CN114126716A - Mage a4 t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种对MAGE‑A4特异性的分离的T细胞受体(TCR)和包含所述TCR的功能部分的多肽。还涉及多价TCR复合物、编码TCR的核酸、表达所述TCR的细胞和包含所述TCR的药物组合物。本发明还涉及用作药物的TCR，特别是用于治疗癌症的TCR。

Description

MAGE A4 T细胞受体
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年3月27日提交的欧洲专利申请No.19 165 387.2的权益，其通过引用全文并入本文。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并在此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件名称是MED16702PCT_ST25。文本文件是146KB，在2020年3月24日创建，并且在提交本说明书的同时通过EFS-Web电子递交。
背景技术
本发明涉及对MAGE-A4特异性的分离的T细胞受体(TCR)、包含TCR功能部分的多肽、多价TCR复合物、编码TCR的核酸、表达TCR的细胞、以及包含它们的组合物和药物组合物。本发明还涉及在医学治疗方法中或用于配制和/或用作药物中，特别是用于治疗癌症的应用中使用前述物质的方法。
相关技术的描述
形成细胞介导的免疫系统的部分的T淋巴细胞(或T细胞)在消除病原体中起主要作用。T细胞在胸腺中发育并在其表面上表达TCR分子，该TCR分子允许识别在有核细胞上表达的主要组织相容性复合体(MHC)分子上呈递的肽(称为抗原呈递)。来源于病原体的抗原，即由MHC分子呈递的外源抗原将引发强的T细胞应答，而由于在此类T细胞发育过程中在胸腺中的自身抗原特异性T细胞的阴性选择，自身抗原通常不会导致T细胞应答。因此，免疫系统可以区分呈递外源抗原或自身抗原的有核细胞，并且通过T细胞的强有效的细胞因子释放和细胞毒性机制特异性地靶向和消除受感染的细胞。
免疫系统的力量已被认为是未来癌症治疗的一个很有前途的工具。在过去的几十年中，研究已经开始通过利用过继细胞疗法(ACT)来开发T细胞的独特性质，该过继细胞疗法涉及施用离体扩增的源自患者的淋巴细胞。ACT对于癌症的治疗时一个有吸引力的概念，因为它不需要患者的免疫能力，并且被转移的淋巴细胞的特异性可以靶向通常不能有效地触发自体T细胞应答的非突变并因此免疫原性差的肿瘤抗原。尽管已证明ACT是各种类型癌症的有前途的治疗，但其作为临床治疗的广泛应用仍受到对来自每位患者的肿瘤特异性T细胞的定制(custom)分离和表征的需求的阻碍—定制(custom)分离和表征这一过程不仅可能是困难且耗时的，也常常不能产生高亲合力T细胞(Xue等，Clin.Exp.Immunol.2005Feb；139(2):167–172；Schmitt et al.,Hum.Gene Ther.2009 Nov；20(11):1240–1248)
肿瘤抗原特异性TCR向原代T细胞的遗传转移可以克服ACT当前的一些局限性，因为它允许快速产生具有定义的抗原特异性的肿瘤反应性T淋巴细胞，甚至在免疫受损患者中也是如此。然而，鉴定具有特异性识别肿瘤抗原并在体内显示出预期抗肿瘤作用的TCR的合适T细胞克隆仍然是目前研究的主题。考虑到2012年全球约有1410万新发癌症病例，并且目前癌症是全球约14.6％的人类死亡的原因，因此迫切需要新的和有效的治疗方案。本发明的目的是满足上述需要。
MAGE-A4属于黑素瘤抗原(MAGE)家族。该MAGE家族在包括黑素瘤、结肠、肺至乳腺和其它肿瘤的各种恶性肿瘤类型中表达。具体地，根据其组织表达模式，将MAGE家族分成两组，其中MAGE-A亚家族在睾丸的生殖细胞中表达，在恶性肿瘤中异常再表达。这也适用于MAGE-A4。
肿瘤组织表达研究已经揭示在19-35％的非小细胞肺癌(NSCLC)病例、13％的乳腺癌病例、47％的上皮卵巢癌病例和22％的结肠直肠癌病例中，MAGE-A4(过)表达(Tajima等，Lung Cancer 2003；42:23-33；Gure等，Clin Cancer Res 2005,11:8055-8062；Kim等，IntJ Mol Med 2012,29:656-662；Otte等，Cancer Res 2001,61:6682-668；Daudi等，PLoS One2014,9:e104099；Li等，Clin Cancer Res 2005,11:1809-1814)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种分离的MAGE-A4特异性T细胞受体(TCR)。
具体地，所述TCR特异性地识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。
在具体的实施方案中，所述TCR特异性地识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式，更具体地，所述TCR识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述TCR包含：可变TCRα区和可变TCR β区，所述可变TCRα区包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，所述可变TCR β区包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；或所述TCR包含可变TCR α区和可变TCR β区，所述可变TCRα区包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，所述可变TCRβ区包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；或所述TCR包含可变TCRα区和可变TCR β区，所述可变TCR α区包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3，所述可变TCRβ区包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR 3。
在特定的实施方案中，TCR包含：具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区；或具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变TCRβ区；或具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变TCRβ区。
在一些实施方案中，TCR包含：具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ链；具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的TCR β链；或具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的TCRβ链。
在其它实施方案中，TCR包含：具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的TCR β链；具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的TCR β链；或具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的TCRβ链。
在一些实施方案中，所述TCR包含：具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的TCRβ链；具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的TCRβ链；或具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的TCRβ链。
本文考虑的TCR是分离的和/或纯化的，并且可以是可溶的或膜结合的。
在一些实施方案中，本发明涉及一种本文所述的分离的TCR，其中与结合至由HLA-A*02:01编码的分子呈递的不相关肽相比，当结合至由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQID NO:1的氨基酸序列时，由效应细胞上表达的TCR与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQID NO:1的氨基酸序列的结合所诱导的IFN-γ分泌可高100倍以上，优选地高500倍以上，更优选地高2000倍以上。
在一些实施方案中，TCR的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默置换。此外，TCR可以被标记。可用的标记是本领域已知的，且可使用常规方法，任选地经由不同长度的连接子可以将所述标记与TCR或TCR变体偶联。术语“标记”或“标记基团”是指任何可检测的标记。另外，或可选地，可以将氨基酸序列修饰为包含治疗剂或药代动力学修饰部分。所述治疗剂可选自免疫效应分子、细胞毒性剂和放射性核素。免疫效应分子可以是例如细胞因子。所述药代动力学修饰部分可以是至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或它们的组合。
TCR，特别是本文所考虑的TCR的可溶形式，可通过连接其它功能部分而被修饰，从而如用于降低免疫原性、增加流体动力学大小(溶液中的大小)、溶解度和/或稳定性(例如，通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。其它可用的功能部分和修饰包括“自杀”或“安全开关”，其可用于在患者体内关闭或开启携带本发明TCR的效应宿主细胞。本文还设想了具有改变的糖基化形式的TCR。
也可将药物或治疗实体，比如小分子化合物，添加至TCR，特别是添加至本发明TCR的可溶形式。所述TCR，特别是本发明TCR的可溶形式，可另外地被修饰以引入其它结构域，该种其它结构域有助于相应分子(标签)的识别、示踪、纯化及/或分离。
在一些实施方案中，TCR为单链类型，其中TCRα链与TCR β链通过连接子序列连接，任选地其中所述连接子序列为可切割的。
另一方面涉及包含本文所述的TCR的功能部分的多肽，其中所述功能部分包含选自SEQ ID NO:4、7、14、17、24和27的氨基酸序列中的至少一个。
在具体的实施方案中，所述功能部分包含TCRα可变区和/或TCRβ可变区。
具体的实施方案涉及一种多价TCR复合物，其包含至少两个本文所述的TCR。在一个更具体的实施方案中，所述TCR中的至少一个与治疗剂相连。
特别的实施方案涉及一种融合蛋白，其包含TCR α链及TCR β链，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:94、96、98、104、110和116中任一项所示的氨基酸序列。
在具体的方面，所述融合蛋白进一步包含弗林蛋白酶(furin)裂解位点和/或核糖体跳跃序列。
另一方面涉及编码本文所述的TCR或编码如上所述的多肽或融合蛋白质的核酸。
一方面，编码TCR α链的核酸序列如SEQ ID NO:69、77、85、99、105和111中任一项所示。另一方面，编码TCRβ链的核酸序列如SEQ ID NO:70、78、86、100、106和112中任一项所示。在其它方面，TCR包含由SEQ ID NO:69编码的α链和由SEQ ID NO:70编码的β链；由SEQID NO:77编码的α链和由SEQ ID NO:78编码的β链；由SEQ ID NO:85编码的α链和由SEQ IDNO:86编码的β链；由SEQ ID NO:99编码的α链和由SEQ ID NO:100编码的β链；由SEQ ID NO:105编码的α链和由SEQ ID NO:106编码的β链；或由SEQ ID NO:111编码的α链和由SEQ IDNO:112编码的β链。
进一步的方面涉及由SEQ ID NO:93、95、97、101、107和113中任一项所示的核酸序列编码的融合蛋白。
另一方面涉及包含如上所述的本申请的核酸的质粒或载体。另一方面涉及包含编码如下多肽序列的核酸的质粒或载体：SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示的多肽序列；SEQID NO:89和SEQ ID NO:90所示的多肽序列；SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92所示的多肽序列；SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103所示的多肽序列；SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109所示的多肽序列；或SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115所示的多肽序列。优选地，所述载体为表达载体或适于转导或转染细胞(尤其是真核细胞)的载体。所述载体可以是例如逆转录病毒载体，例如γ-逆转录病毒或慢病毒载体。
另一方面涉及表达本文所述TCR的细胞。所述细胞可以是分离的或非天然存在的。
另一方面涉及包含如上所述的核酸或如上所述的质粒或载体的细胞。更具体地，所述细胞可以包含：含有如上所述的一种核酸或多种核酸的表达载体；或含有编码本文所述TCR的α链的核酸的第一表达载体，以及含有编码本文所述TCR的β链的核酸的第二表达载体。
所述细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。通常，所述细胞是免疫效应细胞，尤其是T细胞。其它合适的细胞类型包括γ-δT细胞、自然杀伤(NK)细胞和NK-样T(NKT)细胞。
另一方面涉及特异性地结合本文所述TCR的一部分的抗体或其抗原结合片段，所述TCR介导对MAGE-A4的特异性。
另一方面涉及一种组合物，其包含本文所述的TCR、本文所述的多肽、本文所述的融合蛋白、本文所述的多价TCR复合物、本文所述的核酸、本文所述的载体、本文所述的细胞或本文所述的抗体。
另一方面涉及一种药物组合物，其包含本文所述的TCR、本文所述的多肽、本文所述的融合蛋白、本文所述的多价TCR复合物、本文所述的核酸、本文所述的载体、本文所述的细胞或本文所述的抗体。
通常，所述药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。
另一方面涉及将本文所述的TCR、本文所述的多肽、本文所述的多价TCR复合物、本文所述的核酸、本文所述的载体、本文所述的细胞、本文所述的抗体、本文所述的组合物或药物组合物用作药物，特别是用于治疗癌症。所述癌症可以是血液癌症或实体瘤。所述癌症可以选自肉瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病。优选地，所述癌症选自NSCLC、SCLC、乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌、肉瘤和骨肉瘤。
附图说明
图1示出了用不同的MAGE-A4-反应性TCR转导的CD8+T细胞的MAGE-A4GVY-MHC-多聚体结合。将CD8+T细胞自健康供体的PBMC分离并用三种不同的MAGE-A4-TCR和一种不识别MAGE-A4的对照TCR转导。通过使用鼠恒定β区作为转导的标志物的FACS富集转导的CD8+T细胞。在使这些细胞扩增后，用MAGE-A4GVY-MHC-多聚体和抗CD8和鼠恒定β区(mmCb)的抗体对其染色，并通过流式细胞术分析。在活CD8+/mCb+细胞上对群体进行门控，并示出多聚体/CD8的染色。
图2示出了MAGE-A4-TCR-转基因T细胞识别HLA-A2上呈递的MAGE-A4GVY-肽。将转基因T细胞与外部负载有MAGE-A4GVY-肽的T2细胞或已经用MAGE-A4基因转导的K562/HLA-A2细胞共培养。作为阴性对照，分别使用负载有对照肽的T2细胞和未转导的K562/HLA-A2细胞。通过标准ELISA测量共培养上清液中IFN-γ的浓度来分析靶细胞的识别。
图3示出了MAGE-A4-TCR-转基因T细胞的功能性亲合力。将转基因T细胞与外部负载有梯度浓度的MAGE-A4GVY-肽(10-12M-10-4M)的T2细胞共培养。通过标准ELISA测量共培养上清液中的IFN-γ浓度。
图4A-C示出了MAGE-A4-TCR-转基因T细胞(TCR-1、TCR-2和TCR-3)以HLA-A2依赖性方式裂解MAGE-A4阳性肿瘤细胞系的能力。将转基因T细胞与不同的MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(NCI-H1703，NCI-H1755)、MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(Saos-2)和MAGE-A4-阴性HLA-A2-阴性肿瘤细胞系(A549)共培养。将负载有MAGE-A4GVY-肽的肿瘤细胞用作阳性对照。采用Incu
Figure BDA0003377521100000071
ZOOM装置(Essen Bioscience)通过每两小时拍照来测量针对用荧光标志物稳定转导的肿瘤细胞系的细胞毒性。为了分析细胞因子的释放，24小时后收获共培养上清液并通过标准夹心ELISA(BD人IFN-γELISA组件)来分析IFN-γ浓度。
图5A-C示出了MAGE-A4-TCR-转基因T细胞(TCR-1、TCR-2和TCR-3)不识别正常人细胞。将转基因T细胞与代表必需组织或器官的不同的原代细胞和诱导多能干细胞(iPS)衍生的细胞共培养。将负载有MAGE-A4GVY-肽的正常细胞用作阳性对照。通过与IFN-γ预温育以在神经元上诱导HLA-A2表达。HLA-A2-阴性NHBE细胞用HLA-A2-ivtRNA电穿孔，并通过流式细胞术证实所有细胞的HLA-A2表达。为了分析细胞因子的释放，24小时后收集共培养上清液，并通过标准夹心ELISA(BD人IFN-γ或IL-2ELISA组件)来分析IFN-γ以及IL-2浓度。
图6示出了用不同的MAGE-A4反应性全人TCR转导的CD3+T细胞的MAGE-A4GVY-MHC-多聚体结合。将CD3+T细胞自健康供体的PBMC分离并用三种不同的MAGE-A4-TCR和一种不识别MAGE-A4的对照TCR转导。在使这些细胞扩增后，用MAGE-A4GVY-MHC-多聚体和抗CD3的抗体对其染色，并通过流式细胞术分析。在活CD3+细胞上对群体进行门控，并多聚体染色。
图7示出了MAGE-A4全人TCR转基因T细胞识别HLA-A2上呈递的MAGE-A4GVY肽。将转基因T细胞与外部负载有MAGE-A4GVY-肽的T2细胞或已经用MAGE-A4基因转导的A549/HLA-A2细胞共培养。作为阴性对照，分别使用负载有对照肽的T2细胞和未转导的A549/HLA-A2细胞。通过Luminex分析测量共培养上清液中IFN-γ的浓度来分析靶细胞的识别。
图8示出了MAGE-A4全人TCR转基因T细胞以HLA-A2依赖性方式特异性地与MAGE-A4-阳性肿瘤细胞系反应的能力。将转基因T细胞与不同的MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A375,NCI-H1703,NCI-H1755)、MAGE-A4-阳性HLA-A2-阴性肿瘤细胞系(NCI-H520)和MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A549)共培养。为了分析细胞因子的释放，24小时后收获共培养上清液并通过Luminex分析来分析IFN-γ浓度。
图9示出了MAGE-A4全人TCR转基因T细胞以HLA-A2依赖性方式裂解MAGE-A4-阳性肿瘤细胞系的能力。将转基因T细胞与不同的MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A375,NCI-H1755,A549-HLA-A2-MAGE-A4)和MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A549-HLA-A2)共培养。在共培养开始后6小时时开始通过阻抗分析测量对肿瘤细胞系的细胞毒性。
图10示出了MAGE-A4全人TCR转基因T细胞控制移植到NSG小鼠中的MAGE-A4-阳性肿瘤的能力。
图11A-C示出了MAGE-A4 TCR的载体拷贝数(VCN)和表达。用编码全人MAGE-A4 TCR(TCR-5)或增强的变体(TCR-8)的慢病毒载体转导外周血单核细胞(PBMC)。A)TCR-5和TCR-8T细胞中的VCN测量是相当的。B)通过流式细胞术采用GVY-特异性四聚体检测评估T细胞表面上的TCR表达，并以总CD3+T细胞的百分比示出。与TCR-5的表达相比，TCR-8的表达增加。C)通过流式细胞术采用GVY特异性四聚体检测评估T细胞表面上的TCR分子的密度，并以总四聚体+TCR T细胞的几何平均荧光强度(gMFI)示出。与TCR-5表达密度相比，TCR-8的表达密度增加。
图12A-B示出了表达全人MAGE-A4 TCR(TCR-5)或增强的变体(TCR-8)的T细胞在体外特异性杀伤表达MAGE-A4的靶细胞。A)将TCR-5、TCR-8或未转导(UTD)T细胞与A549.A2细胞(A2+、MAGE-A4(-))、NCI-H2023细胞(A2+、MAGE-A4(+))、A375细胞(A2+、MAGE-A4(+))或A549.A2.MAGE4细胞(A2+、MAGE-A4(+))以1:1的E：T比率共培养。24小时后将IFNγ释放作为T细胞活性的生物标记进行评估。当与表达MAGE-A4的靶细胞共培养时，TCR-5和TCR-8T细胞分泌INFγ，但在MAGE-A4阴性存在下，TCR-5和TCR-8T细胞不分泌INFγ。B)将TCR-5、TCR-8或未转导(UTD)的T细胞与A375细胞(A2+、MAGE-A4(+))、A549.A2.MAGE4细胞(A2+、MAGE-A4(+))或U2OS细胞(A2+、MAGE-A4(低))，以10:1、5:1和2.5:1的E：T比率共培养。6小时后通过阻抗将细胞毒性测量为相对于单独肿瘤细胞的标准化百分比。针对三种表达MAGE-A4的细胞系，TCR-5和TCR-8T细胞介导了相当的细胞毒性。
图13A-B示出了在具有表达MAGE-A4的肿瘤的小鼠中，表达全人MAGE-A4 TCR(TCR-5)或增强的变体(TCR-8)的T细胞介导消退。给5只NSG小鼠(每种情况)皮下注射MAGEA4(+)A375肿瘤细胞，并用载体、UTD T细胞或表达全人MAGE-A4 TCR(TCR-5)或增强的变体(TCR-8)的T细胞处理。每周两次测量肿瘤生长，并通过与接受UTD和载体对照的小鼠进行比较来评价TCR T细胞抗肿瘤活性。A)具有50mm3 A375肿瘤的小鼠接受5×106(左)或1.5×106(右)个UTD T细胞、TCR-5T细胞或TCR-8T细胞。TCR-5和TCR-8T细胞均以5×106个T细胞的剂量控制肿瘤，但是TCR-8T细胞在1.5×106个T细胞的较低剂量下显示增加的肿瘤控制。B)具有100mm3 A375肿瘤的小鼠接受10×106个UTD T细胞、TCR-5T细胞或TCR-8T细胞。与TCR-5 T细胞或UTD T细胞相比，TCR-8T细胞介导增加的肿瘤消退。
发明详述
A.概述
MAGE-A4表达模式使其成为ACT的合适的肿瘤特异性靶标。MAGE-A4包括十肽形式的表位(Duffour等，Eur J Immunol.1999 10:3329-37)，该种十肽具有由HLA-A2分子呈递的氨基酸序列GVYDGREHTV(SEQ ID NO:1)。总之，MAGE-A4是ACT的合适的肿瘤特异性靶标。需要用于癌症免疫疗法的靶向MAGE-A抗原的新型、安全且有效的TCR效应物。本发明涉及有效靶向癌细胞上MAGE-A4抗原的T细胞受体，旨在解决这种未满足的医学需要。
B.定义
在参照本发明的一些优选实施方案更详细地描述本发明的各方面之前，提供以下一般定义。
如以下说明性描述的本发明可以在缺少任何未在本文具体公开的一个或多个要素、一个或多个限制的情况下适当地实施。
将参照特定实施例和一些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。
当在本说明书和权利要求书中使用术语“包括(包含)”时，其不排除其他元素。对于本发明的目的，术语“由…组成”被认为是术语“包括(包含)…”的优选实施方案。在下文中，如果将一组定义为包括至少一定数量的实施方案，则也应理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。
对于本发明的目的，术语“获得”被认为是术语“可获得的”的优选实施方案。在下文中，如果例如将抗体被定义为从特定来源可获得的，则也应理解为公开了从该来源获得的抗体。
当在提及单数名词时使用不定冠词或定冠词，如“一个”、“一种”或“所述”时，除非特别说明，否则其包括该名词的复数形式。在本发明的上下文中，术语“约”或“大约”表示本领域技术人员将理解其仍然确保所讨论特征的技术效果的准确度的间隔。该术语通常表示与所示数值的间隔为±10％，优选±5％，更优选±2％，最优选±1％。
除非另有说明，在一系列要素之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个要素。术语“至少一个”是指一个或多个，比如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定，许多与本文描述的本发明的具体实施方案的等同物。本发明旨在涵盖此类等同物。
术语“和/或”无论在本文何处使用均包括“和”、“或”以及“由所述术语连接的元素的全部或任何其它组合”的含义。
术语“小于”或“大于”不包括具体的数目。例如，小于20意为小于所指示的数目。同样地，大于或高于意味着大于或高于所指示的数目，如，大于80％意指大于或高于所指示的数目80％。
术语“包括”意指“包括但不限于”。“”包括与“包括但不限于”可互换使用。
在本说明书的整个说明书和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为既考虑复数又考虑单数。
技术术语以它们对本领域技术人员的常识或含义来使用。如果特定的含义被传达给某些术语，则这些术语的定义将在以下该术语使用的上下文中给出。
在本公开中阐述了另外的定义。
本说明书全文所引用的所有出版物(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书等)，无论在前还是在后，均以引用的方式全文并入本文。本文的任何内容均不能被解释为承认本发明由于在先发明而不早于这样的公开物。在通过引用并入的材料与本说明书矛盾或不一致时，本说明书将取代任何这样的材料。
本文引用的所有文献和专利文献的内容均通过引用整体并入本文。
C.TCR背景
TCR由两条不同且分开的蛋白质链组成，即TCR alpha(α)和TCR beta(β)链。TCRα链包括可变区(V)、连接区(J)和恒定区(C)。TCR β链包含可变区(V)、多样性区(D)、连接区(J)和恒定区(C)。TCRα和TCRβ链的重排V(D)J区包含高变区(CDR，互补决定区)，其中的CDR3区决定特异性表位识别。在C-末端区，TCRα链和TCRβ链均含有疏水跨膜结构域，并在短胞质尾区终止。
通常，该TCR为一个α链与一个β链的异二聚体。该异二聚体可与呈递肽的MHC分子结合。
在上下文中，术语“可变TCR α区”或“TCRα可变链”或“可变结构域”是指TCRα链的可变区。在上下文中，术语“可变TCRβ区”或“TCRβ可变链”是指TCRβ链的可变区。
使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法(IMGT数据库，www.IMGT.org；Giudicelli等，Nucl.Acids Res.,34,D781-D784(2006).；Lefranc and Lefranc,Academic Press2001)对TCR基因座和基因命名。
D.MAGE-A4
第一方面涉及对MAGE-A4特异性的分离的T细胞受体(TCR)。
MAGE-A4属于所谓的癌症/睾丸抗原的组。癌症/睾丸抗原在各种恶性肿瘤和生殖细胞中表达，但在其它成人组织中不表达。因此，MAGE-A4是一种有趣的免疫治疗靶抗原。将编码MAGE-A4的人基因命名为MAGEA4(ENSG00000147381)。
特别地，本文考虑的TCR特异性地识别包含MAGE-A4的氨基酸230至239的表位，即氨基酸序列SEQ ID NO:1(GVYDGREHTV；本文也称为MAGE-A4GVY)或其片段。
通常，当抗原由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递时，TCR识别所述抗原的肽片段。
人白细胞抗原(HLA)系统或复合物是编码人主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的基因复合物。HLA-A*02(HLA-A2)是HLA-A基因座处的一个具体的I类主要组织相容性复合体(MHC)等位基因组。HLA-A*02:01是具体的HLA-A*02等位基因。
因此，在具体实施方案中，该TCR特异性地识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式，在甚至更具体的实施方案中，该TCR特异性地识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
TCR对MAGE-A4是高度特异性的，并且对其它肽没有表现出交叉反应性。这意味着TCR不识别不表达MAGE-A4的正常人细胞系，所述正常人细胞系包括心肌细胞、内皮细胞、肺成纤维细胞、肝细胞、肾皮质上皮细胞、星形胶质细胞、支气管上皮细胞和神经元。交叉反应性可通过如本文所述的IFN-γ分泌来测量。
在上下文中，术语“对…特异性的”意指TCR特异性结合靶标。在特定的实施方案中，TCR对MAGE-A4是特异性的，并且特异性地结合由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
E.TCR特异性序列
TCR的TCRα链的CDR3可具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:24的氨基酸序列。
TCR的TCRβ链的CDR3可具有选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
一些实施方案涉及一种分离的TCR，其包含TCRα链和TCRβ链，其中a)所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的互补决定区3(CDR3)，和所述TCRβ链包含具有SEQ IDNO:7的氨基酸序列的CDR3；或b)所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，和所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；或c)所述TCRα链包含具有SEQID NO:24的氨基酸序列的CDR3，和所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3。
更具体的实施方案涉及分离的TCR，其中所述TCR包含：a)TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；或b)TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；或c)TCRα链和TCRβ链，所述TCRα链包含具有SEQ IDNO:22的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3，所述TCRβ链包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1，具有SEQID NO:26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3。
优选的实施方案涉及由CDR，特别是由如上所述的TCRα和TCRβ链的CDR3定义的分离的TCR，其中重组TCR序列经修饰而含有鼠源化的，优选地最小鼠源化的Cα和Cβ区。
