DE2405316B2

DE2405316B2 - Immobilisiertes enzympraeparat

Info

Publication number: DE2405316B2
Application number: DE19742405316
Authority: DE
Inventors: Ralph Allan Horseheads NY Messing (VStA)
Original assignee: Corning Glass Works
Current assignee: Corning Glass Works
Priority date: 1973-02-16
Filing date: 1974-02-05
Publication date: 1977-08-25
Also published as: BE811132A; DE2405316A1; CA1018469A; JPS49110887A; GB1440702A; FR2218344A1; US3850751A; JPS577713B2; FR2218344B1; DE2405316C3

Description

nete Enzympräparate mit guter Lebensdauer, Alkalibeständigkeit sowie verbesserter quantitativer und qualitativer Immobilisierung zur Verfügung zu stellen.

Die Erfindung betrifft immobilisierte Enzympräpa- Diese Aufgabe wird durch das Enzympräparat der rate, bei denen das Enzym an anorganische im wesent- 40 Erfindung mit einem im Wesentlichen kieselsäurelichen kieselsäurefreie Träger gebunden sind. freien Träger dadurch gelöst, daß das Material ein

Die meisten hochmolekularen Enzyme sind wasser- poröser Keramikkörper mit einer durchschnittlichen löslich, was ihre Anwendbarkeit als Katalysatoren be- Korngröße von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchgrenzt, weil sie mit in Lösung gehen, die Produkt- schnittlicher Porendurchmesser wenigstens so groß wie reinheit beeinträchtigen und verlorengehen. 45 die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner als

Es ist daher versucht worden, sie zu immobilisieren, 1000 Ä, und daß das Enzym an die Innenfläche des wasserunlöslich zu machen, z.B. durch Bindung an porösen Keramikkörpers gebunden ist.
oder Einschluß in einem wasserunlöslichen Träger Von kritischer Bedeutung ist das Verhältnis von ohne Beeinträchtigung der katalytischen Aktivität auf durchschnittlicher Porengröße und der Abmessung des längere Dauer. Bisher wurden vielfach organische 50 an den Träger zu bindenden Enzyms. Die durchschnitt-Träger verwendet, z.B. Polyaminostyrolperlen oder liehe Porengröße soll Beschickung und Halbwertszeit Zellulosederivate. Nachteile der organischen Träger der Lebensdauer möglichst erhöhen und eine leichte sind Quellung, mangelnde Steifigkeit, geringe Diffusion Diffusion des Substrats in das Trägermaterial und zum des Substrats, Mikrobenbefall, geringe Wärmebestän- gebundenen Enzym gewährleisten. Vorzugsweise wird digkeit; schwierige Sterilisierung usf. (vgl. Weetall, 55 das Enzym an kieselsäurefreies, keramisches Material in Science, Bd. 166, [1969], S. 615). Deshalb wurden aus agglomerierten Metallöxidpartikeln wie Aluminach der Lehre der US-PS 35 56 945 und 3519 538 nium-, Titan-oder Zirkonoxid gebunden. Der Träger anorganische Träger vorgeschlagen. kann auch mehrere dieser Metalloxide enthalten.

Für die nach der Lehre der DT-OS 1944418, ent- Der Träger muß im wesentlichen frei von Kieselsprechend US-PS 35 19 538, geforderte kovalente Bin- 60 säure sein, also möglichst kein SiO₂ enthalten. Er dung des Enzyms über zwischengeschaltete, einen besteht aus einem nicht brüchigen, keramischen Matesiliziumfunktionellen Teil und einen organischen Teil rial mit einer Oberfläche größer als 5 qm/g und hat aufweisenden Silankoppler wird ein stark kieselsäure- einen Durchmesser der durchschnittlichen Porengröße, haltiges Material, insbesondere poröses Glas bevor- der wenigstens so groß wie die größte Abmessung zugt, wenn auch anderes, nicht siliziumhaltige Metall- 65 des zu bindenden Enzyms, aber kleiner als etwa oxide als Möglichkeit erwähnt werden, ohne jedoch 1000 Ä ist.

die physikalische Beschaffenheit, Porösität, Korngröße Der Träger muß porös sein, bloß fein verteilte

und dergleichen als kritische Merkmale erkannt zu Metallöxidpartikeln genügen also nicht ohne weiteres.

Ein kritisches Merkmal ist das Verhältnis der durchschnittlichen Porengröße des Trägers und der größten Abmessung des Enzyms. Der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesser hängt unmittelbar von der größten Abmessung des verwendeten Enzyms und s in gewissem Umfang auch von der Größe des in Frage kommenden Substrats ab, falls dieses etwas größer als das Enzym sein sollte. In jedem Falle muß es zwar wenigstens so groß wie die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner als 1000 A sein, to Durch geeignete Auswahl aus diesem Bereich können auch Träger mit die Diffusion größerer Substrate gestattender Porengröße erhalten werden. Das Enzym muß in das innere Porennetzwerk im Wege der Massendiffusion eindringen können. Ist das Substrat größer, z.B. bei proteolytischen Enzymen, so muß die durchschnittliche Porengröße auch das Substrat eindringen lassen. Die obere Grenze sollte aus zwei Gründen jedoch 1000 Ä nicht übersteigen. Größere Porenweiten verringern die Gesamtoberfläche für die Enzymaufnähme. Zweitens wird der Schutz des Enzyms unter Turbulenzbedingungen bei größeren Porenweiten geringer, d. h., es besteht die Gefahr der Ablösung des Enzyms, besonders bei Durchlaufumsetzungen mit größerem Druckabfall. Der praktische Bereich für die meisten Enzyme liegt zwischen 100 und 1000 A, vorzugsweise 100-500 A. Die beste durchschnittliche Porengröße hängt aber immer vom jeweiligen Enzym und seinem Substrat ab.

