CN102218053A - 木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用，尤其是木犀草素在制备抑制肿瘤、关节炎、视网膜病、血管瘤或银屑病的病变组织血管生成药物中的应用。根据本发明提供的应用，可将木犀草素制备成血管生成的药物，扩大了木犀草素的应用范围。

Description

木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用

技术领域

本发明属中药领域，具体涉及木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用。

背景技术

血管生成(angiogenesis)是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管，主要包括：激活期血管基底膜降解；血管内皮细胞的激活、增殖、迁移；重建形成新的血管和血管网，是一个涉及多种细胞的多种分子的复杂过程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。肿瘤增殖造成的肿瘤细胞间低pH值、低血糖、压力和炎症等因素都能促进血管生成。

肿瘤的生长、转移与新生血管关系密切。肿瘤生长首先需要建立一个新生血管网络，缺少血供的肿瘤其直径一般只能维持在1～2mm以内，肿瘤的转移及在转移部位的生长也有赖于新生血管的形成。肿瘤血管生成是指血管内皮细胞从现存的血管系统中分化、迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程，其基本步骤为：①肿瘤血管生成因子与血管生成抑制因子失衡，血管生成表型形成；②血管内皮基底膜降解；③内皮细胞向肿瘤组织迁移及在迁移中增殖；④内皮细胞管道化、分支化形成血管环；⑤形成新的基底膜。实验证明多数实体肿瘤内，通常是抑制血管生成的因子缺失或失活，促进血管生成的因子占主导地位并作用于内皮细胞使血管生成。血管内皮细胞生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)是作用最强、特异性最高的两种促血管生长因子，通常在肿瘤内异常高表达。

糖尿病性视网膜病变(DR)是一种严重的致盲性糖尿病眼部并发症。据美国统计，糖尿病患者比非糖尿病患者致盲的危险性大50-80倍，每年有10％-12％的新盲人是由DR造成的，是工作年龄段人群致盲的最主要原因。糖尿病性黄斑水肿(DME)是DM的主要病理改变。DME具体的发病机理尚不明确，细胞外液的来源为血管内成分。虽然血液流变学的改变可部分解释液体外渗，但最主要的机制是血-视网膜屏障的破坏。研究表明，视网膜的内、外屏障的破坏均参与了黄斑水肿的发生过程，尤其以内层血一视网膜屏障的破坏占有更重要的地位。视网膜的内屏障由视网膜毛细血管内皮细胞之间的紧密连接构成的，内屏障的改变一直是糖尿病视网膜病变的研究重点，目前已发现某些与内屏障破坏有关的分子生物学改变，部分解释了黄斑水肿的机制。

关节炎(如类风湿性关节炎)、视网膜病(如糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞、早熟性视网膜病)、血管瘤、银屑病等疾病均需要对病变组织血管生成进行控制。

在植物成分中，总称为黄酮类化合物(Flavonoid)的物质是分布最广的一类酚性化合物。木犀草素(luteolin)是一种有代表性天然黄酮，弱酸性四羟基黄酮类化合物，化学名为3’，4’，5，7-四羟基黄酮，结构式如I所示，主要存在于金银花、菊花、荆芥、白毛夏枯草等药物中，以及百里香、芽甘蓝、洋白菜、菜花、甜菜、椰菜和胡萝卜等蔬菜中，而且以糖甙的形式分布于多种植物中，如芹菜、青辣椒、紫苏叶等。早期文献报道木犀草素具有抗菌、抗炎、保护心血管、解痉、祛痰、抑制酶活性、免疫调节、抗氧化、抗辐射、利尿、利胆等药理作用。目前研究证实木犀草素对多种实体瘤、腹水癌和白血病细胞都有显著抑制作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供提供木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用。

其中，所述的血管为肿瘤血管。

其中，所述的血管为关节炎病变组织的血管，优选为类风湿性关节炎病变组织的血管。

其中，所述的血管为视网膜病变组织的血管，优选为糖尿病性视网膜病变组织的血管、视网膜静脉闭塞变组织的血管或者早熟性视网膜病变组织的血管。

其中，所述的血管为瘤病变组织的血管。

其中，所述的血管为抑制银屑病组织的血管。

根据本发明可以将治疗有效量的木犀草素和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与木犀草素没有拈抗作用的其他抗血管生成的药物。其制剂可以是药学上允许的任意一种制剂，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂、脂质体等。木犀草素的用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型和严重程度等变化，其日剂量可以在1～5mg/kg体重范围，可以一次或多次施用。

有益结果：本发明公开了木犀草素的新用途，即木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用。实验表明，木犀草素对人脐静脉内皮细胞增殖、鸡胚尿囊膜血管生成、癌细胞分泌血管生长因子VEGF和FGF、移植瘤裸鼠肿瘤血管生成等均有显著的抑制作用，可用于制备抑制血管生成的药物。