在特别优选的实施方案中，分离的TCR由CDR定义，特别是由上述TCRα及TCRβ链的CDR3定义，其中重组TCR序列经修饰而在Cα跨膜结构域中含有最小鼠源化的Cα及Cβ区域及疏水性氨基酸突变。在特定的实施方案中，与没有最小鼠源化并且在Cα跨膜区中不含有疏水性突变的TCR相比，这些TCR具有增加的表达和功能性亲合力。
在进一步优选的实施方案中，分离的TCR由CDR定义，特别是由如上所述的TCRα和TCRβ链的CDR3定义，其中重组TCR序列未被修饰为含有鼠源化的或最小鼠源化的Cα和Cβ区。
一些实施方案涉及分离的TCR，其中所述TCR包含：a)具有与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRβ区；或b)具有与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRβ区；或c)具有与SEQ ID NO:28具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:29具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRβ区。
如本文所用，“至少80％同一性”，特别是“具有与…具有至少80％同一性的氨基酸序列”包括所述氨基酸序列与所示氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
在一些实施方案中，所述TCR包含TCRα链和TCRβ链，其中a)可变TCRα区具有与SEQID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的CDR3，和可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的CDR3，或b)可变TCR α区具有与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的CDR3，和可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:17所示氨基酸序列的CDR3；或c)可变TCRα区具有与SEQ ID NO:28具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:24所示氨基酸序列的CDR3；和可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:29具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含具有SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的CDR3。
示例性实施方案涉及分离的TCR，其中所述TCR包含：a)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区；或b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变TCRβ区；或c)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变TCRα区和具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变TCR β区。
下表示出了示例性TCR的概述
TCR CDR1α CDR2α CDR3α TRAV TRAJ CDR1β CDR2β CDR3β TRBV TRBJ
1，4，7 TSDQSYG QGSYDEQN CAMSGDSAGNMLTF 14 39 KGHDR SFDVKD CATSDWDRSGDKETQYF 24 2-5
2，5，8 TSDPSYG QGSYDQQN CAMSGGYTGGFKTIF 14 9 SGDLS YYNGEE CASSGGDGDEQFF 9 2-1
3，6，9 DSASNY IRSNVGE CAASRGTGFQKLVF 13 8 LGHDT YNNKEL CASSQFWDGAGDEQYF 3-1 2-7
从实施例中可以看出，本文考虑的TCR对MAGE-A4是特异性的。
优选使用Vector NTI AdvanceTM 10程序的AlignX应用(InvitrogenCorporation，Carlsbad CA，USA)来完成多个序列之间的百分比同一性的测定。该程序使用改进的Clustal W算法(Thompson等，Nucl Acids Res 1994；42：23-33；InvitrogenCorporation.User Manual2004；389-662)。采用AlignX应用的标准参数进行百分比同一性的测定。
本文所考虑的TCR是经分离的或纯化的。“分离的”是指TCR不存在于其最初天然存在的环境中。“纯化的”是指，例如所述TCR不含或基本上不含其最初来源的细胞的其它蛋白质和非蛋白质部分。
在一些实施方案中，TCR的氨基酸序列可包含一个或多个表型沉默置换。
“表型沉默置换”也被称为“保守氨基酸置换”。“保守氨基酸置换”的概念是本领域技术人员所理解的，并优选地意指编码正电荷残基(H、K和R)的密码子被编码正电荷残基的密码子置换，编码负电荷残基(D和E)的密码子被编码负电荷残基的密码子置换，编码中性极性残基(C、G、N、Q、S、T和Y)的密码子被编码中性极性残基的密码子取代，编码中性非极性残基(A、F、I、L、M、P、V和W)的密码子被编码中性非极性残基的密码子取代。这些变异可以自发发生，通过随机诱变引入，或者可以通过定向诱变引入。可以进行这些改变而不破坏这些多肽的基本特征。普通技术人员可以容易地和常规地筛选变体氨基酸和/或编码它们的核酸，以通过本领域已知的方法确定这些变异是否显著降低或破坏配体结合能力。
根据一些实施方案，TCR的氨基酸序列经修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。
可检测标记的非限制性实例是放射性标记、荧光标记、核酸探针、酶和造影剂。可与TCR缔合的治疗剂包括放射性化合物、免疫调节剂、酶或化疗剂。治疗剂可以被与TCR连接的脂质体包封，使化合物可以在靶部位缓慢释放。这将避免在体内转运期间的损坏，并确保在TCR与相关抗原呈递细胞结合后，治疗剂(如毒素)发挥其最大效果。治疗剂的其它实例是：肽细胞毒素，即具有杀伤哺乳动物细胞能力的蛋白质或肽，比如蓖麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNase和RNase。小分子细胞毒性剂，即具有杀伤哺乳动物细胞的能力的化合物，所述化合物具有小于700道尔顿的分子量。此类化合物可以含有能够具有细胞毒性效应的有毒金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂还包括前药，即在生理条件下降解或转化以释放细胞毒性剂的化合物。此类药剂可以例如包括多西他赛、吉西他滨、顺铂、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、依托泊苷、异环磷酰胺、伊立替康、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、米托蒽醌、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213。放射性核素与TCR或其衍生物的缔合可例如通过螯合剂进行；免疫刺激剂(immunostimulator)，也称为免疫刺激剂(immunostimulant)，即刺激免疫应答的免疫效应分子。示例性免疫刺激剂是诸如如IL-2和IFN-γ的细胞因子、抗体或其片段，包括抗-T细胞或NK细胞决定簇抗体(例如，抗-CD3、抗-CD28或抗-CD16)；具有抗体样结合特征的可选蛋白骨架；超抗原，即引起T细胞非特异性活化从而导致多克隆T细胞活化和大量细胞因子释放的抗原，及其突变体；趋化因子比如IL-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激蛋白等，补体活化剂；异种蛋白结构域、同种异体蛋白结构域、病毒/细菌肽。
人T淋巴细胞上的抗原受体分子(T细胞受体分子)与细胞表面上的CD3(T3)分子复合物非共价地缔合。用抗-CD3单克隆抗体干扰该复合物诱导T细胞活化。因此，一些实施方案涉及(通常通过融合至α或β链的N-或C-末端)与抗-CD3抗体或所述抗-CD3抗体的功能片段或变体缔合的本文所述的TCR。适用于本文所述的组合物和方法的抗体片段和变体/类似物包括微抗体、Fab片段、F(ab')2片段、dsFv和scFv片段、纳米抗体TM(Ablynx(Belgium))、包含源自骆驼科(例如骆驼或美洲驼或羊驼)抗体的合成单免疫球蛋白可变重链结构域的分子和结构域抗体(Domain Antibodies)(包含亲和力成熟的单免疫球蛋白可变重链结构域或免疫球蛋白可变轻链结构域(Domantis(Belgium))或表现出抗体样结合特性的可选蛋白质骨架，比如Affobodies(包含工程化蛋白A骨架Affibody(Sweden))或Anticalins(包含工程化的anticalins Pieris(Germany))。
优选地，治疗剂可选自免疫效应分子、细胞毒性剂和放射性核素。优选地，免疫效应分子是细胞因子。
药代动力学修饰部分可以是例如至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或它们的组合。可以以本领域技术人员已知的许多方式引发至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团的缔合。在优选的实施方案中，所述单元共价连接至TCR。本文考虑的TCR可以被一个或数个药代动力学修饰部分修饰。特别地，由一个或数个药代动力学修饰部分修饰TCR的可溶形式。药代动力学修饰部分可以实现治疗剂的药代动力学特征的有益变化，例如改善的血浆半衰期、降低或增强的免疫原性和改善的溶解性。
本文考虑的TCR可为可溶的或膜结合的。术语“可溶的”是指可溶形式(即，不具有跨膜结构域或胞质结构域)的TCR，例如用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂。为了稳定，优选地，正如例如WO 03/020763中所述，可溶性αβ异二聚体TCR在各恒定区的残基之间引入二硫键。存在于αβ异二聚体中的一个或两个恒定结构域可以在C末端或多个C端截短，例如截短至多15个、或至多10个、或至多8个或更少的氨基酸。为了用于过继疗法，αβ异二聚体TCR可例如作为具有胞质结构域和跨膜结构域两者的全长链而被转染。TCR可以含有与天然发现的相应α和β恒定结构域之间的二硫键相对应的二硫键，另外地或可选地，可以存在非天然二硫键。
因此，可通过连接另外的功能部分来修饰TCR，尤其是本文考虑的TCR的可溶形式，用于如降低免疫原性、增加流体动力学大小(溶液中的大小)、溶解度和/或稳定性(如，通过增强对蛋白水解降解的保护)和/或延长血清半衰期。其它可用于切断(shut off)在患者体内携带本发明TCR的效应宿主细胞的可用功能部分和修饰包括“自杀”或“安全开关”。一个实例是Gargett和Brown.Front Pharmacol 2014；5:235描述的可诱导的Caspase 9(iCasp9)“安全开关”。简言之，通过熟知的方法修饰效应宿主细胞以使其表达Caspase 9结构域(其二聚化依赖于小分子二聚化物药物如AP1903/CIP，并导致在经修饰的效应细胞中快速诱导凋亡)。该系统例如描述在EP2173869(A 2)中。其它“自杀”或“安全开关”的实例是本领域已知的，如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，CD20的表达和随后使用抗-CD20抗体或myc标签的耗竭(Kieback等，Proc Natl Acad Sci USA 2008 15；105(2):623-628)。
本文还设想了具有改变的糖基化形式的TCR。如本领域已知的，糖基化形式可以取决于氨基酸序列(如，下文讨论的特定糖基化氨基酸残基的存在与否)和/或产生所述蛋白质的宿主细胞或生物体。多肽的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的是指将碳水化合物部分附着到天冬酰胺残基的侧链上。通过改变氨基酸序列，使其含有一个或多个选自天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸的三肽序列(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)，可方便地实现向结合分子添加N-连接的糖基化位点。可以通过向起始序列添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来引入O-连接的糖基化位点。
另一种使TCR糖基化的方法是通过糖苷与蛋白质的化学或酶促偶联。根据所用的偶联方式，可以将糖附着到(a)精氨酸和组氨酸、(b)游离羧基、(c)游离巯氢基，比如半胱氨酸的巯氢基、(d)游离羟基，比如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的羟基、(e)芳族残基，比如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。类似地，可以如通过将TCR暴露于三氟甲磺酸从而化学地或通过使用内切糖苷酶和外切糖苷酶从而酶促地完成去糖基化(即移除结合分子上存在的碳水化合物部分)。
还可以想到将药物(比如小分子化合物)添加至TCR，尤其是本发明TCR的可溶形式。可以通过共价键或非共价相互作用，比如通过静电力来实现连接。可以使用本领域已知的各种连接子以形成药物缀合物。
可以修饰TCR，特别是本发明TCR的可溶形式以引入其它结构域，所述结构域有助于识别、示踪、纯化及/或分离相应分子(标记)。因此，在一些实施方案中，可以修饰TCRα链或TCRβ链以使其包含表位标签。
表位标签是可引入TCR的标签的用实例。表位标签是氨基酸的短区段，其允许结合特异性抗体，并因此能够对可溶性TCR或宿主细胞在患者体内或培养的(宿主)细胞内的结合和移动进行识别和示踪。因此，可使用许多不同的技术来实现表位标签的检测，并因此实现经标记的TCR的检测。通过在对所述标签特异的结合分子(抗体)存在下培养携带本发明TCR的宿主细胞，标签可进一步用于刺激和扩增所述细胞。
通常，在一些情况下，可以用修饰TCR与靶抗原的亲和力和解离速率的各种突变来修饰TCR。特别地，此类突变可以增加亲和力和/或降低解离速率。因此，该TCR可在至少一个CDR及其可变结构域框架区中突变。
然而，在优选的实施方案中，未对TCR的CDR区进行修饰或体外亲和成熟化，例如对于实施例中的TCR受体。这意味着CDR区具有天然存在的序列。这可能是有利的，因为体外亲和力成熟可导致对TCR分子的免疫原性。这可能导致降低或灭活治疗效果和治疗和/或诱导不良反应的抗药物抗体的产生。
突变可以是一个或多个置换、缺失或插入。可通过本领域已知的任何合适方法引入这些突变，比如DNA合成、聚合酶链反应、基于限制性酶的克隆、非连接依赖性克隆方法，它们描述于例如Sambrook,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012。
理论上，由于内源和外源TCR链之间的错配，可能发生具有交叉反应性风险的不可预测的TCR特异性。为了避免TCR序列的错配，可以修饰重组TCR序列使其含有最少的鼠源化的Cα和Cβ区，这是一种已被证明有效增强多种不同转导的TCR链的正确配对的技术。TCR的鼠源化(即，用其鼠的对应物交换α和β链中的人恒定区)是一种为了改善宿主细胞中TCR的细胞表面表达而普遍应用的技术。不希望受特定理论的束缚，认为鼠源化的TCR更有效地与CD3共受体缔合；和/或优先彼此配对并且更不易于在人T细胞上形成混合的TCR，所述人T细胞经离体遗传修饰以表达所需抗原特异性的TCR但仍保留并表达其“原始”TCR。
已经识别了负责改善鼠源化TCR表达的九个氨基酸(Sommermeyer和Uckert，JImmunol.2010；184(11):6223-6231)并设想将TCRα和/或β链恒定区的一个或全部氨基酸置换为其鼠源对应物残基。这种技术也被称为“最小鼠源化”，并且提供了增强细胞表面表达的优点，同时，减少了氨基酸序列中“异源”氨基酸残基的数量，并且因此，降低了免疫原性的风险。
在优选的实施方案中，含有最小鼠源化的Cα和Cβ区的TCR为包含SEQ ID NO:10的α链和SEQ ID NO:11的β链的TCR-1，包含SEQ ID NO:20的α链和SEQ ID NO:21的β链的TCR-2，包含SEQ ID NO:30的α链和SEQ ID NO:31的β链的TCR-3。
在优选的实施方案中，TCR含有最小鼠源化Cα和Cβ区，并且在Cα跨膜结构域中进一步包含疏水性氨基酸突变。已证明，TCRα链的跨膜结构域导致整个链缺乏稳定性，并由此影响整个TCR-CD3复合物的形成和表面表达。用疏水性氨基酸亮氨酸或缬氨酸置换TCRα跨膜结构域中的三个氨基酸增加了TCR表达和功能性亲合力。Haga-Friedman等，J.Immunology2012；188:5538-5546。
在优选的实施方案中，在TCRα链中含有最小鼠源化Cα和Cβ区以及疏水性氨基酸置换的TCR为包含SEQ ID NO:102的α链和SEQ ID NO:103的β链的TCR-7，包含SEQ ID NO:108的α链和SEQ ID NO:109的β链的TCR-8，包含SEQ ID NO:114的α链和SEQ ID NO:115的β链的TCR-9。
一些实施例涉及如本文所述的分离的TCR，其中所述TCR为单链类型，其中TCR α链与TCRβ链通过连接子序列连接，任选地其中所述连接子为可切割的。
合适的单链TCR形式包含由对应于可变TCRα区的氨基酸序列构成的第一区段，由对应于与TCRβ链恒定区胞外序列对应的氨基酸序列的N末端融合的可变TCRβ区的氨基酸序列构成的第二区段，以及将第一区段的C末端与第二区段的N末端连接的连接子序列。或者，所述第一区段可由对应于TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，所述第二区段可由对应于与TCRα链恒定区胞外序列对应的氨基酸序列的N末端融合的TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成。上述单链TCR可进一步包含第一和第二链之间的二硫键，其中连接子序列的长度和二硫键的位置使得第一和第二区段的可变结构域序列基本上如在天然T细胞受体中那样相互取向。更具体地，所述第一区段可由对应于与TCR α链恒定区胞外序列相对应的氨基酸序列的N末端融合的TCRα链可变区序列的氨基酸序列构成，所述第二区段可由对应于与TCRβ链恒定区胞外序列相对应的氨基酸序列的N末端融合的TCRβ链可变区的氨基酸序列构成，并且在所述第一和第二链之间提供二硫键。连接子序列可以是不损害TCR功能的任何序列。
“功能性”TCRα和/或β链融合蛋白质应意指至少保持基本生物活性的TCR或TCR变体，例如通过添加、缺失或置换氨基酸而进行修饰。在TCR的α和/或β链的情况下，这将意味着两条链均保持能够形成T细胞受体(无论具有未修饰的α和/或β链或具有另一本发明的融合蛋白α和/或β链)，该T细胞受体发挥其生物功能，特别是结合所述TCR的特异性肽-MHC复合物，和/或在特定肽：MHC相互作用后的功能性信号转导。
在特定实施方案中，可将TCR修饰为功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述表位-标签具有6至15个氨基酸，优选9至11个氨基酸的长度。在另一实施方案中，可将TCR修饰为功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白包含间隔开的或直接串联的两个或更多个表位-标签。融合蛋白的实施方案可以含有2、3、4、5或甚至更多个表位-标签，只要所述融合蛋白保持了其生物活性(“功能性”)。
优选的是根据本发明的功能性T细胞受体(TCR)α和/或β链融合蛋白，其中所述表位-标签选自、但不限于CD20或Her2/neu标签，或其它常规标签，比如myc-标签、FLAG-标签、T7-标签、HA-(血凝素)标签、His-标签、S-标签、GST-标签或GFP-标签。Myc-、T7-、GST-、GFP-标签是源自现有分子的表位。相对地，FLAG是设计用于高抗原性的合成表位标签(参见，如，美国专利No.4,703,004和4,851,341)。可以优选使用Myc标签，因为可将高质量的试剂可用于其检测。除了被抗体识别之外，表位标签当然可以具有一种或多种另外的功能。这些标签的序列在文献中进行了描述，并且是本领域技术人员熟知的。
在更优选的实施方案中，分离的TCR以融合蛋白的形式表达，其中TCRα链和TCRβ链被一个或多个多肽切割信号分开。在具体的实施方案中，融合蛋白从5'至3'包含：TCR α链、一个或多个多肽切割信号，和TCRβ链。在具体的实施方案中，融合蛋白从5'至3'包含：TCRβ链、一个或多个多肽切割信号，和TCRα链。
本文考虑的多肽切割信号包括、但不限于蛋白酶切割位点和核糖体跳跃序列。多肽切割信号可位于本文所述的每个多肽结构域之间，如TCRα链和TCRβ链之间。此外，可以将多肽切割信号置于任何连接子肽序列中。示例性多肽切割信号包括多肽切割识别位点，比如蛋白酶切割位点、核酸酶切割位点(例如，罕见限制酶识别位点、自切割核酶识别位点)和自切割病毒寡肽或核糖体跳跃序列(参见deFelipe和Ryan，2004.Traffic,5(8)；616-26)。
适用于具体实施方案的蛋白酶切割位点的示例性实例包括、但不限于弗林蛋白酶(如Arg-X-X-Arg，比如Arg-X-Lys/Arg-Arg或Arg-GIn/Tyr-Lys/Arg-Arg；弗林蛋白酶可进一步切割序列Arg-Ala-Arg-Tyr-Lys-Arg或Arg-Ala-Arg-Tyr-Lys-Arg-Ser)；枯草杆菌蛋白酶(如PC2、PC1/PC3、PACE4、PC4、PC5/PC6、LPC/PC7IPC8/SPC7和SKI-I)；肠激酶(如Asp-Asp-Asp-Aps-Lys*和Asp/Glu-Arg-*Met)；Xa因子(Glu-Gly-Arg*)；凝血酶(如Leu-Val-Pro-Arg*Gly-Ser)；颗粒酶B(如Ile-Glu-Pro-Asp*)；caspase-3(如，Asp-Glu-Val-Asp*)；等等。
自切割病毒肽或核糖体跳跃序列的示例性实例包括、但不限于2A或2A样位点、序列或结构域(Donnelly等，2001.J.Gen.Virol.82:1027-1041)。在具体的实施方案中，病毒2A肽是口疮病毒属(aphthovirus)2A肽、马铃薯Y病毒组(potyvirus)2A肽或心病毒属(cardiovirus)2A肽。在优选的实施方案中，病毒2A肽选自：口蹄疫病毒2A肽(F2A)、马鼻炎A病毒2A肽(E2A)、Thosea asigna病毒2A肽(T2A)、猪捷申病毒-1 2A肽(P2A)、泰勒病毒(Theilovirus)2A肽、脑心肌炎病毒2A肽。
在一些实施方案中，融合蛋白包含TCRα链、蛋白水解切割位点和/或核糖体跳跃序列以及TCRβ链。在优选的实施方案中，该融合蛋白包含TCRα链、弗林蛋白酶切割位点和/或P2A核糖体跳跃序列以及TCRβ链。在其它优选的实施方案中，该融合蛋白质包含TCRα链、P2A核糖体跳跃序列以及TCRβ链。
在特定的实施方案中，融合蛋白包含TCRβ链、蛋白水解切割位点和/或核糖体跳跃序列以及TCRα链。在优选的实施方案中，融合蛋白包含TCRβ链、弗林蛋白酶切割位点和/或P2A核糖体跳跃序列以及TCRα链。在其它优选的实施方案中，融合蛋白包含TCRβ链、P2A核糖体跳跃序列以及TCRα链。
在优选的实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO:94、96、98、104、110和116中任一项所示的氨基酸序列。
F.TCR片段和变体
另一方面涉及包含本文所述TCR的功能部分的多肽。所述功能部分可以包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:27的氨基酸序列中的至少一个。
在特定的实施方案中，所述多肽可以是如，可溶形式的单独的TCR的功能部分。或者，所述多肽可以与其它结构域组合。
所述功能部分可介导TCR与抗原结合，特别是与抗原-MHC复合物结合。在一个实施方案中，所述功能部分包含本文所述的TCRα可变链和/或TCRβ可变链。
TCR变体分子，即将包含TCR的功能性部分的多肽与其它结构域组合的分子，可具有TCR受体的结合特性，但可与效应细胞(而非T细胞)的信号传导结构域组合，特别是与NK细胞的信号传导结构域组合。因此，一些实施方案涉及一种包含本文所述TCR的功能部分以及免疫效应细胞(比如NK细胞)的信号传导结构域的蛋白质。
“结合”是指与靶标特异性地和非共价地缔合、联合或结合的能力。
另一方面涉及一种多价TCR复合物，其包含至少两个如本文所述的TCR。在此方面的一个实施方案中，至少两个TCR分子通过连接子部分连接以形成多价复合物。优选地，所述复合物是水溶性的，因此应相应地选择所述连接子部分。优选地，所述连接子部分能够附着至TCR分子上的特定位置，以使所形成的复合物的结构多样性最小化。此方面的一个实施方案是由TCR复合物提供的，其中聚合物链或肽连接子序列在不位于该TCR的可变区序列中的各TCR的氨基酸残基之间延伸。由于所述复合物可用于医学，因此应根据其药学适用性，例如其免疫原性来选择连接子部分。满足上述所需标准的连接子部分的实例是本领域，例如连接抗体片段的领域已知的。
连接子的实例是亲水聚合物和肽连接子。亲水性聚合物的实例是聚亚烷基二醇。这类中最常用的是基于聚乙二醇或PEG的。然而，其它是基于其它合适的、任选取代的聚亚烷基二醇，包括聚丙二醇，以及乙二醇和丙二醇的共聚物。肽连接子由氨基酸链组成，且作用于产生可在其上附着TCR分子的简单连接子或多聚化结构域。
一个实施方案涉及多价TCR复合物，其中所述TCR中的至少一个与治疗剂缔合。
G.细胞因子和趋化因子释放
一些实施方案涉及本文所述的分离的TCR、本文所述的多肽、本文所述的多价TCR复合物，其中IFN-γ分泌是由效应细胞上表达的本发明TCR与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的结合诱导的。
与结合至HLA-A*02:01编码的分子呈递的不相关肽(ASTN1,SEQ ID NO.56,KLYGLDWAEL)相比，当结合至由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列时，由效应细胞上表达的本发明的TCR与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO：1的氨基酸序列的结合所诱导的IFN-γ分泌可高100倍以上，优选地高500倍以上，更优选地高2000倍以上。IFN-γ分泌可以是例如大于100pg/ml，比如大于500pg/ml或大于2000pg/ml。
可以使用体外测定法来测量细胞因子和趋化因子释放(比如IFN-γ分泌)，在所述体外测定法中，将K562细胞(Greiner等，2006,Blood.2006 Dec 15；108(13):4109-17))用ivtRNA转染或转导以分别表达SEQ ID NO:1的氨基酸序列或不相关肽，并将其用表达待研究TCR的富含CD8+和/或非富含CD8+的PBMC温育，或者在体外测定中，使用外部负载有SEQ IDNO:1或不相关肽的T2细胞，并随后将其用表达待研究TCR的富含CD8+和/或非富含CD8+的PBMC共温育。
一些实施方案涉及如本文所述的分离的TCR、如本文所述的多肽或如本文所述的多价TCR复合物，其中由效应细胞上表达的的本发明TCR与SEQ ID NO:1的氨基酸序列或特别是与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的结合所诱导的IFN-γ分泌低于预定阈值。所述阈值可以通过使用至少2:1的特定效应细胞与靶细胞的比率来确定。
“效应细胞”可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。通常，效应细胞是免疫效应细胞，尤其是T细胞。其它合适的细胞类型包括γ-δT细胞、自然杀伤(NK)细胞和NK-样T(NKT)细胞。
可以在至少10-7[M]，优选地至少10-8[M]，更优选地10-9[M]的MAGE-A4肽浓度下诱导在效应细胞上表达的本发明TCR与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列结合时的IFN-γ分泌。在具体实施方案中，例如当TCR转基因T细胞与T2细胞的比率为2:1时，在至少10-7[M]，优选地至少10-8[M]，更优选地10-9[M]的MAGE-A4肽浓度下可诱导在效应细胞上表达的本发明TCR与由HLA-A *02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列结合时的IFN-γ分泌。
本发明还涉及用于识别与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的靶标氨基酸序列SEQID NO:1结合的TCR或其片段的方法，其中所述方法包括使候选TCR或其片段与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的氨基酸序列SEQ ID NO:1接触，并确定候选TCR或其片段是否与靶标结合和/或介导免疫应答。
可例如通过测量细胞因子分泌(比如IFN-γ分泌)来确定所述候选TCR或其片段是否介导了免疫应答。如上所述，可以例如通过体外测定来测量细胞因子分泌，在所述体外测定中，将用编码氨基酸序列SEQ ID NO:1的ivtRNA转染的K562细胞(或其它APC)用表达待研究TCR或表达包含所述TCR片段的分子的富含CD8+的PBMC温育。
H.核酸、载体
另一个方面涉及编码如本文所述的TCR的核酸或编码如本文所述的TCR的多核苷酸的核酸。
下表示出了编码各个肽序列的核苷酸序列：
Figure BDA0003377521100000241
Figure BDA0003377521100000251
Figure BDA0003377521100000261
“核酸分子”和“核苷酸序列”通常指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，从天然来源合成或获得(如，分离和/或纯化)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接(linkage)，比如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接，而非在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯，优选地，本文所述的核酸是重组的，如本文所用，术语“重组”指(i)通过将天然或合成的核酸区段与可以在活细胞中复制的核酸分子接合而在活细胞外构建的分子，或(ii)由以上(i)中所述的那些复制产生的分子。对于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。可以基于采用本领域已知的或商业上可获得的方法(如，来自Genscript,Thermo Fisher及类似公司)的化学合成和/或酶促连接反应来构建核酸。例如，采用天然存在的核苷酸或各种修饰的核苷酸来以化学地合成核酸(参见Sambrook等)，所述各种修饰的核苷酸被设计为用于增加所述分子的生物稳定性或用以增加杂交后形成的双链体的物理稳定性(如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。核酸可以包含编码任何重组TCR、多肽或蛋白或其功能部分或功能变体的任何核苷酸序列。
本发明亦提供所述分离或纯化的核酸的变体，其中所述变体核酸包含与编码本文所述的TCR的核苷酸序列具有至少75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。这种变体核苷酸序列编码特异性识别MAGE-A4的功能TCR。
