PL194475B1 - Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie - Google Patents

Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie

Info

Publication number
PL194475B1
PL194475B1 PL348789A PL34878901A PL194475B1 PL 194475 B1 PL194475 B1 PL 194475B1 PL 348789 A PL348789 A PL 348789A PL 34878901 A PL34878901 A PL 34878901A PL 194475 B1 PL194475 B1 PL 194475B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
enzyme
strain
plasmid
amylolytic enzyme
Prior art date
Application number
PL348789A
Other languages
English (en)
Other versions
PL348789A1 (en
Inventor
Jacek Bardowski
Monika Domań
Zdzisław Targoński
Adam Waśko
Pierre Renault
Jamila Mondoloni
Original Assignee
Inst Biochemii I Biofizyki Pan
Instytut Biochemii I Biofizyki Pan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biochemii I Biofizyki Pan, Instytut Biochemii I Biofizyki Pan filed Critical Inst Biochemii I Biofizyki Pan
Priority to PL348789A priority Critical patent/PL194475B1/pl
Priority to US10/488,645 priority patent/US7417135B2/en
Priority to PCT/PL2002/000041 priority patent/WO2003008587A2/en
Priority to ES02743993T priority patent/ES2306772T3/es
Priority to EP02743993A priority patent/EP1409689B1/en
Priority to DE60226608T priority patent/DE60226608D1/de
Priority to AT02743993T priority patent/ATE395421T1/de
Priority to AU2002345451A priority patent/AU2002345451A1/en
Publication of PL348789A1 publication Critical patent/PL348789A1/xx
Publication of PL194475B1 publication Critical patent/PL194475B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01041—Pullulanase (3.2.1.41)

