CN113827585B

CN113827585B - 艾地苯在治疗肢带型肌营养不良2g型中的应用

Info

Publication number: CN113827585B
Application number: CN202111255274.1A
Authority: CN
Inventors: 林鹏飞; 吕晓晴
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2021-10-27
Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2041-10-27
Also published as: CN113827585A

Abstract

本发明提供艾地苯在治疗肢带型肌营养不良2G型中的应用，属于医药技术和分子生物学技术领域。本发明通过研究发现，艾地苯可以减少LGMD2G斑马鱼线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生，减轻斑马鱼的弯尾表型、恢复斑马鱼的体长和运动功能，从而表明其具有治疗治疗肢带型肌营养不良2G型的潜力，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

艾地苯在治疗肢带型肌营养不良2G型中的应用

技术领域

本发明属于医药技术和分子生物学技术领域，具体涉及艾地苯在治疗肢带型肌营养不良2G型中的应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

肢带型肌营养不良2G型(LGMD2G)是一种非常罕见的疾病，LGMD2G型患者主要携带TCAP基因的无义突变、移码突变或剪切突变。LGMD2G患者主要在10-30岁发病，伴有下肢近端肌无力，随后或同时出现胫骨前肌无力。随着疾病的进展，患者可出现上肢肌肉的受累。病理特点是肌营养不良样病理改变，有时出现分叶状肌纤维及镶边空泡。部分病人表现为远端肌病，且病理诊断为伴镶边空泡的远端肌病。Telethonin蛋白在免疫组化上表达减弱或缺失。Telethonin蛋白的缺失高度提示TCAP基因缺陷，需要进行TCAP基因检测。

TCAP基因位于17q12，包含两个外显子，编码telethonin蛋白(或称作tcap)，含有167个氨基酸，分子质量为19kDa。Telethonin蛋白在正常肌节装配、发育及肌节-肌膜相互作用及信号转导方面发挥重要作用。它是骨骼肌中含量最丰富的转录产物之一，位于横纹肌肌节的Z线，与titin蛋白的Z1Z2结构域相互作用。Telethonin也在人胃肠道平滑肌中发现，与NaV1.5共定位。

目前，LGMD2G的致病机制仍不清楚并且缺乏LGMD2G的治疗药物。肌原纤维发生过程中，肌细胞分化过程中的肌动蛋白激酶激活和telethonin蛋白磷酸化参与了细胞骨架的重组。一项研究表明，心脏telethonin蛋白在Ser-157和Ser-161位点构成双磷酸化，这对维持横小管组织和细胞内Ca²⁺瞬变至关重要，这表明体内有某种因素可以代偿Telethonin的C末端的截短突变或其他突变，而telethonin蛋白的N端有锚定功能。另外，在LGMD2G病人和LGMD2G小鼠模型中分别发现了线粒体数量和形态异常。然而LGMD2G的致病机制和治疗方法仍需进一步研究。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供艾地苯在治疗肢带型肌营养不良2G型中的应用。本发明通过研究发现，艾地苯可以减少LGMD2G斑马鱼线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生，减轻斑马鱼的弯尾表型、恢复斑马鱼的体长和运动功能，从而表明其具有治疗治疗肢带型肌营养不良2G型的潜力。基于上述研究成果，从而完成本发明。

本发明的第一个方面，提供艾地苯在制备治疗肢带型肌营养不良2G型药物中的应用。

其中，所述艾地苯为2-(10-羟基癸基)-5,6-二甲氧基-3-甲基-1,4-苯醌，CASNo.：58186-27-9。

本发明的第二个方面，提供艾地苯在抑制线粒体自噬和/或制备线粒体自噬抑制剂中的应用。

本发明的第三个方面，提供艾地苯在抑制线粒体自噬相关蛋白BNIP3L和/或制备线粒体自噬相关蛋白BNIP3抑制剂中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含上述艾地苯与至少一种其它药物活性成分组成；所述药物组合物用于治疗肢带型肌营养不良2G型。

本发明的第五个方面，提供一种药物制剂，所述药物制剂包含如下(a)或(b)：

(a)上述艾地苯和至少一种其它非药物活性成分；

(b)上述药物组合物和至少一种其它非药物活性成分。

本发明的第六个方面，提供一种治疗肢带型肌营养不良2G型的方法，所述方法包括：向受试者施加有效剂量的上述艾地苯、上述药物组合物或上述药物制剂。

当受试者为斑马鱼时，所述治疗肢带型肌营养不良2G型具体表现为：

1)改善斑马鱼的弯尾表型；

2)改善斑马鱼的体长；

3)改善斑马鱼的运动功能；

4)减轻线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案提供上述技术方案首次报道了将艾地苯用于治疗肢带型肌营养不良2G型，经实验验证，艾地苯可以有效改善LGMD2G斑马鱼的弯尾表型，恢复斑马鱼的体长，恢复斑马鱼的运动能力，减少线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生。成为干预LGMD2G的潜在治疗方案，具有良好的实际推广应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中将Tcap-MO显微注射于1-4细胞期斑马鱼胚胎后发育至36h的斑马鱼的弯尾表型；