本公开还提供了分离或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或包含在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
在严格条件下杂交的核苷酸序列优选地在高严格条件下杂交。“高严格条件”是指核苷酸序列以比非特异性杂交更强可检测的量与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交。高严格条件包括将具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少量分散错配的多核苷酸与随机序列区分的条件，所述随机序列碰巧具有很少的与核苷酸序列匹配小区域(如，3-10个碱基)。这种小的互补区域比14-17个或更多个碱基的全长互补更容易解链，并且高严格性杂交使它们容易区分。相对高严格条件包括，例如，低盐和/或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或等同物，在约50-70℃的温度下提供的。此类高严格条件容许核苷酸序列和模板或靶链之间很少的错配(如果有的话)，并且特别适合于检测本文所述的任何TCR的表达。通常认为，通过加入增加量的甲酰胺可使条件更严格。
在具体实施方案中，核酸是密码子优化的。如本文所用，术语“密码子优化的”是指在编码多肽的多核苷酸中置换密码子以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括、但不限于以下中的一种或多种：(i)两种或更多种生物体或基因或合成构建的偏倚表之间的密码子偏倚(biases)的变化，(ii)生物体、基因或基因组内的密码子偏倚程度的变化，(iii)密码子(包括环境)的系统性变化，(iv)根据其解码tRNA的密码子的变化，(v)根据GC％的密码子的变化，无论是整体上还是在三联体的一个位置，(vi)与参考序列(例如天然存在的序列)的相似程度的变化，(vii)密码子频率截止的变化，(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构特性，(ix)关于密码子置换组的设计所基于的DNA序列的功能的先前知识，(x)每个氨基酸的密码子组的系统性变化，和/或(xi)假翻译起始位点的分离移除。
另一个实施方案涉及包含编码本文所述TCR的核酸的载体。优选地，所述载体是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或颗粒和/或用于基因疗法的载体。
“载体”是具有能够将核酸序列携带到合适的宿主细胞中的能力的任何分子或组合物，在所述宿主细胞中可以进行所编码多肽的合成。通常并且优选地，载体是已经使用本领域已知的重组DNA技术工程化以引入所需核酸序列的核酸。载体可以包括DNA或RNA和/或包括脂质体。载体可以是质粒、穿梭载体、噬菌粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或颗粒和/或用于基因疗法的载体。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，比如复制起点。载体还可以包括一个或多个选择标志物基因和本领域普通技术人员已知的其它遗传元件。优选地载体是包含根据本发明的核酸的表达载体，所述核酸与允许所述核酸表达的序列可操作地连接。
在优选的实施方案中，载体包含一种核酸，所述核酸编码：具有SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列的TCRβ链和具有SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的TCRα链的核酸；具有SEQID NO:90所示的氨基酸序列的TCR β链和具有SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列的TCRα链；具有SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列的TCRβ链和具有SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的TCRα链；具有SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列的TCR β链和具有SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列的TCRα链；具有SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列的TCR β链和具有SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列的TCRα链；或具有SEQ ID NO:115所示的氨基酸序列的TCRβ链和具有SEQ ID NO:114所示的氨基酸序列的TCRα链。
优选地，所述载体是表达载体。更优选地，所述载体是逆转录病毒，更具体地是γ-逆转录病毒或慢病毒载体。
I.细胞、细胞系
另一方面涉及表达本文所述TCR的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是分离的或非天然存在的。在具体的实施方案中，所述细胞可包含编码本文所述TCR的核酸或包含所述核酸的载体。
在细胞中，可以引入包含编码上述TCR的核酸序列的上述载体，或者可以引入编码所述TCR的ivtRNA。细胞可以是外周血淋巴细胞，比如T细胞。在，例如Engels等，CancerCell,2013；23(4):516–526中描述了TCR的克隆和外源表达的方法。在，例如Cribbs等，BMCBiotechnol.2013；13:98中描述了用慢病毒载体转导原代人T细胞。
术语“转染”是指将外源核酸序列引入宿主细胞，如真核宿主细胞的非病毒过程。应注意核酸序列的引入或转移不限于所提及的方法，而是可以通过包括电穿孔、显微注射、基因枪递送、脂转染或superfection的任何数目的手段来实现。
术语“转导”是指使用病毒载体，如腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、牛痘苗病毒、疱疹病毒、逆转录病毒或慢病毒，将外源核酸序列引入宿主细胞。
一些实施方案涉及细胞，其包含：a)包含本文所述的核酸中的至少一个的表达载体，或b)包含编码本文所述的TCR的α链的核酸的第一表达载体，和包含编码本文所述的TCR的β链的核酸的第二表达载体。
在一些实施方案中，所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。细胞可以是自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤样T(NKT)细胞或T细胞。优选地，所述细胞是T细胞。所述T细胞可以是CD4+或CD8+T细胞或双阴性T细胞，即T细胞既不表达CD4也不表达CD8。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞样记忆T细胞。
在优选的实施方式中，TCR不依赖于共受体发挥功能，即TCR在CD8+和CD4+细胞中均发挥功能，如TCR-5和TCR-8。
干细胞样记忆T细胞(TSCM)是CD8+T细胞的分化程度较低的亚群，具有自我更新的能力和长期持续的特征。一旦这些细胞在体内遇到其抗原，它们进一步分化成中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和终末分化的效应记忆T细胞(TEMRA)，其中一些TSCM保持静止(Flynn等，Clinical&Translational Immunology 2014；3(7):e20.)。这些剩余的TSCM细胞显示在体内建立持久的免疫记忆的能力，并因此被认为是用于过继性T细胞疗法的重要T细胞亚群(Lugli等，Nature Protocols 2013；8:33–42,Gattinoni等，Nat.Med.2011；Oct；17(10):1290–1297)。可使用免疫-磁选择以将T细胞库限制为干细胞记忆T细胞亚型，参见》(Riddell等，Cancer Journal 2014；20(2):141–144)。
J.靶向TCR的抗体
另一方面涉及特异性地结合本文所述TCR的一部分的抗体或其抗原结合片段，所述TCR的一部分介导对MAGE-A4的特异性。在一个实施方案中，介导MAGE-A4特异性的TCR的部分包含选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:24的TCR α链的CDR3和选自SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:27的β链的CDR3。
所述抗体或其抗原结合片段可调节TCR的活性。它可以阻断或不阻断TCR与MAGE-A4的结合。其可用于调节TCR的治疗活性或用于诊断目的。
K.药物组合物、医学治疗和试剂盒
另一方面涉及组合物，其包含本文所述的TCR、含有所述TCR的功能部分的多肽、本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、含有所述核酸的载体、含有所述TCR的细胞或与本文所述的TCR的一部分特异性结合的抗体。
另一方面涉及药物组合物，其包含本文所述的TCR、含有所述TCR的功能部分的多肽、本文所述的多价TCR复合物、编码TCR的核酸、含有所述核酸的载体、含有所述TCR的细胞或与本文所述的TCR的一部分特异性结合的抗体。
优选地，可以将本发明的那些活性组分以与可接受的载体或载体材料混合的剂量用于这样的药物组合物中，使得疾病可以得到治疗或至少减轻。此类组合物可以(除了活性组分和载体之外)包括填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其它材料，这些材料是本领域已知的。
术语“药学上可接受的”定义为无毒材料，其不干扰活性组分的生物活性的有效性。载体的选择取决于应用。
药物组合物可以含有增强活性组分的活性或补充治疗的其它组分。这些另外的组分和/或因子可以是药物组合物的一部分，以实现协同效应或使不良或不希望的反应最小化。
在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,volume I and volumeII.22nd Edition.Edited by Loyd V.Allen Jr.Philadelphia,PA:PharmaceuticalPress；2012中公开了本发明活性组分的配制或制备及应用/用药技术，其全部内容通过引用并入本文。合适的应用是肠胃外应用，例如肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结节内、腹膜内或瘤内注射。静脉注射或输注是患者的优选治疗。
根据优选的实施方案，药物组合物通过输注或注射施用。可注射的组合物是药学上可接受的流体组合物，其包含至少一种活性成分，如表达TCR的扩增的T细胞群(例如对于待治疗的患者是自体的或同种异体的)。活性成分通常溶解或悬浮在生理学可接受的载体中，并且所述组合物可以另外包含少量的一种或多种无毒辅助物质，比如乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等。可用于与本发明的融合蛋白一起使用的此类可注射组合物是常规的；本领域普通技术人员熟知合适的制剂。
通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。
因此，另一方面涉及本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞、特异性结合TCR的一部分的抗体、包含一种或多种表达本文所述TCR的细胞的组合物或药物组合物，其用作药物。
一些实施方案涉及本文所述的TCR、包含所述TCR的功能部分的多肽、本文所述的多价TCR复合物、编码所述TCR的核酸、包含所述核酸的载体、包含所述TCR的细胞、或包含其的组合物或药物组合物，其用于治疗癌症。
在一个实施方案中，所述癌症是血液癌症或实体瘤。血液癌症也称为血癌，其不形成实体瘤，并因此在体内扩散。血液癌症的实例是白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。有两种主要类型的实体瘤，肉瘤和癌。肉瘤是例如血管、骨、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱的肿瘤。
在一个实施方案中，所述癌症选自肉瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病。优选地，所述癌症选自NSCLC、SCLC、乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌，或肉瘤。更优选地，所述癌症选自尿路上皮(膀胱)癌、黑素瘤、头颈癌、卵巢癌、NSCLC、食道癌、胃癌、滑膜肉瘤和黏液样圆细胞脂肪肉瘤(MRCLS)。
在一个实施方案中，TCR识别肺癌细胞系，比如NSCLC细胞系NCI-H1703及NSCLC的肝转移细胞系NCI-H1755。
本文还考虑含有以下的一种或多种的药物组合物和试剂盒：(i)如本文所述的分离的TCR；(ii)包含编码重组TCR的核酸的病毒颗粒；(iii)经修饰以表达如本文所述的重组TCR的免疫细胞，比如T细胞或NK细胞；(iv)编码如本文所述的重组TCR的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包含含有编码本文所述的重组TCR的核苷酸序列的慢病毒载体颗粒(或使用本文所述的载体颗粒修饰以表达重组TCR的T细胞)。此类组合物可以以本文进一步描述的本发明的方法施用给受试者。
根据已知的技术或其基于本发明的内容的对本领域技术人员是显而易见的变形，可以将包含本文所述的修饰的T细胞的组合物用于过继免疫治疗的方法和组合物中。
在一些实施方案中，通过首先从细胞培养基中收获细胞，然后洗涤并以治疗有效量浓缩在适于施用的培养基和容器系统(“药学上可接受的”载体)中来配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用5％的葡萄糖水溶液或林格氏乳酸盐(Ringer's lactate)。输注介质可以补充有人血清白蛋白。
组合物中有效治疗的细胞数通常大于10个细胞，并且高达106个细胞，高达并包括108或109个细胞，并且可以大于1010个细胞。细胞的数量取决于组合物所预期的最终用途，以及其中包括的细胞类型也取决于所预期的最终用途。例如，如果需要对特定抗原特异的细胞，那么细胞群将含有大于70％，通常大于80％、85％和90-95％的此类细胞。对于本文提供的用途，细胞通常为一升或更少的体积，可以是500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，所需细胞的密度通常大于106个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常为108个细胞/ml或更多。可以将临床相关数量的免疫细胞分配到累积等于或大于109、1010或1011个细胞的多次输注中。
本文提供的药物组合物可以是各种形式，例如，固态、液态、粉状、水性或冻干形式。合适的药物载体的实例是本领域已知的。此类载体和/或添加剂可以通过常规方法配制，并且可以以合适的剂量施用给受试者。稳定剂(如脂质)、核酸酶抑制剂、聚合物和螯合剂可保护组合物免于在体内降解。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
可以将如本文所述的重组TCR，或包含编码本文所提供的重组TCR的核苷酸序列的病毒载体颗粒包装成试剂盒。试剂盒可以任选地包括诸如使用说明书、装置和另外的试剂的一种或多种组件，以及用于实施所述方法的组件，比如管、容器和注射器。示例性的试剂盒可包括编码本文提供的重组TCR、重组TCR多肽或病毒的核酸，并可任选地包括使用说明书、用于检测受试者体内病毒的装置、用于向受试者施用所述组合物的装置和用于向受试者施用所述组合物的装置。
本文还考虑了包含编码目的基因(如，重组TCR)的多核苷酸的试剂盒。本文还考虑了包含编码目的序列(如，重组TCR)的病毒载体和任选地编码免疫检查点抑制剂的多核苷酸序列的试剂盒。
本文考虑的试剂盒还包括用于实施检测编码本文公开的任何一种或多种TCR的多核苷酸的存在的方法的试剂盒。特别地，此类诊断试剂盒可包括适当的扩增和检测引物组以及其它用于进行深度测序以检测编码本文公开的TCR的多核苷酸的相关试剂。在进一步的实施方案中，本文的试剂盒可以包含用于检测本文公开的TCR的试剂，比如抗体或其它结合分子。诊断试剂盒也可含有用于确定编码本文所公开的TCR的多核苷酸的存在或用于确定本文所公开的TCR的存在的说明书。试剂盒也可以含有说明书。说明书通常包括描述以下的有形表达：试剂盒中包含的组件和施用方法，包括用于确定受试者的适当状态、适当剂量和适当施用方法的方法。说明书还可以包括用于在治疗期间的持续时间内监测受试者的指导。
本文提供的试剂盒还可以包括向受试者施用本文所述的组合物的装置。本领域已知的用于施用药物或疫苗的各种装置中的任意装置均可包括在本文提供的试剂盒中。示例性装置包括、但不限于皮下注射针、静脉内注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，比如点眼药器(eyedropper)。通常，用于施用试剂盒的病毒的装置将与试剂盒的病毒兼容；例如，可以使诸如高压注射装置的无针注射装置包括在具有不会被高压注射破坏的病毒的试剂盒中，但是通常不使其包括在具有会被高压注射破坏的病毒的试剂盒中。
本文提供的试剂盒还可包括用于向受试者施用化合物(比如T细胞激活剂或刺激剂)，或TLR激动剂(比如TLR4激动剂)的装置。本领域已知的用于向受试者施用药物的各种装置中的任意装置均可包括在本文提供的试剂盒中。示例性的装置包括皮下注射针、静脉内注射针、导管、无针注射装置，但不限于皮下注射针、静脉内注射针、导管、无针注射装置、吸入器和液体分配器，比如点眼药器(eyedropper)。通常，用于施用试剂盒的化合物的装置将与化合物的期望施用方法兼容。
在具体的实施方案中，药学上可接受的载体溶液的制剂是本领域技术人员熟知的，正如在多种治疗方案中使用本文所述的具体组合物的合适的给药和治疗方案的开发也是本领域技术人员熟知的，包括如肠内和肠胃外，如血管内、静脉内、动脉内、骨内、心室内、脑内、颅内、脊柱内、鞘内和髓内施用和制剂。本领域技术人员应当理解，本文所考虑的具体实施方案可以包括其它制剂，比如在药物领域中所熟知的那些，以及例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,volume I and volume II.22nd Edition.Edited byLoyd V.Allen Jr.Philadelphia,PA:Pharmaceutical Press；2012中描述的那些，其全部内容通过引用并入本文。
本说明书全文所引用的所有出版物、专利申请和授权专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物、专利申请或授权专利均被具体地且单独地指明通过引用并入本文那样。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过示例和实施例的方式相当详细地描述了前述实施方案，但是根据本文预期的教导本领域普通技术人员将容易地明白，可以在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下对其进行一些改变和变型。以下实施例仅以示例性的方式而非限制性的方式提供。本领域技术人员将容易地认识到可以对各种非关键参数进行改变或修改以产生基本上类似的结果。
实施例
实施例1
MAGE-A4-TCR转基因T细胞结合MAGE-A4GVY-MHC多聚体
使用体外引发(priming)方法分离MAGE-A4-反应性T-细胞克隆。引发系统使用HLA-A*02:01-阳性的成熟树突细胞(mDC)和HLA-A*02:01-阴性供体作为抗原呈递细胞，而自体CD8+富集的T细胞作为应答细胞。将编码人MAGEA4基因的体外转录RNA(ivtRNA)用作特异性抗原的来源。电穿孔进入mDC后，编码MAGE-A4的ivtRNA被翻译成蛋白质，随后被加工并作为肽由mDC上HLA-A*02:01编码的分子呈递。对于HLA-A*02:01阴性供体，除了MAGE-A4ivtRNA之外，还使用编码HLA-A*02:01的ivtRNA，从而在抗原呈递细胞中转基因地表达相应的HLA等位基因(同种异体法)。T细胞与来自相同供体的ivtRNA转染的mDC的体外共培养导致作为相应TCR来源的抗原特异性T细胞的从头诱导。抗原特异性T细胞可以通过多种方法富集，并通过有限稀释或基于FACS的单细胞分选进行克隆。通过二代测序识别MAGE-A4-反应性T-细胞克隆的TCRα和TCR β链的序列并在将其恒定TCR区用鼠对应物交换后将其克隆至逆转录病毒载体pES.12-6中。通过ficoll梯度离心分离健康供体的PBMC。将CD8+T细胞通过负磁选择(Miltenyi)富集并在非组织培养24孔板中刺激，用抗-CD3(5μg/ml)和抗-CD28(1μg/ml)mAb(BD Pharmingen,Heidelberg,Germany)预涂覆。通过以相应TCR编码逆转录病毒质粒及两个表达质粒转染HEK293T细胞来产生兼嗜性逆转录病毒颗粒。在刺激后第二天，转导CD8+T细胞，在第十二天，通过使用鼠恒定β区作为转导标志物的FACS富集转导的CD8+细胞，然后通过快速扩增方案扩增(Riddell SR,Science,1992Jul 10；257(5067):238-41)。
在实施例2-5所述的实验中，使用了含有鼠源化Cα和Cβ区的TCR(即，包含SEQ IDNO:57的α链和SEQ ID NO:58的β链的TCR-1，包含SEQ ID NO:59的α链和SEQ ID NO:60的β链的TCR-2，包含SEQ ID NO:61的α链和SEQ ID NO:62的β链的TCR-3)。如上所述，使用含有最小鼠源化Cα和Cβ区的TCR，也可以进行与实施例2-5中所述的相同类型的实验。
结果：
用自MAGE-A4-反应性T细胞克隆中分离的三种不同的TCR和一种不识别MAGE-A4的对照TCR转导CD8+T细胞。用MAGE-A4GVY-MHC多聚体(MAGE-A4230-239,GVYDGREHTV；ImmuneAware)和抗CD8和鼠恒定β区的抗体对它们进行染色。所有MAGE-A4-TCR转基因T细胞群均非常有效地结合MAGE-A4GVY-MHC多聚体(＞70％)。在具有对照TCR的细胞中未观察到MAGE-A4GVY-MHC-多聚体染色。这些结果表明从MAGE-A4反应性T细胞克隆中分离的TCR可以在健康供体的T细胞中转基因地表达(图1)。
实施例2
识别MAGE-A4GVY肽的MAGE-A4-TCR转基因T细胞
根据以下方案证实TCR转基因T细胞的MAGE-A4特异性：
作为靶细胞，T2细胞(HLA-A*02pos)加载饱和量(10-5M)的MAGE-A4GVY-肽(SEQ IDNO:1)或不相关对照肽。另外，用HLA-A*02:01和MAGE-A4基因(K562/A2/MAGE-A4)转导K562细胞。将仅用HLA-A*02:01转导的K562细胞作为对照(K562/A2)。以使用20,000个T细胞和10,000个靶细胞的2:1的比率，将每个靶细胞系与TCR-转基因T细胞共培养。20-24h后，通过标准夹心ELISA(BD人IFN-γELISA组件)分析共培养上清液中的IFN-γ浓度。
结果：
MAGE-A4-TCR-转基因T细胞识别负载MAGE-A4GVY的T2和MAGE-A4转导的K562细胞，但不识别对照靶细胞。TCR-3转导的T细胞显示了对K562/A2对照的识别。这些结果表明，从MAGE-A4反应性T细胞克隆中分离的TCR在转移到健康供体的T细胞时是功能性的(图2)。
实施例3
MAGE-A4-TCR转基因T细胞显示高功能性亲合力
用负载MAGE-A4GVY-肽的T2细胞分析MAGE-A4-TCR-转基因T细胞的功能性亲合力的差异：
使T2细胞外部负载梯度浓度(10-11M-10-5M)的MAGE-A4GVY-肽，并以使用10,000个T2细胞和20,000个T细胞的1:2的的比率与TCR-转基因T细胞共培养。20-24h后，通过标准夹心ELISA(BD人IFN-γELISA组件)分析共培养上清液中的IFN-γ浓度。
结果：
综合多个供体，TCR-2针对装载在HLA-A*02上的MAGE-A4GVY肽显示了最高功能性亲合力。与TCR-2相比，TCR-1和TCR-3显示了略微降低的功能性亲合力(图3)。
实施例4
MAGE-A4-TCR-转基因T细胞裂解MAGE-A4-阳性肿瘤细胞系
将MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(NCI-H1703,NCI-H1755)、MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(Saos-2)和MAGE-A4-阴性HLA-A2-阴性肿瘤细胞系(A549)用作靶细胞。对于细胞毒性分析，分别用40,000个TCR转基因T细胞和5,000个(NCI-H1755、NCI-H1703、A549)和2,500个(SAOS-2)肿瘤细胞以约8-16:1的效应细胞比靶细胞的比率(取决于靶细胞大小)建立共培养物，所述肿瘤细胞已用荧光标志物基因转导。将负载饱和浓度的MAGE-A4GVY-肽(10-5M)的肿瘤细胞用作内部阳性对照。使用活细胞监测(Incu
Figure BDA0003377521100000371
ZOOM,Essen Bioscience)在172小时的总时间段内每三小时测量荧光靶细胞的减少(每孔的细胞计数)。为了分析细胞因子的释放，24h后收集共培养上清液，并通过标准夹心ELISA(BD人IFN-γELISA组件)分析相应的IFN-γ浓度。
结果：
所有MAGE-A4-TCR转基因T细胞均识别并裂解两种内源性MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(NCI-H1703,NCI-H1755)。仅当细胞外部负载饱和浓度的MAGE-A4GVY-肽时，MAGE-A4-阴性但HLA-A2-阳性的肿瘤细胞系(Saos-2)才被识别和裂解。MAGE-A4-TCR既不识别也不裂解阴性对照细胞系(A549)。这些结果表明，MAGE-A4-TCR-转基因T细胞能以高选择性的方式有效地裂解内源性MAGE-A4阳性肿瘤细胞(图4a、4b和4c)。
实施例5
MAGE-A4-TCR转基因T细胞不识别正常人细胞
使用一组正常人细胞分析可能由MAGE-A4-TCR-转基因T细胞引起的潜在的靶向非肿瘤(on-target/off-tumor)和脱靶毒性。
测试代表必需组织或器官的原代细胞和诱导的多能干细胞(iPS)衍生的细胞被MAGE-A4-TCR转导的T细胞的识别。将HLA-A*02:01-阴性NHBE细胞经电穿孔用HLA-A2-ivtRNA转染以瞬时表达HLA-A2。在共培养以诱导细胞表面HLA-A2表达开始前用IFN-γ处理iCell神经元72h。所有细胞类型的HLA-A2表达均通过流式细胞术证实。对于毒性分析，用20,000个TCR转基因T细胞和细胞类型特定量的靶细胞建立共培养物。作为内部阳性对照，所有正常人细胞都负载终浓度为10-5M的MAGE-A4GVY-肽。为了分析细胞因子的释放，24h后收集共培养上清液，并通过标准夹心ELISA(BD人IFN-γ或IL-2ELISA组件)分析IFN-γ或IL-2浓度。测定IL-2释放以与iCell神经元共培养，所述神经元已用IFN-γ预处理以诱导HLA-A2表面表达。
结果：
在与MAGE-A4-TCR转基因T细胞共培养开始时，所有原代细胞和诱导的多能干细胞(iPS)衍生的细胞均为HLA-A2阳性。此外，当单个靶细胞负载有MAGE-A4GVY-肽时，MAGE-A4-TCR-转基因T细胞能够有效识别所有正常细胞。未负载的正常细胞不被任何MAGE-A4转基因T细胞识别。MAGE-A4转基因T细胞没有显示出靶向非肿瘤(on-target/off-tumor)和脱靶毒性的迹象(图5a、5b和5c)。
实施例6
编码全人MAGE-A4 TCR的慢病毒载体
将实施例1中识别的TCR多核苷酸序列进行优化以用于表达。将编码多顺反子TCR构建体的慢病毒载体用于表达TCR。多顺反子TCR构建体含有TCRα或β链、任选的弗林蛋白酶裂解位点、P2A核糖体跳跃序列和相应的TCRα或β链。根据已知的方法制备慢病毒载体。参见如Kutner等，BMC Biotechnol.2009；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等，Nat.Protoc.2009；4(4):495–505.doi:10.1038/nprot.2009.22。
编码MAGE-A4 TCR-4多蛋白(SEQ ID NO:94)的多顺反子多核苷酸(SEQ ID NO:93)含有由SEQ ID NO:70编码的β链、编码核糖体跳跃序列的多核苷酸和由SEQ ID NO:69编码的α链。
编码MAGE-A4 TCR-5多蛋白(SEQ ID NO:96)的多顺反子多核苷酸(SEQ ID NO:95)含有由SEQ ID NO:78编码的β链、编码弗林蛋白酶裂解位点的多核苷酸、编码核糖体跳跃序列的多核苷酸和由SEQ ID NO:77编码的α链。
编码MAGE-A4 TCR-6多蛋白(SEQ ID NO:98)的多顺反子多核苷酸(SEQ ID NO:97)含有由SEQ ID NO:86编码的β链、编码弗林蛋白酶裂解位点的多核苷酸、编码核糖体跳跃序列的多核苷酸和由SEQ ID NO:85编码的α链。
实施例7
表达MAGE-A4全人TCR的T细胞结合MAGE-A4GVY-MHC-多聚体
从健康供体的PBMC中分离CD3+T细胞，并用编码三种不同的全人MAGE-A4 TCR和不识别MAGE-A4的对照TCR的慢病毒载体转导。扩增后，用MAGE-A4GVY-MHC多聚体(MAGE-A4230 -239,GVYDGREHTV；immuneAware)和抗CD3抗体对转导的T细胞进行染色。在活CD3+细胞上对群体进行门控，并示出多聚体染色。所有MAGE-A4-TCR转基因T细胞群非常有效地结合MAGE-A4GVY-MHC多聚体(＞70％)。采用对照TCR未观察到MAGE-A4GVY-MHC-多聚体染色。
结果：
这些结果显示从MAGE-A4反应性T细胞克隆中分离的TCR可以在健康供体的T细胞中转基因地表达(图6)。
实施例8
表达MAGE-A4全人TCR的T细胞识别MAGE-A4GVY-肽
使用抗原依赖性细胞因子表达证实TCR转基因T细胞的MAGE-A4特异性。将用编码实施例6中所述的全人MAGE-A4 TCR的慢病毒载体转导的T细胞以2:1的效应细胞与靶细胞比率与用10ng/mL MAGE-A4 GVY-肽或无关对照肽脉冲的T2细胞(HLA-A*02pos)和与未转导的A549/HLA-A2细胞或用MAGE-A4基因转导的A549/HLA-A2共培养。20-24小时后。使用Luminex分析来分析共培养上清液中的IFN-γ浓度。
结果：
MAGE-A4-TCR-转基因T细胞识别MAGE-A4GVY-负载的T2和MAGE-A4转导的A549细胞，但不识别对照靶细胞。这些结果表明表达全人MAGE-A4 TCR的健康人供体T细胞与展示MAGE-A4GVY肽的靶细胞特异性地反应(图7)。
实施例9
表达MAGE-A4全人TCR的T细胞显示高功能性亲合力
使用展示MAGE-A4GVY肽的肿瘤细胞系来分析表达全人MAGE-A4-TCR的T细胞的功能性亲合力的差异。将用编码实施例6中所述全人MAGE-A4 TCR的慢病毒载体转导的T细胞以5:1的效应细胞与靶细胞的比率与MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A375,NCI-H1703,NCI-H1755)、MAGE-A4-阳性HLA-A2-阴性肿瘤细胞系(NCI-H520)和MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A549共培养。20-24小时后。使用Luminex分析来分析共培养上清液中的IFN-γ浓度。
结果：