Abstract

1. Gen plazmidowy kodujacy nowy enzym amylolityczny ulegajacy sekrecji do srodowiska, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1. 2. Gen wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze na koncu 5' zawiera dodatkowa sekwencje nukleotydowa ma strukture nukleotydowa przedstawiona na fig. 2. 3. Sposób wytwarzania genu plazmidowego kodujacego nowy enzym amylolityczny ulegajacy sekrecji do srodowiska, znamienny tym, ze DNA plazmidowy uprzednio wyizolowany ze szczepu bakteryjnego kodujacego enzym amylolityczny, korzystnie szczepu z rodzaju Lactococcus, poddaje sie trawieniu enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, Sacll, Sall, Smal, Spel, Xhol albo Xbal, nastepnie wyciety fragment wielkosci co najmniej 3,0kb laczy sie z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwlasz- cza plL253, pGKV210 albo plL252 trawionym uprzednio równiez enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, albo Sall, albo Smal, po czym obydwa DNA rekombinuje sie ze soba i wprowadza metoda elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje sie w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrebnia sie komórki zawierajace nowy gen i wytwarzajace nowy enzym amylolityczny, w znany sposób. 6. Enzym ulegajacy sekrecji do srodowiska, znamienny tym, ze wykazuje dzialanie w szerokim zakresie kwasnego pH 3,5 do 5,5, z optimum w pH 4,4, i wykazuje optimum dzialania w zakresie temperatur 35 - 45°C, a ulega inaktywacji termicznej w temperaturze powyzej 50°C, przy czym jest kodowany przez nowy gen plazmi- dowy, i ma strukture aminokwasowa przedstawiona na fig. 3. 7. Zastosowanie enzymu amylolitycznego, kodowanego przez nowy gen do fermentacji materialów roslin- nych, korzystnie skrobi, pullulanu, amylozy, amylopektyny, wytwarzania pasz, otrzymywania glukozy, kwasu mlekowego oraz wytwarzania preparatów probiotycznych, znamienny tym, ze kodujacy go gen, wbudowuje sie w strukture szczepu bakteryjnego, korzystnie szczepu Lactococcus lactis IBB500, IBB501, IBB502, IBB140 i nastepnie wykorzystuje sie tak otrzymany szczep bakteryjny do fermentacji materialów roslinnych, mleka lub do otrzymania biomasy. PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy gen plazmidowy kodujący enzym amylolityczny, który po wprowadzeniu do szczepu mikroorganizmu, korzystnie bakteryjnego, zwłaszcza Lactococcus lactis, umożliwia wytwarzanie kodowanego przez niego enzymu amylolitycznego, sposób otrzymywania tego genu oraz zastosowanie w przemyśle enzymu kodowanego przez ten gen.
Bakterie fermentacji mlekowej zdolne są do wykorzystywania wielu różnych cukrów jako źródeł węgla i energii (De Vos W. 1996. Antonie van Leeuwenhoek 70: 223). W znakomitej większości są to cukry proste i dwucukry. Zdolność bakterii fermentacji mlekowej do katabolizmu węglowodanów jest szeroko wykorzystywana w procesach biotechnologicznych związanych z produkcją żywności (Libudzisz Z., Walczak P. i Bardowski J. 1998. wyd., Bakterie Fermentacji Mlekowej - klasyfikacja, metabolizm, genetyka, wykorzystanie. Monografie, Łódź; Aleksandrzak T., Kowalczyk M., Kok J., Bardowski J. 2000, Food Biotechnol. 17 : 61, Elsevier Science B.V., Amsterdam). Jednym z nich jest wytwarzanie fermentowanych produktów mlecznych. Głównym cukrem w mleku jest laktoza, której katabolizm jest właściwością stosunkowo powszechnie występującą wśród bakterii fermentacji mlekowej (Bardowski J. 1995. Przegląd Mleczarski 11 : 315; Van Rooijen R.J. 1992. Lactose catabolism in Lactococcus lactis. Ph.D thesis, Wageningen, The Netherlands).
Innym naturalnym surowcem, obok mleka, wykorzystywanym do produkcji artykułów żywnościowych są rośliny. I te procesy biotechnologiczne są często prowadzone z wykorzystaniem bakterii fermentacji mlekowej. W materiałach roślinnych jednak, w odróżnieniu od mleka, występują głównie wielocukry, takie jak celuloza czy skrobia. Stąd w mikrobiologicznej konwersji surowców roślinnych znajdują zastosowanie te drobnoustroje, które wykazują zdolności celulolityczne bądź amylolityczne. Wśród bakterii fermentacji mlekowej nie występują takie, które potrafią degradować celulozę.