Die größte Abmessung eines Enzyms oder seines Substrats kann in bekannter Weise aus dem Molekülgewicht oder durch Ausschlußversuche bestimmt werden. Bei sphärischen Enzymen ist die größte Abmessung etwa der Moleküldurchmesser. Bei länglichen Enzymen ist die größte Abmessung die Länge, usw. Die durchschnittliche Porengröße muß in manchen Fällen auch das Substrat berücksichtigen. Ist das Substrat kleiner als das Enzym, so diffundiert das Substrat zum gebundenen Enzym (z. B. Glucose und Sauerstoff zur gebundenen Glucoseoxidase) meist ohne Schwierigkeit Ist das Substrat dagegen so groß wie oder größer als das Enzym, so muß die durchschnittliche Porengröße des Trägers dies berücksichtigen. Soll ein stabilisiertes Papainpräparat z.B. zur Hydrolyse eines Proteins wie Alpha-Casein dienen, so muß das mehrfach größere Alpha-Caseinmolekül (Molekülgewicht 121000 im Vergleich zu 21000 des Papains) diffundieren lassen. Die durchschnittliche Porengröße muß z. B. das 2- bis 4fache der Größe des Papainmoleküls betragen, also wenigstens etwa 100-200 A, wenn das Papain zur Hydrolyse von Eiweiß (Molekülgewicht 40 000-70 000) verwendet werden soll. Dagegen kann bei Herstellung von Fructose durch Einwirkung von Glucoseisomerase (Molekülgewicht 180 000, Größe etwa 100 A) auf Glucose die Porengröße näher am unteren Ende des angegebenen Bereichs liegen. Das gleiche gilt z.B. bei Urease (etwa 125 A) mit ebenfalls kleinem Substrat Bei sehr großen Enzymen wie Pyruvatdecarboxylase mit einem berichteten Molekülgewicht von über 1000000 muß der Träger näher an der Porengröße von 1000 A liegen, und auch der kritische Bereich ist entsprechend kleiner. Auch bei Catalase mit einem Molekülgewicht von etwa 250000 und einer größten Abmessung von etwa 183 A ist der kritische Bereich etwas kleiner, liegt also zwischen 183-1000 A, wobei übrigens das kleinere Substrat (Wasserstoffsuperoxid) unberücksichtigt bleiben kann.

Die Art der Bindung hängt in bekannter Weise vom beabsichtigten Gebrauch, den Kosten, der technischen Durchführbarkeit, der behaltenen Enzymaktivität, der Zugänglichkeit der Reagenzien usw, ab. Meist kommen drei Methoden in Frage, nämlich Adsorption z. B. gemäß US-PS 35 56945, chemische Bindung über Silankuppler gemäß US-PS 3519 538, 36 69 841 und Adsorption und Verkettung; in den Poren gemäß Patentanmeldung P 23 39 805.2 der gleichen Anmelderin. Die Trägeroberfläche muß lediglich freie Oxid- oder Hydroxylgruppen zur Bindung aufweisen, die das Enzym über Adsorption, eventuell auch Verkettung in den Poren oder über chemische Kuppler mit wenigstens einem mit diesen Gruppen umsatzbereiten Teil binden. Alle drei Methoden werden hier mit »Bindung« bezeichnet Sie können auch kombiniert werden. In den weiter unten erläuterten Beispielen wurden die Enzyme nach dem Verfahren der US-PS 35 56 945 adsorbiert

Von großer Wichtigkeit für Herstellung und Gebrauch des Präparats ist die Korngröße des porösen Keramikträgers. Um seine Oberfläche voll auszunutzen, muß das Enzym vor Bindung tief in den porösen Träger eindringen können und nach Bindung des Enzyms gilt dies auch für das Substrat

Die Diffusionsfähigkeit des Enzyms hängt von mehreren Faktoren ab, wie Porengröße und Korngröße des Trägers, pH-Wert und isoelektrischer Punkt des Enzyms, sowie Zeit und Temperatur. Als bevorzugter Korngrößenbereich des Trägers wurden 0,074-4,76 mm (4-200 mesh) gefunden. Größere Partikeln erschweren die Diffusion, so daß die Oberfläche nicht voll genutzt wird, und erfordern beim Durchlauf eine sehr lange Verweilzeit des Substrats. Kleinere Partikeln sind nur schwer in der Kolonne zu halten und verursachen bei dichter Packung einen besonderen Aufwand erfordernden starken Druckabfall. Besonders günstig ist der Bereich 0,177-0,71 mm (25-80 mesh).

Für die Herstellung wird ein poröser, im wesentlichen kieselsäurefreier Keramikkörper mit entsprechender Porengröße gemahlen und klassiert, wobei vorzugsweise auf möglichst gleichmäßige Porenverteilung geachtet wird. Geeignet sind beispielsweise poröses Aluminium-, Titan- oder Zirkonoxid, einzeln oder in Mischung oder auch andere, wasserunlösliche Metalloxide. Die porösen Körper werden dann mit einem geeigneten Puffer für die anschließende Enzymbindung vorbereitet oder hydratiert, um möglichst viele Oxid- oder Hydroxylgruppen an der Oberfläche zu bilden. Zur Adsorption von z. B. Glucoseisomerase auf porösem Aluminiumoxid wird eine Hydratation mit einem Puffer mit mehr als 7 pH bevorzugt. Zur Bindung durch Adsorption wird zunächst der Puffer entfernt, jedoch werden die Partikeln feucht gehalten. Sodann wird das Enzym mit einer die optimale Adsorption oder optimale Beschickung der verfügbaren Oberfläche gewährleistenden Konzentration zugesetzt.