综合多个供体，MAGE-A4 TCR5显示出最高的功能性亲合力MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系。与MAGE-A4 TCR-5相比，MAGE-A4 TCR1和MAGE-A4 TCR-6显示了降低的功能性亲合力(图8)。
实施例10
表达MAGE-A4全人TCR的T细胞裂解MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系
将用编码实施例6中所述全人MAGE-A4 TCR的慢病毒载体转导的T细胞以5:1的效应细胞与靶细胞的比率与MAGE-A4-阳性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A375,NCI-H1703,A549-HLA-A2-MAGE-A4)和MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A549-HLA-A2)共培养。共培养6小时后，通过阻抗分析测量对肿瘤细胞系的细胞毒性。
结果：
所有MAGE-A4-TCR转基因T细胞均识别并裂解MAGE-A4-阳性HLA-A2阳性肿瘤细胞系(A375,NCI-H1703,A549-HLA-A2-MAGE-A4)。MAGE-A4-阴性HLA-A2-阳性肿瘤细胞系(A549-HLA-A2)MAGE-A4-TCR转基因T细胞的裂解与使用未转导的对照T细胞观察到的裂解之间没有显著差异(图9)。
实施例11
表达MAGE-A4全人TCR的T细胞体内对照MAGE-A4阳性肿瘤
在10只NSG小鼠的每一只的侧腹注射5×106MAGE-A4阳性A375肿瘤细胞。肿瘤移植十天后，将3.5×107MAGE-A4-TCR-转基因T细胞、3.5×107对照未转导的T细胞或载体PBS施用于小鼠。处理后，通过测径器每周两次测量所有小鼠的肿瘤体积。
结果：
未转导的T细胞和载体-PBS处理的小鼠未能控制肿瘤生长，一旦肿瘤达到每个方案允许的最大尺寸就将其处死。MAGE-A4-TCR转基因T细胞处理的小鼠在T细胞输注后控制肿瘤生长达35天(图10)。
实施例12
增强的人MAGE-A4 TCR
对实施例1中识别的TCR多核苷酸序列进行修饰以增强表达和功能性亲合力。使TCR α和β链恒定区最小鼠源化，并且将疏水性氨基酸置换引入TCRα链恒定区的跨膜结构域中。用于增强的MAGE-A4 TCR的示例性多核苷酸序列示于SEQ ID NO:97-99、103-105和109-111。增强的MAGE-A4 TCR的示例性多肽序列示于SEQ ID NO:100-102、106-108和112-114。
将编码多顺反子TCR构建体的慢病毒载体用于表达增强的MAGE-A4 TCR(TCR-7、TCR-8和TCR-9)。多顺反子TCR构建体含有TCRα或β链、任选的弗林蛋白酶裂解位点、P2A核糖体跳跃序列和相应的TCRα或β链。根据已知方法制备慢病毒载体。参见如Kutner等,BMCBiotechnol.2009；9:10.doi:10.1186/1472-6750-9-10；Kutner等，Nat.Protoc.2009；4(4):495–505.doi:10.1038/nprot.2009.22。
编码MAGE-A4 TCR-7多蛋白(SEQ ID NO:102)的多顺反子多核苷酸(SEQ ID NO:99)含有由SEQ ID NO:98编码的β链、编码核糖体跳跃序列的多核苷酸和由SEQ ID NO:97编码的α链。
编码MAGE-A4 TCR-8多蛋白(SEQ ID NO:108)的多顺反子多核苷酸(SEQ ID NO:105)含有由SEQ ID NO:104编码的β链、编码弗林蛋白酶裂解位点的多核苷酸、编码核糖体跳跃序列的多核苷酸和由SEQ ID NO:103编码的α链。
编码MAGE-A4 TCR-9多蛋白(SEQ ID NO:114)的多顺反子多核苷酸(SEQ ID NO:111)含有由SEQ ID NO:110编码的β链、编码弗林蛋白酶裂解位点的多核苷酸、编码核糖体跳跃序列的多核苷酸和由SEQ ID NO:109编码的α链。
实施例13
表达MAGE-A4全人TCR或增强的MAGE-A4 TCR的T细胞可在人T细胞上高效表达。
从三个独立的健康供体中分离外周血单核细胞(PBMC)，将其活化，并用编码全人MAGE-A4 TCR(TCR-5)或增强的MAGE-A4 TCR(TCR-8)的慢病毒载体转导，或不转导作为阴性对照。体外培养细胞以进行扩增，并通过测量载体拷贝数(VCN)分析载体整合，并通过使用流式细胞术分析用MAGE-A4GVY-MHC多聚体(MAGE-A4230-239,GVYDGREHTV；immuneAware)和抗CD3抗体染色的细胞的表达。
结果：
TCR-5和TCR-8的VCN是相当的，而在用TCR-8和TCR-5转导的细胞中，TCR表面表达和密度更高。图11A-C。
实施例14
表达MAGE-A4全人TCR或增强的MAGE-A4 TCR的T细胞体外特异性识别并杀伤MAGE-A4+细胞系
从三个独立的健康供体中分离外周血单核细胞(PBMC)，将其活化，并用编码全人MAGE-A4 TCR(TCR-5)或增强的MAGE-A4 TCR(TCR-8)的慢病毒载体转导，或将未转导的(UTD)作为阴性对照。评估表达的T细胞对MAGEA4阳性(+)和阴性(-)肿瘤细胞系的特异反应性：A549.A2(A2+，MAGE-A4(-))；NCI-H2023(A2+，MAGE-A4(+))；A375(A2+，MAGE-A4(+))；A549.A2.MAGEA4(A2+,MAGE-A4(+))；和U2OS(A2+，MAGE-A4(低))。
结果：
TCR-5和TCR-8T细胞在与HLA-A2+/MAGEA4(+)肿瘤细胞系共培养时释放IFNγ，但在与HLA-A2+/MAGEA4(-)细胞共培养时或在不存在靶细胞的情况下培养时不释放IFNγ。UTD T细胞在任何培养条件下都不释放IFNγ。图12A。
在10:1、5:1和2.5:1的E:T比率下，TCR-5和TCR-8T细胞有效杀伤HLA-A2+/MAGEA4(+)肿瘤细胞系。在任何E:T比率下，UTD T细胞均不杀伤HLA-A2+/MAGEA4(+)肿瘤细胞系。图12B。
实施例15
表达MAGE-A4全人TCR或增强的MAGE-A4 TCR的T细胞在体内介导表达MAGE-A4的肿瘤的消退
在5只NSG小鼠的每只的侧腹注射MAGE-A4阳性A375肿瘤细胞。向具有50mm3A375肿瘤的小鼠施用PBS(载体)、未转导的T细胞(UTD)、5×106TCR-5或TCR-8T细胞(左侧)或1.5×106TCR-5或TCR-8T细胞(右侧)。向具有100mm3A375肿瘤的小鼠施用PBS(载体)、未转导(UTD)T细胞或10×106TCR-5或TCR-8T细胞。每周两次测量肿瘤生长，并通过与接受UTD和载体对照的小鼠比较来评估TCR T细胞抗肿瘤活性。
结果：
TCR-5和TCR-8T细胞以5×106TCR+T细胞的剂量介导了相当的50mm3A375肿瘤的肿瘤消退。在1.5×106TCR+T细胞的剂量下的50mm3A375肿瘤中和在10×106TCR+T细胞的剂量下的100mm3A375肿瘤中，与TCR-5T细胞相比，TCR-8T细胞介导增加的肿瘤消退。在任何条件下载体和UTD T细胞均不介导A375肿瘤的消退。
本发明的特征还在于以下项目：
项目1：一种对MAGE-A4特异性的分离的T细胞受体(TCR)。
项目2：一种对MAGE-A4特异性的分离的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包含：
a)可变TCRα区，其包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR 3，
可变TCRβ区，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；或
b)可变TCRα区，其包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，
可变TCRβ区，其包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；或
c)可变TCR α区，其包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3，
可变TCRβ区，其包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3。
项目3：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR特异性地识别氨基酸序列SEQ ID NO:1或其片段。
项目4：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR特异性地识别SEQID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式。
项目5：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR特异性地识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
项目6：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含TCRα链，所述TCRα链包含具有选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:24的序列的互补决定区3(CDR3)。
项目7：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含TCR β链，所述TCR β链包含具有选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3。
项目8：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含
a)具有与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCR β区；或
b)具有与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRβ区；或
c)具有与SEQ ID NO:28具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRα区和具有与SEQ ID NO:29具有至少80％同一性的氨基酸序列的可变TCRβ区。
项目9：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含
a)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区；或
b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变TCRβ区；或
c)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变TCRβ区。
项目10：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含
a)具有与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的氨基酸序列的TCRα链和具有与SEQID NO:11具有至少80％同一性的氨基酸序列的TCRβ链；或
b)具有与SEQ ID NO:20具有至少80％同一性的氨基酸序列的TCRα链和具有与SEQID NO:21具有至少80％同一性的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有与SEQ ID NO:30具有至少80％同一性的氨基酸序列的TCRα链和具有与SEQID NO:31具有至少80％同一性的氨基酸序列的TCRβ链
项目11：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含
a)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ链；或
b)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的TCRβ链。
项目12：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR包含TCR α链和TCRβ链，其中
a)-所述可变TCRα区具有与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列编码的CDR3
-所述可变TCRβ区具有与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含由SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列编码的CDR3；或
b)-所述可变TCRα区具有与SEQ ID NO:18具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列编码的CDR3；或
-所述可变TCR β区具有与SEQ ID NO:19具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含由SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列编码的CDR3；或
c)-所述可变TCRα区具有与SEQ ID NO:28具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含由SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列编码的CDR3；或
-所述可变TCR β区具有与SEQ ID NO:29具有至少80％同一性的氨基酸序列，并包含由SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列编码的CDR3。
项目13：根据项目1至5中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：
a)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ链；
b)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的TCRβ链。
项目14：根据项目1至5中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：
a)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的TCRβ链；
b)具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的TCRβ链。
项目15：根据项目1至5中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包括：
a)具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的TCR β链；
b)具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的TCR β链；或
c)具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的TCRβ链。
项目16：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR是经纯化的。
项目17：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，其氨基酸序列包含一个或多个表型沉默置换。
项目18：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，其氨基酸序列经修饰以包含可检测标记、治疗剂或药代动力学修饰部分。
项目19：根据项目18所述的分离的TCR，其中，所述的治疗剂选自免疫效应分子、细胞毒性剂和放射性核素。
项目20：根据项目19所述的分离的TCR，其中所述的免疫效应分子是细胞因子。
项目21：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR为可溶的或膜结合的。
项目22：根据项目18所述的分离的TCR，其中，所述的药物动力学修饰部分是至少一个聚乙二醇重复单元、至少一个二醇基团、至少一个唾液酸基团或它们的组合。
项目23：根据前述项目中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCR是单链类型，其中TCRα链与TCRβ链通过连接子序列连接。
项目24：根据项目1至23中任一项所述的分离的TCR，其中，所述TCRα链或TCRβ链经修饰以包含表位标签。
项目25：一种包含项目1至24中任一项目所述的TCR的功能部分的分离的多肽，其中所述功能部分包含SEQ ID NO:4、7、14、17、24和27的氨基酸序列中的至少一个。
项目26：根据项目25所述的分离的多肽，其中所述功能部分包含TCRα可变链和/或TCRβ可变链。
项目27：一种包含TCRα链和TCRβ链的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ IDNO:94、96、98、104、110和116中任一个所示的氨基酸序列。
项目28：一种多价TCR复合物，其包含至少两个如项目1至24中任一项所述的TCR。
项目29：根据项目28所述的多价TCR复合物，其中所述TCR中的至少一个与治疗剂缔合。
项目30：根据项目1至24中任一项所述的分离的TCR、根据项目25或26所述的多肽、根据项目27所述的融合蛋白、根据项目28或29所述的多价TCR复合物，其中通过结合由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列来诱导IFN-γ分泌。
项目31：一种核酸，其编码根据项目1至24中任一项所述的TCR、编码根据项目25或26所述的多肽、或编码根据项目27所述的融合蛋白。
项目32：根据项目31所述的核酸，其中编码TCRα链的核酸序列如SEQ ID NO:69、77、85、99、105和111中的任一项所示。
项目33：根据项目31或项目32所述的核酸，其中所述编码TCRβ链的核酸序列如SEQID NO:70、78、86、100、106和112中的任一项所示。
项目34：根据项目31所述的核酸，其中所述TCR包含由SEQ ID NO:69编码的α链和由SEQ ID NO:70编码的β链；由SEQ ID NO:77编码的α链和由SEQ ID NO:78编码的β链；由SEQ ID NO:85编码的α链和由SEQ ID NO:86编码的β链；由SEQ ID NO:99编码的α链和由SEQID NO:100编码的β链；由SEQ ID NO:105编码的α链和由SEQ ID NO:106编码的β链；或由SEQID NO:111编码的α链和由SEQ ID NO:112编码的β链。
项目35：根据项目31所述的核酸，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:93、95、97、101、107和113中任一项所示的核酸序列编码。
项目36：一种包含项目31至35中任一项所述的核酸的载体。
项目37：一种载体，其包含编码如下的多肽序列的核酸：(a)SEQ ID NO:87和SEQID NO:88所示的多肽序列；(b)SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示的多肽序列；(c)SEQ IDNO:91和SEQ ID NO:92所示的多肽序列；(d)SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103所示的多肽序列；(e)SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109所示的多肽序列；或(f)SEQ ID NO:114和SEQ IDNO:115所示的多肽序列。
项目38：根据项目36或项目37所述的载体，其中所述载体是表达载体。
项目39：根据项目36至38中任一项所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体。
项目40：根据项目36至39中任一项所述的载体，其中，所述载体是慢病毒载体。
项目41：一种细胞，其表达根据项目1至24中任一项所述的TCR。
项目42：一种细胞，其包含根据项目36至40中任一项所述的载体。
项目43：根据项目41或项目3942所述的细胞，其中，所述细胞是分离的或非天然存在的。
项目44：一种细胞，其包含根据项目31至35中任一项所述的核酸或根据项目36至40中任一项所述的载体。
项目45：根据项目41至44中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含：
a)一种表达载体，其包含至少一种如项目28至32中任一项所述的核酸。
b)第一表达载体，其包含编码如项目1至21中任一项所述的TCR的α链的核酸；和第二表达载体，其包含编码如项目1至21中任一项所述的TCR的β链的核酸。
项目46：根据项目41至45中任一项所述的细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。
项目49：根据项目41至48中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是T细胞。
项目50：根据项目41至48中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是T细胞。
项目51：一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合介导对MAGE-A4的特异性的项目1至24中任一项所述TCR的一部分。
项目52：根据项目51所述的抗体，其中介导MAGE-A4特异性的TCR的一部分包括
a)SEQ ID NO:4的α链的CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链的CDR3或；
b)SEQ ID NO:14的α链的CDR3和/或SEQ ID NO:17的β链的CDR3或；
c)SEQ ID NO:24的α链的CDR3和/或SEQ ID NO:27的β链的CDR3。
项目53：一种组合物，其包含根据项目1至24中任一项所述的TCR、根据项目25或26所述的多肽、根据项目27所述的融合蛋白、根据项目28或29所述的多价TCR复合物、根据项目31至35中任一项所述的核酸、根据项目36至40中任一项所述的载体、根据项目41至50中任一项所述的细胞、或根据项目51或52所述的抗体。
项目54：一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和根据项目1至24中任一项所述的TCR、根据项目25或26所述的多肽、根据项目27所述的融合蛋白、根据项目28或29所述的多价TCR复合物、根据项目31至35中任一项所述的核酸、根据项目36至40中任一项所述的载体、根据项目41至50中任一项所述的细胞、或根据项目51或52所述的抗体。
项目55：一种药物组合物，其包含至少一种药学上可接受的载体和根据项目41至50中任一项所述的细胞。
项目56：根据项目1至24中任一项所述的TCR、根据项目25或26所述的多肽、根据项目27所述的融合蛋白、根据项目28或29所述的多价TCR复合物、根据项目31至35中任一项所述的核酸、根据项目36至40中任一项所述的载体、根据项目41至50中任一项所述的细胞、根据项目51或52所述的抗体、根据权利要求53所述的组合物、或根据权利要求54或55所述的药物组合物，其用作药物。
项目57：根据项目1至24中任一项所述的TCR、根据项目25或26所述的多肽、根据项目27所述的融合蛋白、根据项目28或29所述的多价TCR复合物、根据项目31至35中任一项所述的核酸、根据项目36至40中任一项所述的载体、根据项目41至50中任一项所述的细胞、根据项目51或52所述的抗体、根据权利要求53所述的组合物、或根据权利要求54或55所述的药物组合物，其用于治疗癌症。
项目58：根据项目57所述的TCR、多肽、融合蛋白、多价TCR复合物、核酸、细胞、抗体、组合物或药物组合物，其中所述癌症是血液癌症或实体瘤。
项目59：根据项目57或58所述的TCR、多肽、融合蛋白、多价TCR复合物、核酸、细胞、抗体、组合物或药物组合物，其中，所述癌症选自肉瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病。
项目60：根据项50或51所述的TCR、多肽、融合蛋白、多价TCR复合物、核酸、细胞、抗体、组合物或药物组合物，其中所述癌症优选地选自NSCLC、SCLC、乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌、肉瘤或骨肉瘤。
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通常，在所附权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限于说明书和权利要求中公开的具体实施方案，而应被解释为包括所有可能的实施方案以及这些权利要求所具有的等同方案的全部范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
序列表
<110> 基因医疗免疫疗法有限责任公司
2 七十生物有限公司
<120> MAGE A4 T细胞受体
<130> LC21310016P
<160> 116
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 2
Thr Ser Asp Gln Ser Tyr Gly
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn
1 5
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 4
Cys Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Lys Gly His Asp Arg
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Ser Phe Asp Val Lys Asp
1 5
<210> 7
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Cys Ala Thr Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr
1 5 10 15
Phe
<210> 8
<211> 136
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His
130 135
<210> 9
<211> 135
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu
130 135
<210> 10
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区
<400> 10
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 11
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区
<400> 11
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser
260 265 270
Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Thr Ser Asp Pro Ser Tyr Gly
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Cys Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe
1 5 10 15
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Ser Gly Asp Leu Ser
1 5
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu
1 5
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Cys Ala Ser Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe
1 5 10
<210> 18
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn
130 135
<210> 19
<211> 131
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu
130
<210> 20
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区
<400> 20
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
130 135 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145 150 155 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
180 185 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
195 200 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 21
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区
<400> 21
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Arg Ser Tyr His Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Asp Ser Ala Ser Asn Tyr
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu
1 5
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Cys Ala Ala Ser Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe
1 5 10
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Leu Gly His Asp Thr
1 5
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Tyr Asn Asn Lys Glu Leu
1 5
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Cys Ala Ser Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe
1 5 10 15
<210> 28
<211> 133
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Ser Pro Asn
130
<210> 29
<211> 134
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr
130
<210> 30
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区
