CN105467060B - 一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法 - Google Patents

一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速检测普鲁兰多糖发酵液中的普鲁兰多糖含量的方法，属于生物化工领域。发酵液分别经不同浓度酸溶液加热水解不同糖苷键，分别测量水解产物中的葡萄糖含量，用两次水解液中的葡萄糖含量的差值，计算发酵液中普鲁兰多糖的含量。本发明的检测方法适用性广泛，不受发酵液初始浓度的影响；成本低廉，操作简便，快速准确，适用于生产或菌株筛选过程中的发酵产量分析。

Description

一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一种普鲁兰多糖发酵液中和纯化过程中的普鲁兰多糖的含量测定方法。
背景技术
普鲁兰多糖(pullulan)，中文译为普鲁兰，也叫普鲁兰糖、茁霉多糖、普聚多糖或茁霉糖，是由葡萄糖残基组成的直链状同型多聚糖，葡萄糖以α-1,4-糖苷键连接成麦芽三糖，麦芽三糖由α-(1→6)糖苷键连接形成高分子的普鲁兰多糖，纯品是无味无嗅的白色粉末。因其可塑性、成膜性好，簿膜隔气性佳，在医药、食品、化妆品、农药等行业具有广泛的用途：(1)浸泡或喷涂于食品表面具有无色、无味、透明、抗菌及抗氧化和保鲜的作用；(2)普鲁兰多糖是一种低热量食物配料，具有水溶性膳食纤维的优良特性；(3)普鲁兰多糖具有极好黏着性、凝固性和抗氧化性，是一种良好的食品黏合剂和抗氧化剂；(4)普鲁兰多糖具有优良的成膜性和抗拉伸性，且这种薄膜的氧气透过率极低，用于食品保鲜，延长货物存放时间；(5)医药工业上普鲁兰多糖可作为血浆代用品，制药工业中部分替代动物明胶制成胶囊，可简化防氧化胶囊的生产，提高胶囊弹性和黏着性，延缓胶囊老化，延长药物保存期，尤其可用于中药、易氧化成分的胶囊壳原料，防止有效成分氧化。此外，还可广泛应用于建筑表面处理的覆膜材料，制作人造纤维，作为微生物絮凝剂清除环境水体微生物污染；同时还广泛用于化妆品、洗涤剂、感光材料等领域。
工业上用微生物发酵方法生产普鲁兰多糖，使用葡萄糖或蔗糖作为碳源，因此在发酵过程中、发酵结束时、产物纯化过程中，均有葡萄糖、蔗糖等可溶性糖类杂质。
普鲁兰多糖发酵生产中，当前广泛使用的检测产量方法为硫酸蒽酮法和醇沉干燥法，此二法各有其局限。硫酸蒽酮法测量结果误差较大，重现性不高；每次均需制备标准曲线，操作繁琐；需用浓硫酸，有一定危险性，对操作人员和设备有较高要求。醇沉干燥法测定高浓度酒精中的沉淀物质的干重，沉淀过程有可能沉淀不完全，或者混入杂质；干燥过程耗费大量时间，很难彻底干燥。
发明内容
本发明的目的是提供一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，此法通过控制酸浓度与加热时间的手段，快速检测发酵液中及纯化过程中的普鲁兰多糖的含量。
为实现以上目的，本发明采用以下技术方案。
一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，其特征在于：分别检测在水解条件(1)和(2)下获得的葡萄糖含量，由其差值获得普鲁兰多糖的含量。
本发明所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，其中，条件(1)为：取发酵液，用酸液调节H+浓度0.2～0.8mol/L，沸水浴1～5min；条件(2)为：取发酵液，用酸液调节H+浓度2.0～3.0mol/L，沸水浴20～60min。
本发明所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，所述的水解为酸水解。
本发明所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，所述的发酵液是经过预处理，如离心去除菌体步骤，以排除菌体内部的普鲁兰多糖造成的干扰。
本发明所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，葡萄糖含量由常规技术手段定量测定，优选生物传感分析仪法测定。
