TW201929871A - 神經系統疾患治療劑 - Google Patents

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Abstract

本發明之課題係提供一種於治療神經系統疾患有用之藥劑。本發明之以維生素B12作為有效成分之藥劑具有促進M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、抑制M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、神經再生促進作用等，並且該藥劑作為神經系統疾患，尤其是作為腦梗塞、失智症、脊髓損傷等中樞神經系統疾患之治療劑非常有用。

Description

神經系統疾患治療劑
本發明係關於一種神經系統疾患治療劑等。
神經系統疾患為發生於腦、脊髓、末梢神經、肌肉之疾患。其中，發生於腦、脊髓之疾患稱為中樞神經系統疾患。發生於腦之中樞神經系統疾患之代表例為腦梗塞、失智症等。又，發生於脊髓之中樞神經系統疾患之代表例為脊髓損傷等。
在日本平成26年1年間屬於死因第4位之腦血管障礙中，腦梗塞占約6成，係在罹患後有高可能性需要看護，且在醫療費用方面亦對社會帶來重大影響之疾患。腦梗塞之範圍分為血流完全被阻斷之缺血核心區(ischemic core，亦只稱為核(core))及藉由側枝循環(collateral circulation)獲得血流之周邊部半影區(penumbra、半影帶)。由於核部分的神經細胞快速死亡(1次損傷)，導致難以挽救該部分，而半影區部分係細胞免於死亡的部分，因此有存活的可能性，故，如何挽救該部分成為腦梗塞急性期治療之重點。就腦梗塞病變部組織學的變化而言，係發生(1)神經細胞之細胞凋亡、(2)引起炎症、(3)腦血管障壁(BBB)崩解等。於日本國目前使用之腦梗塞治療藥除了尿激酶或抗凝血/抗血小板劑之外，還有將血液稀 釋、減輕浮腫之藥劑等。就除去自由基之藥劑而言，雖然日本國於2001年核准依達拉奉(Edaravone)(商品名：拉迪卡(Radicut))，惟，於歐美等國並未核准。從2005年起核准血栓溶解療法(t-PA)，惟，只限定在發病起4.5小時以內使用。據此，目前現狀為從2005年以後未出現新的腦梗塞治療藥。
於日本國，已報導一年間有約5000人發生新的脊髓損傷案例，因疼痛、麻痺、運動機能障礙等成為導致生活品質(QOL)大幅降低之原因。脊髓損傷之病態藉由受傷時之直接外力所致之神經細胞或血管組織持續受損(一次損傷)，藉由伴隨著血液脊髓障壁破綻所引起的一連串反應(二次損傷)導致損傷範圍擴大。一次損傷係無法避免者，因此在急性期至亞急性期脊髓損傷治療中重要的是如何減輕二次損傷。惟，於目前臨床上不存在可對急性期脊髓損傷安全使用之有效治療藥，以往使用之甲基培尼皮質醇(methylprednisolone)大量療法亦因其嚴重的副作用，於美國之急性期脊髓損傷治療指南已明確記載已『不應該常規使用』，因此，對於脊髓損傷而言，殷切期望著有效的新穎治療藥。
末梢神經雖然具有損傷後之再生能力，但稱不上充分回復神經機能。神經損傷時，藉由華勒氏變性(Wallerian Degeneration)而將軸突及髓鞘吞噬清除。接著，於再生過程中，再生軸突在由未分化之許旺式細胞(Schwann cell)形成之賓格內氏帶(Bungner’s band)內向遠位方向伸長，引起成為目標之肌肉再神經化。最終，藉由將再生軸突周圍包圍之許旺式細胞形成髓鞘。惟，再生神經之伸長速度非常慢，在到達成為目標之肌肉的距離長之情況下，會產生肌肉萎縮而變得不能期望充分的功能回復。此 外，近年來注目的是於上述再生過程之各階段中，巨噬細胞擔任重要的角色。已知巨噬細胞有引起炎症之作用，相對的，也具有抗炎症性作用之表現型，分別稱為M1型、M2型，並且推測其表現型之間有連續性(發生M1-M2間之轉移)。因此，通常將增加屬於抗炎症性表現型之M2巨噬細胞者稱為促進神經再生。
另一方面，已知中樞神經比末梢神經缺乏再生能力。已知中樞神經損傷後，在寡樹突膠細胞(Oligodendrocytes)發現軸突伸展阻礙物質，該寡樹突膠細胞係在軸突周圍形成髓鞘之細胞，又，巨噬細胞/小神經膠質細胞、星形膠質細胞(Astrocytes)等形成膠質瘢痕而進行抑制軸突伸展之作用。因此，於中樞神經損傷後，亦重要的是抑制巨噬細胞/小神經膠質細胞之炎症作用，與末梢神經相同地，將增加屬於抗炎症性表現型之M2巨噬細胞/小神經膠質細胞者稱為促進神經再生。
維生素B12於治療維生素B12缺乏症有效，已知維生素B12缺乏症亦會引起稱為末梢神經炎、脊髓變化之神經學變化(專利文獻1)。
又，相較於健康者，腦缺血病患係血中之升半胱胺酸濃度變高，暗示血中之升半胱胺酸濃度與腦缺血之關連性。再者，已知藉由投予葉酸、維生素B6、B12，而可減少血中之升半胱胺酸濃度，暗示升半胱胺酸濃度降低有降低腦缺血之風險之可能性(非專利文獻1)。
再者，已知活化素類藉由誘導M2巨噬細胞而顯示抗炎症作用(專利文獻2)，含有源自脂肪組織之間質幹細胞之免疫抑制劑顯示M2巨噬細胞誘導作用(專利文獻3)。
惟，未揭示藉由維生素B12促進M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導、抑制M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導及改善腦梗塞等神經疾患。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表第2016-513694號公報
[專利文獻2]國際公開第2011/149036號公報
[專利文獻3]國際公開第2011/043136號公報
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Current Medicinal Chemistry, 2007, Vol. 14, No. 3, p249-263
本發明以提供一種神經系統疾患治療劑為課題。較佳的是，本發明的課題係提供一種神經系統疾患治療劑，其係具有選自由抑制細胞凋亡作用、抑制壞死作用、促進軸突伸展作用、促進M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、抑制M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用及促進神經再生作用構成之群組中之至少一種。
本發明人等有鑑於上述課題，進行深入研究，結果發現維生素B12具有神經系統疾患治療效果。進一步發現維生素B12具有抑制細胞 凋亡作用、抑制壞死作用、促進軸突伸展作用、促進M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、抑制M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、促進神經再生作用等。以此等見解為基礎，進一步進行研究而完成本發明。
亦即，本發明包含下述態樣：
項1.一種神經系統疾患治療劑，係含有維生素B12。
項1A.一種神經系統疾患之治療方法，係包含對必須接受神經系統疾患治療之病患投予維生素B12。
