CN113004422A - 一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用，所述融合蛋白从N端到C端依次包含：流感病毒的核蛋白NP片段、基质蛋白M2e和血凝素颈部保守区HA2片段，其中所述NP片段的序列为NP1(335‑350aa)和NP2(380‑393aa)；所述M2e包括甲1型M2e的至少两个相同拷贝；所述HA2片段包括H1、H3和H7三种亚型的颈部保守序列(76‑130aa)。本发明所提供的融合蛋白对流感病毒的识别度广，能够识别与本身所包含序列的亚型不同的病毒，可针对高变异流感病毒获得广谱的免疫保护效果。

Description

一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用。
背景技术
流感是由流感病毒引起的严重危害人类健康的急性呼吸道传染病。流感病毒依据病原的不同，可分为甲、乙、丙3型。乙型和丙型流感病毒变异相对较少，从未引起世界大流行，而其中甲型流感病毒亚型多，变异大，已成为流感防控和疫苗研究的重点。预防流感大流行最有效的措施是疫苗接种，然而，依据目前甲型流感疫苗研发策略和技术路线生产的疫苗生产周期长、成本高、有滞后性，很难适应防控流感大流行的需求。若能研制出甲型流感病毒不同亚型间具有交叉保护作用的疫苗，即广谱流感疫苗，将改变目前全世界防控流感大流行的被动局面。
近年来，流感病毒广谱中和抗体的发现、对流感病毒抗原保守区域及细胞免疫机制的深入研究、疫苗免疫策略的优化等都为广谱流感疫苗的研发提供了新思路。研究表明NP(nucleoprotein，NP)蛋白非常保守，同型流感病毒NP蛋白的氨基酸相似性在90％上，在维持病毒RNA的结构和在流感病毒复制周期的过程中具有重要作用，控制着流感病毒的RNP(ribonucleoprotein)进入细胞核、RNA的复制及出核的各个关键环节。同时NP蛋白是CTL反应的主要靶点，其保护效果可通过Th细胞分泌的细胞因子介导，由Tc细跑的杀伤反应来实现，由于其保守性，在甲型流感病毒的不同亚型间具有交叉反应活性。甲型流感病毒M2(matrix，M)作为一种膜蛋白，具有离子通道活性，与膜内pH值的调节密切相关。M2蛋白的胞外区包含23个高度保守的氨基酸残基(M2 ectodomain，M2e)，虽然抗M2e抗体没有中和病毒的作用，但研究表明M2e主要是通过ADCC发挥作用，M2e特异性CD4+T细胞免疫反应也可能参与免疫保护，其单克隆抗体在体外与体内试验中均能抑制病毒的复制。在自然感染过程中虽然M2e蛋白免疫反应比较弱，不起主要作用，若能使用疫苗技术使机体获得针对M2e蛋白的强免疫反应，则有可能发展成为具有交叉保护能力的广谱流感疫苗。流感病毒的HA(haemagglutinin，HA)是流感病毒包膜上的跨膜糖蛋白三聚体，有16种亚型，具有亚型和株的特异性。HA包括头部和颈部，其中头部由HA1结构域组成，介导HA与细胞表面唾液酸受体结合；颈部介导病毒与细胞膜融合，由HA2和小部分HA1结构域构成，是相对保守区域。HA2融合区域广谱中和表位的发现为使用HA2保守区域研发可以对抗多种亚型甲型流感病毒的广谱流感疫苗提供了实验依据。
超抗原(Superantigen,SAg)，为一类能够超强活化刺激T细胞增殖的抗原，可高效激活生物的免疫细胞，产生免疫应答效应。其中金黄色葡萄球菌肠毒素(Stapholoccalenterotoxin,SEs)是一类由金黄色葡萄球菌和链球菌分泌的胞外蛋白质，属于典型的超抗原。其中SEC2亚型可在极低浓度下有效的激活机体的免疫系统，包括细胞免疫和体液免疫，可作为一种免疫激活剂应用于一些疾病的临床治疗研究。
但目前现有技术中，针对流感病毒的疫苗还须根据新的流行毒株及时更换生产毒株以保证疫苗效果，而且由于灭活疫苗生产依赖于鸡胚，生产周期长，生产能力低，成本高，难以适应防控流感大流行的需求；目前在研的亚单位广谱流感疫苗仅以病毒株的某个或少数几个保守区作为免疫靶点，导致其保护性不够广泛，免疫原弱。因此急需一种易于制备、成本低且识别广、有效度高的光谱流感疫苗。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中所生产的季节性流感疫苗保护性不够广泛、免疫原弱且生产成本高的缺陷，提供一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用。
对于多病毒表位串联的疫苗蛋白，本发明人对流感病毒保守区进行了大量的研究，发现只有特定病毒亚型的表位或特定截取表位片段，以及特定的表位数量组合，才能够产生最优的效果。
为实现上述目的，本发明的技术方案之一为：
一种融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次包含：流感病毒核蛋白NP片段、基质蛋白M2e和血凝素颈部保守区HA2片段，其中
所述NP片段的序列为NP1(335-350aa)和NP2(380-393aa)；其中335-350aa与380-393aa分别指NP1和NP2在NP蛋白的氨基酸序列中的位置；
所述M2e包括甲1型M2e的至少两个相同拷贝；所述HA2片段包括H1、H3和H7三种亚型的颈部保守序列(76-130aa)；其中76-130aa表示该片段在HA2的氨基酸序列中的位置。
所述NP片段的序列优选为如SEQ ID NO:3所示；所述M2e的序列优选为如SEQ IDNO:4所示；所述HA2片段的序列优选为如SEQ ID NO:5所示。
上述技术方案中，所述“至少两个”表示可以为两个，三个或三个以上；优选两个或三个。
较佳地，所述NP片段、M2e和HA2片段由连接肽连接，和/或，所述NP1和NP2、H1、H3和H7分别由连接肽连接，其中，所述连接肽为柔性肽。
更佳地，所述连接肽为(G4S)n，n为5～20的自然数；或所述连接肽的序列如SEQ IDNO:6所示。
在一些优选的具体实施例中，所述融合蛋白还包含超抗原。
较佳地，所述超抗原为SEC。
更佳地，所述SEC为SEC2。
进一步更佳地，所述SEC2的序列如SEQ ID NO:9所示。
在一些更优选的具体实施例中，所述超抗原位于所述融合蛋白的N端或C端；和/或，所述超抗原与所述融合蛋白之间通过(G4S)5或SEQ ID NO:6所示序列连接。
较佳地，所述超抗原位于所述融合蛋白的C端，所述超抗原与所述融合蛋白之间通过通过SEQ ID NO:6所示序列连接。
本发明的技术方案之二为：提供一种分离的核酸，其编码技术方案之一所述的融合蛋白。
较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或7所示。
本发明的技术方案之三为：提供一种重组载体，其包含技术方案之二所述的核酸。
本发明的技术方案之四为：提供一种转化体，其包含技术方案之三所述的重组载体。
本发明的技术方案之五为：提供一种疫苗，其包含技术方案之一所述的融合蛋白作为活性成分。
本发明的技术方案之六为：提供本发明的技术方案之一的融合蛋白在制备流感病毒疫苗中的应用。
较佳地，所述流感病毒为甲型流感病毒。
更佳地，所述流感病毒选自H1N1、H3N2、H2N2、H5N1、H7N9和H9N2。
本发明的技术方案之七为：提供一种蛋白组合物，其包含技术方案之一所述的融合蛋白，且所述融合蛋白不含超抗原。
较佳地，所述蛋白组合物还包含超抗原。
更佳地，所述超抗原为SEC。
进一步更佳地，所述SEC为SEC2，所述SEC2的序列例如SEQ ID NO:9所示。
本发明中，“融合基因”指由两个或两个以上不同的核苷酸序列连接而成的基因，或者天然位置并不互相连接的两个或两个以上核苷酸序列连接而成的基因，所述两个基因可以是同一来源，也可以是不同来源。本发明的融合基因所编码的蛋白称作融合蛋白。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明所提供的融合蛋白，对流感病毒的识别度广，能够识别与本身所包含序列的亚型不同的病毒，可针对高变异流感病毒获得广谱的免疫保护效果，为使用疫苗主动预防由未知甲型流感病毒引起的流感大流行带来了希望，具有良好的临床应用价值；且其所产生的抗体滴度、中和病毒的能力及抗原抗体亲和力强。在本发明一较佳实施例中，将其超抗原的融合，其免疫应答强度大大提高，且对细胞无毒性。另外，本发明所提供的融合蛋白通过原核表达系统，例如大肠杆菌，就可大量表达，极大的降低了成本，且生产周期短，非常适于工业生产。
附图说明
图1为nmh和sec2基因片段的PCR产物以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析结果，其中：1为DNA marker；2为nmh基因片段的PCR产物；3为阴性对照即以无菌水为模板；4为sec2基因片段的PCR产物。
图2为nmh和sec2基因片段通过Overlap PCR连接为nmhc基因片段以1.0％琼脂糖凝胶电泳分析结果。其中：1为DNA marker；2为阴性对照即以无菌水为模板；3-6泳道为nmhc基因片段产物。
图3为NMH和NMHC融合蛋白复性后10％的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为免疫调节蛋白SEC2；泳道2为蛋白marker；泳道3为复性后的NMHC融合蛋白；泳道4为复性后的NMH融合蛋白。
图4为以SPR法检测免疫抗体与血凝素抗原亲和力的结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