图2为本发明实施例中将不同浓度的Tcap-MO显微注射于1-4细胞期斑马鱼胚胎后发育至36h时斑马鱼的弯尾表型统计学分析以及共注射人TCAP c.165-166insG突变的mRNA以及人正常TCAP mRNA后斑马鱼的弯尾表型变化；

图3为本发明实施例中正常斑马鱼和LGMD2G斑马鱼肌肉免疫荧光染色显示肌纤维的排列和肌膈结构；

图4为本发明实施例中LGMD2G斑马鱼电镜图片；

图5为本发明实施例中5hpf时LGMD2G斑马鱼胚胎和对照组基础耗氧量；

图6为本发明实施例中48hpf时轻度弯尾、重度弯尾的LGMD2G斑马鱼和对照组基础耗氧量；

图7为本发明实施例中LGMD2G斑马鱼和对照组斑马鱼线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的WesternBlot及定量分析图；

图8为本发明实施例中使用0.05μM和0.025μM艾地苯治疗LGMD2G斑马鱼模型后斑马鱼的表型变化；

图9为本发明实施例中使用0.05μM和0.025μM艾地苯治疗LGMD2G斑马鱼模型后斑马鱼体长的统计图；

图10为本发明实施例中使用0.05μM和0.025μM艾地苯治疗LGMD2G斑马鱼模型后斑马鱼的运动热图及运动总路程定量分析；

图11为本发明实施例中使用0.05μM和0.025μM艾地苯治疗LGMD2G斑马鱼模型后各组斑马鱼BNIP3L的表达分析。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明的一个具体实施方式中，提供艾地苯在制备治疗肢带型肌营养不良2G型药物中的应用。

根据本发明，“治疗”的概念表示任一适用于治疗肢带型肌营养不良2G型及相关疾病的措施，或者对于这种表现的疾病或所表现出来的症状进行预防性治疗，或者避免这种疾病的复发，例如在结束了治疗时间段之后的复发或对已经发作的疾病的症状进行治疗，或预先介入性的防止或抑制或减少该类疾病或症状的发生。

具体的，当受试者为斑马鱼时，所述治疗肢带型肌营养不良2G型具体表现为：

1)改善斑马鱼的弯尾表型；

2)改善斑马鱼的体长；

3)改善斑马鱼的运动功能；

4)减轻线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生。

(a)上述艾地苯和至少一种其它非药物活性成分；

(b)上述药物组合物和至少一种其它非药物活性成分。

其他非药物活性成分包括但不限于药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

其他非药物活性成分包括药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。例如药学上相容的无机或有机酸或碱、聚合物、共聚物、嵌段共聚物、单糖、多糖、离子和非离子型表面活性剂或脂质、药理上无害的盐例如氯化钠、调味剂、维生素例如维生素A或维生素E、生育酚或维生素原、抗氧化剂，例如抗坏血酸，以及用于延长药物活性成分或配方的使用和保存时间的稳定剂和/或防腐剂，和其它现有技术中公知的常用非药物活性成分或助剂和添加剂，以及它们的混合物。

所述药物制剂可以单位剂量形式给药。给药剂型可以是常用的艾地苯化合物剂型形式，或者其他可行的剂型，比如本领域技术人员可以在常规的剂型中选择适合于艾地苯化合物的剂型，通过加入与艾地苯化合物相容的载体、赋形剂、粘合剂、稀释剂等来实现。该处所述的常规剂型比如液体剂型、固体剂型、外用制剂、喷剂等等，比如下列剂型：真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混旋剂型、片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂、包合物、填埋剂、贴剂、擦剂等。

所述受试者是指已经是治疗、观察或实验的对象的动物，包括人和非人动物，如斑马鱼。所述“治疗有效量”是指包括本发明化合物在内的活性化合物或药剂的量，该量可引起研究者、兽医、医生或其他医疗人员所追求的组织系统、动物或人的生物学或医学响应，这包括减轻或部分减轻受治疗的疾病、综合征、病症或障碍的症状。必须认识到，本发明所述活性成分的最佳给药剂量和间隔是由其性质和诸如给药的形式、路径和部位以及所治疗的特定动物等外部条件决定的，而这一最佳给药剂量可用常规的技术确定。同时也必须认识到，最佳的疗程，即同时化合物在额定的时间内每日的剂量，可用本领域内公知的方法确定。