Natomiast zdolność do degradacji skrobi u tej grupy bakterii jest właściwością ograniczoną zasadniczo do nielicznych szczepów z rodzaju Lactobacillus (cyt. za Giraud E., A. Chapailler and M. Raimbault. 1994. Appl. Environ. Microbiol. 60 : 4319). Niektóre bakterie z tego rodzaju, należące do gatunków L. plantarum, L. amylophilus czy L. amylovorus wytwarzają a-amylazę (Fitzsimons A. and O'Connell. 1994. FEMS Microbiol. Letts. 116 :137; Pompeyo CC., Gomez MS., Gasparian S., J. Morlon-Guyot 1993. Appl. Microbiol. Biotechnol. 40 : 266).
Stwierdzono, że poza szczepami z rodzaju Lactobacillus, również niektóre szczepy naturalnie wystę pujące w przyrodzie z rodzaju Lactococcus wykazują tę zdolność. Zaobserwowano bowiem, że wśród szczepów Lactococcus izolowanych z ich naturalnych środowisk bytowania, możliwe jest znalezienie szczepów, które zdolne są do degradacji skrobi (Domań M., E. Czerniec, Z. Targoński and J. Bardowski. (2000), Food Biotechnology 17 : 67, Elsevier Science B.V., Amsterdam).
Nieoczekiwanie, okazało się, iż również inne szczepy, zwłaszcza z rodziny Lactococcus lactis, po wprowadzeniu do nich odpowiedniej struktury genu według wynalazku, są w stanie produkować kodowany przez ten gen nowy enzym amylolityczny ulegający sekrecji do środowiska.
Gen plazmidowy kodujący nowy enzym amylolityczny ulegający sekrecji do środowiska, według wynalazku ma sekwencję nukleotydową przedstawioną na fig. 1.
Gen według wynalazku, na końcu 5', korzystnie, zawiera dodatkową sekwencję nukleotydową i wtedy ma strukturę nukleotydową przedstawioną na fig. 2.
Sposób wytwarzania nowego genu plazmidowego kodującego nowy enzym amylolityczny ulegający sekrecji do środowiska, według wynalazku, polega na tym, że DNA plazmidowy uprzednio wyizolowany ze szczepu bakteryjnego kodującego enzym amylolityczny, korzystnie szczepu z rodzaju Lactococcus, poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, Sacll, Sall, Smal, Spel, Xhol albo Xbal, następnie wycięty fragment wielkości co najmniej 3,0kb łączy się z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza plL253, pGKV210 albo plL252 trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, albo Sall, albo Smal, po czym obydwa DNA rekombinuje się ze sobą i wprowadza metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen i wytwarzające nowy enzym amylolityczny, w znany sposób.
W sposobie według wynalazku jako szczepy bakteryjne do których wprowadzasię rekombinowane DNA stosuje się korzystnie szczepy Lactococcus lactis MG1363, Lactococcus lactis IL1403 lub Lactococcus lactis IBB140.
PL 194 475 B1
W sposobie według wynalazku kolonie wytwarzające enzym amylolityczny i zawierające nowy gen wyodrębnia się korzystnie przesiewając na świeżą pożywkę płynną zawierającą antybiotyk i ewentualnie skrobię.
Nowy enzym ulegający sekrecji do środowiska, kodowany przez nowy gen plazmidowy według wynalazku, ma strukturę aminokwasową przedstawioną na fig. 3.
Enzym ten wykazuje unikalny zestaw, bardzo korzystnych właściwości, a przede wszystkim wykazuje działanie w szerokim zakresie kwaśnego pH 3,5 do 5,5 jak pokazano na wykresie (fig. 1) przy czym optimum występuje w pH 4,4, a jednocześnie wykazuje optimum działania w zakresie temperatur 35 - 45°C, jak pokazano na wykresie (fig. 2), przy czym ulega inaktywacji termicznej w temperaturze powyżej 50°C, jak pokazano na wykresie (fig. 3).
Zastosowanie enzymu amylolitycznego, kodowanego przez nowy gen według wynalazku, do fermentacji materiałów roślinnych, korzystnie skrobi, pullulanu, amylozy, amylopektyny, wytwarzania pasz, otrzymywania glukozy, kwasu mlekowego oraz wytwarzania preparatów probiotycznych, według wynalazku polega na tym, że kodujący go gen, wbudowuje się w strukturę szczepu bakteryjnego, korzystnie szczepu Lactococcus lactis IBB500, IBB501, IBB502, IBB140 i następnie wykorzystaniu tak otrzymanego szczepu bakteryjnego do fermentacji materiałów roślinnych lub mleka lub do otrzymania biomasy.
Gen według wynalazku został zsekwencjonowany, a uzyskana sekwencja wskazuje, że należy on do rodziny genów kodujących pullulanazy. Analiza regionu promotorowego genu oraz badania funkcjonalne sugerują, że ekspresja tego genu podlega represji katabolicznej.
Ogólna charakterystyka enzymu amylolitycznego.