本发明所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，所述的酸液是指盐酸、硫酸或其它在所述浓度范围无强氧化性的强酸。
下面通过采用生物传感分析仪法测定葡萄糖含量，进一步说明本发明。
一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，包括如下步骤：取等量的2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液适量，一份用酸液调节H+浓度0.2～0.8mol/L，沸水浴1～5min；另一份用酸液调节H+浓度2.0～3.0mol/L，沸水浴20～60min；待发酵液中多糖等降解为葡萄糖，测定其含量(分别为A和B)。
葡萄糖含量测定使用生物传感分析仪法，取待测样品1mL，调节pH 5.0～9.0，加纯化水稀释至10mL，取25μL加入生物传感分析仪的进样孔，仪器显示葡萄糖浓度。
由式(1)计算普鲁兰多糖的含量。
式中：162：普鲁兰多糖单糖单位的分子量；180：葡萄糖的分子量。
本发明的检测方法根据不同类型糖苷键在酸溶液中水解的难易程度不同而设计。普鲁兰多糖发酵液中主要的糖类杂质为蔗糖或/和葡萄糖。在低浓度酸溶液中短时间加热情况下，蔗糖先发生水解；提高酸浓度，延长加热时间，蔗糖和普鲁兰多糖均发生水解；且水解产物葡萄糖在本发明水解条件下均保持结构稳定，可用常规检测方法快速精确地检测。用两次水解液中的葡萄糖含量的差值，计算发酵液中普鲁兰多糖的含量。本发明的检测方法适用性广泛，不受发酵液初始浓度的影响；成本低廉，操作简便，快速准确，适用于生产或菌株筛选过程中的发酵产量分析。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实验和实施例对本发明作进一步描述。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
1蔗糖的酸水解条件
配制10.0g/L蔗糖溶液和10.0g/L普鲁兰多糖溶液，各取10mL，加入盐酸调节H+浓度(见表1)，分别沸水浴，按时间梯度分别取样1mL，测定其中的葡萄糖含量，并计算发生水解的蔗糖和普鲁兰多糖的量。结果见表1。
葡萄糖含量检测使用生物传感分析仪法，取待测样品1mL，调节pH 5.0～9.0，加纯化水稀释至10mL，取25μL加入生物传感分析仪的进样孔，仪器显示葡萄糖浓度。
由葡萄糖浓度计算发生水解的蔗糖量和发生水解的普鲁兰多糖，计算见式(2)和式(3)。
式中：a：蔗糖测定步骤生物传感分析仪读数；b：普鲁兰多糖测定步骤生物传感分析仪读数；342：蔗糖的分子量，162：普鲁兰多糖单糖单位的分子量；180：葡萄糖的分子量。
表1 酸浓度和加热时间对糖水解程度的影响
由表1可见，在终浓度0.2～0.8mol/L H+沸水浴1～5min，蔗糖可完全水解，而普鲁兰多糖不发生水解。
2普鲁兰多糖的酸水解条件
配制10.0g/L普鲁兰多糖溶液，各取10mL，加入盐酸调节H+浓度(见表2)，分别沸水浴，按时间梯度分别取样1mL，测定其中的葡萄糖含量，并计算发生水解的普鲁兰多糖的含量。结果见表2。
葡萄糖含量检测使用生物传感分析仪法，取待测样品1mL，调节pH 5.0～9.0，加纯化水稀释至10mL，取25μL加入生物传感分析仪的进样孔，仪器显示葡萄糖浓度。由葡萄糖浓度计算发生水解的普鲁兰多糖，计算同式(3)。
表2 酸浓度和加热时间对普鲁兰多糖水解程度的影响
由表2可见，在终浓度2.0～3.0mol/L H+沸水浴1～5min，普鲁兰多糖可完全水解。而终浓度3.5～5.0mol/L H+沸水浴过程中，反应液由最初的无色逐渐变为黄色，缓缓加深变为深褐色、黑色，试管底部有黑色沉淀生成。该现象显示溶液中其它副反应，水解出的葡萄糖参加副反应，相应地，检测结果变小，葡萄糖结果不能准确对应原溶液中的普鲁兰多糖含量。
下面列举实施例进一步说明本发明，葡萄糖含量检测使用生物传感分析仪法。
实施例1