以下实施例中所有蛋白质分子的编码碱基序列DNA均由上海生工公司合成。
实施例1.融合蛋白的制备
基因合成
1、编码融合蛋白NMH的融合基因nmh，其具有如表1中的SEQ ID NO:1中的碱基序列，其中，NP片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码基因np具有如SEQ ID NO:1所示序列的第1位到90位所示的碱基序列。M2e的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，其编码基因m2e具有如SEQ ID NO:1的第111位到248位所示的碱基序列。HA2片段的氨基酸序列如SEQID NO:5所示，其编码基因ha2具有如SEQ ID NO:1的第270位到807位所示的碱基序列。编码连接短肽的DNA连接子GSAGSAG(SEQ ID NO:6)的碱基序列位于如SEQ ID NO:1所示序列的第91位到110位、第249位到269位、第435位到455位和第621位到641位。
表1
Figure BDA0002962151480000051
注：粗体的序列为连接子序列。
(1)nmh融合基因序列SEQ ID NO:1的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
长度：807bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(2)nmh融合基因的制备：
(a)基因的合成：根据原核表达宿主菌大肠杆菌E.coli BL21(DE3)细胞的特点，进行目的基因的密码子优化。
(b)多克隆位点的选择：根据pET28a载体的结构特点，将目的基因nmh插入在Nco l(5’CCATGG 3’)与Xho I(5’CTCGAG 3’)之间，并在Xho I之前加入His-tag标签和终止密码子(TAA)。
(c)设计好的融合基因序列nmh由上海生工公司合成，并导入pET28a载体(购自Novagen公司)上，转入E.coli BL21(DE3)宿主菌。
由SEQ ID NO:1所示的核苷酸所编码的融合蛋白NMH，具有如SEQ ID NO:2所示(具体见表1)的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:2的信息如下
序列特征：
*长度：269残基
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
分子类型：蛋白质
最初来源：人工序列。
2、编码融合蛋白NMHC的融合基因nmhc，其具有表2中的SEQ ID NO:7中的碱基序列，其中，其中，NP片段碱基序列为如SEQ ID NO:7所示序列的第1位到90位，M2e编码基因m2e具有如SEQ ID NO:7的第111位到248位所示的碱基序列，HA2片段编码基因ha2具有如SEQ ID NO:7的第270位到807位所示的碱基序列，SEC2编码基因sec2通过具有如SEQ IDNO:7的第829位到1545位所示的碱基序列。编码连接短肽GSAGSAG(SEQ ID NO:6)的DNA 连接子具有如SEQ ID NO:7的第91位到110位、第249位到269位、第435位到455位、第621位到641位、第808位到828位所示的碱基序列。
表2
Figure BDA0002962151480000071
注：粗体的序列为linker序列。
(1)融合基因nmhc的核苷酸序列SEQ ID NO:7信息(参见表2)
(a)序列特征：
长度：1545bp
类型：核酸
链型：双链
拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(2)融合基因nmhc的制备：
(a)PCR引物设计：
根据pET28a-sec2载体和pET28a-nmh的结构特点，使用Primer 5.0软件设计相应引物，在nmh基因的5’端设计F1正向引物，在nmh基因3’端设计能够与sec2基因的5’端F2引物重叠互补的R1反向引物；在sec2基因的5’端设计F2正向引物F2使其能够与R1进行重叠互补，在sec2基因的3’端设计反向引物R2，R2需包括His-tag标签、终止密码子和HindⅢ酶切位点。
正向引物(F1)：5’-CATGCCATGGGAAGCGCGGCGTTCGAA-3’(SEQ ID NO:25)
反向引物(R1)：5’-ACTGCCGCCACCGCCCGCATTCTCGCGTAACTGACGTTTAACACGTTCGTA-3’(SEQ ID NO:26)
正向引物(F2)：5’-TTACGTGAAAATGCAGGTGGTGGAGGTAGTGAGAGTCAACCAGACCCT-3’(SEQ ID NO:27)
反向引物(R2)：5’-CCCAAGCTTCTAATGGTGGTGATGGTGATGTCCATTCTTTGTTGTAAGGTGG-3’(SEQ ID NO:28)
(b)获取sec2基因片段和nmh基因片段：
单独PCR反应体系为(Pyrobest buffer、dNTP、pyrobest DNA聚合酶均购自TAKARA公司)：10×Pyrobest buffer 5μL、dNTP 250μmol、正反向引物各25pmol、模板为含sec2基因(或nmh基因)的质粒DNA 0.1μg、pyrobest DNA聚合酶2U，无菌超纯水补齐体积至50μL。
PCR反应条件为：第一阶段：95℃，5min；第二阶段：94℃，55s；55℃(或58℃)，2min；72℃，2min；共30个循环；第三阶段：72℃，10min。
(c)PCR产物回收：sec2基因与融合基因nmh的PCR扩增产物分别经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。
(d)目的片段nmh-sec2的扩增连接:使用Overlap PCR的方法对胶回收后的基因片段nmh与sec2按摩尔比1:1进行桥接扩增，获取融合基因片段。
第一轮PCR反应条件为：第一阶段：95℃，5min；第二阶段：94℃，55s；55℃，2min；72℃，2min；共5个循环；第三阶段：72℃，10min。(注：在第一轮PCR反应过程中不加引物，是通过nmh与sec2基因片段上互补序列自动识别配对(R1与F2存在重叠互补序列)后开始扩增。)在第一轮程序结束后加入适量的F1和R2引物，开始第二轮扩增。
第二轮PCR反应条件为：第一阶段：95℃，5min；第二阶段：94℃，55s；58℃，2min；72℃，2min；共30个循环；第三阶段：72℃，10min。
(e)Overlap PCR产物回收：Overlap PCR扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收1545bp的目的条带，操作方法按照江苏康为世纪有限公司胶回收纯化试剂盒使用说明进行。得到编码产物疫苗蛋白NMH与免疫调节蛋白SEC2的融合蛋白的融合基因nmhc。
由SEQ ID NO:7所示的核苷酸所编码的融合蛋白NMHC，具有如SEQ ID NO:8所示(具体见表2)的氨基酸序列。
其中，SEQ ID NO:8的信息如下
序列特征：
*长度：515残基
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
分子类型：蛋白质
最初来源：人工序列。
表达与纯化
将实施例1中所制得的广谱流感疫苗融合基因nmhc连接到原核表达载体pET-28a-TEV中(融合基因nmh直接由生工合成加入到pET-28a载体上并导入BL21(DE3)宿主菌)，实现在大肠杆菌中表达融合亚单位疫苗NMH-SEC2，具体为：
将融合基因nmh-sec2(即融合基因nmhc)连接入表达载体pET-28a-TEV(购自Novagen公司)中：将表达载体pET-28a-TEV的质粒DNA和nmh-sec2的基因DNA片段分别使用NcoI(购自大连宝生物公司)和Hind III(购自大连宝生物公司)双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收nmh-sec2片段和质粒pET-28a的DNA大片段，以T4DNA连接酶(购自大连宝生物公司)16℃连接过夜，构建靶向性穿膜肽-超抗原融合蛋白表达载体pET28a-nmh-sec2。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自大连宝生物公司)。以卡那青霉素(购自Sigma公司)抗性筛选转化子，挑选重组单克隆扩培，提取质粒DNA，经NcoI和Hind III双酶切鉴定正确重组克隆(图2)。并将经双酶切验证正确的重组克隆质粒送往上海生工公司进行测序。将测序正确的质粒转化进入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中(购自北京天根生化科技公司)。
(1)融合蛋白NMH-SEC2(NMHC)的表达：接种上述转化重组质粒pET28a-nmh-sec2的BL21(DE3)单菌落于60μg/ml卡那青霉素的液体LB培养基中37℃过夜，次日按1:100(体积比)转接到下一代，37℃培养至OD600为0.6-0.8，加入终浓度为10mM IPTG(购自Sigma公司)30℃和37℃诱导4h。
