PL189090B1 - Nowy plazmid oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Abstract

1. Nowy plazmid pIBB501, znamien- ny tym, ze stanowi go plazmid pIL253 za- wierajacy wstawke okolo 20 kb plazmidu pIBB500. 2. Sposób wytwarzania plazmidu pIBB501, znamienny tym, ze otrzymany w wyniku trawienia 30 kb plazmidu pIBB500 enzymem restrykcyjnym EcoRI, fragment 20 kb laczy sie z plazmidem pIL253 trawionym uprzednio równiez en- zymem restrykcyjnym EcoRI, po czym mie- szanine liguje sie i wprowadza metoda elek- troporacji do komórek Lactococcus lactis, korzystnie Lactococcus lactis MG 1363 lub Lactococcus lactis IL 1403, które hoduje sie w znany sposób, a nastepnie przesiewa sie kolonie wytwarzajace enzym amylolityczny i zawierajace plazmid pIBB501 na swieza pozywke plynna zawierajaca antybiotyk i ewentualnie skrobie. fig . 1 PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy plazmid kodujący enzym amylolityczny, zawierający odpowiednią wstawkę oraz sposób jego wytwarzania.

Bakterie mlekowe charakteryzują się zdolnością do przekształcania ogromnej ilości substratów w procesie fermentacji produktów spożywczych. To ścisłe ukierunkowanie kataboliczne jest spowodowane głównie beztlenowymi warunkami wzrostu, wymuszającymi mało wydajne pozyskiwanie energii gdy cukier jest jednocześnie donorem i akceptorem elektronów, zaś produktami: kwas mlekowy, octan, etanol i dwutlenek węgla.

Z powodu ogromnej ilości molekuł, które mogą być metabolizowane przez bakterie fermentacji mlekowej, większość gatunków czy szczepów posiada zdolność do wykorzystywania tylko ściśle określonych substratów jako źródła węgla i energii. W większości przypadków są to mono- czy disacharydy, co jest wyrazem adaptacji do mlecznego środowiska życia przez gatunki bytujące w mleku (de Vos, W.M.. 1996).

Większość cukrów wchodzi w cykl metaboliczny poprzez glukozo-6-fosforan, po czym ich katabolizm przebiega klasyczną glikolizą (szlak Embdena-Meyerhofa-Pamasa), prowadzącą do wytworzenia pirogronianu z zyskiem netto 2 cząsteczek ATP na 1 cząsteczkę zużytego monosacharydu (Cocaign-Bousquet, M. i wsp., 1996).

Podstawowym substratem fermentacyjnym zużywanym przez bakterie rozwijające się w mleku jest laktoza (β-D-galaktopiranozylo a-D-glukoza). Ten disacharyd jest transportowany do komórki, albo za pomocą systemu PTS, albo przy udziale permeazy zlokalizowanej

189 090 w błonie. Wewnątrz komórki laktoza transportowana parmeazą jest hydrolizowana przez βgalaktozydazę do glukozy i galaktozy. Glukoza jest włączana do szlaku glikolitycznego bezpośrednio, natomiast galaktoza po przemianie do glukozo-1-fosforanu w cyklu Leloira. Laktoza ufosforylowana podczas translokacji do wnętrza komórki systemem PTS hydrolizowana jest przez fosfo^-D-galaktozydazę do glukozy i galaktozo-6-fosforanu. Glukoza bezpośrednio, a galaktozo-6-fosforan po przemianach w cyklu tagatozowym do fosfohydroksyacetonu i aldehydu 3-fosfoglicerynowego podlegają rozkładowi w cyklu glikolizy (De Vos, W.M., 1996).

Fruktoza jest włączana do glikolizy na etapie fruktozo-1,6-difosforanu, podczas gdy przemiany biochemiczne wolnej galaktozy zależą od jej sposobu transportu do wnętrza komórki, analogicznie jak galaktozy pochodzącej z wewnątrzkomórkowej hydrolizy laktozy (Poolman, B.1993).

Inne główne szlaki fermentacyjne u bakterii mlekowych, to obok wspomnianej wcześniej glikolizy (homofermentacja), cykl fosfoketołazowy (heterofermentacja) i fermentacja u Bifidobacterium.

Proces heterofermentacji, będący odmianą cyklu pentozowego w pierwszym etapie prowadzi do uzyskania aldehydu 3-fosfoglicerynowego i acetylofosforanu. Produktami końcowymi są kwas mlekowy, etanol i CO2. Proces ten przeprowadzają niektóre bakterie mlekowe, np. Lactobacills plantarum, L. brevis, L. fermentum, Leuconostoc mesenteroides. Heterofermentacja jest energetycznie mniej wydajna niż homofermentacja, dostarczając tylko 1 mol ATP na 1 mol zużytej glukozy. (Cocaign-Bousąuet, M. i wsp., 1996).

Pałeczka jelitowa Bifidobacterium bifidum przeprowadza fermentację poprzez specyficzny szlak metaboliczny prowadzący do powstania równoważnych ilości kwasu mlekowego i octowego. Wydajność energetyczna tego procesu jest nieco większa niż homo fermentacji mlekowej, gdyż pewne ilości ATP powstają przy wytwarzaniu kwasu octowego (KunickiGoldfinger, W., 1994).

Reakcje metaboliczne którymi przebiega dany rodzaj fermentacji mogą się znacznie różnić między sobą, zależąc od gatunku bakterii, warunków fermentacji i rodzaju substratów. W naturze bardzo często przebiegają w tym samym środowisku liczne fermentacje, wykorzystujące różne substraty i wytwarzające różne, odmienne produkty końcowe.

Zdolność degradacji skrobi przez bakterie mlekowe jest zjawiskiem rzadkim. Poznane do tej pory szczepy wytwarzające α amylazę to: Lactobacillus plantarum, L. cellobiosus, L. amylovorus, L. acidophilus, L. amylophilus i L. casei. Wymienione szczepy bytują w materiale fermentacyjnym zawierającym w stanie surowym skrobię, która pod wpływem enzymów amylolitycznych zostaje rozłożona do cukrów prostych. Sacharydy powstałe w wyniku tego procesu stają następnie dostępne dla pozostałych bakterii przeprowadzających fermentację, co jest warunkiem uzyskania odpowiedniej kwasowości, a co za tym idzie dobrej jakości finalnego produktu (Fitzsimons A. i O'Connell M., 1994).

Uważa się, że naturalną niszą ekologiczną bakterii z rodzaju Lactococcus są rośliny, natomiast zasiedlenie mlecznego środowiska nastąpiło wtórnie w procesie ewolucji (Teuber, M., 1993). Z uwagi na to, że głównym cukrem zapasowym w roślinach jest skrobia, można się spodziewać, że wśród dzikich szczepów Lactococcus lactis izolowanych z naturalnego środowiska powinny występować takie, które wytwarzają enzymy hydrolizujące skrobię. W dotychczasowym piśmiennictwie naukowym brak jest jednak danych na ten temat. Co więcej przyjmuje się jak dotąd, że bakterie te nie mają zdolności amylolitycznych. (Bergey, 1986). Ostatnio jednak uzyskano wyniki, które świadczą, że w populacji dzikich szczepów bakterii z rodzaju Lactococcus występują takie, które są zdolne do degradacji skrobi.

Skrobia, obok celulozy, jest najobficiej występującym źródłem węgla w przyrodzie, dostępnym jednak tylko dla organizmów zdolnych do degradacji tego polisacharydu. Enzymy amylolityczne produkują zarówno zwierzęta, rośliny jak i mikroorganizmy. Różnorodność właściwości biochemicznych amylaz odzwierciedla zmienność naturalnych warunków w których mogą być przeprowadzane reakcje hydrolizy.

Komponentami skrobi są: amyloza i amylopektyna - polimery złożone z glukozy połączonej wiązaniami a(l-4), tworzące rozgałęzienia poprzez wiązania a(l-6) glukozydowe. Cząsteczka amylopektyny jest silnie rozgałęziona (średnio co 30 reszt glukozowych), w prze4

189 090 ciwieństwie do liniowej cząsteczki amylozy o średniej długości ok. 1000 reszt glukozowych. Budowa skrobi (długość polimerów, ilość rozgałęzień, procentowy udział amylozy w stosunku do amylopektyny) zależy od pochodzenia rośliny z której została wyizolowana. Pełna degradacja skrobi wymaga zwykle kooperacji kilku rodzajów enzymów amylolitycznych. Ogólnie ich działanie można podzielić na dwie kategorie: endoenzymy przecinają w przypadkowy sposób wiązania glikozydowe wewnątrz cząsteczki skrobi, podczas gdy egzoenzymy hydrolizują wiązania od nieredukującego końca cząsteczki cukru.