Z porównania właściwości pullulanaz badanych szczepów L. lactis IBB 500 i IBB 502 można wyciągnąć wniosek, że mamy do czynienia z jednym enzymem produkowanym w dwóch organizmach. Pullulanaza pochodząca z obu szczepów charakteryzowała się optymalnym pH równym 4,5, natomiast optimum temperatury osiągała przy 45°C (Rys. 22, 23).
Należy zwrócić uwagę na fakt stosunkowo wąskiego zakresu pH działania enzymu w granicach pH 3,5 do 5,5, a także znacznie niższego pH niż dla pullulanaz pochodzących z innych bakterii (Ara K., Igarashi K., Saeki K., Kawai S., and S., Ito. 1992. Biosci. Biotech. Biochem. 56 : 62; Kim Ch., Nashiru O., J., Ko. 1996. FEMS Microbiology Letters 138 : 147; Takasaki Y. 1987. Agric. Biol. Chem., 51 : 9).
Enzym otrzymany przy pomocy nowego genu według wynalazku wykazuje homologię do enzymów amylolitycznych z grupy pullulanaz, a najwyższy stopień identyczności występował w stosunku do pullulanazy z Termotoga maritima. W sekwencji aminokwasowej pullulanazy z L. lactis IBB500 stwierdzono obecność 4 zakonserwowanych motywów, charakterystycznych dla wielu enzymów amylolitycznych. Sekwencja nukleotydowa genu pul poprzedzona była typową dla Lactococcus sekwencją RBS, przed którą znajdował się długi, ponad 500-nuklotydowy region nie kodujący.
Dokładna analiza regionu nie kodującego powyżej genu pul wykazała obecność w nim kilku potencjalnych sekwencji promotorowych. Z uwagi na wcześniejsze obserwacje dotyczące wpływu glukozy na wytwarzanie pullulanazy, z których wynikało, że ekspresja genu pul może podlegać regulacji na drodze represji katabolicznej, region promotorowy poddano analizie w kierunku obecności motywu cre, charakterystycznego dla tego mechanizmu regulacji (Weickert M.J. and S. Adhya. 1992. J. Biol. Chem. 267 : 15869). Stwierdzono, że sekwencja homologiczna do 14-nukleotydowej sekwencji cre występuje w analizowanym regionie promotorowym. Obserwacja ta silnie przemawiała za słusznością wcześniejszej hipotezy. Kolejne poparcie dla tej hipotezy uzyskano w badaniach nad wpływem glukozy, skrobi oraz jej pochodnych na wytwarzanie pullulanazy przez szczep IBB500. W ich wyniku ustalono, że skrobia i jej pochodne indukują wytwarzanie pullulanazy, chociaż w różnym stopniu, podczas gdy w obecności glukozy obserwuje się represję produkcji tego enzymu (Domań M., E. Czerniec, Z. Targoński and J. Bardowski. 2000. Food Biotechnology 17 : 67, Elsevier Science B.V., Amsterdam).
Poniżej przedstawiono przykłady wykonania.
Materiały i metody
Szczepy bakteryjne, warunki hodowlane i stosowane plazmidy.
Szczepy bakteryjne i plazmidy stosowane w tych badaniach przedstawiono w tabeli 1. Szczepy Lactococcus lactis hodowano w podłożach BHI (Oxoid, Anglia) lub M17 (Difco, USA), w temperaturze 28°C; Escherichia coli w podłożu Luria-Bertani (LB), w temperaturze 37°C. Gdy zachodziła potrzeba, w celach selekcyjnych, stosowano następujące antybiotyki: erytromycynę - 5ąg/ml dla L. lactis oraz ampicylinę -100 mg/ml dla E. coli.
PL 194 475 B1
Przykład l
DNA plazmidowy wyizolowano ze szczepu bakteryjnego kodującego enzym amylolityczny, Lactococcus lactis IBB500. Następnie poddano go trawieniu enzymem restrykcyjnym EcoRI, następnie wycięty fragment wielkości nie mniejszej niż 8,0kb połączono z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus - plL253, trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym EcoRI, po czym obydwa DNA zrekombinowano ze sobą i wprowadzono metodą elektroporacji do komórek szczepu Lactococcus lactis, który hodowano, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono, przesiewając na świeżą pożywkę płynną zawierającą antybiotyk i skrobię, komórki zawierające nowy gen o strukturze według wynalazku.
Komórki L. lactis transformowano techniką elektroporacji (Holo H. and l.F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55 : 3119). Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (Sambrook J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Przykład II
DNA plazmidowy wyizolowano ze szczepu bakteryjnego kodującego enzym amylolityczny, Lactococcus lactis IBB500. Następnie poddano go trawieniu enzymem restrykcyjnym Xhol, następnie wycięty fragment wielkości nie mniejszej niż 5,0kb połączono z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych z rodzaju Lactococcus - plL253, trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym Xhol, po czym obydwa DNA zrekombinowano ze sobą i wprowadzono metodą elektroporacji do komórek szczepu Lactococcus lactis, który hodowano, a z wyhodowanej populacji wyodrębniono, przesiewając na świeżą pożywkę płynną zawierającą antybiotyk i skrobię, komórki zawierające nowy gen o strukturze według wynalazku.