項1B1.一種維生素B12，係用於神經系統疾患的治療。
項1B2.一種含有維生素B12之組成物，係用於神經系統疾患的治療。
項1C.一種維生素B12之用途，係用以製造神經系統疾患治療劑。
項2.如項1所述之神經系統疾患治療劑，其係M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進劑。
項3.如項1所述之神經系統疾患治療劑，其係M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制劑。
項4.如項1至3中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係神經再生促進劑。
項5.如項1至4中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述神經系統疾患係中樞神經系統疾患。
項6.如項5所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述中樞神經系統疾患係腦血管疾患。
項7.如項6所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述腦血管疾患係選自由腦梗塞、腦出血、腦血栓症、腦動脈硬化症及失智症構成之群組中之至少一種。
項8.如項1至4中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述神經系統疾患係神經損傷。
項9.如項8所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述神經損傷係中樞神經損傷。
項10.如項9所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述中樞神經損傷係脊髓損傷。
項11.如項1至10中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述維生素B12係選自由甲基鈷胺素、氰鈷胺素、羥鈷胺素、硫化鈷胺素、腺嘌呤鈷胺素及此等之鹽構成之群組中之至少1種。
項12.如項1至11中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，上述維生素B12係甲基鈷胺素。
項13.如項1至12中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係持續性地投予使用者。
項14.如項13所述之神經系統疾患治療劑，其係點滴静脈注射用製劑。
項15.如項1至14中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係以從發病起經過12至24小時後開始投予之方式使用者。
項16.如項1至14中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係以從剛發病起12小時以內開始投予之方式使用者。
第1圖表示實施例1之TUNEL分析結果。縱軸表示細胞凋亡比例。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+)無(-)。**表示藉由Tukey-Kramer法統計分析之結果，p值未達0.01。
第2圖表示實施例2之LDH分析結果。縱軸表示相對於成為壞死指標之LDH活性的高度控制比例。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(10μM)無(-)。*表示藉由學生T檢定法(Student T test)統計分析之結果，p值未達0.05。
第3圖表示實施例3之神經突起伸展分析結果。縱軸表示30個以上神經軸突之平均值。橫軸表示添加之藥劑之濃度(CTR為未添加)。*表示相對於CTR，藉由杜納檢定法(Dunnettest)統計分析之結果，p值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01。
第4圖表示實施例4之TTC染色結果。縱軸表示梗塞體積。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(MeCbl)無(對照(Control))。**表示藉由學生T檢定法統計分析之結果，p值未達0.01。
第5圖表示實施例5之西方墨點法之結果。縱軸表示M1標記(左圖：IL-1β蛋白質、右圖：iNOS蛋白質)量相對於GAPDH蛋白質量之比。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。*表示藉由杜納檢定法統計分析之結果、，值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01。
第6圖表示實施例5之西方墨點法之結果。縱軸表示M2標記(左圖：Arginase I(Arg1)蛋白質、右圖：CD206蛋白質)量相對於GAPDH蛋白質 量之比。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。*表示藉由杜納檢定法統計分析之結果，p值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01。
第7圖表示實施例5之免疫組織學評估之結果。縱軸表示左圖：M1巨噬細胞之比例(iNOS陽性細胞之比例)、右圖：M2巨噬細胞之比例(Arg1陽性細胞之比例)。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。**表示藉由杜納檢定法統計分析之結果，p值未達0.01。
第8-1圖表示實施例6之西方墨點法之結果。縱軸表示磷酸化AKT蛋白質量相對於AKT蛋白質量之比。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。*表示藉由Tukey-Kramer法統計分析之結果，p值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01，***表示同結果之p值未達0.001。
第8-2圖表示實施例6之西方墨點法之結果。縱軸表示磷酸化4EBP1蛋白質量相對於4EBP1蛋白質量之比。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。*表示藉由Tukey-Kramer法統計分析之結果，p值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01，***表示同結果之p值未達0.001。
第8-3圖表示實施例6之西方墨點法之結果。縱軸表示磷酸化S6K蛋白質量相對於S6K蛋白質量之比。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。*表示藉由Tukey-Kramer法統計分析之結果，p值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01，***表示同結果之p值末達0.001。
