DE1442163B2 - Mikrobiologisches verfahren zur herstellung von saurer protease - Google Patents

Description

Es ist bekannt, daß Proteasen, die die Hydrolyse von Peptidbindungen in verschiedenen Proteinen katalysieren, in tierischem Eingeweide sowie in den Zellen und in der Zuchtbrühe von Mikroorganismen, wie Pilzen und Bakterien, enthalten sind. Einige dieser Proteasen können industriell hergestellt werden. Proteasen können nach dem optimalen pH-Wert, bei dem sie katalytisch aktiv sind, in drei Gruppen eingeteilt werden: neutrale Protease, alkalische Protease und saure Protease. Bei den im Handel erhältlichen Proteasen handelt es sich fast ausschließlich um neutrale Protease.

Die bekannten Verfahren zur Herstellung von Protease ergeben relativ niedrige Ausbeuten, da die für die Proteasebildung verwendeten Mikroorganismen eine beschränkte Leistungsfähigkeit haben. Außerdem sind die so hergestellten neutralen Proteasen nur begrenzt einsatzfähig, da sie z. B. bei pH-Werten unter 4 nicht mehr stabil sind.

Bekanntlich wird saure Protease durch Aspergilli gebildet, die typische Pilze (Fungi) sind. Es wurde versucht, saure Protease unter Verwendung eines dieser Mikroorganismen industriell zu erzeugen. Die Versuche waren jedoch bisher erfolglos, da der Mikroorganismus auf einem festen Medium beispielsweise nach dem sogenannten Koji-Verfahren gezüchtet wurde, das sich nicht in den großtechnischen Maßstab übertragen läßt.

Es wurde gefunden, daß ein Stamm von Trametes cinnabarina (Jacq.) Fr., Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd und Poria vaporaria (Fries) Cooke ATCC14624 fähig sind, in guter Ausbeute Protease zu bilden, die sich in hoher Konzentration in der Zuchtbrühe anreichert, und daß es sich hierbei um saure Protease handelt, die mit bemerkenswert hoher und stabiler Aktivität die Hydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen katalysiert. Diese saure Protease zeigt maximale katalytische Aktivität im pH-Bereich von 1 bis 4. Auf Grund dieser Eigenschaft ist sie besonders als Digestivum, das Proteine im Magen aufspaltet, geeignet. Durch dieses Digestivum kann der pH-Wert des Magensaftes stark sauer eingestellt werden (pH 1 bis 3).

Es war bisher nicht bekannt, daß zur Familie Polyporaceae gehörende Mikroorganismen saure Protease zu bilden vermögen.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von saurer Protease durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in wäßrigen, assimilierbare Kohlen- und Stickstoffquellen und übliche Wachstumsfaktoren enthaltenden Nährmedien, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus einen der Stämme von Trametes cinnabarina (Jacq.) Fr. oder von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd 5 oder den Stamm Poria vaporaria (Fries) Cooke ATCC 12 624 einsetzt.

Den hier gebrauchten Klassifizierungsbezeichnungen liegt das System zugrunde, das in »Mycological Flora of Japan« von Seiya It o, Vol. II (herausgegeben

ίο von Yokendo, Tokio, 1955) veröffentlicht wurde.

Die in das Verfahren der Erfindung eingesetzten Mikroorganismen bilden in guter Ausbeute eine stabile saure Protease von hoher Aktivität. Durch Verwendung dieser Mikroorganismen ist die industrielle Herstellung von saurer Protease möglich geworden.

Als assimilierbaren Kohlenstoff liefernde Stoffe

eignen sich Glukose, Dextrin, lösliche Stärke, Saccarose, Maltose und Laktose. Die verschiedensten organischen Verbindungen bzw. organische Stoffe, wie organische Ammoniumsalze, organische Nitrate, Harnstoff, verschiedene Aminosäuren, Maismaische, Pepton, Polypepton, Kasein, Fleischextrakt, Sojabohnenkuchen, Sojabohnenmehl und Kartoffelbrei, eignen sich zur Einführung nicht nur des Kohlenstoffs, sondem auch des digerierbaren Stickstoffs, der jedoch auch in Form von anorganischen Stickstoffverbindungen, z. B. von anorganischen Ammoniumsalzen, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, oder von anorganischen Nitraten, wie Natriumnitrat, Kaliumnitrat, eingeführt werden kann. Zusätzlich hierzu werden zweckmäßig Mineralsalze, Phosphate, Vitamine oder Wachstumsfaktoren, z. B. wasserlösliche Salze von Vitamin B₁, als Hilfsnährstoffe in der Nährlösung verwendet.

