CN115778937A

CN115778937A - 一种白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用

Info

Publication number: CN115778937A
Application number: CN202211301513.7A
Authority: CN
Inventors: 宋洪元; 沈炜; 李青; 张昊瑞; 桂潇; 聂政; 蔡畅
Original assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Current assignee: First Affiliated Hospital of Naval Military Medical University of PLA
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-03-14

Abstract

本发明公开了一种白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，经体内外药理实验证明，白杨素在6μg/ml剂量下，体外能显著抑制人类脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、成管能力，体内能抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管形成，可用于相关视网膜新生血管性疾病的治疗，具有良好的应用前景。

Description

一种白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种从紫葳科植物木蝴蝶中提取的白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

背景技术

白杨素(chrysin)又称白杨黄素，是从紫葳科植物木蝴蝶的种子、茎皮中提取的一种黄酮类化合物，其来源广泛，毒性较低，有很大的药用价值。现代药理研究证明：白杨素具有抗糖尿病、抗惊厥、抗肿瘤、抗焦虑、抗抑郁、神经保护和抗关节炎等广泛的药理活性，而且该类化合物在植物中分布广泛，毒性比较低，因此是新药开发研究中一个非常重要的资源(Garg A,Chaturvedi S.A Comprehensive Review on Chrysin:Emphasis onMolecular Targets,Pharmacological Actions and Bio-pharmaceutical Aspects.CurrDrug Targets.2022；23(4):420-436)。

血管生成所需的能量，80％来源于糖代谢。研究发现，白杨素是一个有效的糖代谢抑制剂，能够显著降低乳酸脱氢酶(LDHA)的表达及活性，其是糖代谢途径的重要酶系之一，进而显著抑制病理性新生血管的生成。既往研究表明，在中枢神经系统中，降低LDHA的表达能有效抑制血管的生成(Lin H,Muramatsu R,Maedera N,Tsunematsu H,Hamaguchi M,Koyama Y,Kuroda M,Ono K,Sawada M,Yamashita T.Extracellular LactateDehydrogenase A Release From Damaged Neurons Drives Central Nervous System Angiogenesis.EBioMedicine.2018Jan；27:71-85.)。

视网膜新生血管性疾病是眼科最常见的眼底病之一，多种眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性、早产儿视网膜病变、糖尿病性视网膜病变等，都会导致视网膜病理性新生血管的形成。在多种因素的介导下，视网膜血管内皮细胞代谢及功能紊乱，血管生成失调会破坏氧和营养物质的输送，导致代谢供需失衡，最终导致病理性视网膜新生血管。既往的研究表明，视网膜新生血管的生长受到一系列化学因子的共同调控，如血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(FGF)等，其中VEGF的研究最为广泛，其具有强烈的促进血管内皮细胞分裂、增殖、迁移的能力，促进新生血管形成(杨杰、彭辉灿.药物治疗视网膜新生血管的研究进展[J].眼科新进展,2007,27(10):792-795)。

视网膜新生血管性疾病根治困难、复发率高，目前临床上以VEGF为靶点的抗血管生成治疗已成为主要手段，但需要反复多次进行玻璃体腔注射，病人的依从性及耐药性难以控制。所以相应的药物研究一直是近年来医药研究领域的热点和难点。因此，仍然需要新的疗法。

中药及其天然产物可多通道、多靶点治疗视网膜新生血管性疾病，具有毒性低、副作用小等优点，是开发抗病理性视网膜新生血管药物的巨大资源库。粉防己、芒柄花素、雷公藤等已被证明对视网膜新生血管有良好的抑制作用(Wu,J,Ke,X,Ma,N,etal.Formononetin,an active compound of Astragalus membranaceus(Fisch)Bunge,inhibits hypoxia-induced retinal neovascularization via the HIF-1α/VEGFsignaling pathway.Drug Des Devel Ther.2016；103071-3081.Liang,XC,Hagino,N,Guo,SS,et al.Therapeutic efficacy of Stephania tetrandra S.Moore for treatment ofneovascularization of retinal capillary(retinopathy)in diabetes--in vitrostudy.PHYTOMEDICINE.2002；9(5)-377-84)。目前，尚无有关白杨素在治疗视网膜新生血管性疾病中的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