Najbardziej rozpowszechniony u mikroorganizmów typ enzymu amylolitycznego stanowią α-amylazy, będące endoenzymami, hydrolizujące wiązania α(1-4) glikozydowe oraz z mniejszą wydajnością wiązania rozgałęzień α(1-6) glizydowe. Produktem działania α-amylaz są dekstryny o różnej długości. β-Amylazy są egzoenzymami produkującymi maltozę, w wyniku przecinania wiązań a(l-4) glikozydowych od nieredukującego końca. Ten typ enzymu nie hydrolizuje wiązań a(l-6) glikozydowych, przez co po trawieniu nim skrobi zawsze zostaje pewna ilość dekstryn. Produktem działania glukozamylaz, hydrolizujących zarówno wiązania α(1-4), jak i α(1-6) glikozydowe, jest glukoza. Izoamylazy i pullulanazy, zwane enzymami rozgałęzień, hydrolizują wyłącznie wiązania α(1-6) glikozydowe. Te dwa enzymy różnią się zdolnością do rozkładania pullulanu, polisacharydu złożonego z maltoz, połączonych wiązaniem α(1-6) glikozydowym. Tylko pullulanazy mogą degradować ten α-glukan. α-Glukozydazy - hydrolizują wiązania α(1-4) i α(1-6) glikozydowe, lecz zazwyczaj po wstępnej degradacji skrobi przez inne enzymy amylolityczne. Interesującą, grupę enzymów amylolitycznych stanowią cyklodekstrynazy, których produktami są cykliczne endoprodukty (Vihinen, M., i Mantsala P., 1989: Ferrari, E. i wsp., 1993).

Skrobia zawarta w podłożu nie może wnikać do komórek bakterii, dlatego enzymy amylolityczne przez nie produkowane są najczęściej wydzielane do środowiska, aczkolwiek zdarzają się także wewnątrzkomórkowe czy związane z błoną komórkową.

Właściwości fizykochemiczne amylaz są różnorodne i najczęściej odzwierciedlają warunki środowiska w którym dany organizm żyje.

Masę molekularną tych enzymów cechuje duża rozpiętość (10 do 129 kD), najczęściej wynosi 50-60 kD, przy czym zdarzają się cząsteczki zarówno dimeryczne jak i tetrameryczne. Amylazy są najczęściej metaloenzymami wymagającymi jonów wapnia, który umożliwia utrzymanie prawidłowej struktury przestrzennej cząsteczki. Optimum temperaturowe działania amylaż waha się od 25 do 1O0°C, natomiast optimum pH może wynosić od 2-11. Parametry te dla konkretnych enzymów mogą ulegać zmianie w zależności od obecności pewnych substancji w podłożu, zwłaszcza wapnia.

Do inhibitorów działania tych enzymów zalicza się najczęściej jony metali ciężkich, grupy sulhydrylowe oraz EDTA (Vihinen, M., i Mantsala P., 1989).

Najbardziej zaawansowane badania genetyczne enzymów amylolitycznych dotyczą aamylazy w Bacillus subtilis. Gen struktury amyE kodujący ten enzym leży na chromosomie w regionie 25°. Wiadomo ponadto, że produkt genu amyR, leżący bezpośrednio obok genu kodującego amylazę (amyE), pełni funkcje regulatorowe wzmagając produkcję α-amylazy (Nicholson, W., 1987). Poza tym produkty wielu innych genów, np. związanych z tworzeniem przetrwalników (sacU), filamentacją (pop) czy opornością na antybiotyki (tmrA7) mają wpływ stymulujący na produkcję α-amylazy, przy czym mogą one działać w sposób synergistyczny. (Vihinen, M..i wsp., 1989). Mechanizmy tych oddziaływań ciągle nie są do końca wyjaśnione. α-Amylazy produkowane są najczęściej w stacjonarnej fazie hodowli, a ich produkcja może być kontrolowana przez różne mechanizmy regulacyjne, takie jak: czasowa aktywacja, represja kataboliczna czy indukcja (Ferrari, E. i wsp, 1993). Ilość wyprodukowanych cząsteczek aamylazy w większości poznanych przypadków jest skorelowana z ilością mRNA, co sugeruje, że regulacja zachodzi na poziomie transkrypcji. Geny kodujące α-amylazy z różnych organizmów m.in. z A. hydrophila, Bacillus sp., B. amyloliąuefaciens, B. licheniformis, B. megaterium, B. stearothermophilus, B. subtilis zostały zsekwencjonowane, co pozwoliło w każdym z nich zidentyfikować obszar promotorowy z typowymi regionami -35 i -10 oraz sekwencję kodującą peptyd sygnałowy o dł. 77-123 nukleotydów. Analiza sekwencji wykazała, że blisko spokrewnione gatunki B. subtilis nie zawsze posiadają α-amylazy wykazujące duże podobieństwo na poziomie sekwencji aminokwasowej. Dla przykładu gatunki Bacillus amyloliguefa189 090 ciens, B. licheniformis, B. meganterium i B. subtilis tworzą wspólną grupę pod względem klasyfikacyjnym, jednakże tylko sekwencje aminokwasowe α-amylaz z B. amyloliąuefaciens i B. licheniformis wykazują znaczne podobieństwo. Wydaje się więc, że pierwotnie mikroorganizmy posiadały jeden gen kodujący endoamylazę. Od momentu kiedy rośliny zaczęły wykorzystywać skrobię jako materiał zapasowy, pierwotny gen kodujący endoamylazę zaczął ewoluować do teraźniejszych form (α-amylaz, izoamylaz, pullulanaz, czy mieszanych aktywności) w zależności od środowiska, w którym żyły bakterie wykorzystujące roślinną skrobię.

Ponadto w otrzymanych sekwencjach aminokwasowych a-amylaz zidentyfikowano trzy konserwowane obszary: region 1 (DVVINH). region 2 (GFRLDAAKH) i region 4 (FVDNHD). Są one odpowiedzialne, kolejno, za: przyłączanie substratu, katalizę i wiązanie wapnia. Istnienie konserwowanego regionu 3 jest sporne, gdyż nie w każdej sekwencji α-amylazy, udaje się go zidentyfikować. Stałe obszary 1, 2 i 4 identyfikuje się także w sekwencjach innych niż αamylaza endoenzymów, takich jak: pullulanaza i izoamylaza (Nakajima, R. i wsp., 1986: Janse, B. i wsp., 1993: Amemura, A., i wsp., 1988).

Wiele genów kodujących α-amylazę, a także promotorów, elementów regulacyjnych udało się przeklonować do innych bakterii lub drożdży za pomocą wektorów fagowych bądź plazmidowych. Niektóre skonstruowane wektory wykazywały niską stabilność, co może być spowodowane zaburzeniem w partycji albo rearanżacjami w DNA. Większość sklonowanych genów ulega ekspresji z własnych promotorów, szczególnie w E. coli lub B. subtilis. W gospodarzach: Bacillus, Pseudomonas i Staphylococcus α-amylaza jest wydzielana do środowiska, w E. coli najczęściej dochodzi do sekrecji enzymu do przestrzeni peryplazmatycznej, zaś jego produkcję na zewnątrz udaje się uzyskać dopiero w warunkach nadekspresji białka (Suominen, I. i wsp., 1987).

α-Amylaza była jednym z pierwszych białek wykorzystanych na potrzeby biologii molekularnej za względu na możliwość łatwego wykrywania jej aktywności. (Vihinen, M., 1989). Szczepy zdolne do degradacji skrobi można zidentyfikować przy użyciu prostego testu płytkowego, który polega na zalaniu płynem Lugola (roztwór I₂ w KI) szczepów wyrosłych na podłożu stałym zawierającym skrobię. W wyniku takiego postępowania szczep amylolityczny otoczony jest strefą niewybarwionej, bo zdegradowanej skrobi, w odróżnieniu od szczepu nie degradującego skrobi, wokół którego podłoże zabarwia się na granatowo. Właściwość ta pozwoliła na zastosowanie genu kodującego amylazę jako czynnika reporterowego, umożliwiającego mierzenie siły promotorów i elementów regulujących· ekspresję genów lub sekrecję białek m.in. z B. subtilis, (Hols, P., 1992 : Sorokin, A. V i wsp., 1986)..