Der pH-Wert des Kulturmediums wird zu Beginn auf etwa 3 bis 7 eingestellt. Bei Verwendung eines Stamms von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd zur Bildung der sauren Protease wird empfohlen, den pH-Wert des flüssigen Mediums während der Bebrütung bei etwa 3, insbesondere zwischen 3,0 und 3,2 zu halten, da hierbei das gebildete Kulturfiltrat mehr als die doppelte Menge an saurer Protease enthält, als wenn das Medium auf etwa pH 5 eingestellt ist.

Die Herstellung der sauren Protease ist auch mit Hilfe des sogenannten Koji-Verfahrens möglich, bei dem feste Stoffe, wie Sägemehl, Reiskleie, Weizenkleie, für die Züchtung verwendet werden.

Die Bebrütung erfolgt zweckmäßig bei üblichen Temperaturen von etwa 25 bis 35° C. Die in der Zuchtbrühe angereicherte Protease erreicht gewöhnlich ihr Maximum zwischen dem zweiten und 15. Tag der Bebrütung. Unter diesen Bedingungen reichert sich die gebildete Protease nicht innerhalb des Mycels an, sondern sie dringt nach außen und reichert sich im Kulturmedium an. Beim Verfahren gemäß der Erfindung wird daher die angereicherte Protease hauptsächlich aus dem flüssigen Teil der Kulturbrühe, und zwar gewöhnlich nach deren Filtraten, gewonnen.
Zur Abtrennung der Protease können allgemein bekannte Methoden zur Gewinnung von Enzymen aus ihren Lösungen angewendet werden. Die gemäß der Erfindung gebildete Protease kann an verschiedenen Adsorbentien adsorbiert oder auch mit Hilfe einiger Fällungsmittel ausgefällt werden. Ferner können allgemeine Gewinnungsmethoden, wie Fällung in der Nähe des iso-elektrischen Punktes, Aussalzen, Dialyse und Kombinationen dieser Methoden zur Abtrennung und Reinigung angewendet werden.

Beispielsweise kann man eine wäßrige Lösung, die die Protease enthält, aussalzen, indem man ein Salz, wie Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Natriumchlorid, zur Lösung gibt. Oder man kann sie der fraktionierten Fällung unterwerfen, indem man ein geeignetes hydrophiles organisches Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, n-Propanol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, zur Lösung gibt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene saure Protease ist bei Temperaturen von z. B, 40 bis 50° C oder, wenn die saure Protease gleichzeitig mit ihren Substraten, d. h. Proteinen, behandelt wird, von 60 bis 70⁰C, im stark sauren pH-Bereich stabil. Daher kann das filtrierte Zuchtmedium, in dem die Proteasekonzentration noch niedrig ist, unmittelbar unter vermindertem Druck eingeengt werden. Es kann auch das Gefriertrocknungsverfahren angewendet werden.

Wenn die Abtrennung durch Adsorption erfolgen soll, können beispielsweise die folgenden bekannten Adsorbentien verwendet werden: Calciumphosphat, Aluminiumoxyd, Bentonit (natürliches kolloides hydratisiertes Aluminiumsilikat), Magnesiumsilikat, Carboxymethylcellulose, schwach saure Kationenaustauschharze vom Carbonsäuretyp wie Mischpolymerisat-Austauschharze mit Carboxylgruppen (schwach sauer) und Harze auf Basis vernetzter Methacrylsäureverbindungen. Diese Austauschharze sind in »Ion Exchange Resins« von Robert K u η i n, 2. Auflage., S. 85 bis 87 (John Wiley & Sons, Inc., 1958), beschrieben.

