CN105039276B - 普鲁兰合成酶、编码基因、载体及应用 - Google Patents

普鲁兰合成酶、编码基因、载体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种普鲁兰合成酶、编码基因、载体及提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用，酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示；首次使用基因工程技术敲除了出芽短梗霉中的普鲁兰合成酶，敲除菌株合成普鲁兰多糖的能力全部消除，说明普鲁兰合成酶在普鲁兰多糖合成过程中具有不可替代的作用；首次利用基因工程技术在出芽短梗霉原始菌中过表达普鲁兰合成酶，重组短梗霉摇瓶发酵普鲁兰多糖的产量能够提高44％。本发明为利用代谢工程技术改造出芽短梗霉的胞外普鲁兰多糖合成途径提供技术基础和方法指导。

Description

普鲁兰合成酶、编码基因、载体及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种普鲁兰合成酶、编码基因、载体及在提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用。
(二)背景技术
出芽短梗霉是一种重要的工业微生物，能够分泌产生多种工业酶，例如淀粉酶，葡萄糖醛酸酶，木聚糖酶和多种胞外兰多糖，例如聚苹果酸，葡聚糖和普鲁兰多糖，其中产量最高的普鲁兰多糖具有良好的生物安全性，生物相容性和延展性，无色，无味，无接触刺激，可广泛应用于生物医药材料，食品包装，化妆品和农业环保领域，具有广泛的应用潜力。
出芽短梗霉是普鲁兰多糖的主要工业生产菌株，高产菌株的普鲁兰多糖生产能力能够达到80g/L发酵液。出芽短梗霉具有很强的胞外普鲁兰多糖合成能力，与其合成途径酶基因有密切关系。但是关于出芽短梗霉多糖的合成途径及其相关基因却始终未有准确阐明。根据已有的研究结果我们归纳出如下结论：在短梗霉细胞中UDPG是所有多糖合成的共同前体分子，UDPG经过不同的糖基转移酶和聚合酶催化，聚合成不同种类的多糖，例如普鲁兰多糖，然后多糖分子经过细胞膜的运输通道，被运输到细胞外。但是到底哪些酶参与了普鲁兰多糖的聚合途径却始终没有详细研究。到目前为止没有检索到任何分子水平的关于短梗霉来源的普鲁兰多糖合成途径相关酶和合成机制的研究成果。本发明首次从出芽短梗霉中克隆得到普鲁兰多糖合成的途径的关键酶-普鲁兰合成酶的编码基因，利用大肠杆菌系统重组表达蛋白，通过普鲁兰多糖体外合成实验，验证了该酶对于反应体系的普鲁兰多糖合成具有促进作用。本发明通过出芽短梗霉基因敲出实验，证明普鲁兰合成酶在普鲁兰多糖的生物合成是不可缺少的，该酶基因的缺失将导致短梗霉普鲁兰多糖合成能力的彻底丧失。本发明通过代谢工程技术，在短梗霉中过表达普鲁兰合成酶，显著提高了菌株普鲁兰多糖的合成产量。本发明提供的出芽短梗霉普鲁兰合成酶的研究成果，将有助于分子水平理解普鲁兰多糖的合成机制，开展短梗霉高产普鲁兰多糖的代谢工程研究具有重要参考价值。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量的酶，即普鲁兰合成酶，同时提供了普鲁兰合成酶编码基因及大肠杆菌重组载体以及普鲁兰合成酶在提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种普鲁兰合成酶，所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述普鲁兰合成酶编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，所述编码基因的cDNA序列为SEQ ID NO.3所示。
本发明涉及一种由所述普鲁兰合成酶编码基因构建的大肠杆菌重组载体。所述载体的构建是将SEQ ID NO.3所示cDNA序列连入pET28a载体的NdeI和XhoI酶切位点而获得。
