CN109381453A - 乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗炎症性疾病药物中的应用 - Google Patents

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CN109381453A CN201710689684.4A CN201710689684A CN109381453A CN 109381453 A CN109381453 A CN 109381453A CN 201710689684 A CN201710689684 A CN 201710689684A CN 109381453 A CN109381453 A CN 109381453A
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刘尧奇
王章伟
邓双炳
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Abstract

本发明公开了乙基硫酸钾在制备炎症、发热、腹泻、咳嗽及作为NF‑κB抑制剂药物方面的应用、其制备方法及组合物。

Description

乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗炎症性疾病药物中的应用
技术领域
本发明涉及乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗炎症性疾病药物中的应用。
背景技术
乙基硫酸又称酸式硫酸乙酯(ethylbisulfate)或乙基硫酸(ethyl-sulfuricacid)。沸点280℃(分解)。相对密度1.316。遇热或其浓水溶液煮沸时分解为有毒的硫氧化物(SOx)烟雾，对皮肤、眼睛、黏膜有强刺激性、强腐蚀性。该品与乙醇醚化，可得麻醉乙醚；用碳酸钾中和得到乙基硫酸钾。
目前并未发现乙基硫酸钾具有医药用途。
发明内容
申请人出乎意料地发现乙基硫酸钾用于制备炎症性疾病、退热、腹泻或NF-κB抑制剂药物方面的新用途、化合物制备方法及其组合物。
本发明的第一发明目的，提供乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗炎症性疾病药物方面的应用；
其中一种优选实施方案，所述炎症性疾病选自感染性炎症或非感染性炎症，包括但不限于可能由细菌，病毒等病原体引起的，或由自身免疫造成的多种炎症性疾病。
其中一种优选实施方案，所述炎症疾病包含但不限于食管炎、肠炎、甲状腺炎、骨炎、口腔炎、胸膜炎、皮炎、肺炎、阴道炎、膀胱炎、支气管炎、炎症性肿胀等。
其中一种更为优选实施方案，所述炎症性肿胀包括但不限于佛波酯致小鼠耳廓肿胀、对角叉菜胶致足肿胀、棉球肉芽肿等。
本发明的第二发明目的，提供乙基硫酸钾在制备用于退热药物方面的应用。
本发明的第三发明目的，提供乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗腹泻药物方面的应用。
本发明的第四发明目的，提供乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗咳嗽药物方面的应用。
本发明的第五发明目的，提供乙基硫酸钾在制备用于NF-κB抑制剂药物方面药物的应用。
本发明的第六发明目的，提供一种药物组合物，其包括治疗有效量的乙基硫酸钾以及药学上可接受的辅料。
所述药物组合物可用于制备炎症性疾病、退热、腹泻或NF-κB抑制剂等药物。
所述药物组合物中，所述药学上可接受的辅料可包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。
根据治疗目的，可将药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、悬浮液、乳液、颗粒剂、胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等，优选液体、悬浮液、乳液、栓剂和针剂(溶液及悬浮液)等。
为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉，碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。还可以根据需要选用通常的涂渍材料制成糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。
为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂，例如，载体，如乳糖，淀粉，椰子油，硬化植物油，高岭土和滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉，黄蓍胶粉，明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。