附图说明

图1：人脐静脉内皮细胞的原代培养和鉴定。其中：A，HUVEC透射光照片(x200)；B，八因子相关抗原鉴定HUVEC，胞内有棕色颗粒为阳性细胞(x400)；C，阴性对照(未加八因子相关抗原，其他同B)(x400)。

图2：木犀草素抑制血管内皮细胞增殖的抑制曲线。

图3：木犀草素抑制鸡胚尿囊膜血管生成照片。

图4：木犀草素在抑制胰腺癌细胞PANC-1表达血管内皮细胞生长因子VEGF和成纤维细胞生长因子FGF mRNA。

图5：木犀草素抑制荷胰腺癌裸鼠肿瘤生长的抑制曲线。

图6：荷瘤小鼠在使用吉西他滨、木犀草素治疗后状态与对照组状态对比照片。

图7：木犀草素抑制肿瘤血管生成的免疫组化分析照片。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：木犀草素抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖。

1、人脐静脉血管内皮细胞的体外分离培养和鉴定。

目的和原理：采用酶消化法体外分离和培养人脐静脉血管内皮细胞，并做八因子相关抗原鉴定。血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，借助胰酶可将内皮细胞与邻近细胞分开，使成单个细胞脱落下来。八因子相关抗原是内皮细胞的特异性标记，可作为内皮细胞的鉴定标准。

方法：取新鲜人脐静脉，PBS冲洗干净后灌入0.1％胰酶至充盈，37℃消化12min。用培养基冲下已消化的内皮细胞，离心收集后重悬于M199完全培养基(含15％FBS，0.1mg/mL肝素钠，0.03mg/mLECGS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)，37℃、5％CO₂培养箱培养。八因子相关抗原鉴定分离得到的细胞，DAB显色后胞内有棕色颗粒为阳性细胞。HUVEC稳定传代至第3～5代用于实验。

结果与评价：成功分离获得可稳定传代的人脐静脉血管内皮细胞，结果见图1，经八因子相关抗原鉴定阳性率大于98％，为研究内皮细胞功能及其在各种疾病的发生发展中所起作用的提供了基础。

2、木犀草素抑制人脐静脉血管内皮细胞增殖。

目的和原理：采用MTT法测定木犀草素对血管内皮细胞增殖的抑制作用。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为水不溶性的紫蓝色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

方法：取对数生长期内皮细胞，96孔板中接种1 x 10⁴个细胞每孔，每孔100μl培养基，37℃、5％CO2培养箱培养。细胞贴壁过夜后加不同浓度木犀草素(20，40，60，80或100μM)刺激，DMSO作为空白对照。24小时后，加10μl MTT溶液(5mg/mL)，放回培养箱继续培养4小时。去掉上清液，加100μl DMSO溶解结晶10分钟后在酶标仪上检测570nm吸光值。用分离的新鲜人血中的单个核细胞(PBMC)作木犀草素的毒性评价。

结果与评价：木犀草素可显著抑制血管内皮细胞增殖，IC₅₀为65μM，而对PBMC几乎无细胞毒作用，见图2。

实施例2：木犀草素抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成。

目的和原理：在鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未完全建立，对各种异物几乎不发生排斥反应，将含药物载体置于其表面，可观察到药物对血管生成的影响。由于其对抗血管生成药物敏感，目前仍被认为是一种较理想的药物筛选模型。

方法：7日龄受精鸡蛋在37.5℃，55％湿度的孵箱中呈45°，大头朝上放置。第二天，在鸡胚大头端开窗(1.5cm x 1.5cm)，小心去掉气室膜，暴露鸡胚绒毛尿囊膜。吸收了待测药物的灭菌滤纸(5mm x 5mm)无菌条件下晾干后放置于鸡胚绒毛尿囊膜上。无菌封口膜封闭开窗鸡蛋，放回孵箱。三天后，去掉封口膜，注射入20％脂肪乳，相机拍照保存结果。

结果与评价：结果见图3，与对照组比较，给予木犀草素后，血管生成受到抑制，大的血管较少，说明木犀草素可以抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，并呈剂量依赖性。

实施例3：木犀草素在抑制胰腺癌细胞PANC-1表达血管内皮细胞生长因子VEGF和成纤维细胞生长因子FGF mRNA。

目的和原理：RT-PCR(reverse transcription and polymerase chain reaction)测定木犀草素作用胰腺癌细胞PANC-1后，VEGF和FGF mRNA水平。RT-PCR通过m RNA反转录成cDNA，再进行PCR扩增，并测定PCR产物的数量，可以推测样品中特意mRNA的相对数量。

方法：胰腺癌细胞PANC-1经不同浓度木犀草素刺激后，消化收集细胞，Trizol提取细胞总RNA，反转录获得cDNA，操作步骤按照Takara反转录试剂盒说明书进行。以cDNA为模板扩增合成VEGF和FGF-2，内参选用GAPDH。PCR产物用2％琼脂糖电泳分离，拍照分析结果。

引物：VEGF sense，5’-ATG GCACCCATGGCAGAAG-3’；

      VEGF antisense，5’-TCA CCG CCT CGG CTT GTC AC-3’；

      FGF-2sense，5’-CAT CAC CAC GCT GCC CGC CTT GC-3’；

      FGF-2antisense，5’-TCG TTT CAG TGC CAC ATA CC-3’；

      GAPDH sense，5’-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3’，

      GAPDH antisense，5’-TTA CTC CTT GGA GGC CAT GTG-3’.

