CN116024177A

CN116024177A - 一种表达slamf7-gpc3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN116024177A
Application number: CN202210987662.7A
Authority: CN
Inventors: 黄曦; 朱漫漫; 吴永坚
Original assignee: Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2022-08-17
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种表达SLAMF7‑GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用。表达SLAMF7‑GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，由生物细胞构成，细胞表面表达SLAMF7‑GPC3双特异性抗体。所述双特异性抗体的基因序列如SEQ ID NO.7所示，该仿生纳米囊泡可提高双特异性抗体的半衰期，保留其较好的组织渗透性及其靶向性，同时识别淋巴细胞上SLAMF7抗原和肝癌细胞上GPC3抗原，利用SLAMF7在多种免疫细胞上表达激活多种免疫细胞，对表达GPC3靶蛋白的肿瘤细胞具有协同杀伤能力，该双特异性抗体有望通过SLAMF7信号重塑肿瘤微环境，具有良好应用前景。

Description

一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗技术领域，具体涉及一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是最常见的肝癌组织学亚型。据统计，只有15％-20％的HCC病例在早期被诊断，大多数晚期患者被诊断为不可切除的晚期HCC、肉眼可见的血管侵犯和肝外扩散，因此在实际临床治疗中存在相当大的挑战。目前使用索拉非尼、乐伐替尼和瑞戈非尼的标准治疗在晚期HCC中仍不令人满意，最近两种PD-1抑制剂派姆单抗和纳武单抗已获得批准用于索拉非尼服用后出现进展的HCC患者的治疗，为包括HCC在内的多种恶性肿瘤提供了有前景的临床效益。然而，只有约20％的HCC患者对PD-1阻断表现出明确和持久的反应，因此还亟需寻找更加有效和新靶点的免疫治疗策略。

跨膜受体信号淋巴细胞激活分子(SLAM)家族，是一组在造血细胞上广泛表达的I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族CD2亚群成员。SLAMF7也称CRACC、CS1、CD319，是SLAM家族第七个成员，在人体多种免疫细胞呈持续性低水平表达，包括NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、部分B细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，但在其他组织中不表达。SLAMF7在多发性骨髓瘤(MM)及其恶性浆细胞中持续高表达，已成为辅助诊断MM的新型生物标志物。SLAMF7是“自配体”，能够通过IgV结构域识别另一个细胞上相同的受体分子作为配体；另外，靶向SLAMF7的单克隆抗体，埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)可与IgC2结构域结合，其共同作用是触发胞内段的ITSM招募SLAM适配器蛋白介导人类白细胞的激活信号。有多个研究报道，SLAMF7在多种免疫细胞中可以通过SLAMF7特异性抗体或自配体的结合调控免疫细胞的功能，增强NK细胞、CD8+T细胞的毒性作用。因此，SLAMF7在肿瘤免疫反应中发挥重要作用，是肿瘤免疫治疗的新型靶点。

目前，针对以SLAMF7作为靶点的免疫治疗药物主要是埃罗妥珠单抗，用于治疗复发或难治性MM。然而，埃罗妥珠单抗在实体肿瘤中未见任何报道，主要原因是实体瘤细胞不表达SLAMF7，单一抗体无法有效同时靶向肿瘤细胞和免疫细胞。近年来，基于抗体结构而进一步开发的双特异性抗体，是目前最有潜在的癌症免疫治疗药物之一。双特异性抗体(BsAbs)是一种可以特异性结合两个抗原或者同一个抗原的两个不同表位的抗体，主要用于治疗肿瘤和自身免疫病。在肿瘤的治疗中，BsAbs是可以双向特异性识别肿瘤抗原和免疫细胞受体(如CD3、CD16)的抗体，促使内源效应T细胞或NK细胞和肿瘤细胞相互作用，进而杀伤肿瘤细胞。BsAbs分子量较小，易于制造，组织穿透增强，但其半衰期短，可导致快速的血液清除以及在靶向部位较差的滞留时间。尽管基于以上的缺点研究者进行了大量的BsAbs格式的改造，但目前还没有明确的首选最佳模式的出现。

发明内容

针对目前现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡及其制备方法与应用，引入了仿生纳米囊泡作为承载双特异性抗体的载体，解决现有双特异性抗体格式的缺陷。

本发明的首要目的在于提供一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，由生物细胞构成，细胞表面表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体。

优选地，所述细胞为HEK293T、HepG2、Huh-7、Hepa1-6、SK-Hep-1、淋巴细胞中的任意一种。

更优选地，所述细胞为HEK293T细胞。

优选地，所述的双特异性抗体的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明的第二个目的在于提供上述表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡的制备方法。