为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如，聚乙二醇，椰子油，高级醇，高级醇的酯，明胶和半合成的甘油酯等。
为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液或悬浮液消毒后(最好加入适量的氯化钠，葡萄糖或甘油等)，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体。例如，水，乙醇，丙二醇，乙氧基化的异硬脂醇，聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。
本发明中，所述的组合物在药物组合物中的含量无特殊限制，其中所述乙基硫酸钾可在很宽的范围内进行选择，其安全、有效剂量根据治疗对象的年龄、体重、病情、病程、给药途径等具体情况来确定，通常可为质量百分比的5～95％，较佳的为质量百分比30～80％。
本发明中，所述药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂或胶囊口服给药；针剂可以单独给药，或者和注射用输送液(如葡萄糖溶液及氨基酸溶液)混合进行静脉注射；栓剂为给药到直肠。
本发明还提供了所述乙基硫酸钾和一种或多种其它种类治疗剂联合用于制备治疗炎症药物中的应用。
所述其它种类的治疗剂可以和所述的乙基硫酸钾或所述药物组合物，做成单一给药的治疗剂型，或者分别先后给药的治疗剂型。
本发明的有益技术效果
本发明的乙基硫酸钾具有良好的抗炎作用，可以有效治疗炎症性疾病，实验证明：
乙基硫酸钾可预防或治疗咳嗽，如31.25-125mg/kg剂量范围内乙基硫酸钾能显著延长枸橼酸喷雾引起的咳嗽的潜伏期及咳嗽次数(P<0.05或P<0.01)，且具有剂量依赖性。
乙基硫酸钾在50-200mg/kg剂量范围内能显著抑制右耳的耳廓肿胀，在45-180mg/kg剂量范围内在3-7h均剂量依赖性显著抑制足肿胀，在22.5-180mg/kg剂量范围内均显著抑制棉球肉芽肿的相对重量(P<0.05或P<0.01)，且呈现剂量依赖性。
乙基硫酸钾具有改善支气管炎的活性；在50-200mg/kg剂量范围内乙基硫酸钾能显著延长枸橼酸喷雾引起的咳嗽的潜伏期及咳嗽次数(P<0.05或P<0.01)，且具有剂量依赖性。
乙基硫酸钾可显著抑制LPS引起的小鼠肺部炎症，改善肺损伤；抑制炎症浸润和各炎症因子(IL-1、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-5、IL-17)表达；抑制NF-κB活化；具有改善支气管炎的活性；能显著延长枸橼酸喷雾引起的咳嗽的潜伏期及咳嗽次数。
乙基硫酸钾具有显著退热作用，单次给药能显著降低酵母菌致发热大鼠或内毒素致发热家兔的体温；退热作用起效快速、持久，在给药后0.5h开始有明显降温作用，并持续至8h。
另外，乙基硫酸钾50-200mg/kg能明显减低其腹泻指数；25-200mg/kg的乙基硫酸钾均能显著抑制小鼠肠推进(P<0.05或P<0.01)。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
医学或药学领域普通技术人员预先在不做相关实验的前提下，无法预知乙基硫酸钾具有本发明所述的医疗用途。
附图说明
图1：乙基硫酸钾抑制LPS诱导的肺炎小鼠肺组织中淋巴细胞的浸润；
图2：乙基硫酸钾给药抑制LPS诱导的肺炎小鼠肺灌洗液及血清中炎症因子的水平；
图3：乙基硫酸钾给药抑制LPS诱导的肺炎小鼠肺组织中炎症因子的mRNA表达；
图4：乙基硫酸钾改善LPS诱导的肺炎小鼠肺部组织病变；
图5：乙基硫酸钾给药抑制LPS诱导的NF-κB信号通路。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明中FL-22代表乙基硫酸钾。
实施例1：乙基硫酸钾的制备
在反应釜中加入定量乙醇，在搅拌下缓缓滴加6倍量硫酸乙醇溶液，控制反应釜温度在38℃，继续搅拌酯化反应24小时。加入乙醇，搅匀，用10％KOH调pH为7.0，加入95％乙醇使含醇量达85％以上，减压回收乙醇，水溶液经吸附树脂柱层析分离，以水∶乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，结晶乙基硫酸钾。
实施例2：乙基硫酸钾对佛波酯致小鼠耳廓肿胀的影响
实验方法