Korzystnym dla biotechnologii jest także częste wydzielanie tego enzymu w dużych ilościach na zewnątrz komórki pod wpływem czynnika indukującego, co stwarza możliwość konstruowania wektorów sekrecyjnych umożliwiających modyfikację genetyczną, przemysłowych szczepów np. laktokoków (Sumitomo, N., i wsp., 1995:Van Asseldonk, M., 1994).

Ponadto, tradycyjnie enzymy amylolityczne znajdują zastosowanie w przemyśle spożywczym, zwłaszcza do przekształcania skrobi w syrop o wysokiej zawartości fruktozy. Ze względu na wysoką temperaturę, panującą podczas tego procesu, do katalizy są zdolne jedynie amylazy pochodzące z dronoustrojów termofilnych. Dlatego szeroko wykorzystuje się α-amylazę z B. licheniformis posiadającą optimum temperaturowe w 90°C.

Enzymy amylolityczne zaczynają być wykorzystywane w produkcji proszków do prania, gdzie zastępuje się nimi alkaliczne proteazy, a także w browarach czy przy oczyszczaniu ścieków. Szczególnym zainteresowaniem badaczy cieszą się od niedawna enzymy amylolityczne wytwarzające cyklodekstryny. Ze względu na specyficzny kształt tych związków i obecność hydrofobowych rejonów wewnątrz molekuły, próbuje się je wykorzystywać jako kapsuły do przenoszenia i ochraniania pewnych związków wykorzystywanych przy produkcji kosmetyków, leków czy żywności (Ferrari, E i wsp., 1993).

Badania molekularne znacznie rozszerzają naszą wiedzę o enzymach amylolitycznych. Najczęściej poziom produkcji a także właściwości tych enzymów są dalekie od idealnych, z punktu widzenia procesu technologicznego. Niektóre z tych cech mogą być zmodyfikowane poprzez zastosowanie optymalnych komórek gospodarzy, wektorów sekrecyjnych lub ekspresyjnych czy ukierunkowanej mutagenezy. Poza tym poznanie molekularnych podstaw funkcjonowania enzymów amylolitycznych jest i może być przydatne do wyjaśnienia istoty takich

189 090 zagadnień jak: mechanizm regulacji ekspresji genów, sekrecji czy wzajemnych interakcji między białkami.

Uważa się, że naturalnym środowiskiem występowania, niszą ekologiczną, bakterii z rodzaju Lactococcus poza mlekiem są rośliny. W dotychczasowym piśmiennictwie naukowym brak było jednak jakichkolwiek danych o występowaniu laktokoków wytwarzających enzymy amylolityczne, a przez to zdolnych do wykorzystywania głównego materiału zapasowego roślin, jakim jest skrobia.

W wyniku przeprowadzonych badań, w populacji 30 dzikich szczepów z rodzaju Lactococcus znaleziono jeden - Lactococcus lactis IBB500, wytwarzający enzym amylolityczny degradujący skrobię, potwierdza to hipotezę środowiska roślinnego jako naturalnego ekosystemu bakterii z rodzaju Lactococcus.

Nieoczekiwanie, okazało się że sposobem według wynalazku, możliwe jest wytworzenie nowego plazmidu kodującego enzym amylolityczny. Plazmid według wynalazku po wprowadzeniu do odpowiedniego, hodowlanego szczepu bakterii pozwala na otrzymanie nowego szczepu produkującego amylazę.

Nowy plazmid plBB501, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi go plazmid pIL253 zawierający wstawkę około 20 kb z plazmidu pIBB500.

Sposób wytwarzania plazmidu pIBB501, według wynalazku polega na tym, że otrzymany w wyniku trawienia 30 kb plazmidu pIBB500 enzymem restrykcyjnym EcoRI, fragment 20 kb łączy się z plazmidem pIL253 trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym EcoRI, po czym mieszaninę liguje się i wprowadza metodą elektroporacji do komórek Lactococcus lactis, korzystnie Lactococcus lactis MG 1363 lub Lactococcus lactis IL 1403, które hoduje się w znany sposób, a następnie przesiewa się kolonie wytwarzające enzym amylolityczny i zawierające plazmid pIBB501 na świeżą pożywkę płynną zawierającą antybiotyk i ewentualnie skrobię.

Nowy plazmid pIBB502, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi go plazmid pIBB501 zawierający wstawkę z plazmidu pIBB500 zmniejszoną do około 8 kb.

Sposób wytwarzania plazmidu pIBB502, według wynalazku polega na tym, że z plazmidu pIBB501, poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym XhoI, usuwa się fragment wstawki o wielkości około 12 kb pochodzącej z plazmidu pIBB500, a pozbawiony tego fragmentu plazmid zamyka się przy pomocy ligazy, po czym wprowadza drogą elektroporacji do komórek Lactococcus lactis, korzystnie Lactococcus lactis MG1363 lub Lactococcus lactis IL 1403 które wysiewa się i hoduje w znany sposób, otrzymując kolonie wytwarzające enzym amylolityczny i zawierające plazmid pIBB502.

Nowy plazmid pIBB504, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi go plazmid pBluescript zawierający wstawkę Pstl, około 1,5 kb z plazmidu pIBB502.

Sposób wytwarzania plazmidu pIBB504, według wynalazku polega na tym, że otrzymany w wyniku trawienia plazmidu pIBB502 enzymem restrykcyjnym Pstl i wyizolowany fragment 1,5 kb łączy się z plazmidem pBluescript trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym Pstl, po czym mieszaninę liguje się i wprowadza metodą transformacji do komórek Eschericha coli., które wysiewa się i hoduje w znany sposób na podłożu z ampicyliną, izolując kolonie zawierające plazmid pIBB504.

Ze zrekombinowanego plazmidu pIBB501 zachodzi prawidłowa ekspresja i sekrecja amylazy w gospodarzu L. lactis MG1363, co świadczy, że udało się sklonować odcinek DNA zawierający geny niezbędne dla produkcji i sekrecji amylazy w szczepie L. lactis IBB500.

Gen kodujący amylazę z plazmidu pIBB500 subklonowano przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej Xhol w komórkach L lactis MG 13 63. W wyniku wycięcia 12 kb fragmentu z pIBB501 i religacji otrzymano plazmid pIBB502 o masie 13 kb. Plazmid ten wprowadzony do komórek gospodarza, korzystnie Lactococcus lactis MG 1363 lub IL 1403 umożliwiał prawidłową produkcję i sekrecję amylazy.

Nie udało się natomiast subklonować genu kodującego amylazę przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRW, Pstl, Xbal, Xhol i EcoRl. Nastąpiło to zapewne z powodu posiadania przez te enzymy miejsc cięcia w obrębie badanego genu. Zostało to potwierdzone w toku dalszych badań dla enzymów Pstl i EcoRW.

189 090

Zlokalizowanie genu kodującego amylazę było możliwe dzięki konstrukcji mapy fizycznej plazmidu pIBB502 i delecji fragmentów DNA. Stwierdzono bowiem, że wypadnięcie fragmentu Pstl o wielkości 1,5 kb z plazmidu pIBB502 sprawia, że komórki, które pobrały zmodyfikowany plazmid, tracą zdolność do produkcji amylazy. Część klonów traciła również aktywność amylazową poprzez posiadanie plazmidu, w którym doszło do inwersji odcinka Pstl. Wyniki te jednoznacznie sugerowały, że gen kodujący amylazę leży częściowo w rejonie 1,5 kb fragmentu Pstl

Plazmidy według wynalazku, po wprowadzeniu do odpowiedniego szczepu bakterii, pozwalają na otrzymanie nowych szczepów o dużej aktywności amylazowej.

W celu zsekwencjonowania, fragment Pstl przeklonowano z plazmidu pIBB502 do wektora sekwencyjnego. Uzyskana od strony starteru rewers sekwencja nukleotydowa wstawki o długości 166 nukleotydów, przetłumaczona na sekwencję aminokwasową, wykazuje znaczną homologię na całej swej długości (54 aminokwasy) do izoamylazy z Pseudomonoas amyloderamosa (34% identyczności i 60% podobieństwa). Homologia do pulullunuzy z Bacillus stearothermophilus jest wprawdzie wyższa (66% identyczności i 83% podobieństwa), jednakże obejmuje ona tylko fragment 15 aminokwasów.