取2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液1，各10mL，一份用盐酸调节H+浓度0.2mol/L，沸水浴5min；另一份用盐酸调节H+浓度2.0mol/L，沸水浴20min，分别水解。
实施例2
取2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液2，各10mL，一份用盐酸调节H+浓度0.5mol/L，沸水浴5min；另一份用盐酸调节H+浓度2.5mol/L，沸水浴30min。
实施例3
取2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液2，各10mL，一份用盐酸调节H+浓度0.6mol/L，沸水浴3min；另一份用盐酸调节H+浓度2.4mol/L，沸水浴40min。
实施例4
取2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液2，各10mL，一份用盐酸调节H+浓度0.8mol/L，沸水浴2min；另一份用盐酸调节H+浓度3.0mol/L，沸水浴30min。
实施例5
取2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液2，各10mL，一份用盐酸调节H+浓度0.4mol/L，沸水浴4min；另一份用盐酸调节H+浓度2.2mol/L，沸水浴60min。
实施例6
取2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液2，各10mL，用盐酸调节H+浓度0.6mol/L，沸水浴4min；另一份用盐酸调节H+浓度2.4mol/L，沸水浴25min。
实施例1～6水解液中葡萄糖含量均使用生物传感分析仪法测定：分别取水解液1mL，调节pH 5.0～9.0，加纯化水稀释至10mL，取25μL加入生物传感分析仪的进样孔，仪器显示葡萄糖浓度；数据经转换为发酵液中葡萄糖含量，采用式(1)求得发酵液中普鲁兰多糖含量，结果见表3。
同时采用醇沉法测定实施例1～6发酵液中普鲁兰多糖含量，方法如下。
1发酵液预处理取实施例1～6发酵液50mL，4000r/min离心20min，取上清，转移入500mL烧杯。
2醇沉用玻璃棒快速搅拌预处理后的发酵液，边搅拌边缓缓加入5倍体积乙醇，烧杯中即出现絮状沉淀。滤网滤除液体，保留沉淀。
3洗涤沉淀物加入200mL酒精洗涤沉淀。重复洗涤3次。
4干燥沉淀物置于80℃烘箱过夜干燥。
5称重充分干燥后，电子天平称重。
6计算得普鲁兰多糖的发酵产量，结果见表3。
表3 本发明方法和醇沉法测定发酵液中普鲁兰多糖含量
结果表明，酸解法与醇沉法的结果有较好的对应关系。与醇沉法比较，本发明有以下优势：
(1)本发明方法耗时短，可在1h内检测发酵产量，便于时跟踪发酵生产过程中的产量变化，为发酵过程控制提供参考。
(2)本发明方法操作简单，数据精确。醇沉方法中多个步骤均可能出现误差，包括搅拌沉淀、洗涤、转移、称量，都有可能造成损失，干燥步骤容易干燥不彻底。

Claims (3)

1.一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：取等量的2份经预处理的普鲁兰多糖发酵液适量，一份用酸液调节H+浓度0.2～0.8mol/L，沸水浴1～5min；另一份用酸液调节H+浓度2.0～3.0mol/L，沸水浴20～60min；用生物传感分析仪法测定水解液中葡萄糖含量，分别为A和B；由式(1)计算普鲁兰多糖的含量：
式中：162：普鲁兰多糖单糖单位的分子量；180：葡萄糖的分子量。
2.如权利要求1所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，其特征在于：所述的预处理是如离心去除菌体步骤。
3.如权利要求1所述的一种普鲁兰多糖含量的快速检测方法，其特征在于：所述的酸液是指盐酸、硫酸或其它在所述浓度范围无强氧化性的强酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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