所述白杨素(Chrysin，5,7-Dihydroxyflavone；Chrysin-5,7-dihydroxyFlavone；5,7-dihydroxy-2-phenyl-4H-benzo(b)pyran-4-one)的分子式为C₁₅H₁₀O₄，淡黄色棱柱形结晶，熔点285℃，具有以下分子结构：

视网膜新生血管性疾病是眼科最常见的眼底病之一，在多种因素的介导下，视网膜血管内皮细胞代谢及功能紊乱，血管生成失调会破坏氧和营养物质的输送，导致代谢供需失衡，最终导致病理性视网膜新生血管。

视网膜新生血管是指在包括损伤、感染、缺氧等多种刺激的诱导下，血管内皮细胞功能发生紊乱，异常增殖形成新生血管，与血管内皮生长因子的生成和释放有关。

所述白杨素可以制成药物制剂。

所述药物制剂的剂型为注射剂，给药方式为玻璃体腔注射。

通过Lip-MS技术，发现白杨素能直接结合乳酸脱氢酶A(LDHA)，并显著抑制其活性。RNA-seq结果显示经白杨素处理后，人脐静脉内皮细胞中的LDHA表达明显降低。LDHA表达及活性降低，抑制了PI3K介导的AKT的激活，进而失去磷酸化FOXO1的能力，未能磷酸化的FOXO1发挥抗新生血管的作用。经玻璃体腔给药的OIR小鼠视网膜新生血管及无灌注区的面积比对照组显著降低。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下优点和有益效果：

经体内外药理实验证明，白杨素在6μg/ml剂量下，体外能显著抑制人类脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、成管能力，体内能抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型的视网膜新生血管形成，可用于相关视网膜新生血管性疾病的治疗，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是白杨素在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的示意图。

图2是白杨素在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的示意图。

图3是白杨素在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管的示意图。

图4是白杨素在体内抑制氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的视网膜新生血管形成的示意图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1

1.实验方法

1.1受试细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(中乔新舟)。

1.2试验药物与试剂

白杨素购自上海源叶生物科技有限公司(B20063)，EDU试剂盒购自锐博生物(C10310-2)

1.3分组与造模

称取30mg白杨素溶解于5ml DMSO，使用超声混匀配制成6mg/ml的储存液，-20℃保存。

低浓度药物处理组(3μg/ml)：将白杨素储存液(6mg/ml)溶解稀释于内皮细胞培养基(ECM)配置成3μg/ml的工作液(白杨素：ECM＝1:2000)；

高浓度药物处理组(6μg/ml)：将白杨素储存液(6mg/ml)溶解稀释于内皮细胞培养基(ECM)配置成6μg/ml的工作液(白杨素：ECM＝1:1000)；

对照组(0μg/ml)：将DMSO 1:1000溶解稀释于ECM中配置成0μg/ml的对照组。

1.4治疗方法

白杨素工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞增殖实验(EDU assay)

第一步，细胞种孔：将密度约为80％～90％的HUVEC细胞进行消化，并细胞计数，每孔取约3×10⁴个细胞种至96孔板中，放置于37℃ 5％CO₂孵箱中孵育，待细胞贴壁后，弃原培养液，对照组加入新鲜培养基，处理组加入ECM稀释的白杨素溶液(低浓度处理组和高浓度处理组分别加入3μg/ml和6μg/ml的白杨素溶液)，放置于37℃ 5％CO₂孵箱中孵育24～48小时。

第二步，Edu标记：将Cell-Light^TM EduApollo567试剂盒中试剂A(EdU，5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)与ECM全培培养基按照1:1000的比例稀释；将96孔板中HUVEC原细胞培养基弃掉，并换为上述稀释液，每孔100μl，放置于37℃ 5％CO₂孵箱中孵育约2小时。