Die Protease kann aus ihrer wäßrigen Lösung durch Zusatz von Protein fallenden Mitteln, wie Nucleinsäuren, Gerbsäuren, Phosphorwolframsäure, gefällt werden. Die Ausfällung der Protease wird durch Einstellung des pH-Wertes der Lösung auf den isoelektrischen Punkt erleichtert. Zur Reinigung der sauren Protease kann auch Elektrodialyse angewendet werden.

Die gemäß der Erfindung hergestellte und gewonnene saure Protease katalysiert überaus stark die Hydrolyse von Peptidbindungen in Proteinen. Die katalytische Wirkung ist von der Art der Proteine unabhängig. Die Protease vermag daher die verschiedensten Proteine, wie Kasein, Hämoglobin und Albumin in gleich starkem Maße aufzuspalten.

Die folgenden Versuche zeigen die Aktivität der sauren Protease und lassen ihre praktischen Anwendungsmöglichkeiten erkennen. Bei diesen Versuchen wurde als Proteasepräparat das pulverförmige Enzym verwendet, das mit Aceton aus der durch Züchtung eines Stamms von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd erhaltenen und filtrierten Brühe extrahiert worden war.

a) Einwirkung der Protease auf Fleisch

In 20 cm³ einer wäßrigen Suspension von 0,1 g gemahlenem Fleisch in einer auf pH 2,8 eingestellten Pufferlösung ließ man das Proteasepräparat in einer 10 mg Protein entsprechenden Mengen bei 55° C mit dem gemahlenen Fleisch reagieren. Nach 20 Minuten bildete sich bei Zusatz von Trichloressigsäure zum Gemisch keine Fällung. Die Absorption der Suspension bei einer Wellenlänge von 275 πιμ. — entsprechend der charakteristischen Absorptionsbande von Tyrosin — nahm erheblich zu und erreichte ihr Maximum 80 Minuten nach Beginn der Reaktion. Nach 100 Minuten verlor das gemahlene Fleisch die natürliche Zähigkeit bzw. Klebrigkeit und wurde bröckelig. Ließ man dagegen die gleiche Fleischsuspension ohne Zusatz der Protease bei 55° C stehen, zeigte sich nach einer weit längeren Zeit als 100 Minuten keine Veränderung.

	IO	O	Absorption (Ε-Wert) der
Reaktionszeit	20	Fleischsuspension bei einer
Minuten	40	Wellenlänge von 275 Γημ
60	(Schichtdicke 1 cm)
5 80	0,000
100	0,455
0,460
0,540
0,680
0,680

b) Einwirkung der Protease auf Abfallhefe

ao Bei der Extraktion von Ribonucleinsäuren aus Hefe erhaltene Abfallhefe, die auf Grund der Zellwände nicht löslich ist, wird durch Einwirkung der sauren Protease löslich gemacht. In je 5 cm³ der nachstehend aufgeführten Enzymlösungen, deren Konzentration 300 mg/100 cm³ betrug, wurden 100 mg Abfallhefe suspendiert. Die Suspensionen wurden 24 Stunden bei 37° C stehen gelassen. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

30	Enzym	Acidität des Mediums	Löslich gemachter
			fester Teil, bezogen auf ursprünglichen festen Teil der Ab
	Pepsin	1/100 n-Salz-	fallhefe (%)
35		säure	11,9
	Trypisin	pH 7 (Phosphat
		puffer)	26,4
	Saure Pro	1/100 n-Salz-
	tease	säure	61,0
40

Einige Ausführungsformen des Verfahrens gemäß der Erfindung sind in den folgenden Beispielen -beschrieben, in denen die Prozentsätze sich auf das Gewicht beziehen, falls nicht anders angegeben. »ATCC« bedeutet »American Type Culture Collection, Washington, D. C, USA.«.

Beispiel 1

51 eines auf etwa pH 5,2 eingestellten Mediums aus 5% Dextrin, 2% Maismaische, 0,15 °/₀ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 °/₀ Magnesiumsulfat (7 Mol Kristallwasser), 2 mg/1 Thiaminhydrochlorid, Rest Wasser, wurden mit einem Stamm von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd beimpft. Dann wurde 6 Tage unter Schütteln bei einer Temperatur zwischen 25 und 60⁰C bebrütet. Nach der Bebrütung war das Mycel stark gewachsen. Durch Zentrifugieren wurde eine klare wäßrige Schicht vom Mycel abgetrennt.