Die Adsorption und Massendiffusion des Enzyms in den Poren kann durch Bewegung beschleunigt werden, z. B. Umlauf, Rühren, Umkippen, Verwendung eines fluiden Betis und dergleichen. Die erforderliche Dauer der optimalen Adsorption hängt vom Träger der Porengröße, Partikelgröße, Größe und Spin der Enzymmoleküle, Temperatur, pH-Wert, Bewegung usw. ab, jedoch ist für ausreichende Adsorption und Beschickung mindestens eine halbe Stunde erforderlich, meist l'/2-5Std. Meist sollte der pH-Wert so gewählt werden, daß die Oberflächenladung des

Enzyms umgekehrt der Oberflächenladung des Trägers ist. Nach der Adsorption wird loses Enzym abgewaschen, ζ. B. mit Wasser, Salzlösung (ζ, Β. 0,5 MNaCl) u. a., die das Präparat nicht beeinträchtigen.

Bei Anwendung katin das Enzympräparat in einer verstöpselten Durchlaufkolonne, einem ständig gerührten Umsetzungsgefäß, einem fiu'den Bett und dergleichen mit der Möglichkeit der Substrataufgabe zur Inkubation gehalten werden. In den Beispielen wurde die Enzymaktivität wiederholt unter statischen und dynamischen Bedingungen untersucht. Bei Prüfung unter dynamischen Bedingungen (entsprechend der geplanten Anwendung) wurde die Halbzeit des Enzyms (Verlust der halben Anfangsaktivitäi) gemessen. Je länger diese Halbzeit, desto wertvoller ist auch das Enzym. Die Beispiele zeigen durchweg sehr lange Halbzeiten und gute Lagerfähigkeit.

Meist wird kontinuierliches Arbeiten dem abschnittsweisen gegenüber bevorzugt. Bei Verwendung in einer Kolonne kann mit Hilfe eines Wassermantels eine optimale Inkubationstemperatur und eine die Halbwertszeit möglichst verlängernde Temperatur eingehalten werden; z. B. bei Herstellung von Fructose Glucose-Substrat und Glucoseisomerase ist für beide Gesichtspunkte 60° günstig. Der pH-Bereich und das Puffersystem für die Inkubation hängen auch vom jeweiligen Enzymsystem ab, z. B. bei Herstellung von Fructose, 7,2-8,2 oder, besonders günstig, 7,4-7,8. In der Regel wird das Puffersystem im Hinblick auf die saure oder alkalische Beschaffenheit des Substrats gewählt, die durch die Substratlösung selbst und/ oder die Gegenwart verschiedener, zugesetzter aktivierender Ionen verursacht wird, sowie den optimalen pH-Wert des Enzymsystems.

In den folgenden Beispielen wurden als Träger für die angegebenen Enzyme poröse Keramikkörper verschiedener, kieselsäurefreier Metalloxide mit Porengrößen von 140-985 Ä verwendet Die Partikelgröße der Träger lag zwischen etwa 25 und 80 mesh. Die Träger bestanden jeweils aus

Al₂O₅ - (175 Ä)

ZrO₂ - (175 Ä)

TiO₂ - (350 Ä) (420 Ä) (820 Ä) (855 Ä)

TiO₂-Al₂O₃ - (220 Ä)

Der zuletzt aufgeführte Träger bestand aus 44 Gew.-% TiO₂ und 56% Al₂O₃.

Beispiel I

Glucoseisomerase adsorbiert auf porösem Al₂O₃

Glucoseisomerase (größte molekulare Abmessung etwa -100 Ä, Molekülgewicht 180000) wurde auf porösem Aluminiumoxidkörpern mit den folgenden physikalischen Merkmalen adsorbiert:

Poröser Al₂O₃-Träger

Durchschnittlicher Porendurchmesser

Porendurchmesser, Minimum
Porendurchmesser, Maximum
Porenvolumen
Oberfläche
Partikelgröße in mesh

175 Ä

140 Ä
220 Ä
0,6 cmVg
100 m²/g
25-60

60 Das adsorbierte Enzym bestand aus roher Glucoseisomerase enthaltend 444 internationale Giucoseisomeraseeinheiten (IGIE) pro g. Die Enzymaktivität wurde mit einem modifizierten Cystein-Carbozolverfahren bestimmt. Das stabilisierte Präparat wurde folgendermaßen hergestellt: einer Lösung von 28,7 mi 0,1 M Magnesiumacetat wurde 5 g des obigen rohen Glucoseisomerasepräparats zugesetzt. Die Aufschlämmung wurde 25 Min. bei Zimmertemperatur gerührt und durch Filterpapier filtriert. Der Rückstand auf dem Filterpapier wurde mit 14,3 ml 0,1 M Magnesiumacetatlösung und anschließend mit 14,3 ml 0,5 M NaHCO₃ und 4,3 ml 0,5 M NaHCO₃ gewaschen. Das Waschprodukt wurde direkt im Filterpapier aufgefangen. Das Gesamtvolumen der Enzymwaschlösung betrug etwa 50 ml.

