JPS5950314B2 - 固定化酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素の製造法に関し、より詳しくは水溶
性ポリマーであるプルランと該プルランの水酸基と反応
してエーテル結合を形成する二官能性物質との反応生成
物から々る親水性ゲルを担体とする固定化酵素の製造法
に関する。

本発明の目的は、酵素活性が高く、安定な固定化酵素の
簡便な製造法を提供することにあり、基質の酵素への連
続的接触反応を可能にし、反応溶液を固定化酵素から分
離すると反応が停止するという効率的な使用を可能にす
る固定化酵素の製造法を提供することにある。

分子中にグルコース単位を含む多糖類が酵素固定化用担
体として利用される例としては、従来よりセルロース及
びデキストランゲルが公知であり、又類似の担体として
アガローズゲルも利用されて来た。

しかしながら、セルロース類は連続使用中に反応液への
可溶化を起し、耐久性に欠ける。

又単位担体重量当り多量の酵素を固定化することは非常
に困難である。

デキストラン架橋物やアガローズゲルは単位重量当り比
較的多量の酵素を固定化できるが、希望する重合度のデ
キストランやアガローズを直接得る事は困難であり、例
えばデキストランの場合は非常に高分子量物を生成した
後、部分的に加水分解し、希望する分子量のものを得る
。

アガローズの場合も寒天からアガロペクチンを取り除く
必要があり、又分子量の調節も困難である。

この様な理由の為にデキストランゲルやアガローズゲル
は非常に高価であり、これらの物質を工業的規模で酵素
固定化担体として使用することは、担体の再使用が出来
る固定化法の場合を除いては経済的に大きな負担となる
。

本発明者らはこれらの問題を顧みて鋭意検討を行った結
果、製造の際に分子量制御が可能で種々の優れた特徴を
有するプルランを架橋せしめて得られる親水性ゲル（特
願昭５０−７６２６７号）を担体として固定化された酵
素は活性が高く優れた性質を示すことを見い出した。

本発明に用いられるプルランはグルコースの三量体であ
るマルトトリオースを単位として、この三量体とは異っ
た結合であるα−１，６結合により反復結合した線状重
合体であり、グルコース単位に含まれる水酸基の反応性
を利用してエーテル結合を形成する二官能性物質との反
応によって三次元網目構造からなる親水性ゲルが得られ
る。

プルランはグルコース単位から成り成っているとは云え
、従来より知られている多糖類例えばデンププンやその
誘導体或いはセルロースやその誘導体等とは分子構造が
全く異りその状質にも著しい相違がある。

例えばプルランは冷水及び熱水にも極めて溶解し易く、
その水溶液の粘度が著しく低いことしかもその水溶液は
他の多糖類の水溶液に比較してゲル化、老化などの現象
も々く長期間安定であり、又プルランそのものに毒性が
なく生体親和性が非常に良好である等の多くの好ましい
性質を有している。

プルランの製造方法には特に制限はない。

現在は不完全菌であるプルラリャ属の菌株を培養するこ
とにより菌体外粘質物として分離採取されるのが一般的
である。

必要ならば培養液から遠心分離により菌体を除外し、メ
タノールで沈澱分離を行うことにより精製される。

なおプルランの分子量は特に制限はないが平均分子量が
Ｉ Ｘ １０’ 以上であることが望ましい。

適当な二官能性物質としては、エピクロルヒドリン、エ
ビブロモヒドリン、ジクロルヒドリン、シフロモヒドリ
ン、エチレンクリコール−シフリシジルエーテル、トリ
エチレングリコール−ジグリシジルエーテル、ジグリシ
ジルエーテル、■。

６−ヘキサンシオールージクリシジルエーテル等が例示
される。

親水性ゲルを得る為の架橋反応は水酸化ナトリウム、水
酸化カリウム、水酸化カルシウム等のアルカリ性物質の
存在下で、水溶液中或いは水を含む混合溶媒中で通常室
温から７０℃までの温度範囲で、１時間から数時間以上
かけて行なわれる。