Zur wäßrigen Schicht wurde Äthanol gegeben, wobei sich 25 g weißes pulverförmiges Enzym abschieden. Die enzymatische Aktivität des Pulvers als Protease bei einem pH-Wert von 3,0 war folgende:

PE ^Kas-_x ³⁷°.^C' 275 ηαμ
mg-Aquiv. Tyrosin

Die Abkürzung für die Aktivität der Protease bedeutet, daß Kasein als Substrat der Einwirkung der

5 6

Protease bei 37° C für 20 Minuten ausgesetzt und die innerhalb des Diaphragmas verblieb, wurden all-

Zunahme der Lichtabsorption während der Reaktion mählich unter Kühlung etwa 20 Volumprozent ge-

bei einer Wellenlänge von 275 ΐημ gemessen wurde, kühltes Aceton gegeben. Das Gemisch wurde in einer

wobei die einem mg-Äquivalent Tyrosin entsprechende Eiskiste stehengelassen. Nach 24 Stunden begannen

Absorption bei der gleichen Wellenlänge als Einheit 5 Kristalle aufzutreten. Die Kristallisation war nach

der enzymatischen Wirksamkeit genommen wurde. 4 bis 5 Tagen abgeschlossen. Die Aktivität des kri-

Bei Verwendung eines Stamms von Trametes cinn- stallinen Enzyms als Protease war folgende:

abarina (Jacq.) Fr. an Stelle eines Stamms Trametes ^ 37⁰C 275 u.

sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd in dem vorstehend be- PE _mg_Ä_quiv Tyrosin ^{= 3}>⁶⁵/^mS ^Protein

schriebenen Versuch wurde ebenfalls saure Protease 10

in Pulverform erhalten. Der hier verwendete Stamm Es wurde festgestellt, daß 10°/o der im Kultur-

von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd hat die filtrat vorhandenen Aktivität als Protease im kri-

Nr. ATCC 14 622, der Stamm von Trametes cinnaba- stallinen Produkt erhalten geblieben war. Es wurde

rina (Jacq.) Fr. ist unter der Nummer ATCC 14 623 ferner gefunden, daß die spezifische Aktivität des

hinterlegt. 15 Produkts etwa 20mal so hoch war wie die des Kultur-

Die auf die beschriebene Weise erhaltene kristalline

5 1 eines auf einen pH-Wert von 5,2 eingestellten saure Protease hatte folgende Eigenschaften:

Zuchtmediums aus 5°/₀ Glukose, 0,3 °/₀ Polypepton, Ihre optimale pH-Wert-Aktivität beträgt etwa 2,3

0,15 °/„ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 °/₀ Magne- 20 bis 2,5, wie aus F i g. 1 ersichtlich (Prüfung der

siumsulfat (7 Mol Kristallwasser), 0,2 °/₀ Hefeextrakt, Aktivität mit Kasein als Substrat). Ihre optimale

2 mg/1 Thiaminhydrochlorid, Rest Wasser, wurde mit Temperatur-Aktivität liegt bei etwa 55 bis 60°C, wie

Poria vaporaria (Fr. non Pers.) Cooke ATCC 14 624 aus F i g. 5 ersichtlich (Prüfung der Aktivität mit

beimpft. Dann wurde 6 Tage unter Schütteln bei einer Kasein als Substrat). Ihre optimale pH-Wert-Aktivität

Temperatur von 28 bis 30⁰C bebrütet. Nach der Be- 25 gegen Hämoglobin liegt bei 2,8 (siehe F i g. 2) und

brütung wurde die Nährmittellösung filtriert. Die bei 3,4 gegen Eieralbumin (siehe F i g. 3).

Aktivität des Filtrats als Protease wurde nach einer Die Protease ist im pH-Bereich von 2,0 bis 6,5

Modifikation der Kunitzschen Methode unter Ver- stabil (siehe F i g. 4) und verliert ihre Aktivität, wenn

wendung einer Laktatpufferlösung ermittelt, die einen sie ohne Substrat 10 Minuten auf 70° C erwärmt wird

pH-Wert von 2,8 hatte: 30 (siehe F i g. 6).