500 mg des porösen Aluminiumoxids wurden in eine 50-ml-Kugelflasche gegeben und 10 ml der Glucoseisomeraselösung zugesetzt Die Flasche wurde an einem Rotationsverdampfer befestigt, ein Vakuum angelegt und die Flasche in einem auf 30-45° gehaltenen Bad 25 Min. lang rotiert, Sodann wurden 10 weitere ml Glucoseisomeraselösung zugesetzt und die Verdampfung unter den gleichen Bedingungen 35 Min. fortgesetzt. Dies wurde zweimal wiederholt, dann eine abschließende Menge von 7 ml Glucoseisomerase zugesetzt und bei 45° weitere 70 Min. verdampft. Die Flasche wurde dann übers Wochenende in einen kalten Raum verbracht Insgesamt 47 ml Glucoseisomeraselösung waren den porösen Aluminiumoxidpartikeln zugesetzt worden.

50 ml Puffer aus 0,01M Natriummaleat mit pH 6,8-6,9 und enthaltend 0,001 Cobaltchlorid und 0,005 Magnesiumsulfat wurden dem Enzympräparat zugesetzt und die Probe 1 Std. bei Zimmertemperatur extrahiert, dann mit 200 ml Wasser und anschließend 10 ml 0,5 M NaCl gewaschen. Die letzte Wäsche wurde über einem Glasfrittentrichter mit 50 ml Wasser durchgeführt Das Enzympräparat wurde dann in einen 50-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und im Puffer bei Zimmertemperatur gelagert Wiederholte Proben wurden während 106 Tagen entnommen. Der durchschnittliche Wert der Prüfungen betrug 130IGIE pro 500 mg, die Enzymaktivitätsausbeute betrug 6%. Der Durchschnittswert wurde durch 20 Prüfungen während der 106 Tage ermittelt, wobei 16 der Prüfungen eine Aktivität von 100-150IGIE pro 500 mg (200-300IGIE pro g) zeigten. Diese Ergebnisse zeigen eine sehr hohe statische Stabilität bei vergleichsweise starker Enzymbeschickung. Die zurückbehaltene Extraktlösung wurde ebenfalls geprüft; sie enthielt 39,8IGIE pro ml, also eine Enzymaktivitätsausbeute von 90%.

Beispiel II

Zur Prüfung unter dynamischen Bedingungen, die einen besonderen Wert der erfindungsgemäßen Präparate ausmachen, wurde die Enzymwirkung bei der Isomerisation von Glucose zur Fructose unter industriellen Einsatzbedingungen geprüft. Die Fructoseherstellung aus billiger Glucoselösung ist wegen der doppelten Süßwirkung bei gleichem Kaloriengehalt, bzw. gleicher Süßwirkung bei halbem Kaloriengehalt von besonderem wirtschaftlichen Interesse.

10 g des stabilisierten Glucoseisomerasepräparats wurden in mit Wasserkühlmänteln umgebene Kolonnen gegeben. Die Kolonnen wurden durch Thermostate auf einer Temperatur von 60° gehalten. Eine

50%ige Glucoselösung wurde hindurchgepumpt, wobei der Durchsatz so eingestellt wurde, daß eine Fructoseumwandlung von 80-85% der theoretischen erreicht wurde. Gegebenenfalls wurde der Durchsatz in bestimmten Absätzen herabgesetzt Die Anfangsdurchsatzrate war 190 ml pro Std. Das Präparat wurde folgendermaßen hergestellt.

11g der im Beispiel I beschriebenen porösen Aluminiumoxidkörper wurden in einen 100-ml-Glaszylinder gebracht und unter Zusatz von 100 ml 0,05 M Magnesiumacetat und 0,01 M Cobaltacetat mit pH 7,5 vorbehandelt. Der Zylinder wurde verstöpselt und nach Mischen durch Umdrehen in ein 60° warmes Bad gesetzt. Nach 15 Min. Umsetzung wurde der Zylinder umgedreht und die Flüssigkeit abgegossen. 100 ml frisches Magnesium-Cobaltacetat wurden zugesetzt, durch Umdrehen des Zylinders gemischt und 2V2 Std. bei Zimmertemperatur stehen gelassen.

Vor der Adsorption wurde eine rohe Enzymlösung bestehend aus 590IGIE pro ml in 0,6 gesättigtem Ammoniumsulfat wie folgt gereinigt: 40 ml der GIucoseisomeraselösung wurden, 1,4 weitere g Ammoniumsulfat zugesetzt, um das Enzym auszufällen. Die Aufschlämmung wurde bei Zimmertemperatur 20 Min. gerührt, und dann bei 2° 30 Min. lang mit 16000UpM zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und weggeworfen. 12 ml der obigen Magnesium-Cobaltacetatlösung wurden der Ausfällung zugesetzt und gerührt. Sodann wurden 3 ml 0,5 M Natriumbicarbonat zugegeben und bis zur Auflösung gemischt. Die Lösung wurde 15 Min. in ein 60° warmes Bad gebracht und nach Entnahme 15 Min. bei 2° mit 16000UpM zentrifugiert. Die klare überstehende Enzymlösung wurde abgegossen und die Ausfällung weggeworfen. Die Enzymlösung (28 ml) hatte einen pH-Wert 7,5. Falls bei der Reinigung keine Aktivität verlorenging, so betrug die Aktivität der Lösung etwa 23 600IGIE.