(2)收集含融合蛋白的沉淀：离心收集诱导表达后的菌体，每100ml原培养物的菌体重悬于10ml平衡缓冲液(20mMTirs-HCl，500mMNaCl，50mM咪唑，pH＝7.9)，于0℃超声破碎至菌液变清亮，10000rpm10min离心，收集包涵体沉淀。
(3)利用AKTA纯化仪(美国GE公司产品)纯化融合蛋白：将包涵体蛋白溶解在8M尿素的平衡缓冲液中，并上样(上样速度为0.2-0.8ml/min)到蛋白纯化工作站AKTA Ni2+亲和层析柱(美国GE公司产品)，使用十个柱体积的含8M尿素的平衡缓冲液(8M尿素，20mMTirs-HCl，500mMNaCl，50mM咪唑，pH＝7.9)漂洗，至UV检测数值稳定。最后使用含8M尿素的洗脱缓冲液(8M尿素，20mMTirs-HCl，500mMNaCl，250mM咪唑，pH＝7.9)洗脱目的蛋白，在UV检测数值开始拉升后进行收集，直至UV平稳，将收集的变性目的蛋白。
(4)将装有变性目的蛋白的透析袋放入含6M尿素复性液的烧杯中(500mL)，于磁力搅拌器上4℃缓慢搅拌4小时，将复性液倒掉250mL，并以每分钟2mL的速度往烧杯中泵入新的复性液(无尿素)，4℃，4小时，重复5-6次，之后泵入PBS溶液，4℃，4小时,重复3次，最后将透析袋放入PBS溶液中，4℃搅拌透析12小时，重复3遍，得到纯度较高的复性的目的蛋白。并经过SDS-PAGE分析纯度，结果如图3所示。
实施例2.抗体滴度研究
亚单位流感疫苗免疫小鼠血清型研究。选取4-6周的雌性BALB/c小鼠作为研究对象，分别在第0天、第14天、第28天腹腔免疫相同摩尔的疫苗蛋白(NMH、NMHC、PBS(对照))，免疫体积为500μl/只小鼠，在第3次免疫后14天(第42天)取血清并进行血清中抗体研究。
将H1N1、H3N2、H2N2、H5N1、H7N9、H9N2等6种(由于实验条件限制，仅以上述6种蛋白为代表)流感亚型的血凝素蛋白(HA)以2μg/mL的浓度包被在ELISA酶标板上，PBST洗板4次，封闭液封闭，PBST洗板4次，之后与梯度稀释的各免疫组血清37℃孵育1小时，PBST洗板4次，孵育二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L))37℃孵育1小时，PBST洗板4次，TMB显示并在450nm处测吸光度，以处理组/对照组＞＝2.1为阳性。结果如表8所示，NMH融合蛋白诱导产生的免疫球蛋白能较好的识别并结合上述6种(不仅限于这6种，如有更多亚型也会结合)病毒亚型的HA，且NMHC组的结合能力相比于NMH组更强。
注：所用流感病毒株为：H5N1(A/Hubei/1/2010)，H7N9(A/Shanghai/2/2013)，H2N2(A/Canada/720/2005)，H9N2(A/Hong Kong/35820/2009),H1N1 A/Michigan/45/2015,H3N2A/Hong Kong/4801/2014。
表8
Figure BDA0002962151480000111
Figure BDA0002962151480000121
实施例3.微量中和实验
第一天，将不同免疫组血清以2倍倍比梯度稀释相应倍数，于96孔板加入50μl/孔，之后加入50μl/孔100TCID50的病毒(以H1N1、H3N2病毒株为代表)共孵育，37℃，2小时，加入100μl/孔MDCK(1.5*10^4个，购买于ATCC CCL-34(MDCK(NBL-2)))于37℃培养20小时，同时设置对照组，阳性对照50μl病毒稀释液+50μl病毒+100μl MDCK。阴性对照100μl病毒稀释液+100μl MDCK。第二天，用ELISA检测病毒感染细胞，先使用抗甲型流感的NP蛋白的鼠源单克隆抗体(货号：11675-T62-50，北京义翘神州科技股份有限公司)检测病毒在MDCK细胞中的复制，从而反应出血清样本对某种病毒的中和作用，细胞阳性对照平均OD值-细胞阴性对照平均OD值/2+细胞阴性对照平均OD值＝X，X＝细胞半数感染阈值，每孔OD值低于X值时，判定为中和反应阳性，中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中和抗体滴度，结果表9所示。
免疫血清分别为NMH、NMHC、NP、M2e、HA2分别单独使用、CNMH(与NMHC的区别为二者方向相反，从N端至C端依次为SEC2和NMH)、NMH+SEC2混合联用、SEC2和PBS，小鼠免疫过程同实施例2，分别以500μl相同的物质的量3.3μM免疫各组小鼠，并于3免后第14天取血清进行检测。
注：H1N1 A/Michigan/45/2015(NIBSC 16/248)，H3N2 A/Hong Kong/4801/2014-like virus
在相同免疫剂量和方式的条件下，NMH处理组在最大稀释倍数320和160以后仍然能有效中和H1N1和H3N2病毒株，而单独NP、M2e、HA2、SEC2均不能很好的中和这两种病毒(即较小稀释倍数下才可以发挥中和作用)，表明本发明的融合蛋白NMH具有成为广谱亚单位疫苗的潜力(即可诱导机体产生抗多种流感病毒感染的抗体)。当NMH融合与免疫调节蛋白SEC2联合使用(偶联或混合使用)时，所诱导产生的血清型可在更高稀释倍数下有效中和流感病毒，阻止其感染DMCK细胞，其中CNMH与NMH+SEC2处理组血清在最大稀释320倍后可有效中和病毒。而NMHC免疫的血清型中和能力最强，即在血清稀释640倍以后仍可有效中和两种病毒。表明在免疫调节蛋白SEC2存在的条件下，NMH可更好的诱导机体产生免疫保护作用。
表9
Figure BDA0002962151480000131
Figure BDA0002962151480000141
实施例4.抗体抗原亲和力检测
在已知NMHC可诱导小鼠产生广谱抗体的前提下，利用表面等离子体共振(SPR)进行抗体抗原亲和力检测。首先，将纯化的血清抗体以1.25nM的浓度置于的PBSP缓冲液(PBS(pH 7.4)，P20浓度为0.05％)中，通过生物传感器(GM5)表面的山羊抗小鼠IgG(H+L)进行胺偶联固定，山羊抗小鼠IgG(H+L)传感器通道作为各结合作用的阴性对照。然后，以30μL/min的流速进样，即在PBSP的运行缓冲液中通过多个浓度的HAs(H1N1、H2N2、H3N2、H5N1)。每一次结合后，用甘氨酸pH2.0反复洗涤传感器表面即再生。反应单元(RU)反映了抗体-抗原复合物结合情况，结果如图4所示。NMHC所诱导的抗体与HAs(H1N1、H2N2、H3N2、H5N1)的亲和力分别为98nM，73.9nM，685nM，72.9nM，显示出对H1N1、H2N2、H5N1具有较高的亲和力。说明NMHC可诱导高亲和力的特异性抗体。
对比例
1.为了验证NP不同片段及片段数量对疫苗蛋白的活性的影响，本实验构建了两组对比融合蛋白，分别为：
(1)、N2MH(N2表示NP380–393aa)、N3/4MH(N3/4表示NP55–69aa和NP147–155aa)和N1/ 3MH(N1/3表示NP335–350aa和NP55–69aa)，并通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应。结果如表8和表9所示，其最终中和病毒的能力不如本发明的NMH(N1/2-M12-H1/3/7)融合蛋白处理组(M12表示甲1型病毒中M2e的2个拷贝数)；
(2)、N1MHC(N1代表NP335–350aa)、N2MHC(N2表示NP380–393aa)、N3/4MHC(N3/4表示NP55–69aa和NP147–155aa)和N1/3MHC4(N1/3表示NP335–350aa和NP55–69aa)四种融合蛋白，并通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应，结果如表8和表9所示。但其最终中和病毒的能力远不如本发明的NMHC(N1/2-M12-H1/3/7-SEC2)处理组，且此效果差异大于未连接超抗原前的对比例效果差异。
2.为了验证M2e不同型种类及拷贝数对疫苗蛋白的活性的影响，本实验构建了两组对比融合蛋白，分别为：
(1)NM11H(M11表示甲1型病毒中M2e的1个拷贝数)、NM13H(M13表示甲1型中M2e的3个拷贝数)和NM22H(M22表示甲4型中M2e的2个拷贝数)三种融合蛋白，并通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应。结果如表8和表9所示，但NM11H和NM22H的最终中和病毒的能力不如本发明的NMH(N1/2-M12-H1/3/7)处理组，而M13H与NMH产生的抗体功能相似，无明显差别；
(2)NM11HC(M11表示甲1型病毒中M2e的1个拷贝数)、NM13HC(M13表示甲1型中M2e的3个拷贝数)和NM22HC(M22表示甲4型中M2e的2个拷贝数)三种融合蛋白，并通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应。结果如表8和表9所示，它们都可以诱导小鼠产生针对多种流感病毒的广谱中和抗体，但NM11HC和NM22HC的最终中和病毒的能力远不如本发明的NMHC(N1/2-M12-H1/3/7-SEC2)处理组，而M13HC与NMHC产生的抗体功能相似，无明显差别。
3.为了验证HA不同亚型种类及数量对疫苗蛋白的活性的影响，本实验构建了两组对比融合蛋白，分别为：