W analizowanej sekwencji zlokalizowano charakterystyczny motyw, tzw. box IV. Jak wynika z literatury region ten jest jednym z trzech regionów najsilniej konserwowanych u amylaz, takich jak a-amylazy, izoamylazy, pullulanazy, neo-pullulanazy i a-amylazopullulanazy, (Nakajima, R., 1986). Sekwencję konsensusową tego regionu ustalono na FVDNHD (Janse, B.J., 1993), natomiast otrzymana sposobem według wynalazku sekwencja zawiera kolejno aminokwasy YVECHD. Z badań nad a-amylazą Aspergillus oryzae wynika, że kwas asparaginowy (D) regionu IV występuje w miejscu katalitycznym enzymu (Matsuura, Y., 1984). Na podstawie tych wyników, można przypuszczać, że badany enzym wykazuje typ specyficzności wyżej wymienionych endoamylaz.

W wyniku transformacji szczepu Bacillus subtilis (amy) plazmidem pIBB502, posiadającym gen kodujący amylazę, otrzymano klony, które nie wykazywały aktywności amylazowej. Wyjaśnienie tego zjawiska wymaga dalszych badań. Być może pH hodowli było nieoptymalne dla enzymu i przy innym pH enzym ten może być bądź aktywny, bądź produkowany przez B. subtilis. Plazmidowe DNA wyizolowane z transformantów B. subtilis i wprowadzone z powrotem do komórek laktokoków dawało wynik dodatni - otrzymywano klony produkujące amylazę. Oznacza to, że przyczyną braku produkcji i/lub aktywności amylazy w tym szczepie są zapewne odmienne mechanizmy ekspresji genów, bądź sekrecji białek u Bacillus subtilis w porównaniu do Lactococcus lactis, a nie rearanżacje plazmidu. Z danych literaturowych wiadomo było, że próby uzyskania ekspresji lub sekrecji genów pochodzących z B. subtilis w gospodarzu Lactobacillus często bywały zakończone niepowodzeniem (Fitzsimons, A., 1994, b). Rozwiązania według wynalazku wskazują, że podczas klonowania genów pochodzących z Lactococcus w takim gospodarzu jak B . subtilis można napotkać na problemy.

W pracach nad niniejszym wynalazkiem, nieoczekiwanie stwierdzono plazmidową lokalizację genu kodującego amylazę. Uzyskano również częściową sekwencję nukleotydowągenu amy.

W tabeli 1 przedstawiono plazmidy stosowane bądź będące przedmiotem wynalazku.

Tabela 1

Nazwa	Genotyp	Źródło
pIL253	wysokokopiowy, ery wektor do klonowania genów w bakteriach mlekowych (rys. 3)	dr A. Chopin, INRA, Jouy-en-Josas, Francja
pBluescript SKII+	wysokokopiowy, ampr, M13 ori, BR322 ori	Stratagen
pIBB500	amy* dawca genu kodującego amylazę	kolekcja własna
pIBB501	pIL253 ze wstawką ok. 20kb z plazmidu IBB500	konstrukt własny
pIBB502	pochodna pIBB500, zawierająca wstawkę ok. 8kb	konskrukt własny
pIBB504	pochodna plazmidu pBluescript, zawierająca wstawkę Pstl (1,5 kb) pochodzącą z plazmidu pIBB502	konstrukt własny

189 090

Na fig. 1 przedstawiono schemat plazmidu pIBB501, na fig. 2 przedstawiono plazmid pIBB502, na fig.3 przedstawiono schemat plazmidu pIBB504 (amy), gdzie gruba linia oznacza sklonowany fragment Pstl (1,5 kb) pochodzący z plazmidu pIBB502; cienka linia wektor pBluescript SKII, a strzałki regiony które zostały następnie zsekwencjonowane wraz z długością uzyskanej sekwencji w parach zasad (pz). Na fig. 4 przedstawiono schemat plazmidu pIL253, a na fig. 5 przedstawiono schemat plazmidu pIBB500. Na fig. 6 przedstawiono schemat klonowania genu kodującego amylazę z 30 kb plazmidu szczepu Lactococcus lactis pIBB500 w wektorze pIL253. Zaznaczone w wektorze pIL253 miejsce EcoRl w rzeczywistości odpowiada fragmentowi DNA polilinkera ograniczonemu dwoma miejscami EcoRl oddalonymi od siebie o 58 nukleotydów.

Preparaty DNA stosowane w sposobie według wynalazku.

DNA faga λ 0,2 pg/pl trawiony endonukłeazą restrykcyjną BstEll był używany jako standard mas cząsteczkowych.

Bufory i roztwory stosowane w sposobie według wynalazku Bufor TE -10 mM Tris, pH 8,0,1 mM EDTA, pH 8,0

Bufor TAE do elektroforezy w żelu agarozowym - 40mM Tris, 20 mM kwas octowy, 2mM EDTA, pH 8,1.

Bufory do trawień DNA enzymami restrykcyjnymi i do ligacji DNA (Boehringer-Marinheim, New England Biolabs i Fermentas), stosowane wg zaleceń producentów enzymów

Roztwory do izolacji plazmidowego DNA:

roztwór I - 50 mM glukoza, 10 mM EDTA, 25 mM Tris pH 8,0, RNA-za 50 pg/ml roztwór II - 0,2 N NaOH, 1% SDS roztwór III - 3 M octan potasu, pH 4,8

Roztwór do próbek nakładanych na żel: glicerol 50%, błękit bromofenolowy 0,25%, cyjanol ksylenu 0,25%

Roztwór do oczyszczania preparatów DNA z białek: fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (stosunek objętościowy: 25:24:1)

Roztwór do oznaczeń aktywności enzymu amylolitycznego, pH 4,4:

0,025% skrobia, 10 mM Tris-HCl pH 6,9,25 mM CaCl₂, 3 mM octan potasu pH 4,8 Płyn Lugola: 0,33% I₂, 0,66% K₂I

Odczynniki stosowane w sposobie według wynalazku

Enzymy endonukleazy restrykcyjne (Boehringer-Mannheim, New England Biolabs i Fermentas) ligaza DNA faga T4 (Boehringer-Mannheim) lizozym z białka jaja kurzego (Sigma)

RNAza A (Sigma)

Antybiotyki ampicylina (Boehringer-Mannheim) erytromycyna (Sigma)

Inne odczynniki agar (Gibco) agaroza HGT (Marinę Colloids Inc.) alkohol izoamylowy (BDH) bromek etydyny (Sigma) chloroform (Lachema) chlorek wapnia (POCh) chlorek litu (POCh) chlorek cezu (POCh)

EDTA (Sigma) fenol (Sigma) glukoza (Sigma)

IPTG (Sigma) izopropanol (POCh) kwas mlekowy (BDH) kwas octowy lodowaty (Standard) kwas solny (POCh) octan potasu (POCh) octan sodu (POCh)

SDS (Sigma) skrobia (Merck)

Tris (Sigma)

X - gal (Biosynth AG)

189 090

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku nie ograniczające jego zakresu.

Przykład I. Wytwarzanie plazmidu pIBB501.

Pulę plazmidowego DNA szczepu L. lactis IBB500 oraz plazmid pIL253 trawiono endonukleazą (enzymem restrykcyjnym) EcoRl, w oddzielnych probówkach. Po inaktywacji £coRI, i dializie próbek wobec wody, oba plazmidy połączono w jednej probówce przy nadmiarze molamym plazmidu pIBB500, dodając buforu ligacyjnego i enzymu ligazy, prowadząc reakcję 18 godz. w temperaturze 16°C. Po dializie mieszaniny ligacyjnej wobec wody wprowadzano ją do komórek gospodarza L. lactis MG1363 metodą elektroporacji. Poddane elektroporacji komórki zawieszono w pożywce regeneracyjnej i inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Po tym czasie wysiano bakterie na podłoże wybiórczo-różnicujące, zawierające erytromycynę oraz skrobię, po czym inkubowano wysiane bakterie przez 3 dni w celu otrzymania kolonii transformantów, a następnie wykonano test płytkowy z płynem Lugola na wyrosłych koloniach. Kolonie wytwarzające enzym amylolityczny przesiano na świeżą pożywkę płynną z erytromycyną celem analizy plazmidowej, oraz pożywkę stałą z erytromycyną i skrobią, celem potwierdzenia zdolności wytwarzania enzymu amylolitycznego. Następnie potwierdzono otrzymanie plazmidu pIBB501, jako plazmidu zrekombinowanego z pIL253 i 20 kb fragmentu pIBB500. Szczep zawierający plazmid pIBB501 przechowywano w temperaturze - 80°C.