Zur Adsorption wurde nun die Magnesium-Cobaltacetatlösung nach Umkehren von den porösen Aluminiumoxidkörpern abgegossen und 28 ml Enzymlösung in einem Zylinder zugesetzt. Der Zylinder wurde verstöpselt, durch Umdrehen gemischt und in ein 60° warmes Bad gesetzt. Die Enzyme wurden in die Poren diffundieren und mit dem porösen Aluminiumoxid bei 60° 2V2 Std. umsetzen gelassen. Während dieses Zeitraums wurde der Zylinder alle 15 Min. durch Umdrehen gemischt. Nach Entnahme aus dem Bad wurde die Adsorption bei Zimmertemperatur durch Umdrehen und Mischen alle 30Min. während 2 Std. fortgesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur durch Stehenlassen au Ende geführt. Die Enzymlösung wurde abgegossen (28,5 ml, pH 74) und für die weitere Prüfung aufbewahrt Das stabilisierte Enzympräparat wurde mit 60 ml destilliertem Wasser und sodann mit 40 ml 0,5 M NaCl und schließlich 40 ml Magnesium-Cobaltacetatlösung gewaschen. Drei kleine Proben von je etwa 1 g wurden für die weitere Prüfung entnommen,

Die übrigen 10 g wurden in eine thermostatisch auf 60^ό gehalten Kolonne gebracht; der Kolonne wurde eine 50%ige Glucose und 0,005 M Magnesiumsulfat, mit Natriumsulfit auf pH 7,7-8 gepufferte Lösung zugeführt. Während der ersten 26 Std. wurden der Speiselösung O₁OOlM Cobaltchlorid zugesetzt, anschließend war der einzige Aktivator Magnesium. Der anfängliche Durchsatz betrug 190 ml pro Std., der dann periodisch auf eine Umwandlungsrate von 80-85 der theoretischen (entsprechend einer Fructoseausbeute von etwa 40-42/2%) verringert wurde. Die Durchlaufzeit betrug insgesamt 31 Tage. Die Kolonne wurde dann durch Abbruch der Lösungszufuhr ausgetrocknet, Produktproben entnommen und die in g/Std. erzeugte Fructosemenge gemessen. Da der Durchlauf periodisch verringert wurde, so daß eine konstante Umwandlungsrate von 80-85% gegeben war, ist die an einem bestimmten Tag pro Std. erzeugte Fructosemenge ein getreuer Maßstab für die Enzymaktivität in der Kolonne. Die Anfangsbeschickung der Kolonne betrug 381IGIE pro g, die gesamte Kolonne enthielt 3810IGIE, die über 31 Tage 42-28 g Fructose pro Std. ergaben, so daß die Halbzeit des Präparats etwa 42 Tage betrug. Der Versuch zeigt eine hohe Stabilität des Enzympräparats, der vermutlich auf der spezifischen Auslegung des Trägers mit einer für die Glucoseisomerase optimalen durchschnittlichen Porengröße beruht

Beispiele III und IV

Glucoseisomeidbc adsorbiert auf porösem ZrO₂ und TiO₂-Al₂O₃

Die Träger hatten die folgenden Eigenschaften:

	ZrO₂	TiO₂-Al₂O₃
Porendurchmesser, durchschn.	175 Ä	220 Ä
Porendurchmesser, Minimum	140 Ä	140 Ä
Porendurchmesser, Maximum	200 Ä	300 Ä
Porenvolumen in ccm/g	0,23	0,5
Oberfläche in qm/g	50	75
Partikelgröße in mesh	25-60	25-60

500 mg poröses ZrO₂ und 300 mg TiO₂-AI₂O₃ wurden getrennt mit 0,05 M Mugnesiumacetat-0,01 M Cobaltacetatlösung, pH 7,5, 60° während 15 Min. und dann bei Zimmertemperatur während 3 Std. vorbehandelt Die Lösung wurde sodann abgegossen. Den Trägerr wurde 0,8 ml (672 IGIE) nach Beispiel II gereinigt« Glucoseisomeraselösung beigegeben. Die Adsörptlor würde bei 60° während 4 Std. durchgeführt und dabe alle 15 Min, durch Umdrehen gemischt, und übe Nacht ohne weiteres Mischen weiter adsorbieren ge lassen. Die restliche Enzymlösung wurde dann abge gössen. ",■' 'Υ'" '■■■' " '■*'

Die stabilisierten Glucoseisomerasepräparate wur den dann nacheinander erst mit 0,5 M NaCl-Lösüng mit 0,05 M Magneslumncetat-0,01 M Cobaltacetatlö sung, pH 7,5 und zuletzt mit destilliertem Wasse gewaschen. Sie wurden dann getrennt bei Zimmertem peratur in Wasser aufbewahrt. Sie wurden dann will·, rend 18 Tagen auf Qlucoselsomeraseaktlvitiit geprüf Die Tabelle I enthUlt die Ergebnisse.

706634/4*

Tabelle I

Statische Prüfung bei 60° auf Aktivität in IGIE/g

Träger (durchschnittliche Poren	TiO₂-Al₂O₃ (220 Ä)
größe in Ä)	259
ZrO₂ (175 A)	259
53,6	213
50,0	213
43,6	199
57,4	198
41,6
38,9

Beide Träger ergaben ein stabiles Enzympräparat. TiO₂-Al₂O₃ zeigte infolge größerer durchschnittlicher Porenweite, größerer Oberfläche und größerem Porenvolumen eine stärkere Besetzung mit aktivem Enzym.