第9圖表示實施例7之免疫組織學評估之結果。各列之圖從左側起表示近位2.5mm、損傷部位、遠位2.5mm、遠位5.0mm、遠位7.5mm之結果。縱軸於上段之圖表示巨噬細胞數、中段之圖表示M1巨噬細胞數、下段之圖表示M1巨噬細胞比例。橫軸表示坐骨神經損傷後之經過日數。CTR 表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群，Sham表示只進行坐骨神經展開之非損傷群。*表示藉由Tukey-Kramer法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05，#表示藉由學生T檢定法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05。
第10圖表示實施例7之免疫組織學評估之結果。各列之圖從左側起表示近位2.5mm、損傷部位、遠位2.5mm、遠位5.0mm、遠位7.5mm之結果。縱軸於上段之圖表示巨噬細胞數，中段之圖表示M2巨噬細胞數，下段之圖表示M2巨噬細胞比例。橫軸表示坐骨神經損傷後之經過日數。CTR表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群，Sham表示只進行坐骨神經展開之非損傷群。*表示藉由Tukey-Kramer法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05，#表示藉由學生T檢定法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05。
第11圖表示實施例8之免疫組織學評估之結果。縱軸於上段之圖表示軸突數，中段之圖表示髓鞘化軸突數，下段之圖表示髓鞘化率。橫軸表示製作出神經橫切面切片之位置(從左側起為近位2.5mm、損傷部位、遠位2.5mm、遠位5.0mm、遠位7.5mm)。CTR表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群，Sham表示只進行坐骨神經展開之非損傷群。*表示藉由Tukey-Kramer法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05。
第12圖表示實施例9之BBB評分測定之結果。縱軸表示BBB評分。橫軸表示製作脊髓損傷模型之手術後之經過日數(0為手術前)。CTR表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群，Sham表示只進行坐骨神經展開 之非損傷群。*表示藉由Steel-Dwass試驗法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值表示未達0.05。
第13圖表示實施例9之熱痛覺計測試(Thermal algesimetry試驗)之結果。縱軸表示對右腳底給予紅外線熱刺激到因為熱而拉回後腳為止之時間。橫軸表示製作脊髓損傷模型之手術後之經過日數(0為手術前)。CTR表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群，Sham表示只進行坐骨神經展開之非損傷群。*表示藉由Steel-Dwass試驗法統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05。
第14圖表示實施例10之M1標記(IL-1β蛋白質及iNOS蛋白質)之西方墨點法之結果。縱軸表示M1標記(IL-1β蛋白質或iNOS蛋白質)量相對於GAPDH蛋白質量之比。橫軸表示添加之藥劑之種類及有(+或濃度)無(-)。*表示藉由杜納檢定法統計分析之結果，p值未達0.05，**表示同結果之p值未達0.01。
第15圖表示實施例10之M2標記(Arg1蛋白質及CD206蛋白質)之西方墨點法之結果。縱軸、橫軸、各符號與第14圖相同。
第16圖表示實施例11之術後7日的免疫螢光染色之結果。各圖表表示由部位產生之變化。各圖之橫軸表示從損傷部位算起之方向及距離。縱軸於上段之圖表示巨噬細胞數，中段之圖表示M1或M2巨噬細胞數，下段之圖表示M1或M2巨噬細胞比例。CTR表示未治療群、MeCbl表示甲基鈷胺素投予群。*表示藉由Mann Whitney U試驗之統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05，**表示p值未達0.01。
第17圖表示實施例11之術後14日免疫螢光染色之結果。其他與第16圖相同。
第18圖表示實施例11之術後28日免疫螢光染色之結果。其他與第16圖相同。
第19圖表示實施例11之關於M1巨噬細胞之免疫螢光染色之結果。各圖表示由術後之經過日數產生之變化。各列之圖從左側起表示關於從損傷部位算起之方向及距離，頭側2mm、頭側1mm、尾側1mm、尾側2mm之結果。縱軸於上段之圖表示巨噬細胞數，中段之圖表示M1巨噬細胞數，下段之圖表示M1巨噬細胞比例。橫軸表示製作脊髓損傷模型之手術後之經過日數。CTR表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群。*表示藉由Mann Whitney U試驗之統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05，**表示p值未達0.01。
第20圖表示實施例11之關於M2巨噬細胞免疫螢光染色之結果。其他與第19圖相同。
第21圖表示實施例11之關於M1/M2比之免疫螢光染色之結果。各圖表示由術後之經過日數產生之變化。從左側起表示關於從損傷部位算起之方向及距離，頭側2mm、頭側1mm、尾側1mm、尾側2mm之結果。縱軸表示M1/M2比。橫軸表示製作脊髓損傷模型之手術後之經過日數。CTR表示未治療群、MeCbl表示甲基鈷胺素投予群。*表示藉由Mann Whitney U試驗之統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05，**表示p值未達0.01。
第22圖表示實施例11之關於M1/M2比之免疫螢光染色之結果。各圖表示藉由部位之變化。從左側起表示製作脊髓損傷模型之手術後經過7日、14日、28日後之結果。縱軸表示M1/M2比。橫軸表示製作脊髓損傷模型之手術後之經過日數。橫軸表示從損傷部位算起之方向及距離。CTR表示未治療群、MeCbl表示甲基鈷胺素投予群。*表示藉由Mann WhitneyU試驗之統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.05，**p值表示未達0.01。
第23圖表示實施例12之旋轉滾輪測試之結果。橫軸表示腦梗塞術後之經過日數，縱軸表示至從旋轉滾輪掉落之時間之相對值。CTR表示未治療群，MeCbl表示甲基鈷胺素投予群。**表示藉由Mann Whitney U試驗統計分析(CTR v.s.MeCbl)之結果，p值未達0.01。
於本專利申請，關於「含有」及「包含」之表現，包含「含有」、「包含」、「實質上包含」及「僅包含」之概念。
於本專利申請，「巨噬細胞/小神經膠質細胞」係指「巨噬細胞及/或小神經膠質細胞」，為包含「巨噬細胞及小神經膠質細胞」之意、「巨噬細胞或小神經膠質細胞」之意雙方之用語。