本发明涉及一种所述普鲁兰合成酶的基因敲除载体pAPKO19pul。所述载体的构建是将SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示上下游同源臂序列融合于SEQ ID NO.6所示的潮霉素表达盒序列两端，组成的融合基因片段，克隆到pMD18-T而获得。
本发明涉及一种用于所述普鲁兰合成酶基因过表达载体，pAPE16pul。所述载体的构建是将SEQ ID NO.7所示18srDNA基因序列融合于SEQ ID NO.6所示的潮霉素表达盒序列5’端，再将SEQ ID NO.8所示18srDNA基因序列融合于SEQ ID NO.9所示的普鲁兰合成酶基因表达盒序列3’端，最后将两个融合基因片段，首尾相连后，克隆到pMD19-T而获得。
本发明还涉及一种所述普鲁兰合成酶在提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用，所述应用是将普鲁兰合成酶编码基因转化入出芽短梗霉中，从而提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量，具体所述的应用是将普鲁兰合成酶整合型过表达载体pAPE16pul，使用PCR的方法获得线性化片段后电击转化入出芽短梗霉中，从而获得胞外多糖产量显著提高的出芽短梗霉工程菌。优选所述出芽短梗霉为出芽短梗霉NRRL Y-2311-1(出芽短梗霉NRRL Y-2311-1公开文献信息：Optimization of high molecular weight pullulanproduction by Aureobasidium pullulans in batch fermentations.Biotechnology Progress.2002 May-Jun；18(3):675-8.)。
本发明的意义在于首次从出芽短梗霉中克隆了参与胞外普鲁兰多糖合成的普鲁兰合成酶编码基因的cDNA和核苷酸序列。普鲁兰合成酶经过大肠杆菌重组表达纯化后的重组蛋白，经过活性测定，能够在添加了UDPG，蔗糖，ATP和短梗霉细胞裂解液的体外合成体系中促进普鲁兰多糖的合成。上述性质这说明这个酶是一个全新的酶。首次使用基因工程技术敲除了出芽短梗霉中的普鲁兰合成酶，敲除菌株合成普鲁兰多糖的能力全部消除，说明普鲁兰合成酶在普鲁兰多糖合成过程中具有不可替代的作用。首次利用基因工程技术在出芽短梗霉原始菌中过表达普鲁兰合成酶，重组短梗霉摇瓶发酵普鲁兰多糖的产量能够提高44％。本发明为利用代谢工程技术改造出芽短梗霉的胞外普鲁兰多糖合成途径提供技术基础和方法指导。
(四)附图说明
图1普鲁兰合成酶的大肠杆菌重组蛋白的SDS-PAGE电泳图和Western图，M：TAKARA蛋白分子量标准(low)，1:BL21(DE3)-28a0.1mM IPTG 25℃诱导，2:BL21(DE3)-PUL-28a未诱导破碎后全细胞，3：BL21(DE3)-PUL-28a 0.1mM IPTG 25℃诱导破碎后全细胞，4：BL21(DE3)-PUL-28a 0.1mM IPTG 25℃诱导破碎后上清，5：BL21(DE3)-PUL-28a 0.1mM IPTG 25℃诱导破碎后沉淀，6：BL21(DE3)-PUL-28a 0.1mM IPTG 25℃诱导纯化；上样量5μL；7：Western蛋白marker，8：纯化蛋白的western。
图2普鲁兰合成酶的活性测定体系催化产物的TLC图谱，1是标准葡萄糖样品，2是标准麦芽三糖样品，3是标准普鲁兰多糖样品，4是反应体系产物。
图3带有普鲁兰合成酶基因组同源臂序列的短梗霉基因敲除载体pAPKO19-pul示意图。
图4带有普鲁兰合成酶cDNA基因片段的短梗霉整合表达载体pAPE16-pul示意图。
图5敲除菌株，原始菌株，过表达菌株普鲁兰产量比较柱状图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