Beispiele V und VI

Papain adsorbiert auf porösem TiO₂ und porösem TiO₂-Al₂O₃

Zur Herstellung stabilisierter Papainpräparate wurden Träger mit den folgenden physikalischen Eigenschaften verwendet:

Poröse TiO₂ und TiO₂-Al₂O₃-Träger

	TiO₂	TiO₂-AI₂O,
Porendurchmesser, durchschnittl. (A)	350	220
Porendurchmesser, Minimum (A)	220	140
Porendurchmesser, Maximum (A)	400	300
Porenvolumen (ecm/g)	0,45	0,5
Oberfläche in qm/g	48	77
Partikelgröße in mesh	25-60	25-60

parate wurden dann während 15 Tagen mit Casein geprüft. Sie hatten die folgende Aktivität:

Tabelle II

Statische Prüfung bei 37° auf Aktivität in mg Papain/g Träger

Tag

Jc 500 mg Träger wurden getrennt mit 9 ml 0,5 M NaHCO₃-Lösung während l'/üStd. bei 37° in einem Rüttelwasserbad vorbehandelt. Der Puffer wurde dann abgegossen und die Träger mit destilliertem Wasser gewaschen. 10 g Papin iMolekulguwictit 21000, größte Abmessung 48 A) wurden In 50 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung mit pH 6,95 enthaltend 86 mg Cysteinhydrochlorid und 37 mg Dinatrlumüthylendlamlntotraessigsäure suspendiert und auf den betreffenden Trägern adsorbiert. Die erhaltenen Präparate wurden mit Casein (Molekülgewicht 121000) nach dem Verfuhren der US-PS 35 56 945 geprüft. Dies geschuh im einzelnen folgendermaßen.

10 ml enthaltend 2 g Enzym der Paplnlösung wurden jedem Träger zugegeben und dlo Adsorption während 3 Std. bei 37° In einem Schüttelwasserbad vorgenommen, Die Enzymlösung wurde dann abgegossen und die Präparate mit destilliertem Wasser gewaschon, anschließend mit 0,5 M NaCl und nochmals mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Sie wurden dünn bei Zimmertemperatur In Wasser aufbewahrt, Die Prä-

Träger (durchschnittliche Porengröße in A)

TiO₂ (350 Ä) TiOj-Al₂O₃ (220 A)

7,41
6,82
3,84
2,24

9,06 6,80 4,85 4,00

Beispiele VII und VIII

Alkalischer Bacillus subtilis Protease adsorbiert auf porösem TiO₂ und porösem TiO₂-Al₂O₃

Ähnliche Träger wie in den vorigen beiden Beispielen wurden für die Adsorption des Bacillus subtilis verwendet, der ein Molekülgewicht von 27000 und eine größte Abmessung von 42 A aufweist. Die Enzympräparate wurden durch Verwendung einer aus 10 g alkalischer Protease suspendiert in 50 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8 enthaltenden Lösung hergestellt. 10 ml (2 g Enzym) der Proteaselösung wurden

500 mg Proben jedes Trägers (350 A TiO₂ und 220 A

TiO₂-AI₂O₃) zugesetzt. Die Adsorption entsprach etwa

der für die obigen Papainbeispiele.

Die erhaltenen Präparate wurden wie gemäß der

US-PS 35 56 945 mit Casein (Molekülgewicht 121000) geprüft, jedoch enthielt die Substratlösung 0,1 M Phosphatpuffer und der pH betrug 7,4. Die Proben enthielten weder Cysteinhydrochlorid noch Äthylenüiamintetraessigsäure. Die Tabelle III enthält.die Prüfergebnisse von 15 Tagen.

Tabelle III
Statische Prüfung
Aktivität in mg alkalische Protease/g Träger

^T"8 Träger, durchschnittl. Porengröße in A

TiO₂ (350 A) TiO₂-AI₂Oj (220 A)

5,47
3,60
1,17
0,67

4,69 1,57 0,64 0,40

Beispiele IX-XIU

Urease adsorbiertaul'Trägern mit verschiedener Poretv·^ größe '■' ■'■■■ ';'■'"';°Ä^!

Stabilisierte Ureasepräparate können zum ..MesÄty des Harnstickstoffgehalts Im Blut verwendet well Urease Harnstoff selektiv zu meßbaren NHj ^u"d COj hydrollslert, die Ihrerseits zum::rmM^:f stofTgehalt in Beziehung gesetzt werden könnerfite den folgenden Beispielen wurde Urease an vecicHlefi iAn^QJei Keramikkörper mit PorengiößetvÄD 140-985 A und durchschnittlichen ~ " ^¹'¹ '^UL"¹

175-855 Ä gebunden, um den Träger mit der optimalen Porengröße für dieses Enzym zu bestimmen. Urease hat ein Molekülgewicht von etwa 480000 und eine größte Abmessung von etwa 125 A als Monomer strat für Urease, im Verhältnis zum Enzym sehr klein ist, kann es bei Bestimmung der durchschnittlichen Porengröße Tür den Träger außer acht bleiben, im Gegensatz zum Papainsubstrat Casein. Die Träger

und etwa 250 Ä als Dimer. Da Harnstoff, das Sub- 5 hatten die folgenden Physikalischen Eigenschaften:

	Poröse Träger	AI₂O₃-TiO₂	TiO₂	TiO₂	TiO₂
	AI₂O₃	220	350	420	855
Durchschnittl. Porendurchmesser (A)	175	140	220	300	725
Minimum Porendurchmesser (A)	140	3OG	400	590	985
Maximum Porendurchmesser (A)	220	0,5	0,45	0,4	0,22
Porenvolumen, ccm/g	0,6	77	48	35	9
Oberfläche, qm/g	100	25-60	25-60	30-80	25-80
Partikelgröße, mesh	25-60

500 mg eines jeden dieser Träger wurden durch Schütteln in 11ml 0,5 M NaHCO₃ bei 37° während 1 Std. und 40 Min. vorbehandelt. Die NaHCO_rLösung wurde dann abgegossen. Jeder 500 mg Probe des Trägers wurden 20 ml einer l%igen wässerigen Ureasesuspension mit 400 Sumner-Einheiten (SE) Ureaseaktivität pro g oder 80 SE pro Probe beigegeben. Träger und Ureaselösungen wurden 5 Std. in einem Wasserbad bei 37° geschüttelt und die Mischung dann bei Zimmertemperatur 22 Std. stehengelassen. Dann wurde die Enzymlösung abgegossen und die Präparate zuerst mit destilliertem Wasser, dann mit 0,5 M NaCl-Lösung und zuletzt wieder mit destilliertem Wasser gewaschen. Sie wurden dann in kleine Kolonnen überführt und bei Zimmertemperatur während eines Zeitraums von 32 Tagen auf Aktivität geprüft. Die Tabelle enthält die Ergebnisse.

