ES2306772T3 - Un gen de lactococcus, la enzima amilolitica codificada por este, y su aplicacion. - Google Patents
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Abstract
Un gen plasmídico, que codifica una nueva enzima amilolítica segregada hacia el entorno, con la siguiente secuencia de nucleótidos: (Ver fórmula)
Description
Un gen de Lactococcus, la enzima
amilolítica codificada por éste, y su aplicación.
El objeto de la invención es un nuevo gen
plasmídico que codifica una enzima amilolítica que, después de su
introducción en una cepa microbiana, de manera favorable bacteriana,
en especial Lactococcus lactis, permite la producción de la
enzima amilolítica codificada, así como maneras de obtener este gen
y la aplicación industrial de la enzima que es codificada por
él.
Las bacterias de ácido láctico son capaces de
utilizar muchos azúcares diferentes como fuente de carbono y
energía (De Vos, W., 1996, Antonie van Leeuwnhoek, 70:223). La
significativa mayoría de estos azúcares son monosacáridos o
disacáridos. La capacidad de las bacterias de ácido láctico para
catabolizar carbohidratos se emplea ampliamente en procesos
biotecnológicos relacionados con la producción de alimentos
(Libudzisz, Z., Walczak, P. y Bardowski, J. (ed.), 1998, Bacterias
de ácido láctico - clasificación, metabolismo, genética, aplicación
(en polaco), Monografías, Lódz'; Aleksandrzak, T., Kowalczyk, M.,
Kok, J., Bardowski, J., 2000, Food Biotechnol., 17:61, Elsevier
Science B.V., Ámsterdam). Uno de estos procesos es la producción de
productos de leche fermentada. El azúcar principal en la leche es
la lactosa, cuyo catabolismo es una característica bastante común
presente en las bacterias de ácido láctico (Bardowski, J., 1995,
Przeglad Mleczarski, 11:315; VanRooijen, R.J., 1992, Lactose
catabolism in Lactococcus lactis, tesis doctoral, Wageningen,
Países Bajos).
Otra fuente natural, además de la leche, de
producción de alimentos son las plantas. Estos procesos
biotecnológicos se realizan, con frecuencia, con el uso de
bacterias de ácido láctico. Sin embargo, en el material vegetal, de
manera diferente a la leche, están presentes polisacáridos, tales
como celobiosa o almidón. Por tanto, en la conversión microbiana
del material vegetal, se incorporan microbios que tienen capacidades
celulolíticas o amilolíticas. Las bacterias lácticas carecen de la
capacidad para degradar la celulosa.
Sin embargo, la capacidad de degradar la
celulosa es, en este grupo de bacterias, una característica limitada
básicamente a unas pocas cepas del género Lactobacillus
(cit. por Giraud, E., A. Chapailler y M. Raimbault, 1994, Appl.
Environ. Microbiol., 60:4319). Algunas de estas bacterias, que
pertenecen a las especies L. plantarum, L. amylophilus o
L. amylovorus, producen \alpha-amilasa
(Fitzsimons, A. y O'Connell, 1994, FEMS Microbiol. Letts., 116:137;
Pompeyo, C.C., Gómez, M.S., Gasparian, S., J.
Morlon-Guyot, 1993, Appl. Microbiol. Biotechnol.,
40:266).
Se ha determinado que, además de las cepas del
género Lactobacillus, algunas cepas del género
Lactococcus, que aparecen de forma natural en el entorno,
también demuestran esta capacidad, puesto que se encuentran cepas
que degradan el almidón entre cepas de Lactococcus aisladas a
partir de hábitats naturales (Doman', M., E. Czerniec, Z.
Targon'ski y J. Bardowski (2000), Food Biotechnology, 17:67,
Elsevier Science B.V., Ámsterdam).
De forma inesperada, se ha descubierto que
también otras cepas, en especial de especies de Lactococcus
lactis, después de introducir una estructura génica específica
según la invención, son capaces de producir una nueva enzima
amilolítica que es codificada por este gen y que se segrega hacia el
entorno.