<400> 30
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
<210> 31
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区
<400> 31
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr
260 265 270
His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 32
accagcgatc agagctacgg c 21
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 33
cagggcagct acgacgagca gaat 24
<210> 34
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 34
tgtgccatga gcggcgatag cgccggcaac atgcttacat tt 42
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 35
aagggccacg accgg 15
<210> 36
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 36
agcttcgacg tgaaggac 18
<210> 37
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 37
tgcgccacca gcgactggga tagaagcggc gacaaagaga cacagtactt c 51
<210> 38
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区；密码子优化的
<400> 38
atgagcctga gcagcctgct gaaggtcgtg acagcctctc tgtggctcgg acctggaatc 60
gcccagaaga tcacccagac acagcccggc atgttcgtgc aagagaaaga agccgtgaca 120
ctggactgca cctacgacac cagcgatcag agctacggcc tgttctggta caagcagcct 180
agcagcggcg agatgatctt cctgatctac cagggcagct acgacgagca gaatgccacc 240
gagggcagat acagcctgaa cttccagaag gcccggaagt ccgccaacct ggtcatttct 300
gcttctcagc tgggcgacag cgccatgtac ttttgtgcca tgagcggcga tagcgccggc 360
aacatgctta catttggcgg cggaacccgg ctgatggtca agccccatat tcagaacccc 420
gatcctgccg tgtaccagct gagagacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgtctgttc 480
accgacttcg acagccagac caacgtgtcc cagagcaagg acagcgacgt gtacatcacc 540
gacaagaccg tgctggacat gcggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg 600
tccaacaaga gcgatttcgc ctgcgccaac gccttcaaca atagcattat ccccgaggac 660
acattcttcc ccagctccga tgtgccctgc gacgtgaagc tggtggaaaa gagcttcgag 720
acagacacca acctgaactt ccagaacctg agcgtgatcg gcttcagaat cctgctgctg 780
aaggtggccg gcttcaatct gctgatgacc ctgagactgt ggtccagctg a 831
<210> 39
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区; 密码子优化的
<400> 39
atggccagcc tgctgttctt ctgcggcgcc ttttatctgc tcggcaccgg ctctatggac 60
gccgacgtta cacagacccc tcggaacaga atcaccaaga ccggcaagcg gatcatgctg 120
gaatgcagcc agaccaaggg ccacgaccgg atgtactggt acagacagga ccctggcctg 180
ggcctgagac tgatctacta cagcttcgac gtgaaggaca tcaacaaggg cgagatcagc 240
gacggctaca gcgtgtcaag acaggctcag gccaagttca gcctgtctct ggaaagcgct 300
atccccaacc agacagccct gtacttctgc gccaccagcg actgggatag aagcggcgac 360
aaagagacac agtacttcgg ccctggcacc agactgctgg tgctggaaga tctgaacaag 420
gtgttccctc cagaggtggc cgtgttcgag ccttctaagg ccgagattgc ccacacacag 480
aaagccacac tcgtgtgcct ggctaccggc ttctttcctg accacgtgga actgtcttgg 540
tgggtcaacg gcaaagaggt gcacagcggc gtcagcacag atccccagcc tctgaaagaa 600
cagcccgctc tgaacgacag ccggtactgt ctgagcagca gactgagagt gtccgccaca 660
ttctggcaga accccagaaa ccacttcaga tgccaggtgc agttctacgg cctgagcgag 720
aacgatgagt ggacccagga tagagccaag cctgtgacac agatcgtgtc tgccgaagcc 780
tggggcagag ccgattgtgg aattaccagc gccagctacc atcagggcgt gctgtctgcc 840
acaatcctgt acgagatcct gctgggcaaa gccactctgt acgccgtgct ggtgtctgcc 900
ctggtgctga tggccatggt caagagaaag gacttttga 939
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 40
accagcgatc ctagctacgg c 21
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 41
cagggcagct acgaccagca gaat 24
<210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 42
tgtgccatga gcggcggcta caccggcggc ttcaagacaa tcttt 45
<210> 43
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 43
agcggcgacc tgagc 15
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 44
tactacaacg gcgaggaa 18
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 45
tgtgccagct ctggcggaga tggcgacgag cagtttttt 39
<210> 46
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区; 密码子优化的
<400> 46
atgagcctga gcagcctgct gaaggtcgtg acagcctctc tgtggctcgg acctggaatc 60
gcccagaaga tcacccagac acagcccggc atgttcgtgc aagagaaaga agccgtgaca 120
ctggactgca cctacgacac cagcgatcct agctacggcc tgttctggta caagcagcct 180
agcagcggcg agatgatctt cctgatctac cagggcagct acgaccagca gaatgccacc 240
gagggcagat acagcctgaa cttccagaag gcccggaagt ccgccaacct ggtcatttct 300
gctagccagc tgggcgacag cgccatgtac ttttgtgcca tgagcggcgg ctacaccggc 360
ggcttcaaga caatctttgg cgccggaacc agactgttcg tgaaggccaa tattcagaac 420
cccgatcctg ccgtgtacca gctgagagac agcaagagca gcgacaagag cgtgtgtctg 480
ttcaccgact tcgacagcca gaccaacgtg tcccagagca aggacagcga cgtgtacatc 540
accgacaaga ccgtgctgga catgcggagc atggacttca agagcaacag cgccgtggcc 600
tggtccaaca agagcgattt cgcctgcgcc aacgccttca acaatagcat tatccccgag 660
gacacattct tccccagctc cgatgtgccc tgcgacgtga agctggtgga aaagagcttc 720
gagacagaca ccaacctgaa cttccagaac ctgagcgtga tcggcttcag aatcctgctg 780
ctgaaggtgg ccggcttcaa tctgctgatg accctgagac tgtggtccag ctga 834
<210> 47
<211> 933
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区; 密码子优化的
<400> 47
atgggcttca gactgctgtg ctgcgtggcc ttttgtctgc ttggagccgg acctgtggat 60
agcggcgtta cccagacacc taagcacctg atcacagcca caggccagcg cgtgaccctg 120
agatgttctc ctagaagcgg cgacctgagc gtgtactggt atcagcagtc tctggaccag 180
ggcctgcagt tcctgatcca gtactacaac ggcgaggaaa gagccaaggg caacatcctg 240
gaacggttca gcgcccagca gttcccagat ctgcacagcg agctgaacct gagcagcctg 300
gaactgggag atagcgccct gtacttctgt gccagctctg gcggagatgg cgacgagcag 360
ttttttggcc ctggcaccag actgaccgtg ctggaggacc tgaagaacgt gttccctccg 420
gaggtggccg tgttcgagcc cagcaaagcc gagatcgcgc acacccagaa ggccaccctg 480
gtgtgcctgg ccaccggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaacggc 540
aaggaggtgc acagcggcgt gagcaccgac ccccagcccc tgaaggagca gcccgccctg 600
aacgacagcc gctactgcct gagcagccgc ctgcgcgtga gcgccacctt ctggcagaac 660
ccccgcaacc acttccgctg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 720
acccaggacc gcgccaagcc cgtgacccag atcgtgagcg ccgaggcctg gggccgcgcc 780
gactgcggca ttaccagccg cagctaccat cagggcgtgc tgagcgccac catcctgtac 840
gagatcctgc tgggcaaggc caccctgtac gccgtgctgg tgagcgccct ggtgctgatg 900
gcgatggtga agcgcaagga cagccgcggc tga 933
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 48
gacagcgcca gcaactac 18
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 49
atccggtcca acgtgggcga g 21
<210> 50
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 50
tgcgctgcca gcagaggcac cggcttccag aaactggtgt tt 42
<210> 51
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 51
ctgggccacg acacc 15
<210> 52
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 52
tacaacaaca aagagctg 18
<210> 53
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的
<400> 53
tgtgccagca gccagttctg ggatggcgct ggcgacgagc agtatttt 48
<210> 54
<211> 822
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区; 密码子优化的
<400> 54
atgaccagca tccgggccgt gttcatcttc ctgtggctgc agctggacct ggtcaacggc 60
gagaatgtgg aacagcaccc cagcacactg agcgtgcaag agggcgattc tgccgtgatc 120
aagtgcacct acagcgacag cgccagcaac tacttcccct ggtacaagca agagctgggc 180
aaaagacccc agctgatcat cgacatccgg tccaacgtgg gcgagaagaa ggaccagaga 240
atcgccgtga cactgaacaa gaccgccaag cacttcagcc tgcacatcac cgagacacag 300
cctgaggata gcgccgtgta cttttgcgct gccagcagag gcaccggctt ccagaaactg 360
gtgtttggca ccggcaccag actgctggtg tccccaaata ttcagaaccc cgatcctgcc 420
gtgtaccagc tgagagacag caagagcagc gacaagagcg tgtgtctgtt caccgacttc 480
gacagccaga ccaacgtgtc ccagagcaag gacagcgacg tgtacatcac cgacaagacc 540
gtgctggaca tgcggagcat ggacttcaag agcaacagcg ccgtggcctg gtccaacaag 600
agcgatttcg cctgcgccaa cgccttcaac aatagcatta tccccgagga cacattcttc 660
cccagctccg atgtgccctg cgacgtgaag ctggtggaaa agagcttcga gacagacacc 720
aacctgaact tccagaacct gagcgtgatc ggcttcagaa tcctgctgct gaaggtggcc 780
ggcttcaatc tgctgatgac cctgagactg tggtccagct ga 822
<210> 55
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有最小鼠源化恒定区; 密码子优化的
<400> 55
atgggctgca gactgctgtg ctgtgtggtg ttctgcctgc tgcaagccgg acctctggat 60
acagccgtgt ctcagacccc taagtacctg gtcacccaga tgggcaacga caagagcatc 120
aagtgcgagc agaacctggg ccacgacacc atgtactggt acaagcagga cagcaagaaa 180
ttcctgaaga tcatgttcag ctacaacaac aaagagctga tcatcaacga gacagtgccc 240
aacagattca gccctaagag ccccgataag gcccacctga acctgcacat caacagcctg 300
gaactgggcg acagcgccgt gtacttttgt gccagcagcc agttctggga tggcgctggc 360
gacgagcagt attttggccc tggcaccaga ctgaccgtga ccgaggacct gaacaaggtg 420
ttccctccgg aggtggccgt gttcgagccc agcaaagccg agatcgcgca cacccagaag 480
gccaccctgg tgtgcctggc caccggcttc ttccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaacggca aggaggtgca cagcggcgtg agcaccgacc cccagcccct gaaggagcag 600
cccgccctga acgacagccg ctactgcctg agcagccgcc tgcgcgtgag cgccaccttc 660
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgc caggtgcagt tctacggcct gagcgagaac 720
gacgagtgga cccaggaccg cgccaagccc gtgacccaga tcgtgagcgc cgaggcctgg 780
ggccgcgccg actgcggcat taccagcgcg agctaccatc agggcgtgct gagcgccacc 840
atcctgtacg agatcctgct gggcaaggcc accctgtacg ccgtgctggt gagcgccctg 900
gtgctgatgg cgatggtgaa gcgcaaggac ttctga 936
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Lys Leu Tyr Gly Leu Asp Trp Ala Glu Leu
1 5 10
<210> 57
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化的
<400> 57
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly
165 170 175
Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser
180 185 190
Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys
195 200 205
Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val
210 215 220
Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 58
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化的
<400> 58
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro
130 135 140
Lys Val Thr Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp
225 230 235 240
Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Lys Lys Asn Ser
305
<210> 59
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化的
<400> 59
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala
130 135 140
Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu
145 150 155 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser
165 170 175
Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp
180 185 190
Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr
195 200 205
Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
<210> 60
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化的
<400> 60
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Thr Leu
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
195 200 205
Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
210 215 220
Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
245 250 255
Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala
260 265 270
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
275 280 285
Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys Lys Asn Ser
290 295 300
<210> 61
<211> 269
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化的
<400> 61
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn
180 185 190
Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile
195 200 205
Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp
210 215 220
Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe
225 230 235 240
Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala
245 250 255
Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 62
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠源化的
<400> 62
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys
130 135 140
Val Thr Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser
195 200 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe
210 215 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro
225 230 235 240
Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp
245 250 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val
260 265 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
275 280 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Lys
290 295 300
Lys Asn Ser
305
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 63
acttcagacc agtcgtacgg t 21
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 64
cagggatcgt acgacgagca gaac 24
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 65
tgcgcaatgt ccggcgatag cgcaggaaac atgctgactt tc 42
<210> 66
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 66
aagggccacg accgc 15
<210> 67
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 67
tccttcgacg tgaaggac 18
<210> 68
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 68
tgtgccacct cggattggga ccgatccggc gacaaggaaa ctcagtactt c 51
<210> 69
<211> 831
<212> DNA
<213> 人优化的
<400> 69
atgagcctct cttccctgct caaagtggtc actgcctccc tgtggctggg accgggaatc 60
gcccagaaga tcactcagac ccagcctgga atgttcgtgc aagagaaaga ggccgtgacc 120
ctggattgta cttatgacac ttcagaccag tcgtacggtt tgttctggta caagcagccg 180
tcctccggag aaatgatctt cctgatctac cagggatcgt acgacgagca gaacgctacc 240
gagggcagat attccctcaa cttccaaaag gcccggaaat ccgcgaacct cgtgatctcg 300
gcctcacaac ttggggactc cgctatgtat ttctgcgcaa tgtccggcga tagcgcagga 360
aacatgctga ctttcggcgg tggaactagg ctgatggtca agccccacat tcaaaaccct 420
gacccagcag tctaccagtt gcgggattcc aagtcttccg ataaatccgt gtgtctcttt 480
acagacttcg atagccagac caacgtgtcc cagagcaaag acagcgacgt gtacattact 540
gacaagactg tgctggacat gcggtccatg gacttcaaga gcaactccgc cgtcgcttgg 600
tccaacaagt ctgactttgc gtgcgcgaac gctttcaaca acagcattat cccggaggac 660
acctttttcc cttcccccga gtcaagctgc gatgtcaagc ttgtggaaaa gtcgttcgaa 720
accgacacca acctgaactt ccagaacctg tccgtcatcg ggttccgcat tctgctgctg 780
aaggtcgccg gcttcaatct cctgatgact ctccgcttgt ggtcctcata a 831
<210> 70
<211> 936
<212> DNA
<213> 人优化的
<400> 70
atggcgtccc tgctgttctt ctgcggtgcc ttctaccttc tgggaaccgg ctcgatggac 60
gccgacgtga cccaaacccc tcgcaaccgc atcaccaaga ctggaaagcg gatcatgctg 120
gaatgctccc agaccaaggg ccacgaccgc atgtactggt acagacagga cccgggtctg 180
ggattgcgcc tgatctacta ctccttcgac gtgaaggaca tcaacaaggg ggagatctcc 240
gatggatact cagtctcgag acaagcccag gctaagtttt ccctgtccct cgaatccgcc 300
attcccaatc agaccgcgct gtacttctgt gccacctcgg attgggaccg atccggcgac 360
aaggaaactc agtacttcgg accaggaacc aggctcctgg tgctggagga tctgaacaag 420
gtgttcccgc cggaagtggc agtgttcgag ccatccgaag ccgagatctc gcatacgcag 480
aaggccaccc tcgtgtgcct ggccactggg tttttccctg accacgtgga gctctcgtgg 540
tgggtcaacg gaaaggaagt gcacagcggt gtctcaaccg acccgcaacc tctcaaggaa 600
cagcccgcgc tcaatgattc gcggtactgc ctgagcagcc ggctcagagt gtccgccact 660
ttctggcaaa acccgcggaa ccatttccgg tgccaagtgc aattctacgg gctgtcggaa 720