第三步，细胞固定：将96孔板中培养基吸除，PBS溶液清洗细胞，清洗3次，每次5-10分钟。清洗结束后，每孔加入100μl 4％多聚甲醛溶液，室温下固定30分钟，弃细胞固定液；细胞固定完成后每孔加入2mg/ml甘氨酸溶液100μl，室温下脱色摇床5-10分钟，弃甘氨酸溶液；每孔加入100μl PBS溶液清洗细胞，5分钟；每孔加入100μl 0.5％TritonX-100渗透剂，室温摇床清洗5分钟；每孔加入100μl PBS清洗细胞，室温脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。

第四步，Apollo染色：染色前首先将试剂B(

反应缓冲液)、试剂C(

催化剂溶液)、试剂D(

荧光染料溶液)、试剂E(

缓冲添加剂)及ddH₂O按试剂盒说明书配制成1X Apollo染液，细胞固定及清洗结束后每孔加入100μl上述染液，室温避光，摇床孵育30分钟，弃染液；每孔加入0.5％TritonX-100渗透剂100μl，室温摇床清洗2～3次，每次10分钟。

第五步，DAPI染色：将DAPI原液与PBS溶液按照1:10000稀释，每孔加入稀释后DAPI染液100μl，室温避光，摇床染色15分钟，弃染液；每孔加入100μl PBS溶液，室温摇床清洗3次，每次5～10分钟，最后一遍不弃PBS。

第六步，观察：使用荧光显微镜，观察并拍摄图像，计算增值期细胞核染色数量与全部细胞核数量及其比值。

2.结果如图1所示，图1是白杨素在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(Ctrl)增值期细胞比例最多，低浓度药物处理组(3μg/ml)次之，高浓度药物处理组(6μg/ml)增值期细胞比例最小。说明白杨素在体外能显著抑制HUVEC的增殖能力，并呈浓度依赖性。

实施例2

1.实验方法

1.1受试细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(中乔新舟)。

1.2试验药物与试剂

白杨素购自上海源叶生物科技有限公司(B20063)。

1.3分组与造模

1.4治疗方法

白杨素工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞迁移实验(Migration assay)

第一步，细胞种孔：将ibidi Culture-insert 2Well放置于干燥的细胞培养皿表面，细胞密度约为80％～90％的HUVEC细胞进行消化，将100μl细胞悬液种于Culture-insert孔中，放置于37℃ 5％CO₂孵箱中孵育24小时。

第二步，划痕形成：轻柔去除Culture-insert后，对照组加入新鲜培养基，处理组加入培养基稀释的白杨素溶液(低浓度处理组和高浓度处理组分别加入3μg/ml和6μg/ml的白杨素溶液)，放置于37℃ 5％CO₂孵箱中孵育12～24小时。

第三步，观察：显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。

2.结果如图2所示，图2是白杨素在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(0μg/ml)细胞的迁移距离最大，低浓度药物处理组(3μg/ml)次之，高浓度药物处理组(6μg/ml)细胞的迁移距离最小。说明白杨素在体外能显著抑制HUVEC的迁移能力，并呈浓度依赖性。

实施例3

1.实验方法

1.1受试细胞：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(中乔新舟)。

1.2试验药物与试剂

白杨素购自上海源叶生物科技有限公司(B20063)，Mateigel胶购自康宁公司(354248)。

1.3分组与造模

1.4治疗方法

白杨素工作液处理细胞。

1.5实验步骤

细胞成管实验(Tube Formation assay)

第一步，铺胶：将96孔板置于冰上，每孔中加入80μl Matrigel胶，放入4℃冷却沉淀10分钟；将96孔板放入37℃ 5％CO₂孵箱中孵育20分钟。

第二步，细胞种孔：将提前白杨素(低浓度处理组和高浓度处理组分别加入3μg/ml和6μg/ml的白杨素溶液)处理好的细胞消化重悬，并进行细胞计数，每孔50μl细胞悬液接种于上述预先铺好基质胶的96孔板中，每孔数量为1×10⁴个细胞；将96孔板放置于37℃ 5％CO₂孵箱中孵育2～4小时。