於本發明之一態樣中，係關於含有維生素B12之神經系統疾患治療劑、細胞凋亡抑制劑、壞死抑制劑、軸突伸展促進劑、M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進劑、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制劑、神經再生促進劑等(於本說明書亦有以「本發明之劑」表示)。以下，針對此等加以說明。
1.有效成分
維生素B12包含鈷胺素、其衍生物及此等之鹽。維生素B12具體而言可列舉：鈷胺素、鈷胺素之鈷離子經置換者及此等之衍生物。更具體之例可列舉：甲基鈷胺素、氰鈷胺素、羥鈷胺素、硫化鈷胺素、腺嘌呤鈷胺素、此等之鹽等。此等中較佳為甲基鈷胺素、氰鈷胺素、羥鈷胺素及此等之鹽，更佳為甲基鈷胺素及其鹽。
鈷胺素及其衍生物之鹽只要是藥學上容許之鹽即可，並無特別限制，酸性鹽、鹼性鹽皆可採用。例如，酸性鹽之例可列舉：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；乙酸鹽、丙酸鹽、酒石酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽等有機酸鹽；天冬胺酸鹽、麩胺酸鹽等胺基酸鹽等。又，鹼性鹽之例可列舉：鈉鹽、鉀鹽等鹼金屬鹽；鈣鹽、鎂鹽等鹼土金屬鹽等。
維生素B12亦可為溶劑化物之形態。溶劑只要是藥學上容許者即可，並無特別限制，可列舉例如：水、乙醇、丙三醇、乙酸等。
維生素B12可單獨使用1種，亦可將2種以上之組合。
2.用途
維生素B12具有治療神經系統疾患之效果。因此，維生素B12可利用為神經系統疾患治療劑之有效成分。
維生素B12具有細胞凋亡抑制作用、壞死抑制作用、軸突伸展促進作用、促進M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、抑制M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導作用、促進神經再生作用等。因此，維生素B12可利用為細胞凋亡抑制劑、壞死抑制劑、軸突伸展促進劑、M2巨噬細胞/ 小神經膠質細胞誘導促進劑、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制劑、M1：M2比(M1巨噬細胞/小神經膠質細胞相對於M2巨噬細胞/小神經膠質細胞之比)抑制劑、神經再生促進劑等之有效成分。
進一步，維生素B12可利用為神經系統疾患治療劑之一較佳態樣之有效成分，亦即，利用為以選自由細胞凋亡抑制作用、壞死抑制作用、軸突伸展促進作用、M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進作用、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制作用及神經再生促進作用構成之群組中之至少一種為基礎之神經系統疾患治療劑之有效成分。
神經系統疾患並無特別限制，包含中樞神經系統疾患、末梢神經系統疾患。中樞神經系統疾患可列舉例如腦血管疾患、神經損傷等。
腦血管疾患可列舉腦梗塞、腦出血、腦血栓症、腦動脈硬化症、失智症等。
神經損傷可為末梢神經損傷及中樞神經損傷中之任一種。中樞神經損傷亦包含脊髓損傷。神經損傷之原因亦無特別限制，由外傷、石膏壓迫、電撃傷、椎間盤突出、放射線暴露等各種原因引起之神經損傷成為適用對象。又，成為適用對象之神經損傷之程度亦無特別限制，軸突雖被保留但發生脫髓鞘之情況、伴隨華勒氏變性(Wallerian degeneration)之情況、神經於解剖學斷裂之情況等之任一種情況皆成為適用對象。又，亦包含神經損傷中伴隨損傷之各種症狀，例如於受到損傷之神經支配領域之運動障礙(上下肢的運動麻痺/肌力降低等)、感覺障礙(感覺遲鈍、麻、疼痛等)、自律神經障礙(發汗異常、皮膚顏色變化)等。
神經系統疾患較佳為以選自由細胞凋亡抑制作用、壞死抑制作用、軸突伸展促進作用、M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進作用、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制作用及神經再生促進作用構成之群組中之至少一種為基礎而可治療之神經系統疾患。
本發明之劑只要在含有維生素B12(於本說明書中亦有只稱為「有效成分」之情況)的限制下則無特別限制，因應所需亦可含有其他成分。其他成分只要是藥學上容許之成分即可，並無特別限制。其他成分除了具有藥理作用之成分之外亦含有添加劑。添加劑可列舉例如：基劑、載體、溶劑、分散劑、乳化劑、緩衝劑、穩定劑、賦形劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、增黏劑、保濕劑、著色料、香料、螯合劑等。
此外，單獨使用維生素B12即可發揮神經系統疾患治療效果、細胞凋亡抑制作用、壞死抑制作用、軸突伸展促進作用、M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進作用、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制作用(此外，未否認具有從M1巨噬細胞/小神經膠質細胞轉移到M2巨噬細胞/小神經膠質細胞之作用)、神經再生促進作用等。因此，本發明之劑即使未含有具有此等效果及/或作用之其他成分，亦可發揮所期待之效果，惟，亦可含有具有藥理作用之其他成分。
本發明之劑之使用態樣並無特別限制，可因應其種類採用適當之使用態樣。本發明之劑係因應其用途，而例如可於體外(in vitro)使用(例如，添加於培養細胞之培養基中)，亦可於體內(in vivo)使用(例如，對動物投予)。
本發明之劑之適用對象並無特別限制，於哺乳動物可列舉例如：人類、猴子、小鼠、大鼠、狗、貓、兔子、豬、馬、牛、羊、山羊、鹿等。又，細胞可列舉動物細胞等。細胞之種類亦無特別限制，可列舉例如：血液細胞、造血幹細胞/前驅細胞、配偶子(精子、卵子)、線維母細胞、上皮細胞、血管內皮細胞、神經細胞、肝細胞、角質形成細胞、肌肉細胞、表皮細胞、內分泌細胞、ES細胞、iPS細胞、組織幹細胞、癌細胞等。
本發明之劑可採用任意之劑型，例如：錠劑(包含口腔內崩解錠、咀嚼錠、發泡錠、口含錠劑、軟糖劑等)、丸劑、顆粒劑、細粒劑、散劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、乾糖漿劑、液劑(包含飲料劑、懸濁劑、糖漿劑)、果凍劑等經口製劑型態或注射用製劑(例如，點滴注射劑(例如，點滴靜脈注射用製劑等)、靜脈注射劑、肌肉注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑)、外用劑(例如，軟膏劑、泥敷劑、洗劑)、栓劑、吸入劑、眼劑、眼軟膏劑、點鼻劑、點耳劑、微脂體劑等非經口製劑型態。
本發明之劑之投予路徑只要可獲得所期待之效果則無特別限制，可列舉：經口投予、經管營養、灌腸投予等經腸投予、經靜脈投予、經動脈投予、肌肉內投予、心臓內投予、皮下投予、皮內投予、腹腔內投予等非經口投予等。