ICR小鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g，随机分为6组(模型组、乙基硫酸钾五个剂量组)。用20μL移液枪均匀地在每只小鼠右耳涂抹20μLTPA溶液。造模后1h按0.l mL/10g的体积静脉注射乙基硫酸钾，给药剂量分别为12.5、25、50、100、200mg/kg。造模6h后脱颈椎处死小鼠，用直径8mm打孔器分别在两耳廓同一部位打下圆耳片，电子天平称重，按下式计算耳廓肿胀度和肿胀抑制率。肿胀度(％)＝(右耳质量-左耳质量)/左耳质量×100％。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
乙基硫酸钾在50-200mg/kg剂量范围内能显著抑制右耳的耳廓肿胀(P<0.05或P<0.01)，且肿胀抑制率均在35％以上。
乙基硫酸钾对TPA诱导的耳廓肿胀的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实施例3：乙基硫酸钾对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响
实验方法
Wistar大鼠，200-220g，随机分为6组(正常组、模型组、乙基硫酸钾四个剂量组)。水合氯醛麻醉后，除正常组给予等量的生理盐水外，其它各组大鼠右后足跖皮下注射无菌1％角叉菜胶生理盐水悬液0.1mL致炎，致炎后0.5h分别静脉注射给予不同剂量乙基硫酸钾或生理盐水，给药体积为1mL/100g。水容积法测定致炎前及致炎后1、3、5、7h的右后足跖容积，计算肿胀率及肿胀抑制率。肿胀率(％)，表示为(Vt-Vn)/Vn*100，Vn和Vt分别表示致炎前及致炎后响应时间的足体积。肿胀抑制率(％)，表示(模型组平均肿胀率-给药组平均肿胀率)/模型组平均肿胀率*100。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
角叉菜胶注射后5h左右达到肿胀峰值。乙基硫酸钾在45-180mg/kg剂量范围内在3,5,7h均剂量依赖性显著抑制足肿胀(P<0.05或P<0.01或P<0.001)，5-7h的肿胀抑制率达30-70％。
乙基硫酸钾对角叉菜胶诱导的不同时间足肿胀的影响
注：与正常组比较，##P<0.01，###P<0.001；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
不同时间乙基硫酸钾对足肿胀的抑制率
实施例4：乙基硫酸钾对大鼠棉球肉芽肿的影响
实验方法
SD大鼠，200g左右，饲养于22±2℃的环境中，自由摄食和饮水。适应3天后用随机分成5组(模型组、乙基硫酸钾四个剂量组)。大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，无菌操作在腹部作一小切口，将经高压灭菌烘干后的20mg棉球植入大鼠两侧上肢腹股沟皮下，随即缝合皮肤。于术后次日开始给药，连续7天，第8天称重后放血处死大鼠，剥离并取出棉球肉芽组织(剔除脂肪组织)，置于60℃烘箱内烘干至恒重后称重，减去原棉球重量，即为肉芽肿重量，计算抑制率。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
结果下表所示，相对于模型组，乙基硫酸钾在22.5-180mg/kg剂量范围内均显著抑制棉球肉芽肿的相对重量(P<0.05或P<0.01)，且呈现剂量依赖性。
乙基硫酸钾对棉球肉芽肿相对重量(肉芽肿干重/体重)的影响
注:与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
综合实施例2-4可知，乙基硫酸钾对非特异性炎症具有较好的疗效：
1)在50-200mg/kg剂量范围内能显著抑制右耳的耳廓肿胀(P<0.05或P<0.01)，且肿胀抑制率均在30％以上。
2)乙基硫酸钾对角叉菜胶诱导的不同时间的影响，在45-180mg/kg剂量范围内在3，5，7h均剂量依赖性显著抑制足肿胀(P<0.05或P<0.01或P<0.001)，5-7h的肿胀抑制率达30-70％。
3)在22.5-180mg/kg剂量范围内均显著抑制棉球肉芽肿的相对重量(P<0.05或P<0.01)，且呈现剂量依赖性。
实施例5：乙基硫酸钾对酵母菌致大鼠发热的药效研究
实验方法
Wistar大鼠，150g左右，饲养于22±2℃的环境中，自由摄食和饮水。适应3天，每天监测大鼠直肠温度，剔除体温不正常或变化大的大鼠。造模前12h禁食不禁水。造模前1h测量每只大鼠体温2次，取均值作为每只大鼠基础体温。
大鼠颈部以下的背部皮下注射15％酵母菌悬液10mL/kg，引起大鼠发热。按摩注射部位以使悬浮液在皮下扩散。室温应保持在22-24℃。造模5h后记录直肠温度，剔除体温未达到38℃的大鼠，根据体温进行分组，分为正常组、模型组、乙基硫酸钾(22.5mg/mL、45mg/mL、90mg/mL、160mg/mL)组。分组后马上给药，并于给药后0.5、1、2、4、6、8、10h后再次测定大鼠直肠温度。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