Przykład E. Wytwarzanie plazmidu pIBB502

Otrzymany w przykładzie I plazmid pIBB501 zmniejszono następnie do 13 kb poprzez delecję odcinka enzymem restrykcyjnym Xhol. Trawienie tym enzymem powoduje wypadnięcie z pIBB501 fragmentu wstawki o wielkości 12 kb pochodzącej z pIBB500. Pozbawiony tego fragmentu plazmid zamknięto przy pomocy enzymu ligazy, dodając buforu ligacyjnego i enzymu ligazy, w reakcji prowadzonej w temperaturze 16°C przez 18 godz. Po dializie mieszaniny ligacyjnej wobec wody wprowadzano ją do komórek gospodarza L. lactis MG 1363 metodą elektroporacji. Po elektroporacji komórki zawieszano w pożywce regeneracyjnej i inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Po tym czasie wysiano bakterie na podłoże wybiórczo-różnicujące, zawierające erytromycynę oraz skrobię, po czym inkubowano wysiane bakterie przez 3 dni w celu otrzymania kolonii transformantów, a następnie na wyrosłych koloniach wykonano test płytkowy z płynem Lugola. Kolonie wytwarzające enzym amylolityczny przesiano na świeżą pożywkę płynną z erytromycyną celem analizy plazmidowej, oraz pożywkę stałą z erytromycyną i skrobią, celem potwierdzenia zdolności wytwarzania enzymu amylolitycznego. Następnie potwierdzono otrzymanie plazmidu pIBB502, jako plazmidu zrekombinowanego z pIL253 i 8 kb fragmentu pIBB500. Szczep zawierający plazmid pIBB502 przechowywano w temperaturze - 80°C.

Przykład III. Wytwarzanie plazmidu pIBB504.

Wytworzony w przykładzie II plazmid pIBB502 i plazmid pBluescript trawiono w osobnych probówkach enzymem Pstl. Po inaktywacji enzymu Pstl, fragmenty pEBB502 rozdzielono w żelu agarozowym i wyizolowano fragment 1,5 kb, który rekombinowano następnie z pBluescript przeciętym Pstl (zlinearyzowanym). Połączony plazmid zamknięto przy pomocy enzymu ligazy dodając buforu ligacyjnego i enzymu ligazy, prowadząc reakcję w temperaturze 16°C przez 18 godz. Po dializie mieszaniny ligacyjnej wobec wody wprowadzano ją do kompetentnych komórek gospodarza Eschierischia coli TG1 metodą transformacji.

Poddane transformacji komórki wysiano na podłoże z ampicyliną jako czynnikiem selektywnym dla transformantów. Następnie wykonano test płytkowy z płynem Lugola na wyrosłych koloniach. Kolonie przesiano na świeżą pożywkę celem potwierdzenia zdolności wytwarzania enzymu amylolitycznego. Następnie potwierdzono otrzymanie plazmidu pIBB504, jako plazmidu zrekombinowanego z 1,5 kb fragmentu pE3B502 i plazmidu pBluescript. Szczep zawierający plazmid plBB504 przechowywano w temperaturze -80°C.

Stwierdzono, że wprowadzanie powstałego w przykładzie II plazmidu pIBB502 do komórek szczepu Lactococcus lactis MG 1363 połączone jest z nabyciem zdolności wytwarzania amylazy. Nie zaobserwowano natomiast produkcji amylazy z plazmidu pIBB502 w gospodarzu B. subtilis. Brak zdolności amylazowych szczepu L. lactis MG 13 63 po pobraniu plazmidu pIBB502, z którego 1,5 kb fragment Pstl uległ delecji lub inwersji pozwalał przypuszczać, że

189 090 gen kodujący amylazę leży częściowo w rejonie tego fragmentu. Fragment Pstl został przeklonowany do wektora pBluescript i poddany sekwencj ono waniu. Otrzymano sekwencję nukleotydową wstawki o długości 166 pz, w której jedna z ramek odczytu nie zawierała kodonu stop ani start. Analiza wydedukowanej sekwencji aminokwasowej wykazała znaczną homologię do pullulanazy z Bacillus stearothermophilus i izoamylazy z Pseudomonas amyloderamosa. Znaleziono w niej także silnie konserwowany u wszystkich endoamylaz motyw aminokwasów - tzw. box IV, biorący udział w funkcjach katalitycznych enzymu.

Zaznaczone w wektorze pIL253 miejsce EcoRI w rzeczywistości odpowiada fragmentowi DNA polilinkera ograniczonemu dwoma miejscami EcoRI oddalonymi od siebie o 58 nukleotydów.

Celem określenia wielkości zrekombinowanego plazmidu pIBB502 w komórkach transformantów wytwarzających amylazę, metodą minilizatów izolowano z nich plazmidowy DNA i trawiono enzymem restrykcyjnym Xhól. Plazmid pIBB502 poddany trawieniu oraz wzorzec mas cząsteczkowych rozdzielano elektroforetycznie w żelu agarozowym. Po elektroforezie, w preparacie strawionego plazmidu pIBB502, zaobserwowano obecność jednego prążka, odpowiadającego masie ok. 13 kb. W świetle wcześniejszych trawień plazmidu pIBB501 enzymem restrykcyjnym Xhol, wynik ten jest zrozumiały. Enzym ten posiada bowiem dwa miejsca cięcia w plazmidzie pIBB501, w tym jedno w polilinkerze wektora pIL253, przez co generuje powstawanie dwóch fragmentów DNA o masach 12 i 13 kb. Fragment 13kb, zawierający wektor pIL253 uległ następnie samoligacji, dając funkcjonalny plazmid zawierający gen amylazowy (fig. 2). Nowo skonstruowany plazmid nazwano pIBB502, zaś jedną z uzyskanych po klonowaniu kolonii wytwarzającą amylazę - IBB502.

Konstrukcja mapy fizycznej plazmidu pIBB502

Celem przeprowadzenia krótkich delecji pozwalających precyzyjnie zlokalizować gen kodujący amylazę w plazmidzie pIBB502, ustalono pozycję miejsc cięcia niektórych enzymów restrykcyjnych w tym plazmidzie.

Porcje plazmidu pIBB502 (200 ng) trawiono wybranymi enzymami restrykcyjnymi, po czym produkty reakcji rozdzielono elektroforetycznie w obecności wzorca mas cząsteczkowych.

Analiza zdjęć rozdziału elektroforetycznego uzyskanych w wyniku pojedynczych trawień fragmentów pokazała, że część użytych enzymów nie przecina plazmidu pIBB502, np. Apal, Eagl, Hincll, SaB, Smal, albo tnie go na wiele małych fragmentów, jak np. Accl, EcoRN, Hindill, Clal. Do enzymów linearyzyjących plazmid należą: Xhol, Xbal oraz EcoRI, natomiast enzymy Pstl, Spel oraz BstXl rozpoznają dwa miejsca cięcia.

Trawienia podwójne natomiast pozwoliły dokładnie zorientować względem siebie miejsca cięcia niektórych enzymów restrykcyjnych w plazmidzie pIBB502 i ustalić mapę fizyczną tego plazmidu (fig. 2).

Na rysunku zaznaczono jedynie te miejsca EcoRN i Hindill, które zostały zlokalizowane w wyniku późniejszej analizy sekwencji fragmentu Pstl.

Lokalizacja genu kodującego amylazę przy użyciu endonukleazy restrykcyjnej Pstl.

Do dalszego subklonowania genu kodującego amylazę w plazmidzie pIBB502 użyto enzymu restrykcyjnego Pstl, który trawiąc plazmid pIBB502 generuje powstanie dwóch fragmentów DNA o wielkościach 11,5 kb (odcinek zawierający wektor) i 1,5 kb. Enzymem Pstlstrawiono 1 pg plazmidu, po czym preparat oczyszczono z białek mieszaniną fenol chloroform, dializowano na sączku oraz ligowano. Mieszaninę ligacyjną wprowadzano metodą elektroporacji do komórek biorcy L. lactis MG1363 (amy, erfi), które następnie wysiewano na podłoże stałe BHI ze skrobią i erytromycyną. Uzyskano liczne transformanty, ok. 4000 kolonii. Na podstawie testu płytkowego stwierdzono, że około 30% transformantów było zdolnych do degradacji skrobi.