Komórki L. lactis transformowano techniką elektroporacji (Holo H. and I.F. Nes. 1989. Appl. Environ. Microbiol. 55 : 3119). Pozostałe techniki biologii molekularnej użyte w przykładzie były zgodne ze standardową metodyką (Sambrook J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manuał, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Przykład III
Strukturę sekwencji nukleotydowej nowego genu oraz sekwencji aminokwasowej enzymu amylolitycznego kodowanego przez ten gen według wynalazku stwierdzono przez zsekwencjonowanie
1,5-kb fragmentu Pstl plazmidu plBB502, zawierającego część nowego genu, który uprzednio sklonowano w plazmidzie pBluescript (Stratagene), otrzymując plazmid plBB504. Plazmid ten został wykorzystany do zsekwencjonowania z obu stron znajdującej się w nim wstawki. Transformację komórek E. coli przeprowadzono zgodnie ze standardową metodą, z użyciem CaCI2 (Sambrook J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Kompletną sekwencję nukleotydową wstawki oraz brakującego fragmentu nowego genu kodującego enzym amylolityczny otrzymano, stosując sekwencjonowanie metodą tzw. „primer walking”. W sekwencjonowaniu DNA używano zestaw BigDye Terminator (Promega, USA), aparat do PCR model 2400 (Perkin-Elmer) oraz sekwenator ABI377 (Applied Biosystem, USA). Uzyskane sekwencje nukleotydowe i aminokwasowe analizowano przy pomocy programów GCG (Genetics Computer Group. 1991. Program manual for the GCG package, version 7, April 1991. Genetic Computer Group, Madison, Wisconsin, USA) oraz BLAST (Altschul S.F., W. Gish, W. Miller, E.W. Myers and D.J. Lipman. (1990), J. Mol. Biol. 215 : 403).
Przykład IV
Do oznaczania aktywności amylolitycznej użyto dwa rodzaje testów, jakościowy i ilościowy.
Test jakościowy - płytkowy. Szczepy bakteryjne wysiewano na podłoże BHI z 0,5% skrobią i inkubowano w 28°C przez 2 dni. Następnie, wyrosłe kolonie zalewano płynem Lugola, który barwi nie zdegradowaną skrobię na granatowo. Kolonie wydzielające enzym amylolityczny do środowiska, były otoczone jasną strefą niewybarwionego podłoża.
Oznaczanie ilościowe enzymu. W badaniu tym stosowano zmodyfikowaną metodę oznaczania aktywności zewnątrzkomórkowej amylazy (Nicholson W. and P. Setlow. 1990. Sporulation, germination and outgrowth, str 433. W C.R. Harwood i S.M. Cutting (wyd.), Molecular Biology for Bacillus. John Wiley and Sons Ltd., Chichester, United Kingdom). W metodzie tej aktywność enzymatyczną określano w supernatancie hodowli: do 200 ml takiego supernatantu dodawano 800 ml substratu (0,025% skrobia w 10mM Tris-HCI - 3 mM octan potasowy - 25 mM CaCI2, pH 4,4) i inkubowano 30 min w 37°C. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 400 ml płynu Lugola i mierzono absorbcję próbki przy długości
PL 194 475 B1 fali 620nm [A620]. W próbie kontrolnej zamiast supernatantu hodowli używano pożywkę, w której prowadzono hodowlę.
Za jedną jednostkę aktywności amylolitycznej (1U) przyjęto taką ilość enzymu, która w warunkach oznaczenia powodowała spadek absorpcji [A620] substratu o 0,1, w stosunku do próby kontrolnej.
T a b e l a 1 Szczepy i plazmidy
Szczepy i plazmidy Genotyp Źródło
Lactococcus lactis
IBB 500 dziki szczep amy+ wyizolowany z roślin kolekcja IBB PAN
IBB 501 amy+ MG 1363zplBB501 ta praca
IBB 502 amy+ pochodna MG 1363 z plBB502 ta praca
IBB 140 amy+ z plBB502 ta praca
IL 1403 amy-, bezplazmidowy A. Chopin, Francja
MG 1363 amy-, bezplazmidowy M. Gasson, Anglia
Escherichia coli
TG1 supE thi D(lac-proAB) hsd (F'+ traD proAB laclqZ M15) (Gibson, 1984)
IBB 504 amy- pochodna TG1 z plBB504 ta praca
Plazmidy
pIBB500 30-kb, dziki plazmid z genem amy+ ta praca
pIBB501 20-kb fragment plBB500 z genem amy+ sklonowany w plL253 ta praca
pIBB502 13-kb pochodna plBB501 z genem amy+ ta praca
PIBB504 1,5-kb fragment Pstl z plBB502 w pSKIl+ ta praca
pBluescript SKII+ AmpR, wektor do klonowania i sekwencjonowania DNA Stratagene, USA
pIL253 EryR, wektor do klonowania genów A. Chopin, Francja
Zastrzeżenia patentowe