乙基硫酸钾有显著退热作用，单次给药能显著降低酵母菌致发热大鼠的体温；退热作用起效快速、持久，在给药后0.5h开始有明显降温作用，并持续至8h。
乙基硫酸钾对酵母菌致发热大鼠的体温影响
注:与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
实施例6：乙基硫酸钾对内毒素致家兔发热的药效研究
实验方法
雄性普通级家兔，2.0kg左右，合格证号：SCXK(苏)2012-0008，饲养于22±2℃的环境中，自由摄食和饮水。适应饲养3天，每天测定体温2次，剔除体温不正常及变化大的家兔。实验前12h禁食不禁水。实验当日检测体温3次，取均值作为基础体温。用无热原的生理盐水将精制的LPS稀释成2mg/L，除正常组外，其余各组均按1mL/kg经耳缘静脉注射LPS；正常组按1mL/kg耳缘静脉注射无热原生理盐水。LPS注射30min后，测定动物直肠温度(剔除体温升高＜0.8℃家兔)，随机分模型组、乙基硫酸钾各剂量(8.75，17.5，35，70mg/kg)组。按1mL/kg耳缘静脉注射不同剂量的乙基硫酸钾溶液，正常组以及模型组给予等体积的生理盐水，测定给药后0.5h、1h、2h、3h、5h和8h家兔肛温，比较不同时间点肛温与基础肛温之差值(ΔT)为体温变化的指标。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
乙基硫酸钾有显著退热作用，单次给药能显著降低内毒素致发热家兔的体温；退热作用起效快速、持久，在给药后0.5h开始有明显降温作用，并持续至8h。
乙基硫酸钾对内毒素致发热家兔的体温影响
注:模型组与正常组比较，##表示极显著(P<0.01)；试验组与模型组比较，*表示有显著性差异(P<0.05)，**表示极显著(P<0.01)。
实施例7：乙基硫酸钾对LPS致支气管炎的影响
实验方法
ICR小鼠，雄性，6-8周龄，体重18-22g，饲养于22±2℃的环境中，自由摄食和饮水。适应饲养3天后用于后续实验研究。用移液枪以鼻腔滴入6mg/mLLPS生理盐水溶液，连续滴入3天，第3天滴鼻后2或6h给药，连续3天，第5天处死动物。小鼠处死后分离气管，插管并固定。随机分正常组、模型组、乙基硫酸钾各剂量(25,50,100,200mg/kg)组。用0.5mL/10g生理盐水，分2次进行支气管肺泡灌洗，回收支气管肺泡灌洗液，进行炎细胞计数。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
LPS滴鼻造模3天能显著升高小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞计数(P<0.01)；不管是末次造模后2h还是6h开始给药，相对于模型组，乙基硫酸钾在50-200mg/kg剂量均能显著降低支气管肺泡灌洗液中白细胞计数(P<0.05或P<0.01)，且有剂量依赖性。提示乙基硫酸钾具有改善支气管炎的活性。
乙基硫酸钾对LPS诱导的气管炎小鼠支气管肺泡灌洗液白细胞计数的影响
注：与正常组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
实施例8：乙基硫酸钾对枸橼酸致豚鼠咳嗽的影响
实验方法
豚鼠，雌雄各半，体重250-300g，饲养于22±2℃的环境中，自由摄食和饮水。于实验前1日，将豚鼠置于4L容积的密闭玻璃钟罩内，使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的17.5％枸橼酸，以最大喷雾量喷雾10秒，记录5min内豚鼠的咳嗽次数，咳嗽次数小于10次者弃除。取通过初筛的豚鼠，随机分为模型组和乙基硫酸钾各给药组，连续给药5d。末次给药后30min，将豚鼠置于4L容积的玻璃钟罩内，使用980-A型超声雾化器喷入预先配置好的17.5％枸橼酸，以最大喷雾量喷雾10秒，记录豚鼠咳嗽潜伏期及5min内咳嗽次数。豚鼠的咳嗽声响亮，以听到咳嗽声为计算标准。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用LSD检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
31.25-125mg/kg剂量范围内乙基硫酸钾能显著延长枸橼酸喷雾引起的咳嗽的潜伏期及咳嗽次数(P<0.05或P<0.01)，且具有剂量依赖性。
乙基硫酸钾对枸橼酸致豚鼠咳嗽潜伏期及咳嗽次数的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实施例9：乙基硫酸钾对LPS致肺炎的药效研究
试验方法：C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌性，体重20±2g。小鼠暴露于雾化的LPS(0.25mg/ml)40min(2次，每隔1h一次)进行造模；在LPS吸入后分别按5、10、20mg/kg腹腔注射给予乙基硫酸钾，考察乙基硫酸钾腹腔注射给药对肺部炎症的改善作用。