Z losowo wybranych klonów, 2 wytwarzających i 3 nie wytwarzających amylazy, wyizolowano DNA plazmidowy i trawiono go enzymem restrykcyjnym Pstl, po czym rozdzielono elektroforetycznie w obecności wzorca mas cząsteczkowych. Na fig. 7 przedstawiono obraz plazmidów transformantów amy- i amy+ poddanych trawieniu enzymem restrykcyjnym

189 090

PstI, (gdzie a - amy'; b - amy'; c - amy'; d - amy+; e - amy+; natomiast ścieżka s przedstawia standard mas cząsteczkowych).

W analizowanym materiale plazmidowym klonów wytwarzających amylazę, zgodnie z oczekiwaniami, zaobserwowano dwa prążki na żelu odpowiadające masie około 11,5 kb i 1,5 kb (fig. 7, ścieżka d, e). Po trawieniu enzymem PstI plazmidowego DNA z 2 klonów nie wytwarzających amylazy na żelu widoczny był jeden prążek o masie ok. 11,5 kb. Oznacza to, że część klonów amy' utraciło fragment Pstl o wielkości 1,5 kb (fig. 7, ścieżka a, b). W przypadku trzeciego transformanta nie wytwarzającego amylazy stwierdzono, że jego plazmidowe DNA daje identyczny wzór prążków jak w przypadku klonów wytwarzających amylazę (fig. 7, ścieżka c). Wynik ten sugeruje, że utrata aktywności amylazowej w tym klonie spowodowana jest inwersją fragmentu Pstl..

Klonowanie 1,5 kb fragmentu Pstl w wektorze pBluescript

Celem uzyskania sekwencji nukleotydowej 1,5 kb odcinka Pstl plazmidu pIBB502 fragment ten sklonowano w wektorze sekwencyjnym pBluescript SKII (amp^r, lacZ), używając jako gospodarza komórki E. coli TG1.

Enzymem Pstl trawiono 1 |ig plazmidu pIBB502 i 300 ng wektora pBluescript SKII, po czym próbki odbiałczano mieszaniną fenol-chloroform. Tak przygotowane fragmenty plazmidu pIBB502 i wektora pBluescript ligowano ze sobą i wprowadzano metodą transformacji do kompetentnych komórek E. coli TG1 (amp^s). Bakterie selekcjonowano na podłożu stałym LB zawierającym ampicylinę, X-gal i IPTG. Wyrosły liczne, ok. 2,5 x 10⁴, transformanty, z czego 1% było białych. Z losowo wybranych 24 białych kolonii metodą minilizatów wyizolowano plazmidowy DNA, trawiono endonukleazą restrykcyjną Pstl i rozdzielano elektroforetycznie w obecności wzorca mas cząsteczkowych. W przypadku dwóch analizowanych plazmidów uzyskano oczekiwany wzór prążków tj. jeden odpowiadający masie 3 kb (zlinearyzowany wektor) i drugi 1,5 kb, będący sklonowaną wstawką. Nowo skonstruowany plazmid oznaczono jako pIBB504 (fig. 3), zaś klon jako IBB504. Na schemacie plazmidu pIBB504 gruba linia oznacza sklonowany fragment Pstl (1,5 kb) pochodzący z plazmidu pIBB502; cienka linia wektor pBluescript SKII, strzałki - regiony, które zostały następnie zsekwencjonowane wraz z długością uzyskanej sekwencji w parach zasad (pz).

Sekwencjonowanie DNA 1,5 kb fragmentu Pstl z plazmidu pIBB504 i analiza uzyskanej sekwencji.

Z wyizolowanego, za pomocą zestawu do izolacji Qiagen, plazmidowego DNA pIBB504 przygotowano do sekwencjonowania dwie matryce DNA. Następnie' każdą z matryc DNA sekwencjonowano używając jednego z dwóch starterów, „direct” i „rewers”, komplementarnych do końców polilinkera w wektorze Bluescript SKII.

Uzyskaną od strony startera rewers sekwencję nukleotydową wstawki, o długości 266 pz (fig. 7), analizowano przy użyciu programu komputerowego GCG. Z 6 możliwych ramek odczytu sekwencji, tylko jedyna nie zawierała żadnego kodonu start ani stop na całej swej długości, dlatego wybrano ją do dalszych badań. Na fig. 7 przedstawiono częściową sekwencję nukleotydową i białkową 1,5 kb fragmentu Pi/I z plazmidu pIBB502 uzyskaną od strony startera rewers. W ramce zaznaczono silnie konserwowany region.

Po przetłumaczeniu sekwencji nukleotydowej na sekwencję aminokwasową, poszukiwano homologii porównując otrzymaną sekwencję z sekwencjami białek zgromadzonych w bazie EMBL. Największe podobieństwo analizowanej sekwencji aminokwasowej stwierdzono do następujących białek: izoamylazy z Pseudomonas amyloderamosa, pullulanazy z Bacillus stearothermophilus i enzymu degradującego glikogen z Mycobacterium tuberculosis (tabela 2). Ponadto poprzez porównanie ze znanymi sekwencjami aminokwasowymi enzymów amylolitycznych odnaleziono silnie konserwowany region, który w analizowanej sekwencji składa się z następujących aminokwasów: tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, cysteiny, histydyny i kwasu asparaginowego - motyw YYECHD (fig. 8).

189 090

Tabela 2

Homologie analizowanej sekwencji do sekwencji białek bazy danych EMBL

Białko	Organizm	Identyczność [%]	Podobieństwo [%]	Długość porównywanego fragmentu
hoamylaza	Pseudomonas amyloderamosa	34	60	cały fragment tj. 53 aminokwasy
Pullulanaza	Bacillus stearothermophilus	66	83	ok. 15 aminokwasów
Enzym degradujący glikogen	Mycobacterium tuberculosis	70	76	ok. 15 aminokwasów

W przypadku sekwencji uzyskanej z drugiej strony fragmentu Pstl (334 nukleotydów) nie wykryto żadnych znaczących homologii.

Ekspresja amylazy z plazmidu plBB502 w szczepie Bacillus subtilis

Celem sprawdzenia zdolności innych bakterii Gram + do produkcji amylazy kodowanej przez genom L. lactis, wprowadzono gen kodujący amylazę na plazmidzie pIBB502 do komórek szczepu Bacillus subtilis YB886 (amy).

Kompetentne komórki Bacillus subtilis YB886 transformowano przy użyciu 40 ng plazmidu pIBB502 (amy+ ery). Jako kontrolę przeprowadzano równoległą transformację tego samego gospodarza wektorem pIL253 (50 ng). Transformanty selekcjonowano na podłożu BHI ze skrobią, i erytromycyną. Uzyskano 290 koloni z transformacji do której użyto plazmid pIBB502 i 90 koloni z transformacji kontrolnej. W teście płytkowym stwierdzono, że żaden z transformantów nie wytwarza amylazy (fig. 9).

Plazmidowe DNA losowo wybranych klonów z obu transformacji wyizolowano, trawiono enzymami restrykcyjnymi EcoRl i Pstl, po czym rozdzielono elektroforetyczne w obecności kontrolnego preparatu plazmidu pIBB502 strawionego w identyczny sposób. Plazmidowy DNA transformantów kontrolnych (zawierających pIL253), zgodnie z oczekiwaniami, dawał na żelu jeden prążek o wielkości wektora tj. 5 kb (zdjęcie - fig. 9, ścieżka b). Układ prążków plazmidowego DNA pochodzącego z klonów otrzymanych po transformacji biorcy plazmidem pIBB502 był identyczny z układem prążków uzyskanych z rozdziału kontrolnego preparatu plazmidu pIBB502 (fig. 9, ścieżka a, c, d). Na fig. 9 ścieżka s oznacza standard mas cząsteczkowych. Przeprowadzona analiza wskazuje, że plazmid pIBB502 nie uległ rearanżacjom w Bacillus subtilis.

Retransformancja plazmidu plBB502 z transformantów Bacillus subtilis do komórek Lactococcus lactis

Plazmidowy DNA (200 ng) z losowo wybranego transformanta B. subtilis YB886, do którego uprzednio wprowadzano plazmid pIBB502, dializowano na sączku i wprowadzono metodą elektroporacji do szczepu gospodarza Z. lactis MG1363 (ery^s, amy). Transformanty selekcjonowano na podłożu BHI ze skrobią i erytromycyną. Wszystkie wyrosłe kolonie wytwarzały amylazę, co stwierdzono na podstawie testu płytkowego. Wynik ten potwierdza, że wprowadzony do komórek B. subtilis plazmid pIBB502 nie ulega żadnym strukturalnym modyfikacjom.

