CN116172993A - 艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用 - Google Patents
艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明中，艾地苯醌能有效预防及治疗超早期脑缺血再灌注损伤，改善脑缺血再灌注损伤的SD大鼠的神经功能评分，能够减轻超早期脑缺血再灌注损伤SD大鼠的脑缺血病灶的面积，减轻脑缺血再灌注的损伤的SD大鼠的细胞凋亡，减轻氧化应激反应，提高线粒体ATP生成量，保护线粒体功能，可通过上调GSK‑3β/β‑catenin信号传导通路减轻大鼠脑缺血‑再灌注损伤。而且艾地苯醌有明显保护及改善线粒体功能，无明显副作用，可以减轻其他药物副作用，成为预防及治疗超早期脑缺血再灌注损伤潜在的治疗方案，具有良好的实际推广应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。
背景技术
急性缺血性脑血管病是由于血栓形成或栓塞导致的血管闭塞进而导致脑血管缺血、脑组织灌注不足所引起的脑功能障碍。
急性缺血性脑血管病超早期，主要指患者出现急性缺血性脑血管病后的6h内，在此时间段内可以进行急性缺血性脑血管病的血管再通治疗，是抢救治疗的重要时期。急性缺血性脑血病超早期常用阿替普酶、尿激酶静脉溶栓、动脉溶栓或机械取栓的治疗方法，以快速恢复缺血区脑血流灌注。但是，在临床治疗中发现血管再通后有时患者病情进一步加重，考虑存在缺血再灌注损伤（ischemia refusion insury, IRI）。IRI是指脑组织恢复血液供应后，脑组织损伤继续加重。研究表明，仅5min脑缺血就能导致成年大鼠海马CA1区神经元死亡。缺血再灌注损伤是一个多因子共同参与、多种通路相互交错参与的复杂的病理过程，出现大量的氧自由基、细胞内Ca2+超载、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸释放增加、线粒体功能障碍等，启动凋亡相关基因、诱导凋亡信号转导通路，最终导致神经元的凋亡或坏死。脑神经元与其他组织细胞不同，其受到各种损害刺激更容易死亡。
缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中治疗的难点，探寻药物防治脑缺血再灌注损伤是目前研究的热点问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用，艾地苯醌能够有效预防和治疗脑缺血再灌注损伤。
本发明提供了艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。
优选的，所述脑缺血再灌注损伤包括急性脑血管病超早期和/或急性期血管再通治疗后引起的脑缺血再灌注损伤。
优选的，所述急性脑血管病包括急性缺血性脑血管病。
优选的，所述预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤通过以下1）~9）中的一个或几个方面实现：
1）改善神经功能损伤；
2）减少脑缺血病灶面积或者脑梗死面积；
3）减轻神经元损伤和/或神经细胞凋亡；
4）减轻氧化应激反应；
5）抑制线粒体凋亡通路；
6）保护线粒体功能；
7）提高线粒体ATP生产量；
8）上调GSK-3β/β-catenin信号传导通路；
9）减轻合并药物的副作用。
优选的，所述药物的剂型包括口服剂型。
优选的，所述艾地苯醌用于大鼠的的工作剂量包括200mg/kg/d。
本发明提供了艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。本发明通过研究发现，艾地苯醌(200mg/kg/d)预处理在缺血再灌注模型大鼠中有很好的耐受性和安全性；本发明首次证明了艾地苯醌预处理可以有效地预防及治疗超早期脑缺血再灌注损伤，经实验验证，艾地苯醌预处理可以有效改善脑缺血再灌注损伤的SD大鼠的神经功能评分，能够减轻超早期脑缺血再灌注损伤SD大鼠的脑缺血病灶的面积，减轻脑缺血再灌注的损伤的SD大鼠的细胞凋亡，减轻氧化应激反应，提高线粒体ATP生成量，保护线粒体功能，可通过上调GSK-3β/β-catenin信号传导通路减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤。而且艾地苯醌有明显保护及改善线粒体功能，无明显副作用，可以减轻其他药物副作用，成为预防及治疗超早期脑缺血再灌注损伤潜在的治疗方案，具有良好的实际推广应用之价值。
附图说明