本发明按照SMART cDNA文库构建方法，成功克隆到了普鲁兰合成酶全长基因，构建该蛋白的原核表达载体，并纯化重组蛋白研究其酶学特性及功能验证。
实施例1、普鲁兰合成酶编码基因的克隆
出芽短梗霉高产多糖期cDNA文库构建，完全按照Clontech SMART cDNA文库构建试剂盒说明书所述方法，获得1×1010pfu/ml滴度的cDNA文库。
从文库中随机挑选2000个克隆，送测序，测序引物M13pucF和M13pucR。
M13pucF：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO.10)
M13pucR：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’(SEQ ID NO.11)
通过序列分析，筛选丰度在10个以上的克隆，获得8个新基因，编号为1-8。其中通过Blast同源序列和结构域比对，其中7个基因都可以归入相关蛋白家族，6号基因没有明确保守结构域，我们将其编号为pul基因，预测为普鲁兰合成酶基因，核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
(2)构建普鲁兰合成酶(pul基因)的大肠杆菌重组表达载体
用酵母总RNA提取试剂盒(购自BIOSCI公司，货号为RT001)提取出芽短梗霉NRRLY-2311-1的总RNA，然后用反转录酶试剂盒(购自BIOSCI公司，货号为RT002)合成cDNA第一条链，并以此为模板，进行PCR扩增，
上游引物pulF：ATGCATTTCTCCACCACCATTTTCG(SEQ ID NO.12)
下游引物pulR：CTAATAAGGCACGGTCAAAGCG(SEQ ID NO.13)
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，59℃退火50s，68℃延伸2min，32个循环；68℃后延伸5min；25℃保温10min。将扩增产物与PMD19-T Vector连接，转化E.coliJM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，然后测序获得1436bp的序列，如SEQ ID NO.3所示，即普鲁兰合成酶cDNA序列。
(3)以合成的cDNA第一条链为模板，以带有酶切位点的引物进行PCR扩增，
上游引物pulFNde：CAT ATGCATTTCTCCACCACCATTTTCG(SEQ ID NO.14)
下游引物为pulRXho：CTCGAG CTAATAAGGCACGGTCAAAGCG(SEQ ID NO.15)
PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，59℃退火50s，68℃延伸2min，32个循环；68℃后延伸5min；25℃保温10min。将扩增产物连接PMD19-T Vector，然后转化E.coli JM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，经扩大培养后取菌液提取质粒，将提取的质粒用NdeⅠ和XhoI双酶切后回收1.5k左右的目的片段，然后与NdeⅠ和XhoI酶切后的pet28a(+)载体连接，再转化E.coli JM109感受态细胞，筛选获得阳性重组子，经扩大培养后取菌液提取质粒，获得普鲁兰合成酶重组表达载体，记为PET28a-Pul重组表达载体。
实施例2 普鲁兰合成酶的大肠杆菌系统重组表达与纯化
