERVE INJURIES
CN109513005A (zh) * 2018-11-16 2019-03-26 南京昂科利医药科技创新研究院有限公司 一种治疗ags的药物作用靶点

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018132391A1 (en) * 2017-01-10 2018-07-19 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods using an epigenetic inhibitor
WO2019032652A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 Children's Hospital Medical Center METHODS OF TREATING DISEASES AND NERVE INJURIES
CN109513005A (zh) * 2018-11-16 2019-03-26 南京昂科利医药科技创新研究院有限公司 一种治疗ags的药物作用靶点

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