图1为艾地苯醌预处理对MCAO/R大鼠神经功能的影响；其中，（a）为Sham组、Vehicle组和艾地苯醌预处理组大鼠神经功能缺损评分（n=25）；（b~c）为Sham组、Vehicle组和艾地苯醌处理组大鼠脑指数、脑含水量统计图（n=5）；结果以均值±SD表示；#p＜0.05，**p＜0. 01；
图2为艾地苯醌预处理对MCAO/R大鼠脑梗死面积的影响；其中，（a）为Sham组、Vehicle组和艾地苯醌处理组大鼠TTC染色图。取材后把大鼠脑从头侧到尾侧，以视交叉为中心冠状面切成6片约2mm厚的脑片，用2%TTC染色后甲醛固定1天，拍照。TTC染色切片中的红色区域是非缺血区，白色区域表示大脑的缺血部分（Bar scale＝20μm）；（b）为梗塞体积的定量分析；Sham组的梗塞体积都等于零；结果以均值均值±SD表示；#p＜0.05，**p＜0.01；
图3为艾地苯醌预处理对MCAO/R大鼠神经元细胞的影响；（a）为Sham组，Vehicle组和艾地苯醌处理组大鼠HE染色图（n＝5）（Bar scale=20 μm）；（b~e）为艾地苯醌对MCAO/R大鼠凋亡因子表达变化的影响（n=5）；结果以均值±SD表示；#p＜0.05，**p＜0. 01；
图4为艾地苯醌预处理对MCAO/R大鼠MDA、SOD表达变化的影响；其中，A为Control组，Sham组，Vehicle组和艾地苯醌处理组大鼠MDA表达，B为Control组，Sham组，Vehicle组和艾地苯醌处理组大鼠SOD表达；****p＜0.0001
图5为艾地苯醌预处理对线粒体凋亡通路鼠Cytc蛋白的影响；其中，A为Control组，Sham组，Vehicle组和艾地苯醌处理组大鼠的细胞质及线粒体内Cytc蛋白表达，B为4组大鼠的细胞质Cytc蛋白水平与内参水平比较，C为4组大鼠的线粒体内Cytc蛋白水平与内参水平比较，*p＜0.05，**p＜0. 01，***p＜0.001，****p＜0.0001；
图6为艾地苯醌预处理对线粒体ATP生产量的影响；#与Vehicle组比较，P＜0.05，*与Sham组比较，P＜0. 05；
图7为艾地苯醌对MCAO/R大鼠GSK-3β/β-catenin通路相关蛋白表达变化的影响（n=5）；结果以均值±SD表示；其中，（a）为4组大鼠的T-GSK-3β蛋白与P- GSK-3β蛋白表达水平，(b)~为4组大鼠P-GSK-3β蛋白与GAPDH蛋白表达水平比较，(c) 为4组大鼠T-GSK-3β蛋白与GAPDH蛋白表达水平比较，(d) 为4组大鼠P-GSK-3β蛋白与T-GSK-3β蛋白表达水平比较，(e) 为4组大鼠的T-β-catenin蛋白与P-β-catenin蛋白表达水平,(g)为4组大鼠T-β-catenin蛋白与β-actin蛋白表达水平比较，(f) 为4组大鼠P-β-catenin蛋白与β-actin蛋白表达水平比较，（h）为4组大鼠P-β-catenin蛋白与T-β-catenin蛋白表达水平的比较，*p＜0.05，**p＜0. 01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
具体实施方式
本发明提供了艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。
艾地苯醌的结构式如式1所示：
在本发明中，“预防和/或治疗”的概念表示任一适用于预防及治疗脑缺血再灌注损伤的措施。
在本发明中，所述脑缺血再灌注损伤优选的包括急性脑血管病超早期和/或急性期血管再通治疗后引起的脑缺血再灌注损伤。
从脑缺血的病理上来说发病6h之内的是超早期，超早期脑组织改变不明显，血管内皮、神经元及星形胶质细胞等肿胀、线粒体肿胀空化，在临床上在超早期可以进行血管再通治疗。
在本发明中，所述急性脑血管病优选的包括急性缺血性脑血管病。
在本发明中，所述预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤优选的通过以下1）~9）中的一个或几个方面实现：
1）改善神经功能损伤；
2）减少脑缺血病灶面积或者脑梗死面积；
3）减轻神经元损伤和/或神经细胞凋亡；
4）减轻氧化应激反应；
5）抑制线粒体凋亡通路；
6）保护线粒体功能；
7）提高线粒体ATP生产量；
8）上调GSK-3β/β-catenin信号传导通路；
9）减轻合并药物的副作用。
在本发明中，所述减轻氧化应激反应优选的包括提高SOD活性和/或降低MDA含量。艾地苯醌通过抑制神经元脂质过氧化，增强细胞清除氧自由基能力，保护缺血再灌注损伤的神经元细胞。
在本发明中，艾地苯醌是线粒体辅酶Q10类似物，有明显保护及改善线粒体功能的作用，无明显副作用，可以减轻其他药物副作用。
在本发明中，艾地苯醌可使GSK-3β在Ser9位点磷酸化，磷酸化的β-catenin显著减少，上调GSK-3β/β-catenin通路的信号传导，抑制神经元细胞凋亡。
