DE2405316B2 - Immobilisiertes enzympraeparat - Google Patents
Immobilisiertes enzympraeparatInfo
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- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
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Description
nete Enzympräparate mit guter Lebensdauer, Alkalibeständigkeit sowie verbesserter quantitativer und
qualitativer Immobilisierung zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung betrifft immobilisierte Enzympräpa- Diese Aufgabe wird durch das Enzympräparat der
rate, bei denen das Enzym an anorganische im wesent- 40 Erfindung mit einem im Wesentlichen kieselsäurelichen
kieselsäurefreie Träger gebunden sind. freien Träger dadurch gelöst, daß das Material ein
Die meisten hochmolekularen Enzyme sind wasser- poröser Keramikkörper mit einer durchschnittlichen
löslich, was ihre Anwendbarkeit als Katalysatoren be- Korngröße von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchgrenzt, weil sie mit in Lösung gehen, die Produkt- schnittlicher Porendurchmesser wenigstens so groß wie
reinheit beeinträchtigen und verlorengehen. 45 die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner als
Es ist daher versucht worden, sie zu immobilisieren, 1000 Ä, und daß das Enzym an die Innenfläche des
wasserunlöslich zu machen, z.B. durch Bindung an porösen Keramikkörpers gebunden ist.
oder Einschluß in einem wasserunlöslichen Träger Von kritischer Bedeutung ist das Verhältnis von ohne Beeinträchtigung der katalytischen Aktivität auf durchschnittlicher Porengröße und der Abmessung des längere Dauer. Bisher wurden vielfach organische 50 an den Träger zu bindenden Enzyms. Die durchschnitt-Träger verwendet, z.B. Polyaminostyrolperlen oder liehe Porengröße soll Beschickung und Halbwertszeit Zellulosederivate. Nachteile der organischen Träger der Lebensdauer möglichst erhöhen und eine leichte sind Quellung, mangelnde Steifigkeit, geringe Diffusion Diffusion des Substrats in das Trägermaterial und zum des Substrats, Mikrobenbefall, geringe Wärmebestän- gebundenen Enzym gewährleisten. Vorzugsweise wird digkeit; schwierige Sterilisierung usf. (vgl. Weetall, 55 das Enzym an kieselsäurefreies, keramisches Material in Science, Bd. 166, [1969], S. 615). Deshalb wurden aus agglomerierten Metallöxidpartikeln wie Aluminach der Lehre der US-PS 35 56 945 und 3519 538 nium-, Titan-oder Zirkonoxid gebunden. Der Träger anorganische Träger vorgeschlagen. kann auch mehrere dieser Metalloxide enthalten.
oder Einschluß in einem wasserunlöslichen Träger Von kritischer Bedeutung ist das Verhältnis von ohne Beeinträchtigung der katalytischen Aktivität auf durchschnittlicher Porengröße und der Abmessung des längere Dauer. Bisher wurden vielfach organische 50 an den Träger zu bindenden Enzyms. Die durchschnitt-Träger verwendet, z.B. Polyaminostyrolperlen oder liehe Porengröße soll Beschickung und Halbwertszeit Zellulosederivate. Nachteile der organischen Träger der Lebensdauer möglichst erhöhen und eine leichte sind Quellung, mangelnde Steifigkeit, geringe Diffusion Diffusion des Substrats in das Trägermaterial und zum des Substrats, Mikrobenbefall, geringe Wärmebestän- gebundenen Enzym gewährleisten. Vorzugsweise wird digkeit; schwierige Sterilisierung usf. (vgl. Weetall, 55 das Enzym an kieselsäurefreies, keramisches Material in Science, Bd. 166, [1969], S. 615). Deshalb wurden aus agglomerierten Metallöxidpartikeln wie Aluminach der Lehre der US-PS 35 56 945 und 3519 538 nium-, Titan-oder Zirkonoxid gebunden. Der Träger anorganische Träger vorgeschlagen. kann auch mehrere dieser Metalloxide enthalten.