检测方法及指标：
1)支气管肺泡灌洗及细胞计数
小鼠气管插管，PBS灌洗，0.3ml×1次，收集支气管肺泡灌洗液；4℃冷冻离心500g×5min；收集上清，-20℃待检细胞因子。300μlPBS重悬细胞沉淀，吸20μl加80μl固定液固定技术。其余分成两份流式细胞染色鉴定细胞分类及比例(CD3-FITC,CD11b-APC,Gr1+-PE)。
2)ELISA检测小鼠血清及支气管肺泡灌洗液中炎症因子水平
小鼠麻醉，眼球取血，3000r/min离心15min，取血清于按照ELISA试剂盒说明书操作，检测血清IL-1、IL-6及TNF-的水平。
3)肺组织炎症因子检测
取一小块肺组织(约1mg)浸泡于1mlTrizol中，匀浆，抽提总RNA。将RNA反转录成cDNA:引物信息如下：
β-actin forward5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’,
β-actin forward5’-TTTGATGTCACGCACGATTT-3’；
tnf-α forward5’-CGAGTGACAAGCCTGTAGCCC-3’；
tnf-α reverse5’-GTCTTTGAGATCCATGCCGTTG-3’；
il-1β forward5’-CTTCAGGCAGGCAGTATCACTC-3’；
il-1β reverse5’-TGCAGTTGTCTAATGGGAACGT-3’；
il-6 forward5’-ACAACCACGGCCTTCCCTAC-3’；
il-6 reverse5’-TCTCATTTCCACGATTTCCCAG-3’；
il-4forward5’-GTCTGCTGTGGCATATTCTG-3’；
il-4 reverse5’-GGCATTTCTCATTCAGATTC-3’；
il-5 forward5’-GGCTACACAGAGAAACCCTGT-3’；
il-5 reverse5’-CATGCATACACAGGTAGTTCA-3’；
il-17 forward5’-TCGAGAAGATGCTGGTGGGT-3’；
il-17 reverse5’-CTCTGTTTAGGCTGCCTGGC-3’；
4)肺组织病理切片及H&E染色
颈椎脱臼法处死小鼠，取其右肺下叶，以10％甲醛固定，酒精脱水，常规石蜡包埋、切片，进行H&E染色。
5)对NF-B活化的影响
肺组织石蜡切片，脱蜡，二甲苯浸泡，乙醇梯度洗脱；1％TritonX100通透组织1min。3％山羊血清室温封闭1h；室温分别孵一抗p-p65(1：50)90min、二抗孵育1h；苏木素染核30S，蒸馏水冲洗2次，每次5min；脱水。中性树胶封片，显微镜拍照。
统计方法：
结果以mean±SEM表示，先使用单因素方差分析(ANOVA)，有差异后两组之间的比较使用Student’s-ttest检验，两组以上比较使用Dunnett’stest检验，P<0.05认为有显著差异，P<0.01认为有极显著差异。
实验结果：
1)乙基硫酸钾显著抑制肺组织中淋巴细胞浸润
各组小鼠吸入LPS造成炎症模型，不同剂量乙基硫酸钾腹腔注射给药一次。处死小鼠后进行肺部灌流，收集灌洗液中的淋巴并进行流式细胞染色分析，计数。结果以mean±SEM表示，n＝8，*P<0.05，**P<0.01vs.LPS，##P<0.01vs.normal。
如图1所示，在LPS引起的肺炎小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中，模型组(LPS)小鼠的总细胞数显著高于正常组；给予乙基硫酸钾之后，可明显减少BALF中的总细胞数；进一步的流式染色实验结果显示，乙基硫酸钾治疗后肺组织中浸润的CD3T+细胞，巨噬细胞CD11b+及嗜中性粒细胞(Gr1+)的浸润都出现显著下降。
2)乙基硫酸钾显著抑制血清及支气管肺泡灌洗液中炎症因子的水平
采集各组小鼠灌洗液及血清，ELISA测定各炎症因子水平。结果以mean±SEM表示，n＝8，*P<0.05,**P<0.01vs.LPS，##P<0.01vs.normal。
如图2所示，LPS雾化吸入后，模型组小鼠支气管肺泡灌洗液及血清中TNF-α，IL-6，IL-1β的水平明显升高。乙基硫酸钾给药以后剂量依赖性地降低血清及肺泡灌洗液中炎症因子水平。
3)乙基硫酸钾显著抑制肺组织中炎症因子的mRNA水平
采集各组小鼠肺组织，提取RNA，Q-PCR测定各个炎症因子水平。结果以mean±SEM表示，n＝8，*P<0.05,**P<0.01vs.LPS,##P<0.01vs.normal。
Q-PCR结果显示，模型组小鼠肺组织炎症因子il-1，il-4，il-5，il-6，il-17和tnf-的基因表达均明显升高，乙基硫酸钾各剂量给药都可显著抑制上述基因的表达(图3)。