在本发明中，所述药物的剂型优选的包括口服剂型；所述药物优选的还包括一种或多种药学上或食品学上可接受的辅料。
在本发明中，以大鼠给药计，所述艾地苯醌用于大鼠的工作剂量优选的包括200mg/kg/d。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
一、试验设计
140只8周龄健康雄性Spraque-Dawley（SD）大鼠随机分成4组，Control 组，假手术对照组（Sham），缺血再灌注组（Vehicle组），艾地苯醌组（MCAO/R+IDE200mg/kg/d）。
A 正常组（Control），正常饲养不加入任何干扰。
B 假手术对照组（Sham），仅分离颈内外血管，不放置线栓，术后灌胃等体积玉米油，连续3天。
C 缺血再灌注组（Vehicle组）再灌注后灌胃等体积玉米油，连续3天。
D 艾地苯醌组（MCAO/R+IDE200mg/kg/d）艾地苯醌预处理1天，再灌注后灌胃艾地苯醌200 mg/kg/d，连续3天。
后2组参照Longa等改良线栓法建立大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型（（middlecerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R），缺血2h后向外轻柔拔出鱼线进行缺血侧大脑中动脉再灌注。
每笼四只大鼠，群居饲养，保证足够饮食饮水。大鼠饲养房维持湿度在65%左右，维持室温恒定在20~25 ℃，光照时间为12h/12h模拟昼夜变化。不同药物组干预3天后，所有小鼠行安乐死，留取各组小鼠组织标本。本动物试验的试验设计及动物处理过程均严格遵循潍坊医学院动物实验伦理委员会的规章制度。
二、试验结果
1、艾地苯醌预处理可改善大鼠超早期脑缺血-再灌注损伤后的神经功能损伤
为探讨艾地苯醌预处理是否能改善MCAO/R后的神经功能损伤，采用Z-Longa 5分制评分表评估手术后大鼠行为学评分。缺血-再灌注3天后，Vehicle组行为学评分显著增高，与Vehicle组相比，艾地苯醌处理组行为学评分显著降低（P＜0.05，图1中的（a））。为了进一步验证艾地苯醌治疗能否可改善大鼠神经损伤，我们每组随机抽取3只大鼠检测其脑组织含水率和脑指数，再灌注3天后，Vehicle组大鼠脑含水率和脑指数均显著升高（p＜0.05，图1中的（b~c））。与Vehicle组比较，200mg/kg艾地苯醌处理组大鼠脑梗死率，脑含水率和脑指数均显著降低。
2、艾地苯醌预处理可减少超早期脑缺血-再灌注损伤大鼠脑梗死面积。
为了观察MCAO/R后大鼠脑梗死面积的变化，我们采用TTC染液对2mm新鲜速冻脑切片进行染色。缺血-再灌注损伤3天后，TTC染色结果显示： Sham组脑片被染成红色。Vehicle组与艾地苯醌处理组均可观察到未着色的缺血梗死灶，以皮质和海马区为主（图2中的（a））。200mg/kg艾地苯醌处理治疗组梗死灶范围明显小于Vehicle组，(（b）梗塞体积的定量分析)具有统计学差异（P＜0.01，图2）。
3、艾地苯醌预处理可减轻超早期脑缺血-再灌注大鼠神经元损伤和细胞凋亡
为了观察MCAO/R大鼠脑片中神经元的形态变化，采用伊红和苏木素对脑切片进行染色。HE染色结果显示： Vehicle组脑组织结构紊乱、间质水肿、胞核出现深染、固缩、碎裂。与Vehicle组比较，艾地苯醌组脑组织神经元损伤程度减轻，大鼠神经元排列尚整齐（图3中的（a））。
鉴于各种凋亡因子在再灌注损伤中发挥重要作用，对脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织进行了Western Blot 检测。Western Blot显示与Sham组相比，Vehicle组示细胞总蛋白Bax和cleaved Caspase-3表达明显增高，诱导细胞凋亡（P＜0.0001，图3中的（b~e））。与Vehicle组相比，200mg/kg艾地苯醌处理组Bax、Cleaved Caspase-3表达明显下降，抑制细胞凋亡（P＜0.01，图3中的（c~e））。
4、艾地苯醌预处理可减轻脑缺血-再灌注损伤大鼠氧化应激反应
缺血再灌注损伤3天后，与Sham组比较，Vehicle组SOD含量显著降低(P<0.05)；MDA含量均显著升高(P<0.05)。与Vehicle 组比较，艾地苯醌预处理组SOD活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)。提示艾地苯醌预处理可通过抑制神经元脂质过氧化，增强细胞清除氧自由基能力，保护缺血-再灌注损伤的神经元细胞(图4)。
5、艾地苯醌预处理可通过抑制线粒体凋亡通路减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤。