他の条件が同一ならば親水性ゲルの架橋度は溶媒量が少
ない程大きくなり、又プルランの分子量或いは二官能性
物質の添加量の増大と共に大きくなる。

つまり６固い”ビーズとなる。ビーズの６固さ”即ち膨
潤状態に於ける含水率は工ないし５０１−／ｌＰの範囲
のものが好ましい。

あまりに大きい含水率のものは機械的強度が弱く、逆に
含水率の極度に小さいものは、網目すなわち細孔サイズ
が小さくなり過ぎる上に酵素の固定化の際に利用できる
水酸基の数も少くなるからである。

酵素の固定化担体としては球状のゲルが好ましいが、こ
れは、通常２０重量％ないし６０重量係濃度のプルラン
水溶液を該溶液と不混和性でかつポリヒニルアセテート
、ポリスチレンやポリエチルビニルエーテル等の様な分
散安定剤を含有する液体分散媒（例えばノルマルヘキサ
ン、ヘプタン、イソオクタン、さンセン、トルエン等）
中に液滴として分散せしめた二相系で攪拌速度を制御し
ながら反応させる事によって得られる。

生成するゲル粒子の大きさは分散条件を経験的に思い出
すことによって決定されるが、粒子の大きさには通常分
布があるので必要ならば篩を用いて分級される。

酵素固定化担体として用いる為には１０μ〜５００μの
直径を有する球状が望ましい。

かくして調製された親水性ゲル担体への酵素の結合様式
に関しては、グルコース単位中或いは場合によっては二
官能性物質中に含まれる水酸基の反応性を利用する種々
の結合方法が全て適用されうる。

その中で１塩化シアヌールを用いるトリアジニル誘導体
による結合法、２アジド結合による結合法、３ジアゾ結
合による結合法、４モノ・・ロゲンアセチル誘導体によ
る結合法及び６チタン、錫、ジルコン又は鉄の誘導体と
の反応による結合法等の方法が当該親水性ゲルへの固定
化法としては特に優れており、高活性で活性保持率の高
い固定化酵素が得られることを見い出した。

本発明の固定化法が適用される酵素は上記結合法によっ
て酵素活性が全くなくなるものでなければ特に制限はな
い。

例えばトリプシン、キモトリプシン、リパーゼ、微生物
起源のプロテアーセ、エステラーゼ、コリンエステラー
ゼ、ウレアーゼ、プロメライン、リボヌクレアーゼ、デ
オキシリボヌクレアーゼ、ペニシリンアミダーゼ、アミ
ノアシラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースイン
メラーゼ、グルコースオキシダーゼ、クレアチンキナー
ゼ、ミオシンＡＴＰアーゼ、パパイン、インベルターゼ
、ペプシン、β−アミラーゼ、イソアミラーゼ、マルタ
ーゼ、ウリカーゼ等が効果的に固定化される。

次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、こ
れらは単なる例示であって、その趣旨を越えない限り以
下の実施例によって限定されるものではなく種々の変法
が可能である。

実施例 １ 平均分子量１０万のプルランをエピクロルヒドリンで架
橋させて調製し、膨潤時の含水率が３．５？／？で、乾
燥時のゲル直径が３７μないし７４μの親水性ゲル２．
ＰをＩＮ濃度の苛性ソーダ２５ｄに浸漬し、室温で１５
分間攪拌後過剰のアルカリ溶液を濾過し取り除いた。

次にこの親水性ゲルを５分間室温で２５−のジオキサン
に浸漬すせ、攪拌後前もって調製しておいた４ｔの塩化
シアヌールを含む２０Ｗｔｌのジオキサン溶液を加え、
室温で激しく攪拌した。

１分後２５ｍの氷冷水を反応溶液に加え、次いで手ばや
く酢酸２５ｄを加え反応を停止させた。

混合液をＥ過後親水性ゲルを手ばやく冷すセトン及び氷
冷水で洗滌し、直ちに固定化反応に供した。

即ち１６５ＷＩＩｉのプロナーゼを２０ｄのリン酸緩衝
液に溶解しｐＨ８，０４℃に保持しておいた溶液に上述
の方法で得られたＳ−）ジアジニル化親水性ゲルを加え
、攪拌しながら０．２Ｎ濃度の苛性ソーダの添加により
ｐＨを８゜Ｏに保ち、温度を４℃以上に上昇させない様
に注意しながら５時間固定化を行った。

５時間後固定化酵素を炉別し、５Ｍ濃度の塩化す） Ｉ
Ｊウム溶液と０゜ＩＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ６゜０
）及び冷水で洗液に蛋白質が見い出されなくなるまで洗
滌した。