4)乙基硫酸钾明显改善肺组织病理损伤
采集各组小鼠肺组织，固定进行石蜡切片及H&E染色和组织病理评分。结果以mean±SEM表示，n＝6，*P<0.05,**P<0.01vs.LPS,##P<0.01vs.normal。
如图4所示，H&E染色结果显示，模型组(LPS)肺小血管周围组织水肿发生水肿，炎细胞浸润增加。给予乙基硫酸钾后，减轻病理评分，肺部损伤明显改善。
5)乙基硫酸钾显著抑制NF-κB信号通路活化
采集各组小鼠肺组织，固定进行石蜡切片及免疫组化染色。
LPS刺激可激活肺部细胞中NF-κB通路，主要表现为NF-κB的磷酸化，如图5，免疫组化结果显示在受损的肺部细胞中p65的磷酸化水平升高，细胞核中分布有大量棕色颗粒。乙基硫酸钾给药以后小鼠肺组织基本回复到正常形态，细胞核中磷酸化p65的水平也降低。
结果：
1)乙基硫酸钾腹腔注射给药可显著抑制肺部炎症细胞的浸润并降低肺部灌洗液及血清中的炎症因子(IL-1,TNF-及IL-6)的含量；
2)乙基硫酸钾腹腔注射给药可显著抑制LPS引起的肺组织的损伤及炎症因子mRNA(il-6,tnf-,il-4,il-5,il-17和il-1)的表达水平；
3)乙基硫酸钾腹腔注射给药可显著降低肺部组织中NF-κB通路的活化，实现对小鼠肺组织的保护。
实施例10：乙基硫酸钾对番泻叶致小鼠腹泻的影响
实验方法
ICR小鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g，随机分为5组。试验组按0.lmL/10g的体积静脉注射不同剂量的乙基硫酸钾溶液，模型组和正常组给予同体积的生理盐水；间隔15min后，除正常组外，其它各组按0.15ml/10g的体积灌胃番泻叶煎剂，并单个放在铺有滤纸的小鼠笼内观察灌服番泻叶后6h内小鼠大便及腹泻情况，统计稀便数、总便数、稀便级，并计算腹泻指数(稀便率与稀便级的乘积)。
a.腹泻率：一组动物中排稀便的动物数与该组动物总数之百分比。
b.稀便率：每只动物所排的稀便数与总便数之比。
c.稀便级：表示稀便的程度。以稀便污染滤纸形成污迹面积的大小定级。
级数 1 2 3 4
污迹直径(cm) <1 1～1.9 2～3 >3
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
相对于正常组，番泻叶灌胃后1-6h能引起模型组腹泻指数的显著升高(P<0.01)；乙基硫酸钾50-200mg/kg能明显减低其腹泻指数(P<0.01)。
乙基硫酸钾对番泻叶诱导的小鼠腹泻指数的影响
注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
实施例11：乙基硫酸钾对小鼠肠推进的影响
实验方法
ICR小鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重18-22g。随机分为11组。动物禁食18h，分别按0.lmL/10g的体积静脉注射喜炎平和乙基硫酸钾，间隔15min后再按0.l5mL/10g的体积灌胃给予活性炭混悬液，并于30min后取整段小肠，不加牵引平铺于玻璃板上。测量幽门至盲肠部的小肠全长及幽门至碳末前沿的距离。以幽门至碳末前沿的距离占幽门至盲肠部全长的百分率为小肠推进率。
数据分析
所有数据均以means±S.D表示，组间统计学差异采用Tukey’s检验。P值小于0.05被认为有显著性差异。
实验结果
25-200mg/kg的乙基硫酸钾均能显著抑制小鼠肠推进(P<0.05或P<0.01)。
乙基硫酸钾对小鼠碳末推进的影响
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Claims (8)

1.乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗炎症性疾病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述炎症性疾病选自食管炎、肠炎、甲状腺炎、骨炎、口腔炎、胸膜炎、皮炎、肺炎、阴道炎、膀胱炎、支气管炎、炎症性肿胀。
3.乙基硫酸钾在制备用于退热药物中的应用。
4.乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗腹泻药物中的应用。
5.乙基硫酸钾在制备用于预防或治疗咳嗽药物中的应用。
6.乙基硫酸钾在制备用于NF-κB抑制剂药物中的应用。
7.一种乙基硫酸钾的制备方法，其步骤包括：
将一定量的乙醇加入反应器中，在搅拌下加入磺酸酯化试剂，控制反应温度在15～45℃，反应10～40小时，再加入有机醇，用碱溶液调pH＝6～7.5，分离。
8.一种包含乙基硫酸钾的药物组合物在制备炎症性疾病、退热、腹泻或NF-κB抑制剂药物中的应用。
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