Aparatura stosowana w przykładach wykonania wynalazku aparat do elektroporacji Gene Puiser (BioRad)

DNA Speed Vac DNA 110 (Savant) mikrowirówka Z 230 M (Chermle) wirówka preparatywna RC5B (Sorvall) ultrawirówka Ultra Plus (Sorvall) spektrofotometr LKB Ultrospec III (Pharmacia) zestaw do fotografii (ImageStore-UVP)

189 090

Metody stosowane w sposobie według wynalazku

Metody hodowli drobnoustrojów

Hodowle szczepów Lactococcus lactis w podłożu płynnym lub stałym oraz szczepów Bacillus subtilis na podłożu stałym prowadzono w temperaturze 28 - 30°C.

Szczepy Escherichia coli hodowano w temperaturze 37°C, przy czym hodowle w podłożu płynnym napowietrzano przez wytrząsanie.

Izolacja plazmidowego DNA

Izolacja plazmidowego DNA z komórek E. coli metodą minilizatów

DNA plazmidowy z E. coli izolowano metodą lizy alkalicznej (Bimboim, H.C. i Doły J., 1979). Próbki nocnych hodowli o objętości 1,5 ml odwirowywano przez 1 min przy 12 000 obr./min. w mikrowirówce, po czym osad zawieszano w 0,1 ml roztworu I do izolacji plazmidowego DNA. Następnie dodawano 0,2 ml roztworu II, mieszano przez wielokrotne odwracanie probówek i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Kolejno do próbek dodawano 0,2 ml roztworu III, mieszano i pozostawiano w lodzie na 5 minut. Po odwirowaniu przez 20 minut przy 17 000 obr./min. do supematantu dodawano 2,5 objętości 96% etanolu i inkubowano przez 10 min w -80°C. Po zebraniu osadu przepłukiwano go 70% etanolem, suszono i zawieszano w buforze TE.

Plazmidy do sekwencjonowania izolowano przy użyciu zestawu do oczyszczania plazmidowego DNA firmy Qiagen.

Izolacja plazmidowego DNA z komórek L. lactis i B. subtilis metodą minilizatów

Stosowano metodę lizy alkalicznej zmodyfikowaną poprzez wstępne trawienie w 37°C przez 15 min ścian komórkowych bakterii lizozymem - 4 pg/ml dla L. lactis i 2 pg/ml dla B. subtilis.

Izolacja plazmidowego DNA z komórek L. lactis na dużą skalą

Stosowano metodę lizy alkalicznej zmodyfikowaną przez dodatkowe ultrawirowanie preparatu w gradiencie chlorek cezu z bromkiem etydyny (wg Sambrock, J. i wsp., 1989).

Osad plazmidowego DNA otrzymany w wyniku lizy alkalicznej (otrzymany z 2 litrów hodowli) zawieszano w 16 ml buforu TE.

Następnie dodawano 16,4 g chlorku cezu, a po rozpuszczeniu 800 jj1 bromku etydyny o stężeniu 10 mg/ml i rozdzielano do 4 probówek ultrawirowniczych. Probówki równoważono roztworem chlorku cezu o gęstości 1,56 g/cm³. Wirowano przez noc w ultrawirówce przy 45 000 obrotów/minutę w 20°C. Następnie zbierano frakcję plazmidowego DNA, ekstrahowano alkoholem izoamylowym i dializowano w buforze TE (stosunek objętościowy próbki do buforu 1:1000) przy użyciu woreczków dializacyjnych. zmieniając bufor czterokrotnie. Uzyskany w ten sposób preparat DNA zamrażano w -20°C.

Przygotowanie kompetentnych komórek Escherichia coli

100 ml hodowli bakterii w logarytmicznej fazie wzrostu (ODeoo = 0,3) wirowano przez 10 min., 4000 obr/min, 4°C. Osad zawieszano w 4 ml zimnego 100 mM roztworu CaCl₂. Po 120 min. inkubacji w lodzie, dodawano glicerol do końcowego stężenia 15%, rozpipetowano na 100 (il porcje i zamrażano w ciekłym azocie. Tak przygotowane komórki kompetentne przechowywano w - 80°C.

Transformacja komórek Escherichi coli

Komórki E. coli transformowano metodą wg Sambrook, J. i wsp. (1989).

Do pojedynczej transformacji używano 100 |il zamrożonych komórek. Zawiesinę komórek kompetentnych delikatnie rozmrażano w lodzie, a następnie dodawano do nich DNA plazmidowe lub mieszaninę ligacyjną. Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w lodzie, a następnie komórki poddawano szokowi termicznemu. ogrzewając przez 5 minut w 37°C. Po tym czasie do każdej probówki dodawano 1 ml pożywki LB i inkubowano w 37°C przez 60 minut.

Transformanty selekcjonowano na podłożu LB z ampicyliną (50 pjgml), X-gal (40 pg/m1), IPTG (0,1 mM). Białe zabarwienie koloni w odróżnieniu od niebieskiego świadczyło o obecności w komórkach zrekombinowanego plazmidu.

189 090

Przygotowanie elektrokompetentnych komórek Lactococcus lactis MG 1363.

Bakterie hodowano na podłożu SGM17 z dodatkiem glicyny 1,5% przez noc w 30°C, po czym hodowlę nocną rozcieńczano 100-krotnie w podłożu SGM17 z 1,5% glicyną i hodowano w temp.30°C do uzyskania OD600 od 0,2 do 0,7. Bakterie odwirowywano w temp. 4°C, przemywano dwukrotnie zimnym roztworem 0,5 M sacharoza-10% glicerol, a następnie zawieszono w 1/100 objętości tego samego roztworu i zamrożono w -80 °C.

Transformacja komórek Lactococcus lactis

Transformację L. lactis przeprowadzono metodą.elektroporacji (Holo, H. i Nes I.F., 1989).

Komórki elektrokompetentne (100 pl) rozmrażano w lodzie, po czym dodawano do nich przedializowany DNA (max. 3 pg), mieszano i przenoszono do kuwet. Bezzwłocznie poddawano bakterie działaniu prądu o następujących parametrach: 2,45 kV, 25 pF, 200 Ω. Następnie do komórek dodawano 1 ml podłoża SGM17 i inkubowano 2 godziny w 30°C. Transformanty selekcjonowano na podłożu BHI z erytromycyną (5 pg/ml) i skrobią (0,5%) po dwóch dniach inkubacji w 30°C.

Transformacja komórek Bacillus subtilis

Do pojedynczej transformacji używano 100 pl komórek kompetentnych Bacillus subtilis. Zawiesinę komórek rozmrażano w 37°C, a następnie dodawano do nich DNA plazmidowy. Próbki inkubowano w 37°C przez 30 minut. Transformanty selekcjonowano na podłożu BHI z erytromycyną (5 pg/ml) i skrobią (0,5%) po dwóch dniach inkubacji w 30°C.

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Elektroforezę prowadzono w żelach agarozowych 0,7%, zawierających bromek etydyny (0,5 pg/ml), w buforze TAE przy napięciu 30-100 V(wg Sambrook, J. i wsp., 1989). Żele naświetlano promieniami UV o długości 365 nm i fotografowano.

Trawienia DNA plazmidowego enzymami restrykcyjnymi.

Trawienia DNA endonukleazami restrykcyjnymi przeprowadzono w firmowych buforach i warunkach zalecanych przez producenta.

Ligacja fragmentów DNA plazmidowego

Ligację fragmentów DNA przy użyciu ligazy DNA z faga T4 prowadzono w 16°C przez noc, metodą na „lepkie końce” (wg Sambrook i wsp., 1989), utrzymując w mieszaninie ligacyjnej stężenie DNA nie większe niż 40 pg/ml i stosunek molamy wstawki do wektora 3:1.

Przygotowanie matrycy DNA do sekwencjonowania

Matrycę stanowił wektor sekwencyjny Bluescript SK II wraz z wklonowanym fragmentem DNA zawierającym 1,5 kb odcinek Pst I z plazmidu pIBB502.

DNA plazmidowe w ilości ok. 10 pg w objętości 32 pl denaturowano przez dodanie 8 pl 2M NaOH przez 15 min. Następnie dodawano 7 pl 3M octanu sodu pH 4,8 oraz 3 objętości 96% etanolu, inkubowano 15 min w -80°C, po czym odwirowywano w 4°C. Powstały osad przemywano 70% etanolem i suszono.