洗滌液を回収し、回収液の２８０μｍに於ける紫外吸収
強度より算出した固定化酵素量は乾燥ゲル１．Ｐ当り７
６■であった。

こうして得られた固定化酵素の比活性をＤＬ−リジンメ
チルエステルを基質とし、１０重量係の基質濃度で３０
℃ｐＨ６，０に於いてｐＨスタットで測定したところ２
゜５３μｍｏ ｌ ｅ ｓ／Ｗ ・ｗｉｎ で、溶液
状酵素の比活性の５２％であった。

実施例 ２ 平均分子量１０万のプルランとエピクロルヒドリンの反
応によって調製した膨潤状態の含水率が２７ ｔ／ｌで
、乾燥時のゲル直径が３７μないし７４μの親水性ゲル
２Ｆを実施例１と同一の条件で塩化シアヌールと反応さ
せ、洗滌しＳ−）ジアジニル化親水性ゲルを得た。

ストレプトマイセスファエオクロモゲネスより得たグル
コースイソメラーゼ（１１０Ｕｎｉ ｔ／１７Ｗ） ６
０１１１？を溶解した０、０５罰濃度のリン酸緩衝液２
５ｍ１に８−）ジアジニル化親水性ゲルを添加し、実施
例１と同様の操作で固定化及び洗滌を行った。

０゜ＩＭ濃度のグルコースを含むリン酸緩衝溶液（０，
０５罰濃度、ｐＨ７，５，０，００５Ｍ濃度のマグネシ
ウムイオン含有）５０ｄを用いて、７０℃で１時間振盪
し、この固定化酵素の活性を測定したところ、固定化さ
れた酵素は４９５０Ｕｎｉｔであった。

この固定化酵素のうち３５００Ｕｎｉｔに当る分量だけ
とり直径８間の外套管付きカラムにつめ、外套管に７０
℃の温水を循環させながら３Ｍ濃度のグルコース溶液（
ｐＨ７，５，０，００５Ｍマグネシウムイオン含有）を
５Ｖ＝３ 、５ ｈｒ−１で流入させ、流出液のフラク
トース量をシスティン−カルバゾール硫酸法で定量した
ところ、グルコースよりフランクドースへの転換率は５
２％であった。

実施例 ３ 平均分子量６万のプルランとエピクロルヒドリンの反応
によって調製した膨潤状態の含水率が５．６ ？／Ｉ−
で、乾燥時のゲル直径が７４μないし１２５μの親水性
ゲル２Ｆを２Ｎ濃度の苛性ソーダ液に浸した後、水−メ
タノール混合溶媒中でモノクロル酢酸を用いてカルボキ
シメチル化した。

次いでメタノール中で塩化水素ガスを用いてメチルエス
テル化し、更に抱水ヒドラジンで親水性ゲルをヒドラジ
ド化した。

その後３ｑ６亜硝酸ソーダ溶液でアジド化し、直ちに市
販ウレアーゼ１０００サムナ一単位を含むリン酸緩衝液
２５ｄに浸漬し、４℃で１２時間ゆっくり振盪しながら
固定化反応を行った後、５Ｍ濃度のＮａｑ溶液、０．１
Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ６７）及び蒸留水で固定化
酵素を洗滌した。

得られた固定化酵素の活性をファンスライスらの比色法
で求めたところ４８０サムナ一単位であった。

実施例 ４ 実施例２で用いたのと全く同じ親水性ゲル２１をブロモ
酢酸２５１を溶解させたジオキサン２０ｄに浸漬し、室
温で８時間ゆっくり攪拌した。

次いで１７罰のブロモアセチルプロミドを徐々に滴下し
、滴下後約６時間攪拌を続けた。

反応波水冷した０、１Ｍ濃度の炭酸す） ＩＪウム溶液
及び氷冷水で洗滌しブロモアセチル化親水性ゲルを得た
。

このブロモアセチル化親水性ゲルをアミノアシラーゼ（
１万単位／、Ｐ） １００■を溶解した０、２Ｍ濃度の
リン酸緩衝液（ｐＨ８、５）に浸漬し、５℃で１８時間
ゆっくり攪拌しながら固定化反応を行い、次いで得られ
た固定化酵素を繰り返し洗滌した。