aacgacgaat ggacccagga cagggccaag cccgtgaccc agattgtgtc cgctgaagcc 780
tgggggagag ctgattgcgg tttcaccagc gtgtcgtatc agcagggcgt gctgtcagcc 840
accattctgt acgaaatcct cctggggaag gccacactgt acgccgtgct cgtgtccgcc 900
ctggtgctga tggccatggt caagcggaag gacttc 936
<210> 71
<211> 21
<212> DNA
<213> 人优化的
<400> 71
acctccgacc cgtcctacgg g 21
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人优化的
<400> 72
caaggctcct atgatcagca gaac 24
<210> 73
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 73
tgtgccatgt cgggcggata caccggggga ttcaagacca ttttc 45
<210> 74
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 74
tctggcgacc tctcc 15
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 75
tactacaacg gagaggag 18
<210> 76
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 76
tgcgcaagca gcggtggtga cggggatgaa cagttcttt 39
<210> 77
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 77
atgtccctta gctcactgct gaaagtggtc actgcgagcc tgtggctggg accaggcatt 60
gctcaaaaga tcacccagac tcagcctggg atgttcgtgc aagagaagga agccgtgacc 120
ctcgactgca cttacgacac ctccgacccg tcctacgggc tgttctggta caagcagccg 180
tcctccggag agatgatctt cctcatctac caaggctcct atgatcagca gaacgccacc 240
gaaggacgct acagcctgaa cttccagaag gctcggaagt cggcgaacct cgtgatcagc 300
gcatcccaac tgggggacag cgccatgtac ttctgtgcca tgtcgggcgg atacaccggg 360
ggattcaaga ccattttcgg ggccggcact agactgttcg tgaaggccaa catccagaat 420
cctgatccgg cggtgtatca gctgcgcgac tccaagtctt ccgataaatc cgtgtgtctc 480
tttacagact tcgactccca aaccaacgtg tcacagtcca aggacagcga tgtgtacatc 540
accgacaaaa ccgtgctgga catgcggtcc atggacttca agtcaaacag cgcagtcgcc 600
tggtccaaca agtccgactt cgcctgtgcg aacgccttca acaactccat cattccggaa 660
gatacctttt tcccttcacc tgagtcgagc tgtgatgtga agctcgtgga aaagtcgttt 720
gaaacggaca ccaacctgaa ctttcagaac ctgtccgtga ttggtttccg catcctgctg 780
ctgaaggtcg ccggcttcaa cttgctgatg acgctccggc tgtggtcctc gtaa 834
<210> 78
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 78
atgggattcc gccttctgtg ctgcgtggcc ttctgcttgc ttggagctgg tcccgtcgac 60
tcgggagtga cccagacgcc gaagcacttg attaccgcta ctgggcagcg cgtgactctg 120
cgatgctcac cacggtctgg cgacctctcc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggactgcagt tcctgatcca gtactacaac ggagaggagc gggctaaggg aaacatactg 240
gagcggttct cggcgcaaca attccccgat ctgcactccg aactgaacct gtcctccctg 300
gaattgggag actccgccct gtacttctgc gcaagcagcg gtggtgacgg ggatgaacag 360
ttctttggcc ctggaaccag actcaccgtg ctcgaggacc tcaagaacgt gttcccaccc 420
gaagtcgcgg tgttcgagcc ctccgaagcg gaaatcagcc atactcagaa agccactctc 480
gtgtgcctgg ccaccggatt ctacccggac cacgtcgagc tctcttggtg ggtgaacggg 540
aaagaggtcc acagcggcgt gagcactgat ccgcagccgc tgaaggaaca acccgccttg 600
aacgactcgc ggtactgtct gtcctcccgg ctgagagtgt cggccacctt ctggcaaaac 660
cccaggaacc actttaggtg ccaagtccag ttctacggcc tgagcgaaaa cgatgagtgg 720
acccaggaca gagccaagcc tgtgacccag attgtgtcag ccgaggcttg gggtagagca 780
gactgcggat tcacctccga gtcctaccaa caaggcgtcc tctcggcgac cattctgtac 840
gaaatcctgc ttgggaaggc cactctgtac gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg 900
gccatggtca agcggaagga ctcccggggg 930
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 79
gactcagcat caaactat 18
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 80
atccgctcca acgtcggaga g 21
<210> 81
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 81
tgtgcggcct cgaggggcac tgggtttcag aagctcgtgt tc 42
<210> 82
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 82
ctcggacacg acacc 15
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 83
tacaacaaca aggaactg 18
<210> 84
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 84
tgcgcgtcca gccagttctg ggacggagcg ggcgacgaac agtacttc 48
<210> 85
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 85
atgacgtcca ttagagccgt gttcattttc ctgtggctgc aactggacct cgtgaatgga 60
gaaaacgtcg agcagcaccc atccaccctg agcgtgcagg agggagactc cgcagtcatc 120
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attgccgtga cactcaacaa gaccgccaag catttctccc ttcacatcac cgaaacccag 300
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gtgttcggca ctgggacccg gctgctggtg tcgccaaaca tccagaatcc agaccccgcg 420
gtgtaccagc tgagagactc gaagtcttcc gataaatccg tgtgtctctt tacagacttc 480
gatagccaga ctaacgtgtc ccagtccaag gactccgatg tgtacatcac cgacaagact 540
gtgctggata tgcggagcat ggactttaag tccaattcag cggtcgcgtg gagcaacaag 600
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ccgtcaccgg aatcctcgtg cgacgtgaag ctggtcgaga agtccttcga aaccgatacc 720
aacctgaact tccaaaacct ctccgtgatc ggcttcagaa tcctgctgct gaaagtggct 780
ggcttcaatt tgctgatgac cctgcggctc tggagcagc 819
<210> 86
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 86
atgggttgtc ggttgctgtg ttgcgtcgtg ttctgccttc ttcaagctgg tcctctcgat 60
actgccgtga gccaaacccc taagtacctt gtcacccaaa tgggcaacga caagtccatc 120
aaatgcgaac agaacctcgg acacgacacc atgtactggt acaaacagga ttccaagaag 180
ttcctgaaga ttatgttctc atacaacaac aaggaactga ttatcaacga aactgtgccg 240
aaccggttct caccgaagtc gcctgacaag gctcatctca acttgcatat caactcgctg 300
gagctcggcg actccgccgt gtacttctgc gcgtccagcc agttctggga cggagcgggc 360
gacgaacagt acttcggccc gggcactcgg ctgaccgtga ccgaagatct gaacaaagtg 420
ttcccccccg aagtggccgt gttcgaacct tccgaggccg agatcagcca cacccaaaag 480
gccactctgg tctgcctggc caccggtttc ttccccgatc acgtggaact gtcttggtgg 540
gtgaacggaa aagaagtgca ctcgggggtg tccacggacc cccagcctct gaaggaacag 600
ccggcactga atgactcacg ctactgtctg tcgtcacggc tgcgcgtgtc ggccaccttc 660
tggcaaaacc cgcgaaacca ctttcgctgc caagtgcagt tttacgggct ttccgagaac 720
gacgagtgga ctcaggacag agcgaagccc gtgacccaaa tcgtgtccgc cgaggcctgg 780
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gtgctgatgg ctatggtcaa gcggaaggat 930
<210> 87
<211> 276
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 88
<211> 312
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 89
<211> 277
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
130 135 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145 150 155 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
180 185 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
195 200 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
210 215 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 90
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 91
<211> 273
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
<210> 92
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp
305 310
<210> 93
<211> 1833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 93
atggcgtccc tgctgttctt ctgcggtgcc ttctaccttc tgggaaccgg ctcgatggac 60
gccgacgtga cccaaacccc tcgcaaccgc atcaccaaga ctggaaagcg gatcatgctg 120
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accattctgt acgaaatcct cctggggaag gccacactgt acgccgtgct cgtgtccgcc 900
ctggtgctga tggccatggt caagcggaag gacttcggca gcggagctac caacttctcc 960
ctgctgaagc aggccggcga tgtggaagaa aatcccggac ctatgagcct ctcttccctg 1020
ctcaaagtgg tcactgcctc cctgtggctg ggaccgggaa tcgcccagaa gatcactcag 1080
acccagcctg gaatgttcgt gcaagagaaa gaggccgtga ccctggattg tacttatgac 1140
acttcagacc agtcgtacgg tttgttctgg tacaagcagc cgtcctccgg agaaatgatc 1200
ttcctgatct accagggatc gtacgacgag cagaacgcta ccgagggcag atattccctc 1260
aacttccaaa aggcccggaa atccgcgaac ctcgtgatct cggcctcaca acttggggac 1320
tccgctatgt atttctgcgc aatgtccggc gatagcgcag gaaacatgct gactttcggc 1380
ggtggaacta ggctgatggt caagccccac attcaaaacc ctgacccagc agtctaccag 1440
ttgcgggatt ccaagtcttc cgataaatcc gtgtgtctct ttacagactt cgatagccag 1500
accaacgtgt cccagagcaa agacagcgac gtgtacatta ctgacaagac tgtgctggac 1560
atgcggtcca tggacttcaa gagcaactcc gccgtcgctt ggtccaacaa gtctgacttt 1620
gcgtgcgcga acgctttcaa caacagcatt atcccggagg acaccttttt cccttccccc 1680
gagtcaagct gcgatgtcaa gcttgtggaa aagtcgttcg aaaccgacac caacctgaac 1740
ttccagaacc tgtccgtcat cgggttccgc attctgctgc tgaaggtcgc cggcttcaat 1800
ctcctgatga ctctccgctt gtggtcctca taa 1833
<210> 94
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 94
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
305 310 315 320
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser
325 330 335
Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu Gly Pro
340 345 350
Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe Val Gln
355 360 365
Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser Asp Gln
370 375 380
Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu Met Ile
385 390 395 400
Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr Glu Gly
405 410 415
Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn Leu Val
420 425 430
Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala Met
435 440 445
Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg
450 455 460
Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
485 490 495
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
500 505 510
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
515 520 525
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
530 535 540
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
545 550 555 560
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
565 570 575
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
580 585 590
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
595 600 605
Ser Ser
610
<210> 95
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 95
atgggattcc gccttctgtg ctgcgtggcc ttctgcttgc ttggagctgg tcccgtcgac 60
tcgggagtga cccagacgcc gaagcacttg attaccgcta ctgggcagcg cgtgactctg 120
cgatgctcac cacggtctgg cgacctctcc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggactgcagt tcctgatcca gtactacaac ggagaggagc gggctaaggg aaacatactg 240
gagcggttct cggcgcaaca attccccgat ctgcactccg aactgaacct gtcctccctg 300
gaattgggag actccgccct gtacttctgc gcaagcagcg gtggtgacgg ggatgaacag 360
ttctttggcc ctggaaccag actcaccgtg ctcgaggacc tcaagaacgt gttcccaccc 420
gaagtcgcgg tgttcgagcc ctccgaagcg gaaatcagcc atactcagaa agccactctc 480
gtgtgcctgg ccaccggatt ctacccggac cacgtcgagc tctcttggtg ggtgaacggg 540
aaagaggtcc acagcggcgt gagcactgat ccgcagccgc tgaaggaaca acccgccttg 600
aacgactcgc ggtactgtct gtcctcccgg ctgagagtgt cggccacctt ctggcaaaac 660
cccaggaacc actttaggtg ccaagtccag ttctacggcc tgagcgaaaa cgatgagtgg 720
acccaggaca gagccaagcc tgtgacccag attgtgtcag ccgaggcttg gggtagagca 780
gactgcggat tcacctccga gtcctaccaa caaggcgtcc tctcggcgac cattctgtac 840
gaaatcctgc ttgggaaggc cactctgtac gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg 900
gccatggtca agcggaagga ctcccggggg agagcaaaga ggggatcggg agccaccaat 960
tttagcctgc tgaagcaggc cggcgatgtg gaagaaaatc ctggccccat gtcccttagc 1020
tcactgctga aagtggtcac tgcgagcctg tggctgggac caggcattgc tcaaaagatc 1080
acccagactc agcctgggat gttcgtgcaa gagaaggaag ccgtgaccct cgactgcact 1140
tacgacacct ccgacccgtc ctacgggctg ttctggtaca agcagccgtc ctccggagag 1200
atgatcttcc tcatctacca aggctcctat gatcagcaga acgccaccga aggacgctac 1260
agcctgaact tccagaaggc tcggaagtcg gcgaacctcg tgatcagcgc atcccaactg 1320
ggggacagcg ccatgtactt ctgtgccatg tcgggcggat acaccggggg attcaagacc 1380
attttcgggg ccggcactag actgttcgtg aaggccaaca tccagaatcc tgatccggcg 1440
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tccgacttcg cctgtgcgaa cgccttcaac aactccatca ttccggaaga tacctttttc 1680
ccttcacctg agtcgagctg tgatgtgaag ctcgtggaaa agtcgtttga aacggacacc 1740
aacctgaact ttcagaacct gtccgtgatt ggtttccgca tcctgctgct gaaggtcgcc 1800
ggcttcaact tgctgatgac gctccggctg tggtcctcgt aa 1842
<210> 96
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 96
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn
305 310 315 320
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
325 330 335
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
340 345 350
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
355 360 365
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
370 375 380
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
385 390 395 400
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
405 410 415
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
420 425 430
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
435 440 445
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
450 455 460
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
465 470 475 480
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
485 490 495
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
500 505 510
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
515 520 525
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
530 535 540
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
545 550 555 560
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
565 570 575
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
580 585 590
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
595 600 605
Arg Leu Trp Ser Ser
610
<210> 97
<211> 1830
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 97
atgggttgtc ggttgctgtg ttgcgtcgtg ttctgccttc ttcaagctgg tcctctcgat 60
actgccgtga gccaaacccc taagtacctt gtcacccaaa tgggcaacga caagtccatc 120
aaatgcgaac agaacctcgg acacgacacc atgtactggt acaaacagga ttccaagaag 180
ttcctgaaga ttatgttctc atacaacaac aaggaactga ttatcaacga aactgtgccg 240
aaccggttct caccgaagtc gcctgacaag gctcatctca acttgcatat caactcgctg 300
gagctcggcg actccgccgt gtacttctgc gcgtccagcc agttctggga cggagcgggc 360
gacgaacagt acttcggccc gggcactcgg ctgaccgtga ccgaagatct gaacaaagtg 420
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ccggcactga atgactcacg ctactgtctg tcgtcacggc tgcgcgtgtc ggccaccttc 660
tggcaaaacc cgcgaaacca ctttcgctgc caagtgcagt tttacgggct ttccgagaac 720
gacgagtgga ctcaggacag agcgaagccc gtgacccaaa tcgtgtccgc cgaggcctgg 780
ggacgcgccg actgcggttt cacctccgtg agctaccaac agggcgtgct gtcagctacc 840
atcctttacg agatcctcct gggaaaggcc accctctacg ccgtcctggt gtccgcactg 900
gtgctgatgg ctatggtcaa gcggaaggat tttagggcca aacgcgggtc cggagcgacc 960
aacttctcgc tgttgaagca ggccggcgat gtggaagaga accctggacc gatgacgtcc 1020
attagagccg tgttcatttt cctgtggctg caactggacc tcgtgaatgg agaaaacgtc 1080
gagcagcacc catccaccct gagcgtgcag gagggagact ccgcagtcat caagtgcact 1140
tactccgact cagcatcaaa ctatttcccg tggtataagc aggaactcgg aaagcggcct 1200
cagctcatca ttgacatccg ctccaacgtc ggagagaaga aggaccagag aattgccgtg 1260
acactcaaca agaccgccaa gcatttctcc cttcacatca ccgaaaccca gcccgaggac 1320
agcgccgtct acttttgtgc ggcctcgagg ggcactgggt ttcagaagct cgtgttcggc 1380