Kas 37°C 275 u. ^^{e wurc}*^{e an e}i^ner Säule aus Carboxymethylcellu-

PE _„/x'_ ,,· t,„.„J£, — 8,08 · 10~²/cm³ lose adsorbiert, dann stufenweise mit einer 0,02molaren

mg/Aquiv. 1 yrosm ' ei- _XT ' . . . _π ™ ,.. _ττ., _c

Salzsaure - Natriumacetat - Pufferlosung vom pH 3,5

Nach Zusatz von Äthanol zur filtrierten Nährlösung bis 5,5 eluiert, wobei die allein aktive Fraktion erhalten

wurden 20 g des pulverförmigen Enzyms erhalten, 35 wurde.

das die Wirksamkeit der sauren Protease zeigte. Ihr Ultraviolett-Absorptionsspektrum ist charak-

. · 1 1 teristisch für typisches Protein, das eine maximale

Beispiel 3 Adsorption bei einer Wellenlänge von 277 bis 280 ΐημ

30 1 eines Nährmediums, dessen pH-Wert 3,0 bis aufweist (F i g. 7).

3,2 betrug, wurden mit Trametes sanguinea (L. ex Fr.) 4° Die Einheitlichkeit der Substanz wurde durch Lloyd ATCC 14 622 beimpft. Das Medium hatte Elektrophorese (Gerät nach Tiselius) bestätigt, wobei folgende Zusammensetzung: 5°/₀ Dextrin, 2% Mais- 15°/o des enzymatischen Proteins im Phosphatpuffer maische, 0,15 °/₀ Kaliumdihydrogenphosphat, 0,05 °/₀ (μ = 0,1) von pH 6,08 dem elektrischen Feld bei Magnesiumsulfat (7 Mol Kristallwasser), 2 mg/1 Thi- 72 V und 10 mA 3 Stunden ausgesetzt wurden. Auch aminhydrochlorid, Rest Wasser. Es wurde 6 Tage 45 die Analyse mit der Ultrazentrifuge im Acetatpuffer unter Bewegung und Belüftung bei einer Temperatur (U = 0,1) von pH 5,0 bei einer Umdrehungszahl von von 25 bis 30⁰C bebrütet. Nach der Bebrütung wurde 9,667 · 10²/Sek. für 75 Minuten zeigte, daß die unterdie Kulturbrühe filtriert. Zum Filtrat wurde Aceton suchte Protease einheitlich war. Die Sedimentationsgegeben, wobei sich 150 g weißes pulverförmiges konstante betrug 2,95 · 10-¹³ bei 17° C, woraus das Enzym abschieden. Das Pulver wurde in einer geringen 50 Molekulargewicht der sauren Protease mit etwa Menge einer 0,02molaren Salzsäure-Natriumacetat- 30 000 errechnet wurde.

Pufferlösung gelöst, die einen pH-Wert von 3,5 hatte. Bei dem im Beispiel beschriebenen Versuch kann Die Lösung ließ man durch eine Säule eines schwach es geschehen, daß die dialysierte Lösung gefärbt ist. sauren Kationenaustauschers mit Carboxylgruppen Diese Störung kann jedoch behoben werden, indem man laufen, der mit einer Pufferlösung der gleichen Zu- 55 die Lösung durch eine mit einem schwachbasischen sammensetzung vorbehandelt worden war. Die am Anionen austauschharz auf Basis von Styrol-Misch-Harz adsorbierte Protease wurde mit der auf pH 5,5 polymerisaten gefüllte Kolonne laufen läßt,
eingestellten 0,5molaren Salzsäure-Natriumacetat-Pufferlösung eluiert. Aus dem Eluat wurden Frak- Beispiel 4
tionen, die als Protease aktiv waren, abgetrennt und 60 Cnacheereichf)
der fraktionierten Fällung mit Ammoniumsulfat