El nuevo gen plasmídico que codifica la nueva
enzima amilolítica que se segrega hacia el entorno, según la
invención, tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
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El nuevo gen según la invención tiene, de manera
favorable, en su extremo 5' terminal, otra secuencia de nucleótidos
que, juntas, proporcionan la siguiente estructura de
nucleótidos:
Las formas para producir el nuevo gen plasmídico
que codifica la nueva enzima amilolítica que se segrega hacia el
entorno, según la invención, son las siguientes: el ADN plasmídico,
previamente aislado a partir de la cepa bacteriana que pertenece,
de manera favorable, al género Lactococcus, que codifica la
enzima amilolítica, se digiere con enzimas de restricción, de
manera favorable EcoRI, SacII, SalI,
SmaI, SpeI, XhoI o XbaI.
Posteriormente, el fragmento roto, de manera favorable con un tamaño
no menor que 3,0 kb, se acopla con un plásmido capaz de replicarse
en células bacterianas, de manera favorable del género
Lactococcus, en especial pIL253, pGKV210 o pIL252, también
digerido previamente con enzimas de restricción, de manera favorable
EcoRI, SalI o SmaI, después de lo cual los dos
fragmentos de ADN se recombinan entre sí y se introducen mediante
electroporación en las células bacterianas, que se cultivan de una
manera conocida y, a partir de la población cultivada, las células
que poseen el nuevo gen que codifica la nueva enzima amilolítica se
aislan de una manera conocida.
En el procedimiento según la invención, las
cepas bacterianas en las que se introduce el ADN recombinante que
se emplean de manera favorable son Lactococcus lactis MG1363,
Lactococcus lactis IL1403 o Lactococcus lactis
IBB140.
En el procedimiento según la invención, las
colonias que producen la enzima amilolítica y que portan el nuevo
gen se separan positivamente mediante inoculación en un medio
líquido fresco con antibióticos y almidón si resulta necesario.
\newpage
La nueva enzima segregada hacia el entorno,
codificada por el nuevo gen plasmídico según la invención, tiene la
siguiente estructura de aminoácidos:
Esta enzima muestra un conjunto exclusivo de
características ventajosas, en especial muestra una actividad en un
amplio intervalo de pH ácido, desde 3,5 a 5,5, como se muestra en la
gráfica (figura 1), estando su óptimo a pH 4,4. Al mismo tiempo, la
temperatura óptima de la actividad enzimática está en el intervalo
de 35ºC-45ºC, como se muestra en la gráfica (figura
2), y se inactiva térmicamente a una temperatura mayor que 50ºC,
como se muestra en la gráfica (figura 3), estando su óptimo a pH
4,4. Al mismo tiempo, la temperatura óptima de la actividad
enzimática está en el intervalo de 35ºC-45ºC, como
se muestra en la gráfica (figura 2), y se inactiva térmicamente a
una temperatura mayor que 50ºC, como se muestra en la gráfica
(figura 3).
La aplicación de la enzima amilolítica
codificada por el nuevo gen según la invención en la fermentación de
material vegetal, de manera favorable almidón, pululano, amilosa,
amilopectina, producción de productos alimentarios, obtención de
glucosa, ácido láctico y la producción de especímenes probióticos,
alimentos que contienen probióticos, productos alimentarios y
piensos, según la invención, se basa en el hecho de que su gen se
introduce en la estructura de la cepa bacteriana, de manera
favorable las cepas de Lactococcus lactis IBB500, IBB501,
IBB502, IBB140, y posterior-
mente se aplican las cepas obtenidas a fermentaciones de material vegetal o leche, o a la producción de biomasa.
mente se aplican las cepas obtenidas a fermentaciones de material vegetal o leche, o a la producción de biomasa.