与Sham 组相比，Vehicle组线粒体Cytc蛋白水平明显降低，胞浆Cytc蛋白表达水平明显增(P<0.05)，提示MCAO/R处理后引起Cytc从线粒体中释放到细胞浆中，说明缺血-再灌注损伤后大鼠神经元可通过细胞线粒体调亡通路引起细胞调亡。与Vehicle组比较，艾地苯醌预处理组线粒体Cytc蛋白表达水平明显增高，胞浆Cytc蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，提示艾地苯醌 预处理组可通过抑制细胞线粒体调亡通路，保护缺血再灌注损伤的神经元细胞(图5)。
6、艾地苯醌预处理可通过保护线粒体功能减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤。
与Sham组相比，Vehicle组ATP生成量明显降低 (P<0.05)，提示MCAO/R处理后引起线粒体功能异常。与Vehicle组比较，艾地苯醌预处理组ATP生成量明显增高 (P<0.05)，提示艾地苯醌预处理可通过改善线粒体功能，提高ATP生成量，减轻缺血再灌注损伤的神经元细胞(图6)。
7、艾地苯醌预处理可通过上调GSK-3β/β-catenin信号传导通路减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤
鉴于GSK-3β/β-catenin信号通路在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用，我们推测艾地苯醌可能通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路减轻脑缺血-再灌注损伤。WesternBlot检测显示，与Sham组相比，Vehicle组大鼠Western-Blot示磷酸化的GSK-3β在Ser9的水平显著下降，同时磷酸化的β-catenin表达量的数量显著增加，GSK-3β/β-catenin通路的信号传导被抑制，促进细胞凋亡。与Vehicle组相比，200mg/kg艾地苯醌处理组可使GSK-3β在Ser9位点磷酸化，磷酸化的β-catenin显著减少，上调GSK-3β/β-catenin通路的信号传导，抑制细胞凋亡（图7）。
综上可知：
艾地苯醌(200mg/kg/d)预处理在缺血再灌注模型大鼠中有很好的耐受性和安全性；本发明首次证明了艾地苯醌预处理可以有效地预防及治疗超早期脑缺血再灌注损伤，经实验验证，艾地苯醌预处理可以有效改善脑缺血再灌注损伤的SD大鼠的神经功能评分，能够减轻超早期脑缺血再灌注损伤SD大鼠的脑缺血病灶的面积，减轻脑缺血再灌注的损伤的SD大鼠的细胞凋亡，减轻神经元氧化应激反应，提高线粒体ATP生成量，保护线粒体功能，可通过上调GSK-3β/β-catenin信号传导通路减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤。而且艾地苯醌有明显保护及改善线粒体功能，无明显副作用，可以减轻其他药物副作用，成为预防及治疗超早期脑缺血再灌注损伤潜在的治疗方案，具有良好的实际推广应用之价值。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (6)
1.艾地苯醌在制备预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脑缺血再灌注损伤包括急性脑血管病超早期和/或急性期血管再通治疗后引起的脑缺血再灌注损伤。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述急性脑血管病包括急性缺血性脑血管病。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的应用，其特征在于，所述预防和/或治疗脑缺血再灌注损伤通过以下1）~9）中的一个或几个方面实现：
1）改善神经功能损伤；
2）减少脑缺血病灶面积或者脑梗死面积；
3）减轻神经元损伤和/或神经细胞凋亡；
4）减轻氧化应激反应；
5）抑制线粒体凋亡通路；
6）保护线粒体功能；
7）提高线粒体ATP生产量；
8）上调GSK-3β/β-catenin信号传导通路；
9）减轻合并药物的副作用。
5.根据权利要求1~3任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括口服剂型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述艾地苯醌用于大鼠的工作剂量包括200mg/kg/d。
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