将构建的重组表达载体PET28a-pul转入E.coli BL21(DE3)中，接种单菌落到LB培养基，37℃，180rpm培养至OD600nm＝0.6-1.0，加入终浓度0.1mmol/L的IPTG诱导6h后，收集菌体，将菌体重新悬浮于20mMTris-HCl缓冲液(pH6.0)，利用超声破碎法裂解菌体，离心分离得到细胞上清；将细胞上清液通过Ni-NTA亲和层析介质(QIAGEN 32210)纯化蛋白，100mM咪唑洗脱获得纯化普鲁兰合成酶。然后用SDS-PAGE检测蛋白，结果如图1所示。由图1可知，在泳道6上约20kDa处出现单一条带，大小符合普鲁兰合成蛋白预测分子量19.4KDa外加0.6KDa的His标签的分子量。由于载体上含有6×His蛋白标签，我们用抗His的单克隆抗体，利用Western-Blot检测，结果如图1泳道8所示，约20Kda出现明显印迹条带，表明带有His标签的普鲁兰合成酶成功重组表达。
实施例3 普鲁兰合成酶重组蛋白的活力测定
(1)短梗霉细胞裂解液制备
接种出芽短梗霉NRRLY-2311-1于产多糖培养基，在30℃、180rpm发酵培养44h，取5ml发酵液，离心收集菌体弃上清，菌体用无菌水洗涤1遍后，加入1ml 20mM Tris-HCLpH6.0缓冲液重悬，置于研钵，倒入液氮快速研磨2min。将全部物质收集倒入EP管，分装成小份，-80℃冻存，随用随取。
产多糖培养基组分：80g/L葡萄糖，2.5g/L酵母提取物，5.0g/L K2HPO4，0.6g/L(NH4)2SO4，0.2g/LMgSO4·7H2O，1.0g/L NaCl，pH 6.8，溶剂为水。
(2)活力测定
1)样品反应体系：
反应混合物包括：20μM UDPG，50μM蔗糖，40μM ATP，50μL 0.1M的Tris-HCl(pH7.0)，50μL 0.1M MgCl2，50μL细胞裂解液，20微升纯化普鲁兰合成酶(实施例2制备)，无菌水补充至总体积250μL。
不加普鲁兰合成酶的反应体系作为背景体系，其他步骤与反应体系相同。
2)活力测定方法：
步骤1：反应混和物在30℃水浴90min后，沸水浴终止反应。
步骤2：1/2反应混合物加入普鲁兰酶5U(Sigma-E2412)40℃处理2h后，在0.05NHCl中沸水浴10min降解剩余的UDPG。反应体系用0.05N的NaOH中和至pH7.0后，12000g，4℃离心10分钟，弃沉淀，用Nelson-Somogyi法测定上清中的还原糖。
步骤3：剩下的1/2反应混和物作为对照反应直接用0.05N HCl沸水浴处理10min，0.05N的NaOH中和至pH7.0后，12000g，4℃离心10分钟，弃沉淀，用Nelson-Somogyi法测定上清中的还原糖。普鲁兰酶处理过的样品体系中的还原糖量减去反应对照中的还原糖量统计为麦芽三糖量。
添加普鲁兰合成酶的反应体系中的麦芽三糖量减去未添加普鲁兰合成酶的背景体系中的麦芽三糖量的差值，定义为反应产物麦芽三糖。
普鲁兰合成酶活性单位定义为：在上述测定的条件下每分钟产生1微摩尔麦芽三糖所需要的酶量为1U。
普鲁兰合成酶比活力定义为：每毫克普鲁兰合成酶对应的活力单位数。
(3)反应体系和背景体系产物薄层层析(TLC)分析
麦芽三糖(Sigma-M8378)，葡萄糖(Sigma-G8270)，普鲁兰多糖(Sigma-91335)级，硅胶板(20×20cm，Merck 100390)。
硅胶板活化：硅胶板用前在100℃烤箱内烤2h，然后置干燥器中冷却，备用。
点样：点样量1μL。点样线距板底1.5cm，样品间距1.5cm。
展开：采用正丁醇﹕吡啶﹕水＝6﹕4﹕3(体积比)为展开剂，置层析缸内室温展开，待展开剂前沿走至距板上端1cm处取出。
显色：经层析展开的硅胶板浸入苯胺-二苯胺显色剂(2％二苯胺丙酮﹕2％苯胺丙酮﹕85％磷酸＝5﹕5﹕1)即刻取出，100℃烘箱烘干使之显色。
(3)结果分析
酶活力测定结果证明普鲁兰合成酶的活力单位为0.5U/μl，比活力为86U/mgprotein，反应体系比背景体系的麦芽三糖含量提高了120％，由于麦芽三糖全部来自于普鲁兰多糖的水解，因此可以认为普鲁兰多糖的合成产量提高了120％。反应体系产物TLC结果如图2，1是标准葡萄糖样品，2是标准麦芽三糖样品，3是标准普鲁兰多糖样品，4是反应体系产物，由图中可以看出产物中除了麦芽三糖斑点，没有其他产物斑点出现，点样点附近的能看到部分没有完全降解的普鲁兰多糖。上述结果说明在添加了重组普鲁兰合成酶的反应体系中经过90min的反应，能够合成多糖产物，该产物经过普鲁兰酶水解后，产物的迁移率与标准麦芽三糖完全一致，确认为麦芽三糖，因此合成的多糖产物确定为普鲁兰多糖。