本發明之劑中有效成分之含量係受使用態樣、適用對象、適用對象之狀態等左右，並無特別限制，可為例如0.0001至100重量%，較佳為0.001至50重量%。
對動物投予本發明之劑時之投予量只要能表現藥效之有效量則無特別限制，通常，就有效成分之重量而言，於通常經口投予時每日 為0.1至1000mg/kg體重，較佳為0.5至500mg/kg體重，於非經口投予時每日為0.01至100mg/kg體重，較佳為0.05至50mg/kg體重。上述投予量可依年齡、病態、症狀而適當地增減。
本發明之劑從可更有效地發揮M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進作用、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制作用、神經再生促進作用等之觀點而言，較佳為持續地投予使用。藉此，可將作用於投予對象內細胞(例如，神經系統疾患患部之細胞，較佳為巨噬細胞/小神經膠質細胞)之有效成分濃度維持在可適合M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進作用、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制作用、神經再生促進作用發揮之濃度(例如，5nM至100μM，較佳10nM至50μM，更佳20nM至10μM，更佳50nM至5μM，最佳100nM至1μM)，可更有效地發揮此等作用。又，本發明之劑雖取決於適用對象，惟，較佳為點滴注射劑，更佳為點滴静脈注射用製劑。
本發明之劑之投予時機並無特別限制。
作為一例，本發明之劑係以從發病起經過例如12至24小時後開始投予之方式使用。發病為可確認其疾患之症狀或發生該症狀之直接要因之時間點，例如，只要是腦梗塞等缺血性腦血管疾患時，為缺血部位之產生時間點。由於本發明之劑可作用於從產生缺血部位起在相對較晚之時刻起作用之修復機構(M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進作用、M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制作用、神經再生促進作用)，因此應用於腦梗塞等缺血性腦血管疾患時，即使於上述時刻(從發病起12至24小時後)投予亦可發揮治療效果。
作為另一例，本發明之劑係以於神經損傷(較佳為脊髓損傷)等神經系統疾患之急性期(例如，剛發病至發病起12小時內)開始進行投予之方式使用。發病為可確認其疾患之症狀或生該症狀直接要因之時間點，例如，只要是脊髓損傷等神經損傷時，即為神經產生損傷之時間點。
[實施例]
以下，依據實施例對本發明更詳細地進行說明，惟，本發明不限定於此等實施例。
實施例1.大腦皮質神經細胞之細胞凋亡抑制作用
使用甲基鈷胺素，以TUNEL分析調查大腦皮質神經細胞之細胞凋亡抑制作用。
<實施例1-1.大腦皮質神經之調製>
大腦皮質神經係依照通常使用之方法採取並培養。從Sprague Dawley(SD)大鼠(懷孕第18天)之胎兒切離大腦皮質，回收於含有10%牛胎兒血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素(penicillin/streptomycin)，經冰冷之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM))。除去軟膜及血管，移至DMEM(未添加FBS，含有1%盤尼西林/鏈黴素)，以剪刀剪成1mm大小。於細胞混合液中添加木瓜蛋白酶(最終濃度2mg/ml)，於37℃進行反應30分鐘。添加Dnase I(70U/ml)，於反應30秒後加入含有10% FBS及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM使反應停止。將細胞混合液以800rpm離心分離後再懸濁於含有10% FBS及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM，播種於經Poly-L lysine(PLL)塗覆之盤 (dish)。細胞播種4小時後將培養基交換成Neurobasal培養基(含有10% B27補充物(supplement)、1%盤尼西林/鏈黴素)。
<實施例1-2.TUNEL分析>
於培養在塗覆有PLL之8洞室載玻片(8 well chamber slide)之大腦皮質神經(實施例1-1)中添加20mM之麩胺酸、10μM之甲基鈷胺素(MeCbl)，於18小時後以Promega公司之deadend fluorometric TUNEL系統評估細胞凋亡細胞比例。於4℃，以4%三聚甲醛(PFA)固定25分鐘。以0.2% TritonX-100進行5分鐘透化處理(permeabilization)後添加孵育緩衝液(incubation buffer)，於37℃、遮光下放置60分鐘，進行標識。核係以DAPI標識。計測總細胞數、TUNEL陽性細胞數。
<實施例1-3.結果>
示結果於第1圖。又，表1表示第1圖之數值。於TUNEL分析中，於單獨添加甲基鈷胺素之細胞凋亡細胞比例(%)與對照組相同。於單獨添加麩胺酸中雖然看到細胞凋亡細胞比例有意義地增加，惟，藉由併用麩胺酸與甲基鈷胺素，細胞凋亡細胞比例顯著降低至對照組水平。
實施例2.大腦皮質神經細胞之壞死抑制作用
使用甲基鈷胺素，以LDH分析調查大腦皮質神經細胞之壞死抑制作用。具體而言，如下所述。
<實施例2-1.LDH分析>
於培養在塗覆有PLL之6洞室載玻片之大腦皮質神經(實施例1-1)中，於進行氧-葡萄糖缺乏(OGD)負荷的30分鐘前添加10μM之甲基鈷胺素。於作為基準之高對照中添加N-甲基-D天冬胺酸(NMDA)。培養基交換成含厄爾平衡鹽緩沖液(earle’s balanced salt solution，EBSS)，於氧濃度1%之環境下進行OGD負荷3小時。回到通常之培養基、氧濃度環境下24小時後，採取上清液，使用細胞毒性偵測套組(cytotoxicity detection kit plus)(SIGMA公司製造)，測定LDH活性。對照群、甲基鈷胺素添加群之LDH活性度係以相對於高對照之LDH活性之比例(%)算出。
<實施例2-2.結果>
結果示於第2圖。又，表2表示第2圖之數值。於藉由OGD負荷進行之LDH分析中，相對於對照群，甲基鈷胺素添加群中相對於成為壞死指標之LDH活性之高對照之比例，可觀察到有意義的降低。
實施例3.大腦皮質神經細胞之軸突伸展促進作用
使用甲基鈷胺素，以神經突起伸展分析調查大腦皮質神經細胞之軸突伸展促進作用。具體而言，如下所述。
<實施例3-1.神經突起伸展分析>
播種大腦皮質神經(實施例1-1)，於24小時後添加各種藥劑。添加藥劑濃度為甲基鈷胺素(1nM、10nM、100nM、1μM、10μM、100μM)。細胞播種72小時後，以抗TuJ1抗體進行免疫螢光染色，計測軸突長度(最長軸突長度/神經元(the longest neurite length per neuron))。惟，只計測未與其他神經連接之細胞，於各評估中測定至少30個以上之神經軸突，算出其平均值作為計測值。
<實施例3-2.結果>