unterworfen. Die bei 40- bis 80°/<,iger Sättigung mit 5 leinesauf etwa pH 5,2 eingestellten Kulturmediums Ammoniumsulfat erhaltenen Fällungen wurden abge- aus 5°/₀ Dextrin, 2°/₀ Maismaische, 0,15 % Kaliumtrennt und in einer geringen Menge der vorstehend dihydrogenphosphat, 0,05 °/o Magnesiumsulfat (7MoI genannten, auf pH 3,5 eingestellten 0,02molaren 65 Kristallwasser), 2 mg Thiaminhydrochlorid/Liter, Rest Pufferlösung gelöst. Die Lösung wurde 24 Stunden Wasser, wurden mit jedem der in der Tabe Ie 1 aufgegen eine Pufferlösung der gleichen Zusammensetzung geführten Stämme beimpft. Dann wurde 6 bis 9 Tage wie das Lösungsmittel dialysiert. Zur Lösung, die unter Schütteln bei einer Temperatur zwischen 25

und 30⁰C bebrütet, bis das Mycel stark gewachsen war. Durch Zentrifugieren wurde eine klar wäßrige Schicht vom Mycel abgetrennt. Zur wäßrigen Schicht wurde Äthanol gegeben, wobei ein festes Gemisch saurer Protease erhalten wurde. Die enzymatischen Aktivitäten der Proteaseproben sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.

Tabelle 1

	Stamm	Aktivität	Be brütung (Taee)
Spezies		pEKas..37°C,275n^ mg-Äquiv. Tyrosin
	IFO 4923	(pro mg Protein)	7
Trametes	IFO 4924	22,85	7
sanguinea	IFO 4925	10,72	9
(L. ex Fr.)	IFO 4926	12,95	8
Lloyd	IFO 6489	5,14	8
	IFO 6490	10,55	8
	IFO 6491	5,25	9
	IFO 6492	9,68	9
	IFO 6493	56,51	6
	IFO 6494	41,92	6
	IFO 6495	13,10	6
	IFO 6139	4,10	6
Trametes	IFO 6485	3,66	9
cinnaba-	IFO 6486	3,65	9
rina	IFO 8255	4,27	6
(Jacq.) Fr.	7,85

Vergleichsversuch (nachgereicht)

Es werden Vergleichsversuche durchgeführt, in denen die Aktivität der erfindungsgemäß hergestellten sauren Protease der des kristallinen Pepsins gegenübergestellt wurde.

Die Versuche wurden nach der Anson-Hagihara-Methode durchgeführt, die beschrieben ist in »Annual Report of Scientific Works from the Faculty of Science«, Osaka University, Volumen 2, S. 56 (1954).

Als Versuchssubstrat wurden 20 mg Milchkasein und als Proteasen 0,031 mg erfindungsgemäß hergestellte Protease und 0,031 mg kristallines Pepsin verwendet. Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

Versuchsprobe	Aktivität mg (Protease-Einheit/ mg Protein)
1 2	1280 840

Es ist erkennbar, daß die erfindungsgemäß hergestellte saure Protease beim Aufschließen von Kaseineiweiß eine etwa l,5mal höhere Wirksamkeit hat als kristallines Pepsin.

Dagegen ist die Aktivität der gemäß dem amerikanischen Verfahren (USA.-Patentschrift 2 848 371) hergestellten Protease beim Abbau des Milchkaseins

as nur halb so groß wie von kristallinem Pepsin. Die erfindungsgemäß gewonnene saure Protease hat demnach gegenüber dem aus der USA.-Patentschrift 2 848 371 bekannten Produkt eine um etwa das 3fache höhere Aktivität.

Hinzu kommt, daß die erfindungsgemäß hergestellte saure Protease eine höhere Stabilität aufweist als die Protease der USA.-Patentschrift 2 848 371, denn diese verliert ihre Aktivität bereits, wenn sie 10 Minuten lang der Einwirkung einer Temperatur von 55° C ausgesetzt wird. Die erfindungsgemäß gewonnene Protease ist dagegen bei 55 bis 60° C noch stabil.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

209 585/359

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von saurer Protease durch aerobes Züchten eines Mikroorganismus in wäßrigen, assimilierbare Kohlen- und Stickstoffquellen und übliche Wachstumsfaktoren enthaltenden Nährmedien, dadurch gekennzeichne t, daß man als Mikroorganismus einen der Stämme von Trametes cinnabarina (Jacq.) Fr. oder von Trametes sanguinea (L. ex Fr.) Lloyd oder den Stamm Poria vaporia (Fries) Cooke ATCC 14624 einsetzt.