El gen según la invención se ha secuenciado, y
la secuencia obtenida indica que pertenece a la familia de los
genes que codifican pululanasa. El análisis de la región promotora
del gen, así como los estudios funcionales, sugieren que la
expresión de este gen sufre una represión catabólica.
A partir de la comparación de características de
las pululanasas de las cepas de L. lactis IBB500 e IBB502
estudiadas, puede concluirse que se está tratando con una enzima
producida en dos organismos. La pululanasa que se obtiene de ambas
cepas tiene un pH óptimo de 4,4 y alcanza la temperatura óptima a
45ºC (figuras 1, 2).
Debe advertirse el intervalo de pH bastante
estrecho de la actividad enzimática, entre pH
3,5-5,5, así como el hecho de que es
significativamente menor que el de las pululanasas derivadas de
otras bacterias (Ara, K., Igarashi, K., Saeki, K., Kawai, S., y S.
Ito, 1992, Biosci. Biotech. Biochem., 56:62; Kim, Ch., Nashiru, O.,
J. Ko, 1996, FEMS Microbiology Letters, 138:147; Takasaki, Y., 1987,
Agric. Biol. Chem., 51:9).
La enzima obtenida con la ayuda del nuevo gen
según la invención muestra homología con enzimas amilolíticas del
grupo de la pululanasa, y la mayor homología se ha encontrado con la
pululanasa de Termotoga maritima. En la secuencia de
aminoácidos de la pululanasa de L. lactis IBB500 se
identificaron cuatro motivos conservados, característicos de muchas
enzimas amilolíticas. La secuencia de aminoácidos del gen pul
está precedida de un RBS típico para Lactococcus, en frente
del cual se identificó una región no codificadora con una longitud
de 500 nucleótidos.
El análisis a fondo de la región no codificadora
cadena arriba del gen pul muestra la presencia de varias
secuencias promotoras putativas. Debido a las observaciones
anteriores del efecto de la glucosa sobre la producción de
pululanasa, a partir de las cuales se concluyó que la expresión del
gen pul puede regularse mediante represión catabólica, la
región promotora se analizó para la presencia del motivo cre,
característico de este mecanismo de regulación (Weickert, M.J. y S.
Adhya, 1992, J. Biol. Chem., 267:15869). Se determinó que la
secuencia homóloga con la secuencia cre de 14 nucleótidos
está presente en la región promotora analizada. Esta observación
apoya en gran medida las hipótesis realizadas con anterioridad. Otro
argumento para la validez de esta hipótesis se adquirió durante los
experimentos sobre la influencia de la glucosa, así como del
almidón y sus derivados, sobre la producción de pululanasa en la
cepa IBB500. En el proceso se determinó que el almidón y sus
derivados inducen la producción de pululanasa aunque a diferentes
niveles, mientras que en presencia de glucosa se observó la
represión de la producción de esta enzima (Doman, M., E. Czerniec,
Z. Targonski y J. Bardowski, 2000, Food Biotechnology, 17:67,
Elsevier Science B.V., Ámsterdam).
A continuación se presentan los ejemplos de
realizaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados
en estos estudios se muestran en la tabla 1. Las cepas de
Lactococcus lactis se cultivaron en medio BHI (Oxoid, Reino
Unido) a la temperatura de 28ºC, y Escherichia coli en medio
Luria-Bertani (LB) a la temperatura de 37ºC. Cuando
fueron necesarios para la selección se emplearon los siguientes
antibióticos: eritromicina - 5 \mug/ml para L. lactis, y
ampicilina - 100 \mug/ml para E. coli.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN plasmídico a partir de la cepa
bacteriana de Lactococcus lactis IBB500 que codifica la
enzima amilolítica. Posteriormente se digirió con la enzima de
restricción EcoRI, después el fragmento roto, no menor que
8,0 kb, se acopló a un plásmido capaz de replicarse en las células
bacterianas de Lactococcus, pIL253, digerido previamente
también con la enzima de restricción EcoRI. Ambos ADN se
recombinaron entre sí y se introdujeron mediante el procedimiento
de electroporación en células de Lactococcus lactis, que se
cultivaron y, a partir de la población cultivada, se aislaron las
células que portaban el nuevo gen de la estructura según la
invención mediante inoculación en un medio líquido fresco con
antibiótico y almidón.