actgggaccc ggctgctggt gtcgccaaac atccagaatc cagaccccgc ggtgtaccag 1440
ctgagagact cgaagtcttc cgataaatcc gtgtgtctct ttacagactt cgatagccag 1500
actaacgtgt cccagtccaa ggactccgat gtgtacatca ccgacaagac tgtgctggat 1560
atgcggagca tggactttaa gtccaattca gcggtcgcgt ggagcaacaa gtccgacttc 1620
gcctgcgcta acgctttcaa caactccatt atcccggagg ataccttctt cccgtcaccg 1680
gaatcctcgt gcgacgtgaa gctggtcgag aagtccttcg aaaccgatac caacctgaac 1740
ttccaaaacc tctccgtgat cggcttcaga atcctgctgc tgaaagtggc tggcttcaat 1800
ttgctgatga ccctgcggct ctggagcagc 1830
<210> 98
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人优化的
<400> 98
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
325 330 335
Pro Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu
340 345 350
Asp Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser
355 360 365
Val Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser
370 375 380
Ala Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro
385 390 395 400
Gln Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln
405 410 415
Arg Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His
420 425 430
Ile Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala
435 440 445
Ser Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg
450 455 460
Leu Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
485 490 495
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
500 505 510
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
515 520 525
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
530 535 540
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
545 550 555 560
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
565 570 575
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
580 585 590
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
595 600 605
Ser Ser
610
<210> 99
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-7 a 完整
<400> 99
atgagcctct cttccctgct caaagtggtc actgcctccc tgtggctggg accgggaatc 60
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gacccagcag tctaccagtt gcgggattcc aagtcttccg ataaatccgt gtgtctcttt 480
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gacaagactg tgctggacat gcggtccatg gacttcaaga gcaactccgc cgtcgcttgg 600
tccaacaagt ctgactttgc gtgcgcgaac gctttcaaca acagcattat cccggaggac 660
acctttttcc cttccagcga cgtcccctgc gatgtcaagc ttgtggaaaa gtcgttcgaa 720
accgacacca acctgaactt ccagaacctg ctagtgattg tgctccgcat tctgctgctg 780
aaggtcgccg gcttcaatct cctgatgact ctccgcttgt ggtcctca 828
<210> 100
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-7 b 完整
<400> 100
atggcgtccc tgctgttctt ctgcggtgcc ttctaccttc tgggaaccgg ctcgatggac 60
gccgacgtga cccaaacccc tcgcaaccgc atcaccaaga ctggaaagcg gatcatgctg 120
gaatgctccc agaccaaggg ccacgaccgc atgtactggt acagacagga cccgggtctg 180
ggattgcgcc tgatctacta ctccttcgac gtgaaggaca tcaacaaggg ggagatctcc 240
gatggatact cagtctcgag acaagcccag gctaagtttt ccctgtccct cgaatccgcc 300
attcccaatc agaccgcgct gtacttctgt gccacctcgg attgggaccg atccggcgac 360
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gtgttcccgc cggaagtggc agtgttcgag ccatccaagg cggagatcgc ccatacgcag 480
aaggccaccc tcgtgtgcct ggccactggg tttttccctg accacgtgga gctctcgtgg 540
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cagcccgcgc tcaatgattc gcggtactgc ctgagcagcc ggctcagagt gtccgccact 660
ttctggcaaa acccgcggaa ccatttccgg tgccaagtgc aattctacgg gctgtcggaa 720
aacgacgaat ggacccagga cagggccaag cccgtgaccc agattgtgtc cgctgaagcc 780
tgggggagag ctgattgcgg tatcaccagc gccagctacc accagggcgt gctgtcagcc 840
accattctgt acgaaatcct cctggggaag gccacactgt acgccgtgct cgtgtccgcc 900
ctggtgctga tggccatggt caagcggaag gacttc 936
<210> 101
<211> 1833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-7多顺反子构建体
<400> 101
atggcgtccc tgctgttctt ctgcggtgcc ttctaccttc tgggaaccgg ctcgatggac 60
gccgacgtga cccaaacccc tcgcaaccgc atcaccaaga ctggaaagcg gatcatgctg 120
gaatgctccc agaccaaggg ccacgaccgc atgtactggt acagacagga cccgggtctg 180
ggattgcgcc tgatctacta ctccttcgac gtgaaggaca tcaacaaggg ggagatctcc 240
gatggatact cagtctcgag acaagcccag gctaagtttt ccctgtccct cgaatccgcc 300
attcccaatc agaccgcgct gtacttctgt gccacctcgg attgggaccg atccggcgac 360
aaggaaactc agtacttcgg accaggaacc aggctcctgg tgctggagga tctgaacaag 420
gtgttcccgc cggaagtggc agtgttcgag ccatccaagg cggagatcgc ccatacgcag 480
aaggccaccc tcgtgtgcct ggccactggg tttttccctg accacgtgga gctctcgtgg 540
tgggtcaacg gaaaggaagt gcacagcggt gtctcaaccg acccgcaacc tctcaaggaa 600
cagcccgcgc tcaatgattc gcggtactgc ctgagcagcc ggctcagagt gtccgccact 660
ttctggcaaa acccgcggaa ccatttccgg tgccaagtgc aattctacgg gctgtcggaa 720
aacgacgaat ggacccagga cagggccaag cccgtgaccc agattgtgtc cgctgaagcc 780
tgggggagag ctgattgcgg tatcaccagc gccagctacc accagggcgt gctgtcagcc 840
accattctgt acgaaatcct cctggggaag gccacactgt acgccgtgct cgtgtccgcc 900
ctggtgctga tggccatggt caagcggaag gacttcggca gcggagctac caacttctcc 960
ctgctgaagc aggccggcga tgtggaagaa aatcccggac ctatgagcct ctcttccctg 1020
ctcaaagtgg tcactgcctc cctgtggctg ggaccgggaa tcgcccagaa gatcactcag 1080
acccagcctg gaatgttcgt gcaagagaaa gaggccgtga ccctggattg tacttatgac 1140
acttcagacc agtcgtacgg tttgttctgg tacaagcagc cgtcctccgg agaaatgatc 1200
ttcctgatct accagggatc gtacgacgag cagaacgcta ccgagggcag atattccctc 1260
aacttccaaa aggcccggaa atccgcgaac ctcgtgatct cggcctcaca acttggggac 1320
tccgctatgt atttctgcgc aatgtccggc gatagcgcag gaaacatgct gactttcggc 1380
ggtggaacta ggctgatggt caagccccac attcaaaacc ctgacccagc agtctaccag 1440
ttgcgggatt ccaagtcttc cgataaatcc gtgtgtctct ttacagactt cgatagccag 1500
accaacgtgt cccagagcaa agacagcgac gtgtacatta ctgacaagac tgtgctggac 1560
atgcggtcca tggacttcaa gagcaactcc gccgtcgctt ggtccaacaa gtctgacttt 1620
gcgtgcgcga acgctttcaa caacagcatt atcccggagg acaccttttt cccttccagc 1680
gacgtcccct gcgatgtcaa gcttgtggaa aagtcgttcg aaaccgacac caacctgaac 1740
ttccagaacc tgctagtgat tgtgctccgc attctgctgc tgaaggtcgc cggcttcaat 1800
ctcctgatga ctctccgctt gtggtcctca taa 1833
<210> 102
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-7 a 完整
<400> 102
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Gln Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val
130 135 140
Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe
145 150 155 160
Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp
165 170 175
Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe
180 185 190
Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys
195 200 205
Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro
210 215 220
Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu
225 230 235 240
Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu Arg
245 250 255
Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg
260 265 270
Leu Trp Ser Ser
275
<210> 103
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-7 b 完整
<400> 103
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser
260 265 270
Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 104
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-7多蛋白
<400> 104
Met Ala Ser Leu Leu Phe Phe Cys Gly Ala Phe Tyr Leu Leu Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ser Met Asp Ala Asp Val Thr Gln Thr Pro Arg Asn Arg Ile Thr
20 25 30
Lys Thr Gly Lys Arg Ile Met Leu Glu Cys Ser Gln Thr Lys Gly His
35 40 45
Asp Arg Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Phe Asp Val Lys Asp Ile Asn Lys Gly Glu Ile Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Gln Ala Gln Ala Lys Phe Ser Leu Ser
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ile Pro Asn Gln Thr Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Thr
100 105 110
Ser Asp Trp Asp Arg Ser Gly Asp Lys Glu Thr Gln Tyr Phe Gly Pro
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Leu Val Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser
260 265 270
Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser
305 310 315 320
Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser
325 330 335
Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu Gly Pro
340 345 350
Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe Val Gln
355 360 365
Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser Asp Gln
370 375 380
Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu Met Ile
385 390 395 400
Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Glu Gln Asn Ala Thr Glu Gly
405 410 415
Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn Leu Val
420 425 430
Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala Met
435 440 445
Ser Gly Asp Ser Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg
450 455 460
Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
485 490 495
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
500 505 510
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
515 520 525
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
530 535 540
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser
545 550 555 560
Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
565 570 575
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Ile Leu
580 585 590
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
595 600 605
Ser Ser
610
<210> 105
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-8 a 完整
<400> 105
atgtccctta gctcactgct gaaagtggtc actgcgagcc tgtggctggg accaggcatt 60
gctcaaaaga tcacccagac tcagcctggg atgttcgtgc aagagaagga agccgtgacc 120
ctcgactgca cttacgacac ctccgacccg tcctacgggc tgttctggta caagcagccg 180
tcctccggag agatgatctt cctcatctac caaggctcct atgatcagca gaacgccacc 240
gaaggacgct acagcctgaa cttccagaag gctcggaagt cggcgaacct cgtgatcagc 300
gcatcccaac tgggggacag cgccatgtac ttctgtgcca tgtcgggcgg atacaccggg 360
ggattcaaga ccattttcgg ggccggcact agactgttcg tgaaggccaa catccagaat 420
cctgatccgg cggtgtatca gctgcgcgac tccaagtctt ccgataaatc cgtgtgtctc 480
tttacagact tcgactccca aaccaacgtg tcacagtcca aggacagcga tgtgtacatc 540
accgacaaaa ccgtgctgga catgcggtcc atggacttca agtcaaacag cgcagtcgcc 600
tggtccaaca agtccgactt cgcctgtgcg aacgccttca acaactccat cattccggaa 660
gatacctttt tcccttcaag cgacgtcccc tgtgatgtga agctcgtgga aaagtcgttt 720
gaaacggaca ccaacctgaa ctttcagaac ctgctagtga ttgtgctccg catcctgctg 780
ctgaaggtcg ccggcttcaa cttgctgatg acgctccggc tgtggtcctc g 831
<210> 106
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-8 b 完整
<400> 106
atgggattcc gccttctgtg ctgcgtggcc ttctgcttgc ttggagctgg tcccgtcgac 60
tcgggagtga cccagacgcc gaagcacttg attaccgcta ctgggcagcg cgtgactctg 120
cgatgctcac cacggtctgg cgacctctcc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggactgcagt tcctgatcca gtactacaac ggagaggagc gggctaaggg aaacatactg 240
gagcggttct cggcgcaaca attccccgat ctgcactccg aactgaacct gtcctccctg 300
gaattgggag actccgccct gtacttctgc gcaagcagcg gtggtgacgg ggatgaacag 360
ttctttggcc ctggaaccag actcaccgtg ctcgaggacc tcaagaacgt gttcccaccc 420
gaagtcgcgg tgttcgagcc ctccaaggcg gagatcgccc atactcagaa agccactctc 480
gtgtgcctgg ccaccggatt ctacccggac cacgtcgagc tctcttggtg ggtgaacggg 540
aaagaggtcc acagcggcgt gagcactgat ccgcagccgc tgaaggaaca acccgccttg 600
aacgactcgc ggtactgtct gtcctcccgg ctgagagtgt cggccacctt ctggcaaaac 660
cccaggaacc actttaggtg ccaagtccag ttctacggcc tgagcgaaaa cgatgagtgg 720
acccaggaca gagccaagcc tgtgacccag attgtgtcag ccgaggcttg gggtagagca 780
gactgcggaa tcaccagcgc cagctaccac caaggcgtcc tctcggcgac cattctgtac 840
gaaatcctgc ttgggaaggc cactctgtac gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg 900
gccatggtca agcggaagga ctcccggggg 930
<210> 107
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-8多顺反子构建体
<400> 107
atgggattcc gccttctgtg ctgcgtggcc ttctgcttgc ttggagctgg tcccgtcgac 60
tcgggagtga cccagacgcc gaagcacttg attaccgcta ctgggcagcg cgtgactctg 120
cgatgctcac cacggtctgg cgacctctcc gtgtactggt atcagcagag cctggaccag 180
ggactgcagt tcctgatcca gtactacaac ggagaggagc gggctaaggg aaacatactg 240
gagcggttct cggcgcaaca attccccgat ctgcactccg aactgaacct gtcctccctg 300
gaattgggag actccgccct gtacttctgc gcaagcagcg gtggtgacgg ggatgaacag 360
ttctttggcc ctggaaccag actcaccgtg ctcgaggacc tcaagaacgt gttcccaccc 420
gaagtcgcgg tgttcgagcc ctccaaggcg gagatcgccc atactcagaa agccactctc 480
gtgtgcctgg ccaccggatt ctacccggac cacgtcgagc tctcttggtg ggtgaacggg 540
aaagaggtcc acagcggcgt gagcactgat ccgcagccgc tgaaggaaca acccgccttg 600
aacgactcgc ggtactgtct gtcctcccgg ctgagagtgt cggccacctt ctggcaaaac 660
cccaggaacc actttaggtg ccaagtccag ttctacggcc tgagcgaaaa cgatgagtgg 720
acccaggaca gagccaagcc tgtgacccag attgtgtcag ccgaggcttg gggtagagca 780
gactgcggaa tcaccagcgc cagctaccac caaggcgtcc tctcggcgac cattctgtac 840
gaaatcctgc ttgggaaggc cactctgtac gccgtgctgg tgtccgccct ggtgctgatg 900
gccatggtca agcggaagga ctcccggggg agagcaaaga ggggatcggg agccaccaat 960
tttagcctgc tgaagcaggc cggcgatgtg gaagaaaatc ctggccccat gtcccttagc 1020
tcactgctga aagtggtcac tgcgagcctg tggctgggac caggcattgc tcaaaagatc 1080
acccagactc agcctgggat gttcgtgcaa gagaaggaag ccgtgaccct cgactgcact 1140
tacgacacct ccgacccgtc ctacgggctg ttctggtaca agcagccgtc ctccggagag 1200
atgatcttcc tcatctacca aggctcctat gatcagcaga acgccaccga aggacgctac 1260
agcctgaact tccagaaggc tcggaagtcg gcgaacctcg tgatcagcgc atcccaactg 1320
ggggacagcg ccatgtactt ctgtgccatg tcgggcggat acaccggggg attcaagacc 1380
attttcgggg ccggcactag actgttcgtg aaggccaaca tccagaatcc tgatccggcg 1440
gtgtatcagc tgcgcgactc caagtcttcc gataaatccg tgtgtctctt tacagacttc 1500
gactcccaaa ccaacgtgtc acagtccaag gacagcgatg tgtacatcac cgacaaaacc 1560
gtgctggaca tgcggtccat ggacttcaag tcaaacagcg cagtcgcctg gtccaacaag 1620
tccgacttcg cctgtgcgaa cgccttcaac aactccatca ttccggaaga tacctttttc 1680
ccttcaagcg acgtcccctg tgatgtgaag ctcgtggaaa agtcgtttga aacggacacc 1740
aacctgaact ttcagaacct gctagtgatt gtgctccgca tcctgctgct gaaggtcgcc 1800
ggcttcaact tgctgatgac gctccggctg tggtcctcgt aa 1842
<210> 108
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-8 a 完整
<400> 108
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
130 135 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145 150 155 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
180 185 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
195 200 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 109
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-8 b 完整
<400> 109
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 110
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-8 多蛋白
<400> 110