结果与评价：结果见图4，木犀草素可在转录水平上显著抑制促血管生长因子的表达，在40μM浓度下即明显起效。

实施例4：木犀草素抑制荷胰腺癌裸鼠肿瘤生长。

目的和原理：动物实验分析木犀草素体外抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长。实施例1、4显示木犀草素不仅可以抑制内皮细胞生长，还能降低肿瘤细胞分泌细胞因子的水平。通过抑制肿瘤血管生长可使肿瘤在缺少营养供给的情况下不能生长。

方法：6～8周龄Balb/c-nu/nu雌性裸鼠，体重(13±2g)，26～28℃，40～60％湿度环境饲养，无菌饲料和水，每日更换。裸鼠适应性喂养一周后，右侧腋窝皮下接种1x10⁷cells/200ul(DMEM：基质胶)，200ul/只。待肿瘤长至100mm³(短径²x长径/2)时分组，每组7只(每组平均体积一致，肿瘤体积过大或过小者剔除)。分为5组，阴性对照组(生理盐水，NS)，阳性对照组(注射用吉西他滨，Gem)，木犀草素低剂量组(Lut低)，木犀草素中剂量组(Lut中)，木犀草素高剂量组(Lut高)。每天早上9:00给药。每三天测一次体重和肿瘤大小(肿瘤体积V＝长径x短经²/2)，先测再给药。每日观察小鼠的自主活动，精神状态，毛发，呼吸，饮食，粪便性状及对外界刺激的反应。三周后脱颈椎处死小鼠，称取体重、用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤后，用手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤，用手术剪钝性剥离肿瘤，并用天平称瘤重、移植瘤重，计算抑制率。以抑瘤率来判断抑瘤作用。肿瘤抑制率(％)＝[1-(平均实验组瘤重/平均对照组瘤重)]×100％

结果与评价：图5显示PANC-1荷瘤小鼠在进行吉西他滨干预后，肿瘤体积显著减少，而木犀草素只有高剂量组得到有效的抑制效果。但是经过5周的观察发现，吉西他滨在减少肿瘤的增长的同时也减少了裸鼠的存活率，在第二周有2只小鼠死亡，停药两次后体重有所恢复，继续给药后在第四和第五周分别各有一只小鼠死亡。吉西他滨给药组小鼠的生活质量极差，体重明显下降，瘦骨嶙峋，拱背发冷，不爱活动。与对照组和吉西他滨组比较，木犀草素给药后裸鼠体重增加，手抓时明显感觉小鼠健壮紧实(图6)。化疗药虽然抑制肿瘤生长效果明显，却给病人增加难以忍受的痛苦，本发明呈现了中药的低毒特质，在低毒的基础上发挥着抗肿瘤的效果。

实施例5：木犀草素抑制肿瘤血管生成的免疫组化分析。

目的和原理：体外实验检测木犀草素对动物肿瘤模型中肿瘤血管生成的影响，免疫组化检测微血管密度(CD31抗体染色)和VEGF表达水平。

方法：石蜡包埋组织脱蜡、水化，PBS洗两次，每次5分钟。3％H₂O₂室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。微波修复抗原，PBS洗5分钟。滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，滴加一抗，4℃过夜(4℃过夜后在37℃复温45分钟)，PBS洗三次，每次2分钟。滴加生物素化二抗，室温20分钟，PBC洗3次，每次2分钟。滴加试剂SABC，室温20分钟，PBS洗4次，每次5分钟。DAB显色：DAB显色试剂盒(镜下掌握显色程度)。蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。脱水、透明、封片、镜检。

结果与评价：结果见图7，吉西他滨组和木犀草素组的棕色颗粒(表示阳性)均显著低于对照组。

Claims (8)

1.木犀草素在制备抑制血管生成药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的血管为肿瘤血管。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的血管为关节炎病变组织的血管。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的血管为类风湿性关节炎病变组织的血管。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的血管为视网膜病变组织的血管。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的血管为糖尿病性视网膜病变组织的血管、视网膜静脉闭塞变组织的血管或者早熟性视网膜病变组织的血管。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的血管为瘤病变组织的血管。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的血管为抑制银屑病组织的血管。

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