Claims (7)

1. Gen plazmidowy kodujący nowy enzym amylolityczny ulegający sekrecji do środowiska, o sekwencji nukleotydowej przedstawionej na fig. 1.
2. Gen według zastrz. 1, znamienny tym, że na końcu 5' zawiera dodatkową sekwencję nukleotydową i ma strukturę nukleotydową przedstawioną na fig. 2.
3. Sposób wytwarzania genu plazmidowego kodującego nowy enzym amylolityczny ulegający sekrecji do środowiska, znamienny tym, że DNA plazmidowy uprzednio wyizolowany ze szczepu bakteryjnego kodującego enzym amylolityczny, korzystnie szczepu z rodzaju Lactococcus, poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, Sacll, Sall, Smal, Spel, Xhol albo Xbal, następnie wycięty fragment wielkości co najmniej 3,0kb łączy się z plazmidem zdolnym do replikacji w komórkach bakteryjnych, korzystnie z rodzaju Lactococcus, zwłaszcza plL253, pGKV210 albo plL252 trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, albo Sall, albo Smal, po czym obydwa DNA rekombinuje się ze sobą i wprowadza metodą elektroporacji do komórek szczepów bakteryjnych, które hoduje się w znany sposób, a z wyhodowanej populacji wyodrębnia się komórki zawierające nowy gen i wytwarzające nowy enzym amylolityczny, w znany sposób.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako szczepy bakteryjne do których wprowadza się rekombinowane DNA stosuje się szczepy Lactococcus lactis MG1363, Lactococcus lactis IL1403 lub Lactococcus lactis IBB140.
5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że kolonie wytwarzające enzym amylolityczny i zawierające nowy gen wyodrębnia się, przesiewając na świeżą pożywkę płynną zawierającą antybiotyk i ewentualnie skrobię.
PL 194 475 B1
6. Enzym ulegający sekrecji do środowiska, znamienny tym, że wykazuje działanie w szerokim zakresie kwaśnego pH 3,5 do 5,5, z optimum w pH 4,4, i wykazuje optimum działania w zakresie temperatur 35 - 45°C, a ulega inaktywacji termicznej w temperaturze powyżej 50°C, przy czym jest kodowany przez nowy gen plazmidowy, i ma strukturę aminokwasową przedstawioną na fig. 3.
7. Zastosowanie enzymu amylolitycznego, kodowanego przez nowy gen do fermentacji materiałów roślinnych, korzystnie skrobi, pullulanu, amylozy, amylopektyny, wytwarzania pasz, otrzymywania glukozy, kwasu mlekowego oraz wytwarzania preparatów probiotycznych, znamienny tym, że kodujący go gen, wbudowuje się w strukturę szczepu bakteryjnego, korzystnie szczepu Lactococcus lactis IBB500, IBB501, IBB502, IBB140 i następnie wykorzystuje się tak otrzymany szczep bakteryjny do fermentacji materiałów roślinnych, mleka lub do otrzymania biomasy.
PL348789A 2001-07-19 2001-07-19 Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie PL194475B1 (pl)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL348789A PL194475B1 (pl) 2001-07-19 2001-07-19 Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie
US10/488,645 US7417135B2 (en) 2001-07-19 2002-06-26 Plasmidic gene, ways of acquiring this gene, the amylolytic enzyme it encodes and its application
PCT/PL2002/000041 WO2003008587A2 (en) 2001-07-19 2002-06-26 A lactococcus gene, the amylolytic enzyme it encodes and its application
ES02743993T ES2306772T3 (es) 2001-07-19 2002-06-26 Un gen de lactococcus, la enzima amilolitica codificada por este, y su aplicacion.
EP02743993A EP1409689B1 (en) 2001-07-19 2002-06-26 A lactococcus gene, the amylolytic enzyme it encodes and its application
DE60226608T DE60226608D1 (de) 2001-07-19 2002-06-26 Lactococcus gen, davon kodierte amylolytisches enzym sowie dessen verwendungen
AT02743993T ATE395421T1 (de) 2001-07-19 2002-06-26 Lactococcus gen, davon kodierte amylolytisches enzym sowie dessen verwendungen
AU2002345451A AU2002345451A1 (en) 2001-07-19 2002-06-26 A lactococcus gene, the amylolytic enzyme it encodes and its application