Für die nach der Lehre der DT-OS 1944418, ent- Der Träger muß im wesentlichen frei von Kieselsprechend US-PS 35 19 538, geforderte kovalente Bin- 60 säure sein, also möglichst kein SiO2 enthalten. Er
dung des Enzyms über zwischengeschaltete, einen besteht aus einem nicht brüchigen, keramischen Matesiliziumfunktionellen
Teil und einen organischen Teil rial mit einer Oberfläche größer als 5 qm/g und hat
aufweisenden Silankoppler wird ein stark kieselsäure- einen Durchmesser der durchschnittlichen Porengröße,
haltiges Material, insbesondere poröses Glas bevor- der wenigstens so groß wie die größte Abmessung
zugt, wenn auch anderes, nicht siliziumhaltige Metall- 65 des zu bindenden Enzyms, aber kleiner als etwa
oxide als Möglichkeit erwähnt werden, ohne jedoch 1000 Ä ist.
die physikalische Beschaffenheit, Porösität, Korngröße Der Träger muß porös sein, bloß fein verteilte
und dergleichen als kritische Merkmale erkannt zu Metallöxidpartikeln genügen also nicht ohne weiteres.
Ein kritisches Merkmal ist das Verhältnis der durchschnittlichen Porengröße des Trägers und der größten
Abmessung des Enzyms. Der bevorzugte durchschnittliche Porendurchmesser hängt unmittelbar von der
größten Abmessung des verwendeten Enzyms und s in gewissem Umfang auch von der Größe des in
Frage kommenden Substrats ab, falls dieses etwas größer als das Enzym sein sollte. In jedem Falle
muß es zwar wenigstens so groß wie die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner als 1000 A sein, to
Durch geeignete Auswahl aus diesem Bereich können auch Träger mit die Diffusion größerer Substrate gestattender
Porengröße erhalten werden. Das Enzym muß in das innere Porennetzwerk im Wege der Massendiffusion
eindringen können. Ist das Substrat größer, z.B. bei proteolytischen Enzymen, so muß die durchschnittliche
Porengröße auch das Substrat eindringen lassen. Die obere Grenze sollte aus zwei Gründen
jedoch 1000 Ä nicht übersteigen. Größere Porenweiten verringern die Gesamtoberfläche für die Enzymaufnähme.
Zweitens wird der Schutz des Enzyms unter Turbulenzbedingungen bei größeren Porenweiten geringer,
d. h., es besteht die Gefahr der Ablösung des Enzyms, besonders bei Durchlaufumsetzungen mit
größerem Druckabfall. Der praktische Bereich für die meisten Enzyme liegt zwischen 100 und 1000 A,
vorzugsweise 100-500 A. Die beste durchschnittliche Porengröße hängt aber immer vom jeweiligen Enzym
und seinem Substrat ab.
Die größte Abmessung eines Enzyms oder seines Substrats kann in bekannter Weise aus dem Molekülgewicht
oder durch Ausschlußversuche bestimmt werden. Bei sphärischen Enzymen ist die größte Abmessung
etwa der Moleküldurchmesser. Bei länglichen Enzymen ist die größte Abmessung die Länge, usw.
Die durchschnittliche Porengröße muß in manchen Fällen auch das Substrat berücksichtigen. Ist das
Substrat kleiner als das Enzym, so diffundiert das Substrat zum gebundenen Enzym (z. B. Glucose und
Sauerstoff zur gebundenen Glucoseoxidase) meist ohne Schwierigkeit Ist das Substrat dagegen so groß
wie oder größer als das Enzym, so muß die durchschnittliche Porengröße des Trägers dies berücksichtigen.