(1)NMH1/3(H1/3表示来自H1和H3的HA2串连)、NMH3/7(H3/7表示来自H3和H7的HA2串连)、NMH1/7(H1/7表示来自H1和H7的HA2串连)、NMH17/3/7(其中H17/3/7表示来自H17，H3和H7的HA2串连)、NMH13/3/7(H13/3/7表示来自H13，H3和H7的HA2串连)、NMH9/3/7(H9/3/7表示来自H9，H3和H7的HA2串连)、NMH1/3/10(H1/3/10表示，来自H1，H3和H10的HA2串连)和NMH1/4/7(H1/4/7表示来自H1，H4和H7的HA2串连)，
通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应。结果分别如表8和表9所示，其最终中和病毒的能力不如本发明的NMH(NP1/2-M12-H1/3/7)处理组。
(2)NMH1/3C(H1/3表示来自H1和H3的HA2串连)、NMH3/7C(H3/7表示来自H3和H7的HA2串连)、NMH1/7C(H1/7表示来自H1和H7的HA2串连)、NMH13/3/7C(H13/3/7表示来自H13，H3和H7的HA2串连)和NMH1/3/10C(H1/3/10表示来自H1、H3和H10的HA2串连)。
通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应，结果分别如表8和表9所示。其最终中和病毒的能力远不如本发明的NMHC(NP1/2-M12-H1/3/7SEC2)处理组，且此效果差异大于未连接超抗原前的对比例效果差异。
4.为了验证SEC2和其他免疫调节蛋白对NMH疫苗作用效果的差异，将免疫调节蛋白SEC2替换为超抗原SEA和SEB，并以相同的方式连接NMH组成的融合蛋白NMHA、NMHB，按照同实施例3一样的方式进行小鼠免疫，同实施例4一致的实验方法进行免疫血清的中和实验的检测。
结果发现，在NMHA与NMHB免疫小鼠过程中有较强的毒性，会引起小鼠发热、食欲不振、焦躁不安、体重减轻甚至死亡。中和实验结果如表9所示NMHA、NMHB的中和效应与NMH相当，不如NMHC。
5.本发明验证以不同方式连接NMH和SEC2的融合蛋白的疫苗活性，构建了两组对比融合蛋白，分别为：
(1)、将NMH与SEC2之间的连接短肽替换为(GS)5(一种柔性连接短肽)，构建融合蛋白NMHC(GS)5，由表8和表9可知NMHC(GS)5免疫组的抗体滴度和中和实验结果都表明，不如以GSAGSAG作为连接肽的NMHC融合蛋白；
(2)、将疫苗分子NMH和免疫调节分子SEC2作为两个独立个体混合联用(NMH+SEC2)，通过抗体滴度和中和实验，发现疫苗分子NMH和免疫调节分子SEC2联用(NMH+SEC2)的免疫效果不如NMH和SEC2共表达(即NMHC)，在抗体滴度研究中，NMH+SEC2免疫组针对H5N1和H9N2亚型最大稀释倍数为4096倍，不及NMHC的稀释倍数8192。中和实验结果显示NMH+SEC2针对H1N1和H3N2发挥中和作用的最大稀释倍数为320，而NMHC针对H1N1的最大稀释倍数为1280，针对H3N2的最大稀释倍数为640。
6.为了验证免疫调节蛋白SEC2在疫苗蛋白不同融合位置的影响，本实验构建了NCMH(NP-SEC2-M2e-HA2)、NMCH(NP-M2e-SEC2-HA2)和CNMH(SEC2-NP-M2e-HA2)三种融合蛋白，并通过抗体滴度和中和实验研究其免疫效应。结果如表8和表9所示，NCMH、NMCH和CNMH处理组可以诱导产生针对多种流感病毒的广谱抗体，但其抗体滴度和中和病毒的能力远不如NMHC(NP-M2e-HA2-SEC2)处理组。
本对比例中所有蛋白质分子的编码碱基序列DNA均由上海生工公司合成，所有蛋白分子的表达载体的构建、蛋白表达与纯化、蛋白定量方法，均与实施例2相同，所有蛋白分子的活性检测均与实施例3、4、5相同。
其中，融合蛋白NMHA(NP-M2e-HA2-SEA)具有下表3中的SEQ ID NO:11中的氨基酸序列，其编码融合基因nmha，具有下表3中的SEQ ID NO:10中的碱基序列。
表3
Figure BDA0002962151480000171
Figure BDA0002962151480000181
注：粗体的序列为linker序列
融合蛋白NMHB具有下表4中的SEQ ID NO:13中的氨基酸序列，其编码基因nmhb，具有下表4中的SEQ ID NO:12中的碱基序列。
表4
Figure BDA0002962151480000182
注：粗体的序列为连接子序列。
疫苗蛋白N1MHC(NP1-M2e-HA2-SEC2)中的N1序列具有下表5中的SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，其编码基因n1，具有下表5中的SEQ ID NO:14所示的碱基序列；蛋白N2MH(NP2-M2e-HA2)中的N2序列具有下表5中的SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，其编码基因n2，具有下表5中的SEQ ID NO:16所示的碱基序列，融合疫苗N2MHC(NP2-M2e-HA2-SEC2)是由N2MH与SEC2融合而成；疫苗蛋白N3/4MH(NP3/4-M2e-HA2)中的N3/4序列具有下表5中的SEQ IDNO:19所示的氨基酸序列，其编码基因n3/4，具有下表5中的SEQ ID NO:18所示的碱基序列，融合疫苗N3/4MHC(NP3/4-M2e-HA2-SEC2)是由N3/4MH与SEC2融合而成；疫苗蛋白N1/3MH(NP1/3-M2e-HA2)中的N1/3序列具有下表5中的SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，其编码基因n1/3具有下表5中的SEQ ID NO:20所示的碱基序列，融合疫苗N1/3MHC(NP1/3-M2e-HA2-SEC2)是由N1/3MH与SEC2融合而成。其中各表位以及超抗原与病毒表位之间的连接肽序列均如SEQ IDNO:6所示。
表5
Figure BDA0002962151480000191
疫苗蛋白NM11H(NP-M2e1*-HA2)中的M11具有下表6中的SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，其编码基因m11具有下表6中的SEQ ID NO:22所示的碱基序列，融合蛋白NM11HC(NP-M2e11*-HA2-SEC2)是由NM11H与SEC2融合而成。疫苗蛋白NM13H(NP-M2e13*-HA2)中的M13具有下表6中的SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，其编码基因m13具有下表6中的SEQ ID NO:24所示的碱基序列，融合蛋白NM13HC(NP-M2e13*-HA2-SEC2)是由NM13H与SEC2融合而成。疫苗蛋白NM22H(NP-M2e22*-HA2)中的M22具有下表6中的SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，其编码基因m22具有下表6中的SEQ ID NO:26所示的碱基序列，融合蛋白NM22HC(NP-M2e22*-HA2-SEC2)是由NM22H与SEC2融合而成。其中各表位以及超抗原与病毒表位之间的连接肽序列均如SEQ ID NO:6所示。
表6
Figure BDA0002962151480000192
Figure BDA0002962151480000201
疫苗蛋白NMH1/3(NP-M2e-HA21/3)中的H1/3具有下表7中的SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，其编码基因h1/3具有下表7中的SEQ ID NO:28所示的碱基序列，融合蛋白NMH1/3C(NP-M2e-HA21/3-SEC2)是由NMH1/3与SEC2串联而成。疫苗蛋白NMH3/7(NP-M2e-HA23/7)中的H3/7具有下表7中的SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，其编码基因h3/7具有下表7中的SEQ IDNO:30所示的碱基序列，融合蛋白NMH3/7C(NP-M2e-HA23/7-SEC2)是由NMH3/7与SEC2串联而成。疫苗蛋白NMH1/7(NP-M2e-HA21/7)中的H1/7具有下表7中的SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，其编码基因h1/7具有下表7中的SEQ ID NO:32所示的碱基序列，融合蛋白NMH1/7C(NP-M2e-HA21/7-SEC2)是由NMH1/7与SEC2串联而成。疫苗蛋白NMH17/3/7(NP-M2e-HA217/3/7)中的H17/3/7具有下表7中的SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，其编码基因h17/3/7具有下表7中的SEQ IDNO:34所示的碱基序列。