1)改善斑马鱼的弯尾表型；

2)改善斑马鱼的体长；

3)改善斑马鱼的运动功能；

4)减轻线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

一、实验设计

1.将COMO和不同浓度的tcap-MO以显微注射的方式注射入1-4细胞期斑马鱼的胚胎中，胚胎发育至36h后进行表型统计，表型共分为4种(1)死亡；(2)重度表型(斑马鱼运动能力严重受损，尾巴明显弯曲)；(3)轻度表型(斑马鱼运动能力轻度受损，尾巴轻度弯曲)；(4)正常表型。将MO和携带TCAP c.165-166insG突变的LGMD2G病人的mRNA或正常人的TCAPmRNA共注射，在胚胎发育至36h时进行表型统计。对MO组和对照组斑马鱼进行电镜研究。用seahorse检测MO组和对照组斑马鱼的基础耗氧量。检测MO组和对照组线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的表达。对COMO组斑马鱼和MO组斑马鱼进行免疫荧光染色，观察肌纤维形态、肌膈结构。斑马鱼饲养于山东大学动物实验中心，斑马鱼的饲养环境为温度控制在28℃左右，14；10小时光照/黑暗周期模拟正常的昼夜生理规律，饮食不限。本动物实验的实验设计及动物处理过程均严格遵循山东大学动物实验伦理委员会的规章制度。

2.利用不同浓度的艾地苯治疗LGMD2G斑马鱼模型，评估治疗前后斑马鱼的表型、体长、运动功能以及BNIP3L蛋白的表达水平。本动物实验的实验设计及动物处理过程均严格遵循山东大学动物实验伦理委员会的规章制度。

二、试验结果

1.LGMD2G斑马鱼模型的构建

(1)将COMO和不同浓度的tcap-MO以显微注射的方式注射入1-4细胞期斑马鱼的胚胎中，胚胎发育至36h后进行表型统计。Tcap-MO注射至斑马鱼胚胎以后，在36hpf可见斑马鱼的弯尾表型(图1)。随着tcap-MO浓度的增高，斑马鱼的弯尾表型越来越严重(图2)。当tcap-MO与人突变的TCAP mRNA共注射可加重单注射tcap-MO导致的弯尾表型(图2)。Tcap-MO与人突变的TCAP mRNA共注射可减轻tcap-MO导致的弯尾表型(图2)。MO组斑马鱼进行免疫荧光染色发现肌膈结构由正常的“V”字型变成“U”型，肌纤维间的裂隙增大(图3)。

(2)在电镜下，LGMD2G斑马鱼模型肌节结构中的“M线”消失，线粒体的形态发生改变(图4)。

(3)在斑马鱼胚胎发育至5hpf时，MO组的基础耗氧量较对照组明显减少(图5)。在48hpf时，MO组又可分为轻度表型组和重度表型组，轻度表型组或重度表型组较对照组基础耗氧量明显减少(图6)。

(4)MO组斑马鱼线粒体自噬相关蛋白BNIP3L较对照组表达明显增高(图7)。

综合以上结果可以说明，斑马鱼tcap基因与人TCAP基因类似，LGMD2G斑马鱼模型具有肌肉病的表型。在LGMD2G斑马鱼体内可出现线粒体自噬现象。

2.艾地苯减轻LGMD2G斑马鱼表型并减少BNIP3L的产生

(1)艾地苯改善LGMD2G斑马鱼弯尾表型：将Tcap-MO和COMO显微注射至斑马鱼1-4细胞期胚胎后，在胚胎发育至4hpf时，将斑马鱼分为四组：COMO组、MO组、MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组。当胚胎发育至36hpf时进行各组之间表型统计，MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组较MO组斑马鱼的表型改善(图8)。

(2)艾地苯改善LGMD2G斑马鱼体长。将COMO和tcap-MO显微注射到斑马鱼1-4细胞期胚胎后，当胚胎发育至4hpf时，将斑马鱼分为四组：COMO组、MO组、MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组。当胚胎发育至36hpf时进行各组之间表型统计，MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组较MO组斑马鱼的体长变长(图9)。

(3)艾地苯改善斑马鱼的运动功能并且减少线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生：将Tcap-MO和COMO显微注射至斑马鱼1-4细胞期胚胎后，在胚胎发育至24hpf时，将斑马鱼分为四组：COMO组、MO组、MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组。当胚胎发育至5pdf时进行斑马鱼行为学评估，MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组较MO组运动能力得到恢复(图10)。同时对各组斑马鱼进行BNIP3L蛋白的Western Blotting分析，MO+0.05μM Ide组、MO+0.025μM Ide组较MO组BNIP3L表达减低(图11)。

综合以上结果可以说明艾地苯能够减少线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生并改善LGMD2G斑马鱼模型的表型。

结合上面两部分的结果，可以得出结论：一方面，Tcap-MO显微注射入斑马鱼胚胎可以模拟LGMD2G肌肉病表型；另一方面，艾地苯能够减少线粒体自噬相关蛋白BNIP3L，改善LGMD2G斑马鱼大体表型、体长、运动功能。因此艾地苯成为LGMD2G的潜在治疗方案。

综上可知：

1、本发明首次证明了艾地苯可以有效地减少线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生，减轻LGMD2G斑马鱼表型。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.艾地苯在制备治疗肢带型肌营养不良2G型药物中的应用；所述治疗肢带型肌营养不良2G型的具体表现为：

1)改善斑马鱼的弯尾表型；

2)改善斑马鱼的体长；

3)改善斑马鱼的运动功能；

4)减轻线粒体自噬相关蛋白BNIP3L的产生。