０゜２Ｍ濃度のＮ−アセチル−ＤＤ−メチオニン溶液（
ｐＨ７。

０ ０ 、５ ｘ １０−’モルＣ。す２含有）を基質
として、３７℃で固定化酵素の活性をＬ−メチオニン生
成量より測定したところ３７０単位であった。

活性固定率３７％。この固定化酵素を用いて活性測定を
１０日間に１０回繰り返して行ったが１０回目の活性は
最初の固定化酵素活性の９２チを保持していた。

実施例 ５ １５ ％ Ｗ／Ｖ塩化チタン（ＩＶ）溶液１０ｍ１に実
施例３で使用したのと同じ含水率及び直径を持つ親水性
ゲル１゜０．Ｐを浸漬し、５分間よく攪拌した後沖過し
、多量の水で洗滌した後戻にＰＨ５゜０の酢酸緩衝液で
洗滌した。

次いで１００■のインベルターゼを含有するｐＨ５、Ｏ
のＯ０ＩＭ濃度のコハク酸塩緩衝溶液中に、この親水性
ゲル−チタン誘導体を浸漬し４℃で１８時間攪拌し、固
定化を行った。

０゜５Ｍ濃度の塩化ナトリウムとＯｏＩＭ濃度のコハク
酸塩緩衝液で良く洗滌した後、この固定化酵素の活性を
ｐＨ５、ＯのＯ０ＩＭ濃度のコハク酸塩緩衝液中の１チ
スクロース溶液を用いて５５℃で測定したところ７２０
単位であった。

なお、１単位のインへルターゼ活性とはｐＨ５゜０，５
５℃で１分間に１Ｍモルのグルコースを遊離する酵素量
のことである。

実施例 ６ 実施例３で使用したものと同じ含水率及び直径をもつ親
水性ゲル１゜Ｏｌを４０ｍ／の水に浸漬し、ブロムシア
ン１゜Ｏｌを加えた。

４℃に冷却下、攪拌しながら混合液のｐＨが１１゜０を
保つように５Ｎ濃度の苛性ソーダ液を滴下し、ｐＨの低
下が停止した後、ゲルを直ちに沖過し、０゜ＩＭ濃度の
ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８゜０）ですばやく洗滌した。

このようにした得たブロムシアンで活性化された親水性
ゲルをプロナーゼ８．０■を含む０゜１Ｍ濃度のホウ酸
緩衝溶液（ｐＨ８゜０）、１０ｄに移し、室温で２時間
ゆっくり往復振盪させて、プロナーゼを固定化した。

未反応の活性基を不活性化するためにプロナーゼ固定化
ゲルを１０倍容の水で洗滌した後、１．０Ｍ濃度のエタ
ノールアミン溶液（ｐＨ８゜０）に浸漬し室温で２時間
攪拌した。

酵素固定化ゲルを沖過し、１Ｍ濃度の塩化す） ＩＪウ
ムを含む、０．１Ｍ濃度の酢酸緩衝溶液（ｐＨ４゜０）
と、ＩＭ濃度の塩化ナトリウムを含む、０゜ＩＭ濃度の
ホウ酸緩衝溶液（ｐＨ８゜０）及び冷水で繰り返し洗滌
した。

洗滌液を回収し、回収液の２８０ ｎｍに於ける紫外吸
収強度により算出した固定化酵素量は、乾燥ゲル１．Ｏ
ｌ当り３３７ｑであった。

固定化酵素の比活性をＤＬ−リジンメチルエステルを基
質とし１０重量％の基質濃度で４０℃ｐＨ６゜０に於い
てｐＨスタットで測定したところ、２７６μｍｏｌｅｓ
Ａ・ｉで、溶液状酵素の比活性の４６チであった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プルランと一般式Ｘ−Ｒ−Ｚ（但し、Ｘ、！＝Ｚは
   ・・ロゲン原子またはエポキシ基、Ｒは１ないし３０個
   の炭素原子を有する脂肪族基を表わす。 ）で表わされる二官能性物質との反応生成物からなる親
   水性ゲルを担体として用い、該担体中の水酸基の反応性
   を利用する化学結合法によって該坦体に酵素を固定化す
   ることを特徴とする固定化酵素の製造法。