疫苗蛋白NMH13/3/7(NP-M2e-HA213/3/7)中的H13/3/7具有下表7中的SEQID NO:37所示的氨基酸序列，其编码基因h13/3/7具有下表7中的SEQ ID NO:36所示的碱基序列，融合蛋白NMH13/3/7C(NP-M2e-HA213/3/7-SEC2)是由NMH13/3/7与SEC2串联而成。疫苗蛋白NMH9/3/7(NP-M2e-HA29/3/7)中的H9/3/7具有下表7中的SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列，其编码基因h9/3/7具有下表7中的SEQ ID NO:38所示的碱基序列。疫苗蛋白NMH1/3/10(NP-M2e-HA21/3/10)中的H1/3/10具有下表7中的SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列，其编码基因h1/3/10具有下表7中的SEQ ID NO:40所示的碱基序列，融合蛋白NMH1/3/10C(NP-M2e-HA21/3/10-SEC2)是由NMH1/3/10与SEC2串联而成。疫苗蛋白NMH1/4/7(NP-M2e-HA21/4/7)中的H1/4/7具有下表7中的SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列，其编码基因h1/4/7具有下表7中的SEQ ID NO:42所示的碱基序列。其中各表位以及超抗原与病毒表位之间的连接肽序列均如SEQ ID NO:6所示。
表7
Figure BDA0002962151480000202
Figure BDA0002962151480000211
Figure BDA0002962151480000221
序列表
<110> 辽宁成大生物股份有限公司
中国科学院沈阳应用生态研究所
<120> 一种融合蛋白、含其的疫苗及其应用
<130> P21010121C
<160> 43
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 807
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nmh
<400> 1
tccgcggcgt tcgaagatct gcgtgttctg agcttcatcc gtggttacga actgcgtagc 60
cgttactggg cgatccgtac ccgttctggt ggttctgcgg gtagcgcggg tatgtctctg 120
ctgaccgaag ttgaaacccc gatccgtaac gaatggggct ctcgttctaa cgattctagc 180
atgagcctgc tgaccgaagt tgaaaccccg atccgtaacg aatggggcag ccgttctaac 240
gattctagcg gttctgcggg ctctgcgggc cgtatcgaaa acctgaacaa aaaagttgat 300
gatggcttcc tggatatctg gacctacaac gctgaactgc tggttctgct ggaaaacgaa 360
cgtaccctgg attaccacga tagcaacgtt aaaaacctgt acgaaaaagt tcgtagccag 420
ctgaaaaaca acgcgggctc tgcgggtagc gcgggccgta ttcaggatct ggaaaaatac 480
gttgaagata ccaaaatcga tctgtggagc tacaacgcgg aactgctggt agcgctggaa 540
aaccagcaca ccatcgatct gaccgattct gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt 600
cgtcagctgc gtgaaaacgc aggtagcgcg ggcagcgcgg gtcagatcgg taacgtgatc 660
aactggaccc gtgattccat gaccgaagtt tggagctaca acgcggaact gctggttgcg 720
atggaaaacc agcacaccat cgatctggcg gatagcgaaa tgaacaaact gtacgaacgt 780
gttaaacgtc agctgcgtga aaacgcg 807
<210> 2
<211> 269
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NMH
<400> 2
Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Ser
20 25 30
Ala Gly Ser Ala Gly Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile
35 40 45
Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Met Ser Leu Leu
50 55 60
Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn
65 70 75 80
Asp Ser Ser Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile Glu Asn Leu Asn
85 90 95
Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu
100 105 110
Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser
115 120 125
Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn
130 135 140
Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr
145 150 155 160
Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu
165 170 175
Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
180 185 190
Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Gly
195 200 205
Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg
210 215 220
Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala
225 230 235 240
Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys
245 250 255
Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala
260 265
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NP
<400> 3
Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser Phe Ile Arg Gly Tyr
1 5 10 15
Glu Leu Arg Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly
20 25 30
<210> 4
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M2e
<400> 4
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly
1 5 10 15
Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr
20 25 30
Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser Asn Asp Ser Ser
35 40 45
<210> 5
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA2
<400> 5
Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg
35 40 45
Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile Gly Asn
115 120 125
Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn
130 135 140
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala
145 150 155 160
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg
165 170 175
Glu Asn Ala