实施例4 短梗霉中普鲁兰合成酶的基因敲除
(1)短梗霉中普鲁兰合成酶的基因敲除载体pAPKO19-pul构建
设计构建敲除载体pAPKO19-pul的引物，具体引物如下：
Pul上游同源臂引物F：AAGAACACTTTCCAAGAACTCTCCAACG(SEQ ID NO.16)
pul上游同源臂引物R：AGGACCTCGTCGACCCTGTGATATCCTGTCGTC(SEQ ID NO.17)
潮霉素抗性表达盒引物F1：
CGACGACAGGATATCACAGGGTCGACGAGGTCCTCG(SEQ ID NO.18)
潮霉素抗性表达盒引物R1：
TTCAGGCTTTTTCATGTTTGTGTCTGCGGGGTA(SEQ ID NO.19)
潮霉素抗性表达盒引物F2：
TACCCCGCAGACACAAACATGAAAAAGCCTGAACTCAC(SEQ ID NO.20)
潮霉素抗性表达盒引物R2：
TCCCGGTCGGCATCTACTCTATTTCTTTGCCCTCGG(SEQ ID NO.21)潮霉素抗性表达盒引物F3：
CGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAGTAGATGCCGACCGGGATCTGT(SEQ ID NO.22)
潮霉素抗性表达盒引物R3：
GAGGAAGCAGTCAGCGTCGACTAATTCGGGGG(SEQ ID NO.23)
pul下游同源臂引物F：
CCCCCGAATTAGTCGACGCTGACTGCTTCCTCT(SEQ ID NO.24)
pul下游同源臂引物R：CAGTCTCGGTCAGCAGTTCGTCCAGCAC(SEQ ID NO.25)
以出芽短梗霉NRRLY-2311-1基因组DNA为模板，在上游同源臂引物F和上游同源臂引物R作用下，PCR扩增普鲁兰合成酶编码基因5端外侧1000bp的基因组侧翼序列(SEQ IDNO.4)。
以NRRLY-2311-1基因组DNA为模板，在下游同源臂引物F和下游同源臂引物R作用下，PCR扩增普鲁兰合成蛋白基因3端外侧1000bp的基因组侧翼序列(SEQ ID NO.5)。
以出芽短梗霉NRRL Y-2311-1基因组DNA为模板，使用潮霉素抗性表达盒引物F1和R1，PCR扩增TEF启动子片段。
以质粒pcambia33002为模板，使用潮霉素抗性表达盒引物F2和R2，PCR扩增潮霉素抗性基因片段。
以出芽短梗霉NRRL Y-2311-1基因组DNA为模板，使用潮霉素抗性表达盒引物F3和R3，PCR扩增由TEF终止子片段。
将上述三条PCR产物按照TEF启动子，抗性基因，TEF终止子的顺序，以摩尔比1：2：1的比例作为混合模板，进行Overlapping重叠PCR，获得潮霉素抗性表达盒片段(SEQ IDNO.6)。
将序列编号为4，5，6的三个DNA片段，按照对应顺序，摩尔比2：1：1的比例作为混合模板，使用pul上游同源臂引物F(SEQ ID NO.16)和下游同源臂引物R(SEQ ID NO.25)以进行overlapping PCR，产物连入pMD19-T载体，名称为pAPKO19-pul。
Overlappig PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火50s，68℃延伸4min，30个循环；25℃保温10min。
(2)敲除盒片段的获得和转化
以pAPKO19-pul质粒为模板，使用pul上游同源臂引物F(SEQ ID NO.16)和下游同源臂引物R(SEQ ID NO.25)进行PCR，获得敲除盒片段。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性50s，60℃退火50s，68℃延伸4min，30个循环；25℃保温10min。