本发明通过以下技术方案实现所述目的：

一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：

S1、依次将信号肽、靶向SLAMF7的单链抗体、(G4S)2连接肽、靶向GPC3的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和Myc标签的基因拼接，经酶切后连接到载体，并转化至感受态细胞，培养后进行质粒提取测序，获得含SLAMF7-GPC3双特异性抗体质粒；

S2、将步骤S1所得质粒进行慢病毒包装，再将慢病毒质粒系统转染细胞，培养后经抗性筛选得到稳定表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的稳转细胞；

S3、扩大培养步骤S2所得稳转细胞，收集细胞进行裂解、研磨、梯度离心，沉淀重悬后经挤压形成仿生纳米囊泡。

优选地，步骤S1所述信号肽的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述靶向SLAMF7的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述(G4S)2连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD8α铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选地，步骤S2所述慢病毒包装载体为psPAX₂和pMD2G质粒。

本发明的第三个目的在于提供上述表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡在制备抗肿瘤药物方面的应用。

优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、黑色素瘤、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和神经母细胞瘤。

更优选地，所述肿瘤为肝癌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡。一方面，SLAMF7是一种在多种免疫细胞上表达的激活型受体，基于SLAMF7的激活信号可以增强多个免疫细胞的抗肿瘤能力，是肿瘤免疫治疗的新型靶点。GPC3抗原在HCC中特异性高表达，但在正常肝组织、肾和胃腺中均无表达，是HCC特异性靶抗原。因此本发明提供的SLAMF7-GPC3双特异性抗体能够激活NK细胞、T细胞等多种免疫细胞对表达GPC3靶蛋白的肿瘤细胞具有良好的杀伤能力，可发挥更强的抗肿瘤效果。另一方面，该双特异性抗原表达在仿生细胞囊泡上，解决了双特异性抗体原本格式的缺陷，延长双特异性抗体的半衰期，增加肿瘤渗透性，激活肿瘤微环境中更多的免疫细胞，抑制肿瘤的生长速度，缩小肿瘤的体积，使得该双特异性抗体具有更强的抗实体肿瘤活性，展现出良好的临床应用前景。

附图说明

图1为SLAMF7-GPC3双特异性抗体的结构示意图。

图2为SLAMF7@GPC3 NVs的纳米粒径图。

图3为SLAMF7@GPC3 NVs的SDS-PAGE鉴定图谱。

图4为SLAMF7@GPC3 NVs与PBMC对HepG2细胞的体外细胞毒试验结果图。

图5为SLAMF7@GPC3 NVs与PBMC对Bel-7402细胞的体外细胞毒试验结果图。

图6为SLAMF7@GPC3 NVs体内动物试验结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1、SLAMF7@GPC3 NVs的制备

1、SLAMF7-GPC3双特异性抗体基因的合成

本发明实施例提供了一种同时靶向SLAMF7和GPC3的双特异性抗体，命名为SLAMF7@GPC3 BsAbs，所述双特异性抗体包括：依次连接的信号肽、靶向SLAMF7的单链抗体、(G4S)2连接肽、靶向GPC3的单链抗体、CD8α铰链区、CD8α跨膜区和Myc标签串联而成，将其进行密码子优化，以保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合293T细胞的表达，结构如图1所示。其中单链可变片段为抗SLAMF7的重链轻链对，可变区核苷酸序列参考单克隆抗体huLuc63的序列(参考WO 2019/241358 A2序列号56)，包括抗SLAMF7VH、VL和铰链区结构域；靶向GPC3的单链抗体序列可变区核苷酸序列参考单克隆抗体GC33的序列(参考WO 2021/186395 A1 Table2)，包括抗GPC3VH、VL和铰链区结构域。为了SLAMF7@GPC3 BsAbs能在细胞表面表达，选择了CD8α信号肽作为膜表达信号肽引导其在膜上表达，CD8α跨膜区则进一步支撑其在膜上稳定存在。信号肽直接连接于抗体可变区的N端，蛋白标签Myc连接于序列的C端以作为蛋白表达的检测指标。各个结构域及信号肽的核苷酸序列如下：

所述信号肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述靶向SLAMF7的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述(G4S)2连接肽的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示，所述CD8α铰链区和跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示，所述Myc标签的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示。

2、SLAMF7-GPC3双特异性抗体质粒的构建

采用overlapPCR以及其它分子克隆技术完成实施例1中各基因的拼接。经EcoRI/BamHI酶切后连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(CD513B-1)克隆载体上，转化Stbl3感受态细胞，培养16h-18h后挑取单克隆培养，然后进行质粒提取并测序，获得目的基因质粒。