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接肽
<400> 6
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly
1 5
<210> 7
<211> 1545
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nmhc
<400> 7
tccgcggcgt tcgaagatct gcgtgttctg agcttcatcc gtggttacga actgcgtagc 60
cgttactggg cgatccgtac ccgttctggt ggttctgcgg gtagcgcggg tatgtctctg 120
ctgaccgaag ttgaaacccc gatccgtaac gaatggggct ctcgttctaa cgattctagc 180
atgagcctgc tgaccgaagt tgaaaccccg atccgtaacg aatggggcag ccgttctaac 240
gattctagcg gttctgcggg ctctgcgggc cgtatcgaaa acctgaacaa aaaagttgat 300
gatggcttcc tggatatctg gacctacaac gctgaactgc tggttctgct ggaaaacgaa 360
cgtaccctgg attaccacga tagcaacgtt aaaaacctgt acgaaaaagt tcgtagccag 420
ctgaaaaaca acgcgggctc tgcgggtagc gcgggccgta ttcaggatct ggaaaaatac 480
gttgaagata ccaaaatcga tctgtggagc tacaacgcgg aactgctggt agcgctggaa 540
aaccagcaca ccatcgatct gaccgattct gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt 600
cgtcagctgc gtgaaaacgc aggtagcgcg ggcagcgcgg gtcagatcgg taacgtgatc 660
aactggaccc gtgattccat gaccgaagtt tggagctaca acgcggaact gctggttgcg 720
atggaaaacc agcacaccat cgatctggcg gatagcgaaa tgaacaaact gtacgaacgt 780
gttaaacgtc agctgcgtga aaacgcgggt tctgcgggta gcgcgggtga gagtcaacca 840
gaccctacgc cagatgagtt gcacaaatca agtgagttta ctggtacgat gggtaatatg 900
aaatatttat atgatgatca ttatgtatca gcaactaaag ttatgtctgt agataaattt 960
ttggcacatg atttaattta taacattagt gataaaaaac taaaaaatta tgacaaagtg 1020
aaaacagagt tattaaatga agatttagca aagaagtaca aagatgaagt agttgatgtg 1080
tatggatcaa attactatgt aaactgctat ttttcatcca aagataatgt aggtaaagtt 1140
acaggtggta aaacttgtat gtatggagga ataacaaaac atgaaggaaa ccactttgat 1200
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tttgaagtgc aaactgataa gaaaagtgta acagctcaag aactagacat aaaagctagg 1320
aattttttaa ttaataaaaa aaatttgtat gagtttaaca gttcaccata tgaaacagga 1380
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gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt cgtcagctgc gtgaaaacgc a 351
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1/3
<400> 29
Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg
35 40 45
Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln
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Leu Arg Glu Asn Ala
115
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h3/7
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cgtattcagg atctggaaaa atacgttgaa gataccaaaa tcgatctgtg gagctacaac 60
gcggaactgc tggtagcgct ggaaaaccag cacaccatcg atctgaccga ttctgaaatg 120
aacaaactgt tcgaaaaaac ccgtcgtcag ctgcgtgaaa acgcaggtag cgcgggcagc 180
gcgggtcaga tcggtaacgt gatcaactgg acccgtgatt ccatgaccga agtttggagc 240
tacaacgcgg aactgctggt tgcgatggaa aaccagcaca ccatcgatct ggcggatagc 300
gaaatgaaca aactgtacga acgtgttaaa cgtcagctgc gtgaaaacgc g 351
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H3/7
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Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu
1 5 10 15
Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr
20 25 30
Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg
35 40 45
Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile
50 55 60
Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
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Leu Ala Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln
100 105 110
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cgtatcgaaa acctgaacaa aaaagttgat gatggcttcc tggatatctg gacctacaac 60
gctgaactgc tggttctgct ggaaaacgaa cgtaccctgg attaccacga tagcaacgtt 120
aaaaacctgt acgaaaaagt tcgtagccag ctgaaaaaca acgcgggctc tgcgggtagc 180
gcgggccaga tcggtaacgt gatcaactgg acccgtgatt ccatgaccga agtttggagc 240
tacaacgcgg aactgctggt tgcgatggaa aaccagcaca ccatcgatct ggcggatagc 300
gaaatgaaca aactgtacga acgtgttaaa cgtcagctgc gtgaaaacgc g 351
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1/7
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Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg
35 40 45
Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile
50 55 60
Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