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL348789A PL194475B1 (pl) 2001-07-19 2001-07-19 Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL348789A1 PL348789A1 (en) 2003-01-27
PL194475B1 true PL194475B1 (pl) 2007-06-29

Family

ID=20079185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL348789A PL194475B1 (pl) 2001-07-19 2001-07-19 Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie

Country Status (8)

Country Link
US (1) US7417135B2 (pl)
EP (1) EP1409689B1 (pl)
AT (1) ATE395421T1 (pl)
AU (1) AU2002345451A1 (pl)
DE (1) DE60226608D1 (pl)
ES (1) ES2306772T3 (pl)
PL (1) PL194475B1 (pl)
WO (1) WO2003008587A2 (pl)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5860480B2 (ja) 2011-01-11 2016-02-16 キャプシュゲル・ベルジウム・エヌ・ヴィ プルランを含む新しい硬カプセル
CN102994469B (zh) * 2012-12-27 2014-12-03 江南大学 一种热稳定性提高的谷氨酰胺转氨酶及其应用
EP3610028A1 (en) 2017-04-14 2020-02-19 Capsugel Belgium NV Process for making pullulan
US11576870B2 (en) 2017-04-14 2023-02-14 Capsugel Belgium Nv Pullulan capsules

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0311469A3 (en) * 1987-09-02 1990-05-30 Plant Genetic Systems N.V. Transformed lactic acid bacteria
PL189090B1 (pl) * 1998-05-29 2005-06-30 Pan Nowy plazmid oraz sposób jego wytwarzania

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003008587A2 (en) 2003-01-30
DE60226608D1 (de) 2008-06-26
US7417135B2 (en) 2008-08-26
US20050064574A1 (en) 2005-03-24
EP1409689B1 (en) 2008-05-14
PL348789A1 (en) 2003-01-27
WO2003008587A8 (en) 2004-06-03
AU2002345451A1 (en) 2003-03-03
EP1409689A2 (en) 2004-04-21
ES2306772T3 (es) 2008-11-16
WO2003008587A3 (en) 2004-02-12
ATE395421T1 (de) 2008-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7803598B2 (en) Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) polypeptides with modified hydrolysis activity
KR101286991B1 (ko) 엑소-특이성 아밀라아제 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를코딩하는 핵산 및 그의 용도
US5731174A (en) Process for the saccharification of starch
Roy et al. Cloning and overexpression of raw starch digesting α-amylase gene from Bacillus subtilis strain AS01a in Escherichia coli and application of the purified recombinant α-amylase (AmyBS-I) in raw starch digestion and baking industry
KR20180069057A (ko) 향상된 단백질 발현 및 이의 방법
CA2452029A1 (en) A group of .alpha.-amylases and a method for identification and production of .alpha.-amylases
Allala et al. Purification, biochemical, and molecular characterization of a novel extracellular thermostable and alkaline α-amylase from Tepidimonas fonticaldi strain HB23
CN111471666A (zh) 比活及热稳定性提高的葡萄糖淀粉酶突变体ga3及其基因和应用
Shanmughapriya et al. Optimization, production, and partial characterization of an alkalophilic amylase produced by sponge associated marine bacterium Halobacterium salinarum MMD047
CN110423737B (zh) 来源于嗜热脂肪土芽孢杆菌的耐热型α-淀粉酶及其应用
Van den Broek et al. Cloning and characterization of two α-glucosidases from Bifidobacterium adolescentis DSM20083
Liiv et al. Cloning of maltase gene from a methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha
Yamashita Starch-processing enzymes produced by recombinant yeasts and fungi
PL194475B1 (pl) Gen plazmidowy, sposób otrzymywania tego genu, kodowany przez ten gen enzym amylolityczny, oraz jego zastosowanie
Miao et al. Enhanced extracellular expression of α-Amylase DL3-4-1 in Bacillus subtilis via systematic screening of optimal signal peptides
US6300115B1 (en) Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences
Unal Production of α-amylase from some thermophilic Aspergillus species and optimization of its culture medium and enzyme activity
US8679814B2 (en) Protein and DNA sequence encoding a cold adapted xylanase
Manohar et al. Enhanced amylolytic activity of intracellular α-amylase produced by Bacillus tequilensis
Saburi et al. A thermophilic alkalophilic α-amylase from Bacillus sp. AAH-31 shows a novel domain organization among glycoside hydrolase family 13 enzymes
Wasko et al. A New Protein of ${\alpha} $-Amylase Activity from Lactococcus lactis
Aygan et al. Production and characterization of alkaliphilic alpha-amylase from Bacillus subtilis A10 isolated from soils of Kahramanmaras, Turkey
CN108913677B (zh) 一种定点突变改造的碱性普鲁兰酶及其应用
US6506592B1 (en) Hyperthermophilic alpha-glucosidase gene and its use
Jeong et al. Cloning and Sequencing of the ${\beta}-Amylase $ Gene from Paenibacillus sp. and Its Expression in Saccharomyces cerevisiae