通过电击法将至少2μg敲除盒片段转化出芽短梗霉NRRLY-2311-1，电击条件为1500V，200欧姆，2ms，通过潮霉素抗性YPD平板筛选，获得在基因组上携带潮霉素抗性基因的重组敲除菌。
实施例5 短梗霉中普鲁兰合成酶的过表达
根据普鲁兰合成酶cDNA序列(SEQ ID NO.3所示)设计构建表达载体的引物，具体引物如下：
pulXhoIF：CCGCTCGAGATGCATTTCTCCACCACCATT(SEQ ID NO.26)
pulNotIR：：
ATAAGAATGCGGCCGCCTAATAAGGCACGGTCAAAGC(SEQ ID NO.27)
然后以普鲁兰合成酶的cDNA为模板，使用引物pulXhoIF和pulNotIR示的核苷酸序列为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为，94℃预变性51min；94℃变性50s，60℃退火50s，68℃延伸2min，30个循环；25℃保温10min；扩增产物通过XhoⅠ和NotⅠ酶切连入经同样酶切的pAPE16载体的多克隆位点中，获得重组质粒pAPE16-pul，如图4所示。获得的pAPE16-pul中目的基因上游装有短梗霉强启动子pTEF1，下游装有终止子TEFTT，筛选标记基因为潮霉素基因。以pAPE16-pul质粒为模板，使用引物F和R，
F：GGGAACATGACATGATTACGC(SEQ ID NO.28)
R：GTGATTAGGCAGTGATTGTATACGA(SEQ ID NO.29)
采用PCR的方法获得带有潮霉素抗性表达盒和pul表达盒的双表达盒线性DNA片段。PCR扩增条件为，94℃预变性51min；94℃变性50s，60℃退火50s，68℃延伸2min，30个循环；25℃保温10min。然后通过电击法将线性片段转化出芽短梗霉，通过潮霉素抗性平板筛选，获得在基因组上携带潮霉素抗性基因的重组过表达工程菌。
实施例6
短梗霉兰敲除株(实施例4制备)，过表达株(实施例5制备)与原始菌株的胞外普鲁兰多糖的合成能力比较
将上述三种菌接种于产多糖培养基，180rpm，30℃摇瓶发酵120小时，同时以出芽短梗霉Y-2311-1原始菌为对照。发酵结束后，发酵液100℃煮沸10min，然后10000g，4℃离心10min，离心收集上清，加入2倍体积冰乙醇，混匀后4℃过夜，12000rpm高速离心10min，弃上清，收集沉淀即为普鲁兰糖，80℃烘干后测定重量。图5结果显示，原始菌株普鲁兰多糖为26.5g/L，工程菌株的普鲁兰多糖产量为38.3g/L，敲除菌株的普鲁兰多糖产量为0.04g/L。表明普鲁兰合成酶的敲除能够基本消除出芽短梗霉普鲁兰多糖的合成能力，该酶基因过表达能够显著提高出芽短梗霉的普鲁兰多糖的产量。
最后说明的是上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种普鲁兰合成酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.一种权利要求1所述普鲁兰合成酶编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
3.一种由权利要求2所述普鲁兰合成酶编码基因构建的重组载体。
4.一种权利要求1所述普鲁兰合成酶在提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用是将出芽短梗霉普鲁兰合成酶编码基因转化入出芽短梗霉中，从而提高出芽短梗霉胞外普鲁兰多糖产量。
6.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述出芽短梗霉为出芽短梗霉NRRL Y-2311-1。
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