3、慢病毒三质粒系统转染293T细胞

具体实施过程如下：

(1)将生长状态良好的293T细胞培养至6孔板的培养板中，当细胞汇合度长至70％左右最佳；

(2)将目的质粒：psPAX2：pMD2G＝4：3：1的比例用PEI转染至293T细胞，然后放入培养箱中培养；

(3)转染12小时后用10％FBS的培养基换液，继续培养24小时后将细胞进行传代；

(4)待细胞状态好转后，在培养基中添加3μg/mL嘌呤霉素进行筛选，将细胞维持在37℃，5％CO₂培养箱中培养，每2-3天传代并补加抗生素，最终获得稳定表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的多克隆稳转细胞株。

4、SLAMF7@GPC3 NVs的制备

将多克隆稳转细胞扩大培养，然后收集细胞进行裂解、研磨、超高速离心后通过挤压器挤压形成仿生纳米囊泡。主要过程如下：收集细胞后用PBS洗涤3次，将细胞沉淀物分散在分离缓冲液中，4℃过夜；第二天将混合物加载到杜恩斯匀浆器中，并通过反复研磨来破坏细胞，将混合体以800×g的速度旋转5分钟以清除大碎片，收集上清液后再以10000×g离心25分钟，再次收集上清液最后以100000×g离心60分钟，收集沉淀并在PBS中分散；将混合物依次用含有800nm、200nm的聚碳酸酯膜的挤出器挤压，最终获得纳米囊泡。

5、SLAMF7@GPC3 NVs表征分析

(1)SLAMF7@GPC3 NVs的纳米粒径图

按照上述方法所描述的，通过低渗裂解、机械破坏、差速离心，最后人工挤压制备表达有双特异抗体的仿生纳米囊泡。通过动态光散射(DLS)技术对囊泡的粒径进行分析。结果如图2所示，SLAMF7@GPC3 NVs的水合粒径为～176nm。

(2)SLAMF7@GPC3 NVs的表征分析

利用Western blot对NVs蛋白标签Myc的表达进行分析，以检测目的蛋白的表达情况。结果如图3所示，相比于未转染的HEK293T NVs，转染后的SLAMF7@GPC3 NVs可检测到蛋白标签Myc的表达，且分子量大小符合预期。

实验结果表明成功构建了一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡(SLAMF7@GPC3 NVs)。

实施例2、SLAMF7@GPC3 NVs有效介导PBMC杀伤GPC3阳性肿瘤细胞检测

利用流式细胞术评估SLAMF7@GPC3 NVs是否能增强PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用。将表达GPC3抗原的HepG2细胞进行CFSE染色后平铺到96孔细胞培养板中，贴壁后吸掉培养基，按照靶细胞：效应细胞＝1:5的比例加入PBMC，再将不同浓度的SLAMF7@GPC3 NVs或作为对照组的Free293TNVs添加到每孔中，混合培养14h后，收集细胞进行死活染色，利用流式细胞术对细胞进行细胞毒性作用的鉴定。

结果分析

体外细胞毒性试验结果见图4，相较于对照组和Free293TNVs组，加入了不同浓度的SLAMF7@GPC3 NVs后能增强PBMC对于HepG2细胞的杀伤，并呈现浓度依赖性，提示SLAMF7@GPC3 NVs可激活多种免疫细胞，从而对肝癌细胞具有有效的杀伤作用。

实施例3、SLAMF7@GPC3 NVs不能介导PBMC杀伤GPC3阴性肿瘤细胞检测

为进一步验证SLAMF7@GPC3 NVs的特异性杀伤作用，拟将不表达GPC3的人肝癌细胞系Bel-7402作为靶细胞，利用实施例2所述的实验方法评估SLAMF7@GPC3 NVs对Bel-7402细胞的杀伤作用。

流式检测结果见图5，加入不同浓度的Free293TNVs和SLAMF7@GPC3 NVs均不能增强PBMC对Bel-7402细胞的杀伤作用，并随着浓度的增加未见明显的毒性作用，并与Control组没有明显差异，可见本发明实施例提供的靶向HCC的SLAMF7@GPC3 NVs具有良好的特异性的抗肿瘤效果。

实施例4、小鼠SLAMF7@GPC3 NVs的制备

为进一步分析SLAMF7@GPC3 NVs在小鼠体内的抗肿瘤活性，制备了鼠源的SLAMF7@GPC3 NVs。

1、质粒构建

将鼠CD8α信号肽(SEQ ID NO.8)、靶向鼠SLAMF7的单链抗体(SEQ ID NO.9)、(G4S)2连接肽(SEQ ID NO.3)、靶向GPC3的单链抗体(SEQ ID NO.4)、鼠CD8α铰链区及跨膜区(SEQID NO.10)和Myc标签(SEQ ID NO.6)的基因序列依次连接，其中单链可变片段为抗鼠SLAMF7的重链轻链对，可变区氨基酸序列参考单克隆抗体Murine Luc90的序列(参考WO2019/241358 A2序列号47)，通过体外基因合成的方法获得鼠源SLAMF7@GPC3 BsAbs基因片段(SEQ ID NO.11)，经EcoRI/BamHI酶切后连接到pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro(CD513B-1)克隆载体上，转化Stbl3感受态细胞，培养16h-18h后挑取单克隆培养，然后进行质粒提取并测序，获得目的基因质粒。