結果示於第3圖。又，表3表示第3圖之數值。於神經突起伸展分析中，於10μM濃度的峰值處以濃度依賴性之方式顯示促進軸突伸展之傾向，相對於未添加藥劑之對照群，於1μM及10μM中具有有意義差，確認到促進軸突伸展。
實施例4.腦梗塞體積之縮小作用
使用甲基鈷胺素，以TTC(2,3,5-氯化三苯基四唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride))染色法調查腦梗塞體積之縮小作用。具體而言，如下所述。
<實施例4-1.製作暫時性中大腦動脈阻塞(tMCAO)模型及投予藥劑>
使用8-9週齡之雄C57BL/6J小鼠(24g左右)。以可監測中大腦動脈之血流之方式，於右頭蓋骨上安裝雷射都卜勒血流計(Laser Doppler Flowmetry)用之探針。將右頸部展開，將外頸動脈結紮後切開總頸動脈，插入尼龍線，一邊觀看血流監測器一邊將線頭推進。將線頭前進至中大腦動脈分岐部並確認血流降低，以該狀態於直腸溫37℃下等待1小時後拔除尼龍線，並將總頸動脈結紮。為了將甲基鈷胺素持續投予，於背部皮下留置滲透壓迷你泵，於模型完成後以1mg/kg/day之用量投予。於未治療群以相同之方法投予生食。術後維持在直腸溫37℃至從麻醉中覺醒。
<實施例4-2.TTC染色法>
術後2日犧牲小鼠(實施例4-1)，取出大腦。於冠狀切面(coronal section)以每1mm薄切，浸漬於2% TTC溶液30分鐘。以實體顯微鏡攝影後算出各個薄片之梗塞面積，藉由給予全大腦薄片之梗塞面積而算出梗塞體積。1張薄片之梗塞面積係以(健康側半球面積-患病側健康部分面積)計算。
<實施例4-3.結果>
結果示於第4圖。又，表4表示第4圖之數值。在對小鼠實施tMCAO手術後2日，藉由TTC染色評估腦梗塞體積。相較於對照群，甲基鈷胺素投予群可觀察到約1/2之有意義之梗塞體積縮小。
實施例5.M2巨噬細胞誘導促進作用及M1巨噬細胞誘導抑制作用
使用甲基鈷胺素，藉由西方墨點法及免疫組織學評估法調查M2巨噬細胞誘導促進作用及M1巨噬細胞誘導抑制作用。具體而言，如下所述。
<實施例5-1.巨噬細胞細胞株之準備>
從大阪之JCRB細胞銀行(培養資源研究室)購入源自小鼠之巨噬細胞細胞株J774A.1(JCRB9108)。利用含有10% FBS及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM進行培養。
<實施例5-2.西方墨點法>
將J774A.1細胞(實施例5-1)播種於直徑6cm之盤中，4日後使用溶解有蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)之細胞裂解緩衝液(cell lysis buffer)收集蛋白質。以BCA分析測定蛋白質濃度後，將各50μg之試樣以SDS-PAGE進行電泳，轉錄於聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride membrane)。以阻斷緩衝液(Blocking buffer)進行1小時之阻斷後與一次抗體於4℃反應整晚。二次抗體於室溫反應1小時，以ECL西方墨點法檢驗系統檢驗出。檢驗出屬於M1標記之iNOS及IL-1β時，於收集蛋白質之24小時前添加脂多糖(LPS)(100ng/ml)及甲基鈷胺素。檢驗出屬於M2標記之Arg1及CD206時，於收集蛋白質之72小時前添加IL-4(20ng/ml)及甲基鈷胺素。
一次抗體使用抗IL-1β兔子多株抗體(Santa Cruz)、抗iNOS兔子單株抗體(Abcam)、抗Arg1兔子多株抗體(Santa Cruz)、抗CD206兔子單株抗體(Abcam)，二次抗體使用經抗兔子IgG山葵過氧化酶(horseradish peroxidase)連結之源自驢子的全抗體(whole antibody)(GE Healthcare Life Sciences)。
<實施例5-3.免疫組織學的評估法>
將J774A.1細胞(實施例5-1)播種於直徑6cm之盤，4日後以4% PFA固定20分鐘。進行阻斷30分鐘，一次抗體於4℃反應整晚。二次抗體於室溫反應1小時，將核以DAPI標識。於檢驗出屬於M1標記之iNOS時，於細胞固定之24小時前添加LPS(100ng/ml)及甲基鈷胺素。於檢出屬於M2標記之Arg1時，於細胞固定之72小時前添加IL-4(20ng/ml)及甲基鈷胺素。
一次抗體使用抗iNOS兔子單株抗體(Abcam)、抗Arg1兔子多株抗體(Santa Cruz)，二次抗體使用Alexa 488標識山羊抗兔子IgG抗體(Lifetechnologies)或Alexa 568標識山羊抗兔子IgG抗體(Lifetechnologies)。
<實施例5-4.結果>
西方墨點法之結果示於第5及6圖。又，表5表示第5圖之數值，表6表示第6圖之數值。關於M1標記，相較於單獨添加LPS，IL-1β係在100nM、iNOS係在100nM至10μM時觀察到有意義的蛋白質量減少。關於M2標記，相較於單獨添加IL-4，Arg1係在100nM及1μM時觀察到有意義的蛋白質量增加。CD206係傾向於在100nM至1μM時成為峰值。
免疫組織學評估法之結果示於第7圖。又，表7表示第7圖之數值。相較於單獨添加LPS，屬於M1標記之iNOS係在加入10nM至100μM之甲基鈷胺素時，而有意義地減少iNOS陽性細胞率。又，相較於單獨添加IL-4，屬於M2標記之Arg1係在加入10nM至1μM甲基鈷胺素時，有意義地增加Arg1陽性細胞率。
與上述之西方墨點法相同，免疫螢光染色亦於100nM附近觀察到峰值向M2方向移動。
實施例6.巨噬細胞誘導作用之機制分析
分析藉由甲基鈷胺素所致之巨噬細胞誘導作用(實施例5)之機制。具體而言，以西方墨點法評估於添加IL-4、甲基鈷胺素(100nM及1mM)後30分鐘之Akt-mTOR路徑(誘導M2基因之主要信號路徑之一)中的Akt、4EBP1及S6K之活化。於該路徑中，藉由來自上流之信號引起Akt之磷酸化，進一步於下流透過mTORC1引起4EBP1之磷酸化及S6K之磷酸化。S6K之磷酸化於信號上流帶來負回饋(negative feedback)作用。西方墨點法除了於收集蛋白質之30分鐘前添加IL-4(20ng/ml)、甲基鈷胺素、RAD001(200nM)，及變更進行檢驗之一次抗體之外，以與實施例5-2相同之操作進行。
結果示於第8-1圖、第8-2圖及第8-3圖。又，表8表示第8-1圖、第8-2圖及第8-3圖之數值。藉由添加IL-4，確認Akt、下流之4EBP1、S6K都活化。併用IL-4與甲基鈷胺素100nM時，相較於單獨添加IL-4之情形，各別的活化比皆增強，惟，若將甲基鈷胺素設為1mM時，與4EBP1及S6K之活化相反，上流之Akt之活性降低。於此進一步添加屬於mTOR抑制劑之RAD001時，則可觀察到上流之Akt之活性被挽救， 而下流之4EBP1及S6K活性被抑制。由上述可知，藉由添加高濃度甲基鈷胺素所致之來自下流之負回饋機制，暗示了向M2基因誘導的上流Akt活性被抑制之機制。
實施例7.坐骨神經損傷後巨噬細胞動態之解析