Se transformaron células de L. lactis
mediante un procedimiento de electroporación (Holo, H. e I.F. Nes,
1989, Appl. Environ. Microbiol., 55:3119).
El resto de las técnicas de biología molecular
utilizadas en el ejemplo se realizaron según la metodología
convencional (Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989,
Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ADN plasmídico a partir de la cepa
bacteriana de Lactococcus lactis IBB500 que codifica la
enzima amilolítica. Posteriormente se digirió con la enzima de
restricción XhoI, el fragmento roto, no menor que 5,0 kb, se
acopló a un plásmido capaz de replicarse en las células bacterianas
de Lactococcus, pIL253, digerido previamente también con la
enzima de restricción XhoI. Después, ambos ADN se
recombinaron entre sí y se introdujeron mediante el procedimiento
de electroporación en células de Lactococcus lactis, que se
cultivaron y, a partir de la población cultivada, se seleccionaron
las células que portaban el nuevo gen de la estructura según la
invención mediante inoculación en un medio líquido fresco con
antibiótico y almidón.
Se transformaron células de L. lactis
mediante un procedimiento de electroporación (Holo, H. e I.F. Nes,
1989, Appl. Environ. Microbiol., 55:3119).
El resto de las técnicas de biología molecular
utilizadas en el ejemplo se realizaron según la metodología
convencional (Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989,
Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
\vskip1.000000\baselineskip
La estructura de la secuencia de nucleótidos del
nuevo gen y la secuencia de aminoácidos de la enzima amilolítica
codificada por este gen según la invención se determinaron
secuenciando un fragmento PstI de 1,5 kb del plásmido
pIBB502, que porta parte del nuevo gen, que se había clonado
previamente en el plásmido pBluescript (Stratagene), lo cual generó
el plásmido pIBB504. Este plásmido se empleó para secuenciar el
fragmento clonado desde ambos lados. La transformación de células
de E. coli se realizó según el procedimiento convencional
con el uso de CaCl_{2} (Sambrook, J., E.F. Fritsch y T. Maniatis,
1989, Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
La secuencia de nucleótidos completa del
fragmento y de la parte que falta del nuevo gen que codifica la
enzima amilolítica se obtuvieron utilizando el procedimiento de
secuenciación denominado "paseo con cebador". Para la
secuenciación del ADN se utilizó el equipo BigDye Terminator
(Promega, EEUU), la máquina de PCR modelo 2400
(Perkin-Elmer), y el secuenciador ABI377 (Applied
Biosystem, EEUU). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos
obtenidas se analizaron utilizando los programas informáticos GCG
(Genetics Computer Group, 1991, manual del programa para el paquete
informático GCG, versión 7, abril 1991, Genetic Computer Group,
Madison, Wisconsin, EEUU) y BLAST (Altschul, S.F., W. Gish, W.
Miller, E.W. Myers y D.J. Lipman (1990), J. Mol. Biol.,
215:403).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la actividad amilolítica se
aplicaron dos ensayos: cuantitativo y cualitativo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron en placas cepas bacterianas sobre
BHI con almidón al 0,5% y se incubaron durante 28ºC durante dos
días. Posteriormente, las colonias cultivadas fueron cubiertas con
reactivo de lugol, que tiñe el almidón no degradado de un color
azul oscuro. Una zona clara de medio no coloreado rodeó a las
colonias que segregaban la enzima amilolítica hacia el entorno. De
esta manera se demostró que dichas cepas producen y segregan la
enzima amilolítica.