Sekwencjonowanie DNA

Sekwencjonowanie przeprowadzono metodą Sangera, przy użyciu oligonukleotydów znakowanych fluorescencyjnie, w Pracowni Sekwencjonowania i Syntezy Oligonukleotydów IBB PAN. Sekwencje nukleotydowe otrzymywano automatycznie za pomocą urządzenia A.L.F. DNA Sequencer firmy LKB Pharmacia. Do sekwencjonowania matryc jako starterów używano oligonukleotydów komplementarnych do końców polilinkera w plazmidzie pBluescript SKIL Uzyskane sekwencje analizowano przy użyciu programu komputerowego GCG.

Leczenie komórek z plazmidów

W celu usunięcia plazmidów z komórek Lactococcus lactis IBB 5 00 zastosowano technikę przedłużonej hodowli przez 7 dni (Sinha, R.P., 1991).

Oczyszczenie preparatów DNA z białek

Odbiałczanie preparatów DNA wg Sambrook, J. i wsp. (1989) służyło do inaktywacji termostabilnych enzymów restrykcyjnych. Do preparatu DNA dodawano równą objętość mieszaniny fenol : chloroform : alkohol izoamylowy (25:24:1), mieszano na worteksie i wirowano 30 sek. Zbierano fazę wodną. Czynność tę powtarzano 2 razy.

189 090

Następnie dodano równą objętość mieszaniny chloroform : alkohol izoamylowy (24:1), mieszano i wirowano. DNA zebrane w fazie wodnej wytrącano etanolem 96%, a następnie osad przemywano 70% etanolem, suszono i zawieszano w buforze TE.

Dializa preparatów DNA

Aby usunąć jony obecne w roztworach DNA przed elektroporacją przeprowadzano dializę na filtrze. Preparat przeznaczony do dializy umieszczano na filtrze VS 0,025 (Millipore) znajdującym się na powierzchni wody destylowanej nalanej do szalki Petriego. Po 10 minutach dializy zbierano krople preparatu pipetą automatyczną z powierzchni filtra.

Detekcja aktywności amylazowej szczepów - test płytkowy

Szczepy bakteryjne hodowano 2 dni w temp. 28°C na odpowiednim podłożu stałym zawierającym skrobię o stężeniu 0,5%, następnie, po tym czasie, podłoże zalewano płynem Lugola, który barwi niezdegradowaną skrobię na granatowo. Szczepy wydzielające do środowiska enzym degradujący skrobię były otoczone jasną strefą niewybarwionego podłoża.

Ilościowe oznaczanie aktywności amylazowej

Stosowano test na aktywność zewnątrzkomórkowej amylazy w supematancie hodowli bakteryjnej (wg Nicholson, W.L., 1990). Przed pomiarem supematanty hodowlane rozmrażano w lodzie, po czym dodawano 800 μΐ roztworu reakcyjnego (0,025% skrobia, 10 mM TrisHCl, 25 mM CaCCĘ, 3 mM octan potasu, pH 4,4) do 200 μl supematantu i inkubowano 30 min w 37°C. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 400 μl płynu Lugola. Odczytywano absorpcję przy długości fali 620 nm [A620]· Próba ślepa zawierała roztwór reakcyjny (800 μΓ) oraz odpowiednią pożywkę (200μ1). 1 jednostka była definiowana jako spadek absorpcji o 0,1 w tych warunkach w próbie badanej w stosunku do absorpcji próby ślepej w ww. warunkach. W przypadku określania optimum temperaturowego reakcje prowadzono w zakresie temperatur od 20 do 60°C używając supematantu 12 godzinnej hodowli w podłożu BHI ze skrobią (0,075%).

fig· 4

189 090

Trawienie Xhoł i ligacja

Xhol

fig. 6 a b s c d e

fig. 7

189 090

TTGCAGGTTGGATTcGCAGCAGGAAATtAYGGCAAGTWCtTATAACGGTCGCAGGAGCtC |-----—---— 4-------- — (--- — —------1------------1--------— —H

AACGTCCAACCTAAgCGTCGTCCTTTAaTRCCGTTCAWGaATATTGCCAGCGTCCTCGaG

AGWIRSRKL?QVLITVAGAL ---------+---------+---------+---------+---------₊---------₊

TTTTGGCTTCTGGAGGTTGGAACGGAAATtGCACAGTGCAAGCTTTTTTGACSCCAAGCC

---------+---------₊---------₊---------+---------+---------+

AAAACCGAAGACCTCCAACCTTGCCTTTAaCGTGTCACGTTCGAAAAAACTGSGGTTCGG

LASGGWNGNCTVQAFLTPSQ ---------+---------+---------+---------+---------+---------+

TTGCAGGTTGGATTcGCAGCAGGAAATtAYGGCAAGTWCtTATAACGGTCGCAGGAGCtC

---------+---------+---------₊----------+---------+---------+

AACGTCCAACCTAAgCGTCGTCCTTTAaTRCCGTTCAWGaATATTGCCAGCGTCCTCGaG

AGWI RSRKL?QVLITVAGAL ---------₊---------+---------+---------+---------+---------+

TTTTGGCTTCTGGAGGTTGGAACGGAAATtGCACAGTGCAAGCTTTTTTGACSCCAAGCC

---------+---------+---------₊---------+---------₊---------+

AAAACCGAAGACCTCCAACCTTGCCTTTAaCGTGTCACGTTCGAAAAAACTGSGGTTCGG

LASGGWNGNCTVQAFLTPSQ ---------₊---------+---------₊---------,+---------+---------+

AGTCTATCAATTATGTTGAATGTCATGATAGYTTCACCTTAAAtSA

---------.)-----------1--------------—---——h-------166

TCAGATAGTTAATACAACTTACAGTACTATCRAAGTGGAATTTaST

V E C

------₊ _.

S F T L N -+---------+--166 fig. 8 a b c d

fig. 9

189 090

fig. 2

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowy plazmid pIBB501, znamienny tym, że stanowi go plazmid pIL253 zawierający wstawkę około 20 kb plazmidu pIBB500.
2. 2. Sposób wytwarzania plazmidu pIBB501, znamienny tym, że otrzymany w wyniku trawienia 30 kb plazmidu pIBB500 enzymem restrykcyjnym EcoRl, fragment 20 kb łączy się z plazmidem pIL253 trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym EcoRl, po czym mieszaninę liguje się i wprowadza metodą elektroporacji do komórek Lactococcus lactis, korzystnie Lactococcus lactis MG 1363 lub Lactococcus lactis IL 1403, które hoduje się w znany sposób, a następnie przesiewa się kolonie wytwarzające enzym amylolityczny i zawierające plazmid pIBB501 na świeżą pożywkę płynną zawierającą antybiotyk i ewentualnie skrobię.
3. 3. Nowy plazmid pIBB502, znamienny tym, że stanowi go plazmid pIBB501 zawierający wstawkę z plazmidu pIBB500 zmniejszoną do około 8 kb.
4. 4. Sposób wytwarzania plazmidu pIBB502, znamienny tym, że z plazmidu pIBB501, poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Xhol, usuwa się fragment wstawki o wielkości około 12 kb pochodzącej z plazmidu pIBB500, a pozbawiony tego fragmentu plazmid zamyka się przy pomocy ligazy, po czym wprowadza drogą elektroporacji do komórek Lactococcus lactis, korzystnie Lactococcus Lactis MG1363 lub Lactococcus Lactis IL 1403, które wysiewa się i hoduje w znany sposób, otrzymując kolonie wytwarzające enzym amylolityczny i zawierające plazmid pIBB502.
5. 5. Nowy plazmid pIBB504, znamienny tym, że stanowi go plazmid pBluescript zawierający wstawkę Pstl, około 1,5 kb z plazmidu pIBB502.
6. 6. Sposób wytwarzania plazmidu pIBB504, znamienny tym, że otrzymany w wyniku trawienia plazmidu pIBB502 enzymem restrykcyjnym Pstl i wyizolowany fragment 1,5 kb łączy się z plazmidem pBluescript trawionym uprzednio również enzymem restrykcyjnym Pstl, po czym mieszaninę liguje się i wprowadza metodą transformacji do komórek Eschierischa coli, które wysiewa się i hoduje w znany sposób na podłożu z ampicyliną i izoluje kolonie zawierające plazmid pIBB504.