Tabelle IV

Aktivität in SE/g mit Trägern verschiedener Porengrößen

Tage	Al₂O₃	AI₂O₃-TiO₂	TiO₂	TiO₂	TiO₂
	(175)	(220)	(350)	(420)	(■355)
0	0,35	0,81	1,18	4,36	2,46
0	0,22	-	-	-	-
I	0,11	-	-·	-	-
4	-	0,59	0,63	2,32	1,77
5	0,05	0,45	0,43	1,98	0,95
6		0,06	0,33	1,98	0,61
7		0,05	0,29	1,56	0,36
U		0,03	0,16	1,11	0,19
18		0,03	0,11	0,73	0,09
27-28		0,01	0,07	0,47	0,03
32		-	0,05	0,34	■ -

erhellt auch aus den folgenden Beispielen, in denen zwei verschiedene Enzyme gleichzeitig in den Poren eines Trägers mit kleinerer und eines Trägers mit größerer durchschnittlicher Porengröße als der Enzymgröße adsorbiert wurden. Als Enzyme wurden UIucoseoxidase und Catalase mit den folgenden Eigenschaften gewählt:

Glucoseoxidase - Molekülgewicht 150000, größte Abmessung 84 A, Catalase, Molekülgewicht 250000,

größte Abmessung 183 A.

Diese beiden Enzyme wurden auf einem porösen Aluminiumoxidträger nach Beispiel I und einem porösem Titanoxidträger nach Beispiel V mit durchschnittlichen Porendurchmessern von 175 bzw. 350 A adsorbiert. Das Adsorptionsverfahren entsprach dem der oben erwähnten gleichlaufenden Anmeldung.

Durch Einwirkung von Glucoseoxidase auf Glucose in Gegenwart von Sauerstoff entsteht Gluconsäure und Wasserstoffsuperoxid. Es wird also fortlaufend sauerstoff benötigt, gleichzeitig aber oxidiert das Wasserstoffsuperoxid das Enzym, das dadurch seine Aktivität einbüßt. Dem kann durch gleichzeitige Adsorption von Catalase entgegengewirkt werden, du diese durch Einwirkung auf das Wasserstoffsuperoxid Sauerstoff freisetzt. Bei kleineren Porengrößen, wie Aluminiumoxid (175 A) bleibt Catalase (183 A) ubei ausgeschlossen, und die Tabelle zeigt die Folgen hiervon im Vergleich zum Träger mit weiterer Porengröße.

Tabelle V

Vergleich der Glucoseoxldase-AkUvitfiten (GOU) prc g poröses AI₂O₃ und TIO₁

Wie die Tabelle zeigt, liegt die durchschnittliche Porengröße für Urease bei etwa 420 A, wenn auch eine kleinere EnzymuktivlWt mit Trägern durchschnittlicher Porengrößen von 175 oder 855 A erhalten bleibt.

Beispiele XIV und XV

Die kritische Bedeutung einer zumindest der Enzym· größe entsprechenden durchschnittlichen Porengröße

PrUfünßS· üoispiol XIV

^la» Poröses (175 A) AI₂O₃

. Botspiel XV

Poröses
(3SOA)TIO₂

I	12,9
1	18,7
4	11,7
5	10,1
6	8,5
7	7,0

20,5 36,2 36,2 36,2 36,2 36,2

'""hvr^.

■»■>.

1.A

Fortsetzung

Prü rungstag

Beispiel XIV
Poröses (175 Ä) AI₂O₃

Beispiel XV

Poröses
(350A)TiO₂

38	zu niedrig, unmeßbare	32,5
	Werte
59	-	36,2
83	-	35,9
103	-	35,5
136	-	32,5
165	-	29,6

Die Aktivität wurde hierbei durch Einsetzen von 300 mg Proben in eine Durchlaufkolonne gemessen. Eine Standardlösung von Glucose wurde mit einem Durchsatz von 145ml/Std. eingeführt. Die Glucoseeinheiten wurden indirekt durch periodische Messung des Gluconsäureanteils bestimmt.

Beispiele XVI-XIX

Weitere 300 mg Präparate wurden hergestellt, bestehend aus Glucoseoxidase und Catalase, adsorbiert auf porösem Titanoxidträgern mit durchschnittlichen Porengrößen von 350, 420, 820 und 855 Ä und den folgenden Eigenschaften:

Das Adsorptionsverfahren ist in der gleichlaufenden Anmeldung beschrieben.

Die Präparate wurden während 42 Tagen wie in den vorigen Beispielen wiederholt geprüft, wobei das Substrat in die Kolonnen aber mit dem höheren Durchsatz von 390ml/Std. eingeführt wurde. Infolge verstärkter Substratdiffusion ist hier eine gesteigerte Glucoseoxidaseaktivität zu erwarten.