第三步，观察：利用荧光显微镜观察各组细胞形态及其成管情况。

2.结果如图3所示，图3是白杨素在体外抑制人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)成管的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(Ctrl)细胞的成管能力最好，低浓度药物处理组(3μg/ml)次之，高浓度药物处理组(6μg/ml)细胞的成管能力最差。说明白杨素在体外能显著抑制HUVEC的成管能力，并呈浓度依赖性。

实施例4

1.实验方法

1.1受试动物：出生后7天的健康C57BL/6J小鼠与母鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司。动物饲养于海军军医大学SPF级动物房，自由饮水饮食，室温23-25℃，相对湿度(44±10)％，维持12h交替光照。

1.2试验药物与试剂

白杨素购自上海源叶生物科技有限公司(B20063)。

1.3分组与造模

称取2.4g白杨素溶解于0.5ml DMSO，超声混匀配制成4.8g/ml的储存液，-20℃保存。

药物处理组(240mg/ml)：将白杨素储存液(4.8g/ml)溶解稀释于PBS配置成240mg/ml的工作液(白杨素储存液：PBS＝1:20)。

1.4治疗方法

玻璃体腔注射。

1.5实验步骤

OIR小鼠模型研究

第一步，OIR小鼠模型制作：将出生后7天的健康C57BL/6J小鼠与母鼠一起放置于密闭氧箱中持续哺乳5天，氧箱浓度维持在75±2％，箱内温度控制在25±2℃，定时添加饲料和水，更换垫料，每隔12小时更换哺乳母鼠以保证哺乳母鼠的身体及行为正常；氧箱内饲养5天后，即小鼠出生后第12天时，将小鼠及其哺乳母鼠返回室内标准环境下饲养，正常空气环境氧浓度为21±2％，以诱导小鼠视网膜新生血管产生，自第12天起至第17天，每天对处理组小鼠进行玻璃体腔注射白杨素稀释液2μl(240mg/ml)，对照组注射2μl PBS(DMSO:PBS＝1:20)，在第17天颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠眼球进行视网膜荧光染色铺片。

第二步，视网膜荧光染色铺片制作：

视网膜固定：将上述OIR模型及正常对照组小鼠眼球取下，放入4％多聚甲醛中固定30分钟。

视网膜分离：在显微镜下，将固定好的小鼠视网膜放入PBS溶液中，用眼科剪沿眼球角巩膜缘处剪开，取出晶状体和玻璃体，用无齿镊小心剥离巩膜，脉络膜，最后夹出残留玻璃体纤维，即可分离出视网膜组织。

封闭：PBS溶液清洗视网膜3次，每次10分钟；加入5％BSA溶液，封闭1小时，以阻断非特异性染色，小心吸除BSA溶液，PBS溶液清洗3次，每次10分钟。

染色：弃PBS溶液，加入100μl PBS稀释的IB4荧光染料，室温孵育2小时，PBS摇床清洗3次，每次10分钟。

铺片：在显微镜下以视乳头为中心，用显微剪刀做4个放射状切口，在载玻片上铺平视网膜，最终呈四叶草状，滴上封片液，盖上盖玻片。

第三步，观察：在荧光显微镜下观察并拍摄图像。

2.结果如图4所示，图4是白杨素在体内抑制氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠模型的视网膜新生血管形成的示意图。从图中可以看出，未加药对照组(Ctrl)可见大片无灌注区及新生血管簇，加药处理组(Chrysin)无灌注区面积及新生血管显著减少。说明白杨素在体内能显著抑制视网膜新生血管的生成。

以上实验表明，白杨素在体内外均能显著抑制病理性新生血管的形成，对视网膜新生血管性疾病有良好的治疗效果，具有良好的药物应用前景。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。

Claims

1.一种白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述白杨素的分子式为C₁₅H₁₀O₄，淡黄色棱柱形结晶，熔点285℃，具有以下分子结构：

3.根据权利要求1所述的白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述白杨素可以制成药物制剂。

4.根据权利要求3所述的白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型为注射剂。

5.根据权利要求4所述的白杨素在制备抑制视网膜新生血管的药物中的应用，其特征在于，所述药物制剂的给药方式为玻璃体腔注射。