以免疫組織學評估法解析甲基鈷胺素對坐骨神經損傷後之巨噬細胞動態給予之影響。具體而言，於坐骨神經損傷後第1、3、7、14日，於近位2.5mm、損傷部位、遠位2.5mm、5.0mm、7.5mm之神經橫切片以螢光免疫染色評估巨噬細胞。此外，近位係指從軸突上之損傷部位開始之細胞體側，遠位係指從軸突上之損傷部位開始之軸突末端側，各個之距離表示從損傷部位算起之距離(實施例8亦相同)。巨噬細胞係以CD68、作為M1標記之iNOS標識、作為M2標記之CD206標識。以M1巨噬細胞比例(%)=M1標記陽性巨噬細胞數(個/mm2)/巨噬細胞數(個/mm2)×100算出。更具體而言，如下所述。
<實施例7-1.外科的處置(坐骨神經壓扁損傷模型大鼠)>
使用6週齡之雄Wistar大鼠(200g左右)。將左坐骨神經展開，於坐骨神經之近位側以鑷子給予壓扁損傷。壓扁時間為10秒鐘，壓扁次數為3次，壓扁操作之間隔為10秒鐘。將肌膜及皮膚以3-0尼龍線(nylon)縫合。將只進行坐骨神經展開之非損傷群與未治療群、甲基鈷胺素投予群進行比較研究。為了將甲基鈷胺素持續投予，於背部皮下留置滲透壓迷你泵，以1mg/kg/day之用量投予。於未治療群以相同之方法投予生食。
<實施例7-2.形態學及組織學之分析(Morphological and histological analysis)>
將術後經過1日、3日、7日、14日之大鼠以麻醉藥鎮静，採取左坐骨神經，以4% PFA固定7日，以20%蔗糖固定24小時後冷凍包埋。將包埋後之組織於神經短軸方向切成5μm厚，放置於玻璃載玻片(glass slide)。切片部位於損傷之近位2.5mm、損傷部位、遠位2.5mm、遠位5.0mm、遠位7.5mm之5個地方進行。進行乾燥1小時，以95%甲醇固定30分鐘。阻斷後於4℃將1次抗體反應整晚。二次抗體於室溫反應1小時，將核以DAPI標識。
一次抗體使用抗CD68小鼠單株抗體(Abcam)、抗iNOS兔子單株抗體(Abcam)、抗CD206兔子單株抗體(Abcam)、抗神經纖維蛋白200(neurofilament 200，NF200)兔子多株抗體(SIGMA)及抗髓鞘鹼性蛋白(myelin Basic Protein，MBP)小鼠單株抗體(CALBIOCHEM)，二次抗體使用Alexa 488標識山羊抗小鼠IgG抗體(Lifetechnologies)、Alexa 488標識山羊抗兔子IgG抗體(Lifetechnologies)、Alexa 568標識山羊抗小鼠IgG 抗體(Lifetechnologies)及Alexa 568標識山羊抗兔子IgG抗體(Lifetechnologies)。
<實施例7-3.結果>
結果示於第9及10圖。又，表9-1、表9-2及表9-3表示第9圖之數值，表10-1、表10-2及表10-3表示第10圖之數值。於損傷部位中，相較於未治療群，甲基鈷胺素投予群於術後第3、7、14日確認到集積巨噬細胞數有意義的減少。於遠位，雖然巨噬細胞數以慢於損傷部位之方式增加，惟，於術後第14日確認到有意義差。
M1巨噬細胞數係於全評估日、甲基鈷胺素投予群中皆確認到有意義的減少。遠位於術後第7、14日確認到有意義差。M1巨噬細胞比例亦觀察到相同之傾向。
M2巨噬細胞數於損傷部位中，係於術後1、7、14日之甲基鈷胺素投予群中確認到有意義的增加，於遠位5mm之術後7日、於遠位7.5mm之術後7及14日確認到有意義差。M2巨噬細胞比例亦觀察到相同之傾向。
實施例8.坐骨神經損傷後神經再生動態之解析
以免疫組織學評估法解析甲基鈷胺素對坐骨神經損傷後之神經再生動態給予之影響。具體而言，評估坐骨神經損傷2週後之損傷坐骨神經的橫切片。評估部位與巨噬細胞評估相同，作成近位2.5mm、損傷部位、遠位2.5mm、5.0mm、7.5mm。再生軸突以NF200標識，髓鞘以MBP標識。 為了計算再生軸突之髓鞘化率，以髓鞘化率(%)=髓鞘化軸突數(個/mm2)/軸突數(個/mm2)×100計算。更具體而言，係以與實施例7相同之方法進行。
結果示於第11圖。又，表11-1、表11-2及表11-3表示第11圖之數值。於損傷部位之軸突數及髓鞘化軸突數係在甲基鈷胺素投予群確認到有意義的改善，軸突數於遠位5.0mm及7.5mm，髓鞘化軸突數於遠位2.5mm、5.0mm及7.5mm，髓鞘化率於遠位5.0mm及7.5mm觀察到有意差。由該結果及實施例7之結果暗示甲基鈷胺素於實際之神經再生過程使M1巨噬細胞減少、使M2巨噬細胞增加，而進行抗炎症性作用，藉此促進神經再生。
實施例9.脊髓損傷之治療作用
使用甲基鈷胺素，藉由BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)評分及熱痛覺計測試調查脊髓損傷之治療作用。具體而言，如下所述。
<實施例9-1.大鼠脊髓損傷模型(Lateral Hemisection model)之製作及藥劑投予>
使用6週齡之雌的Wistar大鼠。大鼠係購自日本查爾斯河實驗室(Charles River Laboratories)(橫濱市，日本)。麻醉方法為將3種混合麻醉藥以生理食鹽水稀釋為1：10後利用腹腔內注射投予。每次之麻醉投予量為咪達唑侖(Midazolam)0.2mg/kg、美托咪定(medetomidine)0.015mg/kg、布托啡諾(Butorphanol)0.25mg/kg。於手術台以臥姿放置，將背部正中展開。切除T10椎弓使脊髓後面露出，以尖刀片將左脊髓切半。皮膚以4-0尼龍線縫合完成手術。比較甲基鈷胺素投予群、未治療群及Sham群3群。甲基鈷胺素投予群、未治療群於術後立即在左背部皮下分別留置填充有甲基鈷胺素(1mg/kg/day)、生理食鹽水之滲透壓迷你泵。Sham群只進行Th10椎弓的切除。
<實施例9-2.BBB評分之測定>
將大鼠個別放入籠子內使其自由步行，觀察5分鐘。依照通常之方法，左下肢之功能在0點(未運動)至21點(通常之運動)之間進行評分。評估係在術前、術後第1、7、14、21、28日進行。
<實施例9-3.熱痛覺計測試>
將大鼠個別放入專用之籠子內，於右腳底給予紅外線熱刺激，測定出直至因為熱而將後肢拉回為止之時間。為了避免皮膚受傷，刺激時間最多為15秒。評估於術前、術後第7、14、21、28日進行。
<實施例9-4.結果>
BBB評分示於第12圖。又，表12表示第12圖之數值。相較於未治療群，甲基鈷胺素投予群於術後第14、21、28日確認到左下肢之運動功能之有意義的改善。
熱痛覺計測試之結果示於第13圖。又，表13表示第13圖之數值。甲基鈷胺素投予群於術後第21、28日確認到右下肢知覺敏感性之有意義改善。
實施例10.M2小神經膠質細胞誘導促進作用及M1小神經膠質細胞誘導抑制作用
使用甲基鈷胺素，藉由西方墨點法調查M2小神經膠質細胞誘導促進作用及M1小神經膠質細胞誘導抑制作用。具體而言，如下所述。
<實施例10-1.西方墨點法>
對於小神經膠質細胞細胞株(6-3細胞)添加LPS(100ng/ml)、作為抗炎症性細胞激素之IL-4(20ng/ml)，並於此加入調整為各種濃度(1nM至1mM)之甲基鈷胺素，分別在添加後第1日、第3日將蛋白質回收。進行電泳並轉錄於薄膜，阻斷後將分別針對M1標記(iNOS,IL-1β)、M2標記(Arg1,CD206)之1次抗體於4℃反應整晚。二次抗體於室溫反應1小時，以檢測器進行條帶檢出。