Tabelle VIII

Vergleich der Glucoseoxidaseaktivität pro g TiO₂ Träger mit steigenden durchschnittlichen Porendurchmessern

Prüflings- TiO₂ Träger, durchschn. Porengröße in A
tag

350 Ä 420 A 820 Ä 855 Ä

Tabelle Vl	Poröse	Träger	TiO₂	TiO₂
	TiO₂	TiO₂	820	855
	350	420
Durchschnittl.
porendurch-			760	725
messer (A)	220	300
Minimum
Porendurch			875	985
messer (λ)	400	590
Maximum
Porendurch-			0,2	0,22
mosser (A)	0,45	0,4
Porenvolumen,			7	9
ccm/g	48	35	25-80	25-80
Oberfläche, qro/g	25-60	30-80
Partikelgröße,
mesh

0	66,0	56,4	43,9	37,8
3	66,0	77,7	43,9	39,7
8	66,0	84,5	46,2	40,3
13	66,0	84,5	46,2	44,3
42	66,0	80,5	40,3	42,0

Wie die Tabelle zeigt, ist die langfristige Glucoseoxidaseaktivität (GOE/g) aller vier Präparate außerordentlich beständig. Dies gilt ganz besonders für poröse Titanoxidträger mit durchschnittlichen Porengrößen von 350 A; über einen Zeitraum von 42 Tagen konnte hier kein Aktivitätsverlust beobachtet werden, und das unter Bedingungen mit gesteigertem Durchsatz der Substratlösung (390 ml/Std. gegenüber 145 ml/ Std,), die an sich eine größere Enzymablösung erwarten ließen. Bei größerem durchschnittlichem Porendurchmesser des Trägers, über 420 A, war eine abnehmende Enzymbeschickung zu beobachten, die auf die geringere Oberfläche (7-9qm/g) der porösen TiO₂-Träger mit durchschnittlichen Porengrößen von 820 und 855 A zurückgeführt werden kann. Präparate mit Trägern aus porösem Titanoxid mit durchschnittlichem Porendurchmesser von 420 A zeigten die stärkste Beschickung in GOE/g. Ein diesem etwa entsprechender

poröser Träger (Porendurchmesser 300 A Minimum, 590 A Maximum) wird für ein synergistisches Glucose-Oxidase-Catalasesystem daher bevorzugt. Selbst Präparate mit Trägern einer durchschnittlichen Porengröße von 855 A (725 A Minimum und 985 A Maximum) waren bemerkenswert beständig, obgleich die Zahl der GOE/g infolge der kleineren Oberfläche geringer war.

Claims

TJ haben. Das gilt auch für die weitere Entwicklung Patentansprüche: auf diesem Gebiet, wobei die spätere US-PS mit ihrem Vorschlag einer Bindung des Enzyms an eine Xräger-

1. Immobilisiertes Enzympräparat, bei dem das Substrat-Kombination wiederum die Verwendung von Enzym an ein im wesentlichen kieselsäurefreies 5 porösem Glas als Trägermaterial bevorzugt, vgl. den anorganisches Material gebunden ist, dadurch Anspruch 1, und in jedem Falle die Bedeutung gekennzeichnet, daß eas Material ein poröser wesentlicher physikalischer Merkmale nicht behandelt. Keramikkörper mit einer durchschnittlichen Korn- Zwar erörtert Messing in Enzymologia, Bd. 39, größe von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnitt- S. 12-14 das Verhältnis von Porengroße und Ober, licher Porendurchmesser wenigstens so groß wie io flächengröße auf die Quantität adsorbierter Enzyme, die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner beschränkt diese Betrachtung aber auf poröse Glasais 1000 Ä, und daß das Enzym an die Innen- träger und auf den rein quantitativen Gesichtspunkt fläche des porösen Keramikkörpers gebunden ist. der adsorbierten Enzymmengen.

2. Enzympräparat nach Anspruch I, dadurch ge- Demgegenüber wurde gefunden, daß kieselsäurehalkennzeichnet, daß derPorendurchmesser 100-1000 Ä, 15 tige Träger, wie z.B. poröses Glas in alkalischer Umvorzugsweise 100-500 Ä, beträgt. gebung nur eine sehr kurze Lebensdauer haben; das

3. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch ge- ist umso bedauerlicher, als viele Enzyme bei alkalikennzeichnet, daß der Keramikkörper wenigstens sehen pH-Werten katalytisch besonders wirksam sind, teilweise aus Aluminiumoxid, Titanoxid oder Zink- Die Alkalifestigkeit kann durch Überzug mit einem oxid besteht. 20 Metalloxid, z. B. Zirkonoxid, verbessert werden. Je-

4. Enzympräparat nach Anspruch 3, dadurch ge- doch bedeutet dies einen weiteren Bearbeitungsschritt kennzeichnet, daß die durchschnittliche Korngröße und höhere Gestehungskosten.

0,177-0,71 mm beträgt Auch ein Überzug von organischen Polymeren wurde

5. Immobilisiertes Enzympräparat, bei dem das bereits vorgeschlagen, US-PS 37 05 084. Auch dies erEnzym an ein im wesentlichen kieselsäurefreies 25 fordert aber ein aufwendiges Beschichtungsverfahren anorganisches Material gebunden ist, dadurch ge- und führt wiederum die Nachteile organischer Stoffe kennzeichnet, daß das Material ein poröser Ke- ein.

ramikkörper mit einer durchschnittlichen Korn- Besondere Schwierigkeiten entstehen auch bei den

größe von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnitt- für die großindustrielle Produktionsweise in Durchlicher Porendurchmesser wenigstens so groß wie die 30 laufkolonnen, die eine besonders zuverlässige und größte Abmessung des Enzymsubstrates, aber klei- dauerhafte Immobilisierung der benötigten Enzyme ner als 1000 Ä ist, und daß das Enzym die Innen- verlangt

fläche des porösen Keramikkörpers gebunden ist. Es ist daher Aufgabe der Erfindung, immobilisierte,

auch für die Verwendung in großem Umfang, insbe-35 sondere Durchlaufkolonnen und dergleichen, geeig-