\vskip1.000000\baselineskip
En este ensayo se utilizó un procedimiento
modificado para determinar la actividad de la amilasa extracelular
(Nicholson, W. y P. Setlow, 1990, Sporulation, germination and
outgrowth, p. 433, W.C.R. Harwood y S.M. Cutting (eds.), Molecular
Biology for Bacillus, John Wiley and Sons Ltd., Chichester, Reino
Unido).
En este procedimiento se determinó la actividad
enzimática en el sobrenadante del cultivo: a 200 \mul de este
sobrenadante se le añadieron 800 \mul del sustrato (almidón al
0,025% en Tris-HCl 10 mM, acetato de potasio 3 mM,
CaCl_{2} 25 mM, pH 4,4) y se incubó durante 30 min a 37ºC. La
reacción se detuvo mediante la adición de 400 \mul de reactivo de
lugol, y la absorción se midió a una longitud de onda de 620 nm
[A_{620}]. Como control se empleó un medio no inoculado.
Se estableció una unidad de actividad
amilolítica (1U) como la cantidad de enzima que, en las condiciones
del ensayo, genera una disminución en la absorción A_{620} del
sustrato de 0,1, comparado con el control.
Claims (6)
1. Un gen plasmídico, que codifica una nueva
enzima amilolítica segregada hacia el entorno, con la siguiente
secuencia de nucleótidos:
2. El gen según la reivindicación 1, que se
caracteriza por el hecho de que su extremo 5' tiene una
secuencia de nucleótidos adicional con la siguiente estructura de
nucleótidos global:
3. Procedimientos para producir el gen
plasmídico según la reivindicación 1, que se caracterizan por
el hecho de al que el ADN del plásmido, previamente aislado a
partir de una cepa bacteriana que codifica la enzima amilolítica,
de manera favorable de una cepa de Lactococcus, se digiere
con una enzima de restricción, de manera favorable EcoRI,
SacII, SalI, SmaI, SpeI, XhoI o
XbaI. Posteriormente, el fragmento roto, de manera favorable
con un tamaño no menor que 3,0 kb, se acopla con un plásmido capaz
de replicarse en células bacterianas, de manera favorable del género
Lactococcus, en especial pIL253, pGKV210 o pIL252, también
digerido previamente con enzimas de restricción, de manera favorable
EcoRI, SacII, SalI, SmaI, SpeI,
XhoI o XbaI. Después los dos fragmentos de ADN se
recombinan entre sí y se introducen mediante electroporación en las
células bacterianas, que se cultivan de una manera conocida y, a
partir de la población cultivada, las células que portan el nuevo
gen y que producen la nueva enzima amilolítica se aislan de una
manera conocida.
4. Procedimientos según la reivindicación 3, que
se caracterizan por el hecho de que las colonias que producen
la enzima amilolítica y que portan el nuevo gen se aislan mediante
inoculación en medio líquido fresco suplementado con antibióticos
y, si es necesario, con almidón.
5. La enzima que se segrega hacia el entorno,
que se caracteriza por el hecho de que muestra actividad en
un amplio intervalo de pH ácido, de 3,5 a 5,5, con un óptimo a pH
4,4, y que muestra un óptimo de actividad en el intervalo de
temperaturas de 35ºC-45ºC y que se inactiva
térmicamente a una temperatura mayor que 50ºC, codificada por el
nuevo gen plasmídico y que tiene la siguiente estructura de
aminoácidos:
6. La aplicación de la enzima amilolítica según
la reivindicación 5, codificada por el gen, en la fermentación de
material vegetal, de manera favorable almidón, pululano, amilosa,
amilopectina, producción de productos alimentarios, obtención de
glucosa, ácido láctico y la producción de especimenes probióticos,
alimentos que contienen probióticos, productos alimentarios y
piensos, que se caracteriza por el hecho de que su gen se
introduce en la estructura de la cepa bacteriana, de manera
favorable cepas de Lactococcus lactis, y posteriormente se
aplican las cepas bacterianas obtenidas a fermentaciones de material
vegetal o leche, o a la producción de biomasa.
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