一次抗體使用抗iNOS抗體、抗IL-1β抗體、抗Arg1抗體、抗CD206抗體(Mannose Receptor)，二次抗體使用抗兔子IgG、HRP連接的羊全抗體(HRP-Linked Whole Ab Sheep)。
<實施例10-2.結果>
西方墨點法之結果示於第14至15圖。又，表14表示第14圖之數值，表15表示第15圖之數值。關於小神經膠質細胞之炎症性(M1)標記，相較於單獨添加LPS，IL-1β係於添加1μM以上之甲基鈷胺素時觀察到蛋白質量有意義的減少，iNOS係於添加10nM以上之甲基鈷胺素時觀察到蛋白質量有意義的減少。關於抗炎症性(M2)標記，相較於單獨添加IL-4，Arg1係於添加1nM至10μM之甲基鈷胺素時觀察到蛋白質量有意義的增加。CD206係於添加10nM至100nM之甲基鈷胺素時觀察到有意義的增加。
實施例11.M2巨噬細胞誘導促進作用及M1巨噬細胞誘導抑制作用
使用甲基鈷胺素調查M2巨噬細胞誘導促進作用及M1巨噬細胞誘導抑制作用。具體而言，如下所述。
<實施例11-1.免疫螢光染色>
關於實施例9-1之大鼠脊髓損傷模型，係將術後經過7、14、28日之大鼠以麻醉藥鎮靜，以4% PFA灌流固定後，採取含有損傷部位之脊髓，以20%蔗糖固定24小時後進行冷凍包埋。將包埋之組織於神經短軸方向切成5μm厚，放置於載玻片(glass slide)。進行乾燥1小時，以100%甲醇固定30分鐘。阻斷後將1次抗體於4℃反應整晚。二次抗體於室溫反應1小時，將核以DAPI標識。
在從損傷部位算起之頭側2mm、頭側1mm、尾側1mm、尾側2mm之患側脊髓橫切片，計測每單位面積之巨噬細胞數、M1(炎症性型)巨噬細胞數、M1巨噬細胞比例、M2(抗炎症性型)巨噬細胞數、M2巨噬細胞比例、M1/M2比。
一次抗體使用抗CD68抗體、抗iNOS抗體、抗Arg1抗體，二次抗體使用Alexa 488標識山羊抗兔子IgG抗體及Alexa 568標識山羊抗小鼠IgG抗體。
<實施例11-2.結果>
免疫螢光染色之結果示於第16至22圖。第16至18圖表示由部位引起之每單位面積之巨噬細胞數、M1(炎症性型)巨噬細胞數、M1巨噬細胞比例、M2(抗炎症性型)巨噬細胞數、M2巨噬細胞比例之變化，第19至20圖表示由術後之經過日數引起之此等的變化。第21圖表示由術後經過日數 引起之M1/M2比之變化，第22圖表示由該部位引起之變化。又，第16至18圖之數值依序表示於表16至18，表19表示第22圖之數值。
相較於未治療群，在甲基鈷胺素投予群中每單位面積之集積巨噬細胞數有減少之傾向，又，於該表現型(phenotype)中M1巨噬細胞有減少之傾向，M2巨噬細胞有增加之傾向。於一部份確認到有意義差。
實施例12.關於光凝固腦梗塞模型中之甲基鈷胺素的功能回復促進效果
<實施例12-1.對象及方法>
使用8-10週齡之雄C57BL/6J小鼠(24g左右)，投予玫瑰紅(rose bengal)後，製造出藉由照射激光所致之光凝固腦梗塞模型。於該模型，將小鼠之頭蓋骨以前窗(anterior fontanelle)外側2mm處為中心，使用鑽頭於頭蓋骨打洞並將頭打開，在投予屬於光感受性色素之玫瑰紅5分鐘後，對右運動皮質中心照射激光，於右側運動皮質製作腦梗塞。如此製作出腦梗塞後立刻包埋滲透壓泵(ALZET Osmotic pumps：使用2星期)，分成甲基鈷胺素投予群(N=3)及未治療群(N=4)，於腦梗塞術後、2日後、4日後、7日後、9日後、11日後、14日後施行旋轉滾輪測試(Rota-rod test) (accelerating velocity：加速方式)。計測小鼠從旋轉滾輪掉落為止之時間，將Max 300秒作為基線(baseline)，算出其比率。
<實施例12-2.結果>
結果示於第23圖。又，表20表示第23圖之數值。於腦梗塞術後2、4、9日後，相較於未治療群，甲基鈷胺素投予群利用旋轉滾輪測試，確認到腦機能有意義的改善。

Claims (18)

  1. 一種神經系統疾患治療劑，係含有維生素B 12。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之神經系統疾患治療劑，其係M2巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導促進劑。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之神經系統疾患治療劑，其係M1巨噬細胞/小神經膠質細胞誘導抑制劑。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係神經再生促進劑。
  5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述神經系統疾患係中樞神經系統疾患。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述中樞神經系統疾患係腦血管疾患。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述腦血管疾患為選自由腦梗塞、腦出血、腦血栓症、腦動脈硬化症及失智症構成之群組中之至少一種。
  8. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述神經系統疾患係神經損傷。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述神經損傷係中樞神經損傷。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述中樞神經損傷係脊髓損傷。
  11. 如申請專利範圍第1項至第10項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述維生素B 12係選自由甲基鈷胺素、氰鈷胺素、羥鈷胺素、硫化鈷胺素、腺嘌呤鈷胺素及此等之鹽構成之群組中之至少1種。
  12. 如申請專利範圍第1項至第11項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其中，前述維生素B 12係甲基鈷胺素。
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係持續性地投予使用者。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之神經系統疾患治療劑，其係點滴静脈注射用製劑。
  15. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係以從發病起經過12至24小時後開始投予之方式使用者。
  16. 如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之神經系統疾患治療劑，其係以從剛發病起12小時以內開始投予之方式使用者。
  17. 一種維生素B 12之用途，係用以製造申請專利範圍第1項至第16項中任一項所述之神經系統疾患治療劑。
  18. 一種含有維生素B 12之組成物，係使用於神經系統疾患的治療。
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