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gcgggccgta ttcaggatct ggaaaaatac gttgaagata ccaaaatcga tctgtggagc 240
tacaacgcgg aactgctggt agcgctggaa aaccagcaca ccatcgatct gaccgattct 300
gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt cgtcagctgc gtgaaaacgc aggtagcgcg 360
ggcagcgcgg gtcagatcgg taacgtgatc aactggaccc gtgattccat gaccgaagtt 420
tggagctaca acgcggaact gctggttgcg atggaaaacc agcacaccat cgatctggcg 480
gatagcgaaa tgaacaaact gtacgaacgt gttaaacgtc agctgcgtga aaacgcg 537
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H17/3/7
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Arg Ile Gln His Leu Ser Asp Arg Val Asp Asp Ala Leu Leu Asp Ile
1 5 10 15
Trp Ser Tyr Asn Thr Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Phe His Asp Ala Asn Val Lys Asn Leu Phe Glu Lys Val Lys
35 40 45
Ala Gln Leu Lys Asp Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile Gly Asn
115 120 125
Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn
130 135 140
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala
145 150 155 160
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg
165 170 175
Glu Asn Ala
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h13/3/7
<400> 36
cgcattaaca tgctggcgga tcgcgtggat gatgcggtga ccgatgtgtg gagctataac 60
gcgaaactgc tggtgctgct ggaaaacggc cgcaccctgg atctgcatga tgcgaacgtg 120
cgcaacctgc atgatcaggt gaaacgcgtg ctgaaagata acgcgggttc tgcgggctct 180
gcgggccgta ttcaggatct ggaaaaatac gttgaagata ccaaaatcga tctgtggagc 240
tacaacgcgg aactgctggt agcgctggaa aaccagcaca ccatcgatct gaccgattct 300
gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt cgtcagctgc gtgaaaacgc aggtagcgcg 360
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tggagctaca acgcggaact gctggttgcg atggaaaacc agcacaccat cgatctggcg 480
gatagcgaaa tgaacaaact gtacgaacgt gttaaacgtc agctgcgtga aaacgcg 537
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<213> Artificial Sequence
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<223> H13/3/7
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Arg Ile Asn Met Leu Ala Asp Arg Val Asp Asp Ala Val Thr Asp Val
1 5 10 15
Trp Ser Tyr Asn Ala Lys Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gly Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Leu His Asp Ala Asn Val Arg Asn Leu His Asp Gln Val Lys
35 40 45
Arg Val Leu Lys Asp Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile Gly Asn
115 120 125
Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn
130 135 140
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala
145 150 155 160
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg
165 170 175
Glu Asn Ala
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cgcctgaaca tgatcaacaa taaaattgat gatcagatcc aggacatctg ggcatacaac 60
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aacaacctgt ataacaaagt aaaacgcgct ctgggctcca acgccggttc tgcaggttcc 180
gccggtcgta ttcaggatct ggaaaaatac gttgaagata ccaaaatcga tctgtggagc 240
tacaacgcgg aactgctggt agcgctggaa aaccagcaca ccatcgatct gaccgattct 300
gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt cgtcagctgc gtgaaaacgc aggtagcgcg 360
ggcagcgcgg gtcagatcgg taacgtgatc aactggaccc gtgattccat gaccgaagtt 420
tggagctaca acgcggaact gctggttgcg atggaaaacc agcacaccat cgatctggcg 480
gatagcgaaa tgaacaaact gtacgaacgt gttaaacgtc agctgcgtga aaacgcg 537
<210> 39
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H9/3/7
<400> 39
Arg Leu Asn Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile
1 5 10 15
Trp Ala Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr
20 25 30
Leu Asp Glu His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys
35 40 45
Arg Ala Leu Gly Ser Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile Gly Asn
115 120 125
Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn
130 135 140
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala
145 150 155 160
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg
165 170 175
Glu Asn Ala
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h1/3/10
<400> 40