2、SLAMF7@GPC3 NVs的制备

具体实施过程如实施例1所述，简述为：将目的质粒：psPAX2：pMD2G＝4：3：1的比例用PEI转染至293T细胞，24-48h后用3μg/mL嘌呤霉素进行筛选，并通过一周的嘌呤霉素持续筛选获得稳定表达鼠源SLAMF7-GPC3双特异性抗体的多克隆稳转细胞株，并将其扩大培养后，依次通过裂解、反复研磨、超速离心、挤压的方法最终获得纳米囊泡。

实施例5、小鼠SLAMF7@GPC3 NVs杀伤皮下移植瘤的疗效检测

拟通过皮下注射Hepa1-6-huGPC3细胞建立小鼠皮下肝癌模型，尾静脉注射鼠源SLAMF7@GPC3 NVs探究其体内抗肿瘤效应。2x10⁶ Hepa1-6-huGPC3细胞注射于C57BL/6小鼠的右侧腹股沟，约10天后待肿瘤体积达到100mm³左右时随机分组，并通过尾静脉注射给药。(1)阴性对照组，只注射PBS；(2)对照组，注射200μg Free 293T NVs；(3)实验组，注射200μgSLAMF7@GPC3 NVs。给药当天为第10天，每隔3天尾静脉注射给药，剂量不变，并用游标卡尺测量Hepa1-6-huGPC3皮下移植瘤体积的大小，记录每组小鼠肿瘤体积和体重的变化，计算体积公式为1/2×长×宽×宽(mm³)。

结果分析

结果如图6A所示，在种植Hepa1-6-huGPC3细胞的野生型小鼠皮下肝癌模型中，给予SLAMF7@GPC3 NVs治疗后可明显抑制肿瘤的生长，与对照组和阴性对照组有明显差异；给予Free 293T NVs治疗后不能抑制肿瘤的生长，肿瘤随着时间逐渐增大，与阴性对照组无明显差异。这表明，表达SLAMF7/GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡可特异性地与肿瘤特异性抗体结合，并激活免疫细胞对其杀伤，在野生型荷瘤小鼠中显示出一定的抗肿瘤效应。

在图6B中，Hepa1-6-huGPC3细胞接种于SLAMF7全敲除小鼠(SLAMF7 KO)皮下建立小鼠皮下肝癌模型，通过4次注射不同的纳米囊泡，比较其对小鼠皮下肝癌的抑制作用。结果显示，给予SLAMF7@GPC3 NVs治疗后不能抑制肿瘤的生长，肿瘤随着时间逐渐增大，并与对照组和阴性对照组无明显差异。这提示，当敲除了免疫细胞上的SLAMF7之后，SLAMF7@GPC3 NVs失去了结合的受体，继而不能有效激活免疫细胞，也进一步提示了，表达GPC3/SLAMF7双特异性抗体的纳米囊泡通过与免疫细胞上的SLAMF7结合，激活免疫细胞从而实现对肿瘤细胞的杀伤。

本发明提供了一种靶向GPC3的双特异性抗体仿生纳米囊泡，GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族的成员，参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡。研究显示，GPC3在70-80％的HCC中表达，但在正常组织中很少表达，是极具前景的肝癌免疫治疗靶标。因此本发明提供的双特异性抗体以SLAMF7作为激活型受体，以GPC3抗原作为肝癌靶点，使得SLAMF7@GPC3 NVs能够特异性识别该GPC3抗原，从而对GPC3靶细胞具有良好的杀伤能力，可发挥更强的抗肿瘤效果。同时该靶向GPC3的双特异性抗体仿生纳米囊泡仅对表达GPC3的肝癌细胞表现出杀伤能力，展现出其特异性的抗肿瘤活性，具有良好的安全性和应用前景。

显然，以上所述的具体实施方案，只是对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，由生物细胞构成，细胞表面表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞为HEK293T、HepG2、Huh-7、Hepa1-6、SK-Hep-1、淋巴细胞中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞为HEK293T。

4.根据权利要求1所述的一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡，其特征在于，所述SLAMF7-GPC3双特异性抗体的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

5.一种权利要求1-4所述的表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述靶向SLAMF7的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述(G4S)2连接肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述靶向GPC3的单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD8α铰链区和跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述Myc标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述慢病毒载体为psPAX₂和pMD2G质粒。

8.权利要求1所述的一种表达SLAMF7-GPC3双特异性抗体的仿生纳米囊泡在制备抗肿瘤药物方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、食管癌、胃癌、黑色素瘤、结直肠癌、膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌和神经母细胞瘤。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。