Met Gly Phe Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Ser Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys His Leu Ile Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Gln Arg Val Thr Leu Arg Cys Ser Pro Arg Ser Gly Asp
35 40 45
Leu Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Ser Leu Asp Gln Gly Leu Gln Phe
50 55 60
Leu Ile Gln Tyr Tyr Asn Gly Glu Glu Arg Ala Lys Gly Asn Ile Leu
65 70 75 80
Glu Arg Phe Ser Ala Gln Gln Phe Pro Asp Leu His Ser Glu Leu Asn
85 90 95
Leu Ser Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gln Phe Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn
305 310 315 320
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
325 330 335
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
340 345 350
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
355 360 365
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
370 375 380
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
385 390 395 400
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
405 410 415
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
420 425 430
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
435 440 445
Ala Met Ser Gly Gly Tyr Thr Gly Gly Phe Lys Thr Ile Phe Gly Ala
450 455 460
Gly Thr Arg Leu Phe Val Lys Ala Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
465 470 475 480
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
485 490 495
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
500 505 510
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
515 520 525
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
530 535 540
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
545 550 555 560
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
565 570 575
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu
580 585 590
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
595 600 605
Arg Leu Trp Ser Ser
610
<210> 111
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-9 a 完整
<400> 111
atgacgtcca ttagagccgt gttcattttc ctgtggctgc aactggacct cgtgaatgga 60
gaaaacgtcg agcagcaccc atccaccctg agcgtgcagg agggagactc cgcagtcatc 120
aagtgcactt actccgactc agcatcaaac tatttcccgt ggtataagca ggaactcgga 180
aagcggcctc agctcatcat tgacatccgc tccaacgtcg gagagaagaa ggaccagaga 240
attgccgtga cactcaacaa gaccgccaag catttctccc ttcacatcac cgaaacccag 300
cccgaggaca gcgccgtcta cttttgtgcg gcctcgaggg gcactgggtt tcagaagctc 360
gtgttcggca ctgggacccg gctgctggtg tcgccaaaca tccagaatcc agaccccgcg 420
gtgtaccagc tgagagactc gaagtcttcc gataaatccg tgtgtctctt tacagacttc 480
gatagccaga ctaacgtgtc ccagtccaag gactccgatg tgtacatcac cgacaagact 540
gtgctggata tgcggagcat ggactttaag tccaattcag cggtcgcgtg gagcaacaag 600
tccgacttcg cctgcgctaa cgctttcaac aactccatta tcccggagga taccttcttc 660
ccgtcaagcg acgtcccctg cgacgtgaag ctggtcgaga agtccttcga aaccgatacc 720
aacctgaact tccaaaacct cctagtgatt gtgctcagaa tcctgctgct gaaagtggct 780
ggcttcaatt tgctgatgac cctgcggctc tggagcagc 819
<210> 112
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-9 b 完整
<400> 112
atgggttgtc ggttgctgtg ttgcgtcgtg ttctgccttc ttcaagctgg tcctctcgat 60
actgccgtga gccaaacccc taagtacctt gtcacccaaa tgggcaacga caagtccatc 120
aaatgcgaac agaacctcgg acacgacacc atgtactggt acaaacagga ttccaagaag 180
ttcctgaaga ttatgttctc atacaacaac aaggaactga ttatcaacga aactgtgccg 240
aaccggttct caccgaagtc gcctgacaag gctcatctca acttgcatat caactcgctg 300
gagctcggcg actccgccgt gtacttctgc gcgtccagcc agttctggga cggagcgggc 360
gacgaacagt acttcggccc gggcactcgg ctgaccgtga ccgaagatct gaacaaagtg 420
ttcccccccg aagtggccgt gttcgaacct tccaaggcgg agatcgccca cacccaaaag 480
gccactctgg tctgcctggc caccggtttc ttccccgatc acgtggaact gtcttggtgg 540
gtgaacggaa aagaagtgca ctcgggggtg tccacggacc cccagcctct gaaggaacag 600
ccggcactga atgactcacg ctactgtctg tcgtcacggc tgcgcgtgtc ggccaccttc 660
tggcaaaacc cgcgaaacca ctttcgctgc caagtgcagt tttacgggct ttccgagaac 720
gacgagtgga ctcaggacag agcgaagccc gtgacccaaa tcgtgtccgc cgaggcctgg 780
ggacgcgccg actgcggtat caccagcgcc agctaccacc agggcgtgct gtcagctacc 840
atcctttacg agatcctcct gggaaaggcc accctctacg ccgtcctggt gtccgcactg 900
gtgctgatgg ctatggtcaa gcggaaggat 930
<210> 113
<211> 1833
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-9多顺反子构建体
<400> 113
atgggttgtc ggttgctgtg ttgcgtcgtg ttctgccttc ttcaagctgg tcctctcgat 60
actgccgtga gccaaacccc taagtacctt gtcacccaaa tgggcaacga caagtccatc 120
aaatgcgaac agaacctcgg acacgacacc atgtactggt acaaacagga ttccaagaag 180
ttcctgaaga ttatgttctc atacaacaac aaggaactga ttatcaacga aactgtgccg 240
aaccggttct caccgaagtc gcctgacaag gctcatctca acttgcatat caactcgctg 300
gagctcggcg actccgccgt gtacttctgc gcgtccagcc agttctggga cggagcgggc 360
gacgaacagt acttcggccc gggcactcgg ctgaccgtga ccgaagatct gaacaaagtg 420
ttcccccccg aagtggccgt gttcgaacct tccaaggcgg agatcgccca cacccaaaag 480
gccactctgg tctgcctggc caccggtttc ttccccgatc acgtggaact gtcttggtgg 540
gtgaacggaa aagaagtgca ctcgggggtg tccacggacc cccagcctct gaaggaacag 600
ccggcactga atgactcacg ctactgtctg tcgtcacggc tgcgcgtgtc ggccaccttc 660
tggcaaaacc cgcgaaacca ctttcgctgc caagtgcagt tttacgggct ttccgagaac 720
gacgagtgga ctcaggacag agcgaagccc gtgacccaaa tcgtgtccgc cgaggcctgg 780
ggacgcgccg actgcggtat caccagcgcc agctaccacc agggcgtgct gtcagctacc 840
atcctttacg agatcctcct gggaaaggcc accctctacg ccgtcctggt gtccgcactg 900
gtgctgatgg ctatggtcaa gcggaaggat tttagggcca aacgcgggtc cggagcgacc 960
aacttctcgc tgttgaagca ggccggcgat gtggaagaga accctggacc gatgacgtcc 1020
attagagccg tgttcatttt cctgtggctg caactggacc tcgtgaatgg agaaaacgtc 1080
gagcagcacc catccaccct gagcgtgcag gagggagact ccgcagtcat caagtgcact 1140
tactccgact cagcatcaaa ctatttcccg tggtataagc aggaactcgg aaagcggcct 1200
cagctcatca ttgacatccg ctccaacgtc ggagagaaga aggaccagag aattgccgtg 1260
acactcaaca agaccgccaa gcatttctcc cttcacatca ccgaaaccca gcccgaggac 1320
agcgccgtct acttttgtgc ggcctcgagg ggcactgggt ttcagaagct cgtgttcggc 1380
actgggaccc ggctgctggt gtcgccaaac atccagaatc cagaccccgc ggtgtaccag 1440
ctgagagact cgaagtcttc cgataaatcc gtgtgtctct ttacagactt cgatagccag 1500
actaacgtgt cccagtccaa ggactccgat gtgtacatca ccgacaagac tgtgctggat 1560
atgcggagca tggactttaa gtccaattca gcggtcgcgt ggagcaacaa gtccgacttc 1620
gcctgcgcta acgctttcaa caactccatt atcccggagg ataccttctt cccgtcaagc 1680
gacgtcccct gcgacgtgaa gctggtcgag aagtccttcg aaaccgatac caacctgaac 1740
ttccaaaacc tcctagtgat tgtgctcaga atcctgctgc tgaaagtggc tggcttcaat 1800
ttgctgatga ccctgcggct ctggagcagc taa 1833
<210> 114
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-9 a 完整
<400> 114
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser Asp
210 215 220
Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
<210> 115
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-9 b 完整
<400> 115
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr
260 265 270
His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp
305 310
<210> 116
<211> 610
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR-9多蛋白
<400> 116
Met Gly Cys Arg Leu Leu Cys Cys Val Val Phe Cys Leu Leu Gln Ala
1 5 10 15
Gly Pro Leu Asp Thr Ala Val Ser Gln Thr Pro Lys Tyr Leu Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Asn Asp Lys Ser Ile Lys Cys Glu Gln Asn Leu Gly His
35 40 45
Asp Thr Met Tyr Trp Tyr Lys Gln Asp Ser Lys Lys Phe Leu Lys Ile
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Asn Asn Lys Glu Leu Ile Ile Asn Glu Thr Val Pro
65 70 75 80
Asn Arg Phe Ser Pro Lys Ser Pro Asp Lys Ala His Leu Asn Leu His
85 90 95
Ile Asn Ser Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Phe Trp Asp Gly Ala Gly Asp Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr
260 265 270
His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Phe Arg Ala Lys Arg Gly Ser Gly Ala Thr
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
325 330 335
Pro Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu
340 345 350
Asp Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser
355 360 365
Val Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser
370 375 380
Ala Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro
385 390 395 400
Gln Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln
405 410 415
Arg Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His
420 425 430
Ile Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala
435 440 445
Ser Arg Gly Thr Gly Phe Gln Lys Leu Val Phe Gly Thr Gly Thr Arg
450 455 460
Leu Leu Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
465 470 475 480
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
485 490 495
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
500 505 510
Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
515 520 525
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
530 535 540
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Ser
545 550 555 560
Asp Val Pro Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
565 570 575
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Ile Leu
580 585 590
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
595 600 605
Ser Ser
610

Claims (27)

1.一种对MAGE-A4特异性的分离的T细胞受体(TCR)，其中所述TCR包含：
a)可变TCR α区，其包含具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的CDR3，
可变TCRβ区，其包含具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:7的氨基酸序列的CDR3；或
b)可变TCRα区，其包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR3，
可变TCRβ区，其包含具有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR3；或
c)可变TCR α区，其包含具有SEQ ID NO:22的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:23的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:24的氨基酸序列的CDR3，
可变TCRβ区，其包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR2和具有SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR3。
2.根据权利要求1所述的分离的TCR，其中所述TCR特异性地识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其片段，优选地，其中所述TCR特异性地识别SEQ ID NO:1的氨基酸序列的HLA-A2结合形式，更优选地，其中所述TCR特异性地识别由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ IDNO:1的氨基酸序列。
3.根据前述权利要求中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：
a)具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的可变TCRβ区；或
b)具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的可变TCRβ区；或
c)具有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的可变TCR α区和具有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的可变TCRβ区。
4.根据前述权利要求中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含功能部分，所述功能部分包含SEQ ID NO:4、7、14、17、24和27的氨基酸序列中的至少一个。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：
a)具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的TCRβ链；
b)具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:21的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的TCRβ链。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：
a)具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的TCR α链和具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的TCRβ链；
b)具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的TCRβ链。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的TCR，其中所述TCR包含：
a)具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的TCRβ链；
b)具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:109的氨基酸序列的TCRβ链；或
c)具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的TCRα链和具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的TCRβ链。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的TCR或根据权利要求8所述的多价TCR复合物，其中通过结合由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列来诱导IFN-γ分泌。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的分离的TCR，其中，与结合至由HLA-A*02:01编码的分子呈递的不相关肽相比，当结合至由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列时，由效应细胞上表达的TCR与由HLA-A*02:01编码的分子呈递的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的结合所诱导的IFN-γ分泌可以高100倍以上，优选地高500倍以上，更优选地高2000倍以上。
10.一种多价TCR复合物，其包含至少两个权利要求1至7中任一项所述的TCR。
11.一种包含TCR α链和TCRβ链的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO:94、96、98、104、110和116中任一项所示的氨基酸序列。
12.一种核酸，其编码根据权利要求1至7中任一项所述的TCR或根据权利要求11所述的融合蛋白。
13.根据权利要求12所述的核酸，其中编码TCR α链的核酸序列如SEQ ID NO:69、77、85、99、105和111中的任一项所示。
14.根据权利要求12所述的核酸，其中编码TCR β链的核酸序列如SEQ ID NO:70、78、86、100、106和112中的任一项所示。
15.根据权利要求10所述的核酸，其中所述TCR包含：
a)由SEQ ID NO:69编码的TCRα链和由SEQ ID NO:70编码的TCRβ链；
b)由SEQ ID NO:77编码的TCRα链和由SEQ ID NO:78编码的TCRβ链；
c)由SEQ ID NO:85编码的TCRα链和由SEQ ID NO:86编码的TCRβ链；
d)由SEQ ID NO:99编码的TCRα链和由SEQ ID NO:100编码的TCRβ链；
e)由SEQ ID NO:105编码的TCRα链和由SEQ ID NO:106编码的TCRβ链；或
f)由SEQ ID NO:111编码的TCRα链和由SEQ ID NO:112编码的TCRβ链。
16.根据权利要求12所述的核酸，其中所述融合蛋白由SEQ ID NO:93、95、97、101、107和113中任一项所示的核酸序列编码。
17.一种包含权利要求12至16中任一项所述的核酸的载体，其中所述载体优选地为表达载体，更优选地为逆转录病毒载体或甚至更优选地为慢病毒载体。
18.一种载体，其包含编码如下的多肽序列的核酸：
a)SEQ ID NO:87和SEQ ID NO:88所示的多肽序列；
b)SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:90所示的多肽序列；
c)SEQ ID NO:91和SEQ ID NO:92所示的多肽序列；
d)SEQ ID NO:102和SEQ ID NO:103所示的多肽序列；
e)SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:109所示的多肽序列；或
f)SEQ ID NO:114和SEQ ID NO:115所示的多肽序列；
其中所述载体优选地为表达载体，更优选地为逆转录病毒载体或甚至更优选地为慢病毒载体。
19.一种细胞，其表达根据权利要求1至47中任一项所述的TCR。
20.一种细胞，其包含根据权利要求17或权利要求18所述的载体。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞、自然杀伤(NK)细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。
23.一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段特异性结合介导MAGE-A4特异性的权利要求1至7中任一项所述的TCR的一部分，优选地，其中所述介导MAGE-A4特异性的TCR的一部分包含：
a)SEQ ID NO:4的α链的CDR3和/或SEQ ID NO:7的β链的CDR3；或
b)SEQ ID NO:14的α链的CDR3和/或SEQ ID NO:17的β链的CDR3或；
c)SEQ ID NO:24的α链的CDR3和/或SEQ ID NO:27的β链的CDR3。
24.一种组合物，其包含根据权利要求1至7中任一项所述的TCR、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求11所述的融合蛋白、根据权利要求12至16中任一项所述的核酸、根据权利要求17或18所述的载体、根据权利要求19至22中任一项所述的细胞或根据权利要求23所述的抗体。
25.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体和根据权利要求1至7中任一项所述的TCR、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求11所述的融合蛋白、根据权利要求12至16中任一项所述的核酸、根据权利要求17或18所述的载体、根据权利要求19至22中任一项所述的细胞或根据权利要求23所述的抗体。
26.根据权利要求1至7中任一项所述的TCR、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求11所述的融合蛋白、根据权利要求12至16中任一项所述的核酸、根据权利要求17或权利要求18所述的载体、根据权利要求19至22中任一项所述的细胞、根据权利要求23所述的抗体、根据权利要求24所述的组合物或根据权利要求25所述的药物组合物，其用作药物。
27.根据权利要求1至7中任一项所述的TCR、根据权利要求8所述的多价TCR复合物、根据权利要求11所述的融合蛋白、根据权利要求12至16中任一项所述的核酸、根据权利要求17或权利要求18所述的载体、根据权利要求19至22中任一项所述的细胞、根据权利要求23所述的抗体、根据权利要求24所述的组合物或根据权利要求25所述的药物组合物，其用于治疗癌症，其中所述癌症优选地是血液癌症或实体瘤，更优选地，其中所述癌症选自肉瘤、前列腺癌、子宫癌、甲状腺癌、睾丸癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、食道癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、黑素瘤、肝细胞癌、头颈癌、胃癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌、髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，最优选地，其中所述癌症选自NSCLC、SCLC、乳腺癌、卵巢癌或结肠直肠癌、肉瘤或骨肉瘤。
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