cgtatcgaaa acctgaacaa aaaagttgat gatggcttcc tggatatctg gacctacaac 60
gctgaactgc tggttctgct ggaaaacgaa cgtaccctgg attaccacga tagcaacgtt 120
aaaaacctgt acgaaaaagt tcgtagccag ctgaaaaaca acgcgggctc tgcgggtagc 180
gcgggccgta ttcaggatct ggaaaaatac gttgaagata ccaaaatcga tctgtggagc 240
tacaacgcgg aactgctggt agcgctggaa aaccagcaca ccatcgatct gaccgattct 300
gaaatgaaca aactgttcga aaaaacccgt cgtcagctgc gtgaaaacgc aggttctgca 360
ggttccgccg gtcgtattaa tcagctgtcc aaacacgttg acgattccgt catcgacatc 420
tggagctata acgcgcagct gctggttctg ctggaaaacg aaaaaaccct ggacctgcac 480
gactctaacg ttcgcaacct gcacgaaaaa gtgcgtcgta tgctgaaaga taacgcg 537
<210> 41
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1/3/10
<400> 41
Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg
35 40 45
Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Lys Thr Arg Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile Asn Gln
115 120 125
Leu Ser Lys His Val Asp Asp Ser Val Ile Asp Ile Trp Ser Tyr Asn
130 135 140
Ala Gln Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Lys Thr Leu Asp Leu His
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Arg Asn Leu His Glu Lys Val Arg Arg Met Leu Lys
165 170 175
Asp Asn Ala
<210> 42
<211> 537
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> h1/4/7
<400> 42
cgtatcgaaa acctgaacaa aaaagttgat gatggcttcc tggatatctg gacctacaac 60
gctgaactgc tggttctgct ggaaaacgaa cgtaccctgg attaccacga tagcaacgtt 120
aaaaacctgt acgaaaaagt tcgtagccag ctgaaaaaca acgcgggctc tgcgggtagc 180
gcgggccgta tccaggacct ggaaaaatac gttgaagaca cgaaggttga tctgtggagc 240
tacaacgctg aactgctggt tgcactggaa aaccagcata ccattgatgt taccgattcc 300
gaaatgaaca aactgttcga acgtgtacgt cgtcagctgc gtgaaaacgc tggctctgcg 360
ggtagcgcgg gccagatcgg taacgtgatc aactggaccc gtgattccat gaccgaagtt 420
tggagctaca acgcggaact gctggttgcg atggaaaacc agcacaccat cgatctggcg 480
gatagcgaaa tgaacaaact gtacgaacgt gttaaacgtc agctgcgtga aaacgcg 537
<210> 43
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H1/4/7
<400> 43
Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile
1 5 10 15
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr
20 25 30
Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg
35 40 45
Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ile
50 55 60
Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Val Asp Leu Trp Ser
65 70 75 80
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp
85 90 95
Val Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu Arg Val Arg Arg Gln
100 105 110
Leu Arg Glu Asn Ala Gly Ser Ala Gly Ser Ala Gly Gln Ile Gly Asn
115 120 125
Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Met Thr Glu Val Trp Ser Tyr Asn
130 135 140
Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala
145 150 155 160
Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg
165 170 175
Glu Asn Ala

Claims (10)

1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白从N端到C端依次包含：流感病毒核蛋白NP片段、基质蛋白M2e和血凝素颈部保守区HA2片段，其中
所述NP片段的序列为NP1(335-350aa)和NP2(380-393aa)；
所述M2e包括甲1型M2e的至少两个相同拷贝；
所述HA2片段包括H1、H3和H7三种亚型的颈部保守序列(76-130aa)。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述NP片段的序列如SEQ ID NO:3所示；所述M2e的序列如SEQ ID NO:4所示；所述HA2片段的序列如SEQ ID NO:5所示；
较佳地，所述NP片段、M2e和HA2片段由连接肽连接，和/或，所述NP1和NP2、所述H1、H3和H7分别由连接肽连接，其中，所述连接肽为柔性肽；
更佳地，所述连接肽为(G4S)n，n为5～20的自然数，或所述连接肽的序列如SEQ ID NO:6所示。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含超抗原；
较佳地，所述超抗原为SEC；
更佳地，所述SEC为SEC2；
进一步更佳地，所述SEC2的序列如SEQ ID NO:9所示。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述超抗原位于所述融合蛋白的N端或C端；和/或，所述超抗原与所述融合蛋白之间通过(G4S)5或SEQ ID NO:6所示序列连接；
较佳地，所述超抗原位于所述融合蛋白的C端，所述超抗原与所述融合蛋白之间通过通过SEQ ID NO:6所示序列连接。
5.一种分离的核酸，其编码如权利要求1～4任一项所述融合蛋白；
较佳地，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1或7所示。
6.一种重组载体，其包含如权利要求5所述核酸。
7.一种转化体，其包含如权利要求6所述重组载体。
8.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包含如权利要求1～4任一项所述融合蛋白作为活性成分。
9.如权利要求1～4任一项所述融合蛋白在制备流感病毒疫苗中的应用；
较佳地，所述流感病毒为甲型流感病毒；
更佳地，所述甲型流感病毒选自H1N1、H3N2、H2N2、H5N1、H7N9和H9N2。
10.一种蛋白组合物，其包含如权利要求1或2所述的融合蛋白；
较佳地，所述蛋白组合物还包含超抗原；
更佳地，所述超抗原为SEC；
进一步更佳地，所述SEC为SEC2，所述SEC2的氨基酸序列例如SEQ ID NO:9所示。
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