Soll ein stabilisiertes Papainpräparat z.B. zur Hydrolyse eines Proteins wie Alpha-Casein dienen,
so muß das mehrfach größere Alpha-Caseinmolekül
(Molekülgewicht 121000 im Vergleich zu 21000 des Papains) diffundieren lassen. Die durchschnittliche
Porengröße muß z. B. das 2- bis 4fache der Größe des Papainmoleküls betragen, also wenigstens etwa
100-200 A, wenn das Papain zur Hydrolyse von Eiweiß (Molekülgewicht 40 000-70 000) verwendet
werden soll. Dagegen kann bei Herstellung von Fructose durch Einwirkung von Glucoseisomerase (Molekülgewicht
180 000, Größe etwa 100 A) auf Glucose die Porengröße näher am unteren Ende des angegebenen
Bereichs liegen. Das gleiche gilt z.B. bei Urease (etwa 125 A) mit ebenfalls kleinem Substrat
Bei sehr großen Enzymen wie Pyruvatdecarboxylase mit einem berichteten Molekülgewicht von über
1000000 muß der Träger näher an der Porengröße von 1000 A liegen, und auch der kritische Bereich
ist entsprechend kleiner. Auch bei Catalase mit einem Molekülgewicht von etwa 250000 und einer größten
Abmessung von etwa 183 A ist der kritische Bereich etwas kleiner, liegt also zwischen 183-1000 A, wobei
übrigens das kleinere Substrat (Wasserstoffsuperoxid) unberücksichtigt bleiben kann.
Die Art der Bindung hängt in bekannter Weise vom beabsichtigten Gebrauch, den Kosten, der technischen
Durchführbarkeit, der behaltenen Enzymaktivität, der Zugänglichkeit der Reagenzien usw, ab.
Meist kommen drei Methoden in Frage, nämlich Adsorption z. B. gemäß US-PS 35 56945, chemische Bindung
über Silankuppler gemäß US-PS 3519 538, 36 69 841 und Adsorption und Verkettung; in den
Poren gemäß Patentanmeldung P 23 39 805.2 der gleichen Anmelderin. Die Trägeroberfläche muß lediglich
freie Oxid- oder Hydroxylgruppen zur Bindung aufweisen, die das Enzym über Adsorption, eventuell
auch Verkettung in den Poren oder über chemische Kuppler mit wenigstens einem mit diesen Gruppen
umsatzbereiten Teil binden. Alle drei Methoden werden hier mit »Bindung« bezeichnet Sie können
auch kombiniert werden. In den weiter unten erläuterten Beispielen wurden die Enzyme nach dem Verfahren
der US-PS 35 56 945 adsorbiert
Von großer Wichtigkeit für Herstellung und Gebrauch des Präparats ist die Korngröße des porösen
Keramikträgers. Um seine Oberfläche voll auszunutzen, muß das Enzym vor Bindung tief in den
porösen Träger eindringen können und nach Bindung des Enzyms gilt dies auch für das Substrat
Die Diffusionsfähigkeit des Enzyms hängt von mehreren Faktoren ab, wie Porengröße und Korngröße
des Trägers, pH-Wert und isoelektrischer Punkt des Enzyms, sowie Zeit und Temperatur. Als bevorzugter
Korngrößenbereich des Trägers wurden 0,074-4,76 mm (4-200 mesh) gefunden. Größere Partikeln
erschweren die Diffusion, so daß die Oberfläche nicht voll genutzt wird, und erfordern beim Durchlauf
eine sehr lange Verweilzeit des Substrats. Kleinere Partikeln sind nur schwer in der Kolonne zu halten
und verursachen bei dichter Packung einen besonderen Aufwand erfordernden starken Druckabfall. Besonders
günstig ist der Bereich 0,177-0,71 mm (25-80 mesh).
Für die Herstellung wird ein poröser, im wesentlichen kieselsäurefreier Keramikkörper mit entsprechender
Porengröße gemahlen und klassiert, wobei vorzugsweise auf möglichst gleichmäßige Porenverteilung
geachtet wird. Geeignet sind beispielsweise poröses Aluminium-, Titan- oder Zirkonoxid, einzeln
oder in Mischung oder auch andere, wasserunlösliche Metalloxide. Die porösen Körper werden dann mit
einem geeigneten Puffer für die anschließende Enzymbindung vorbereitet oder hydratiert, um möglichst
viele Oxid- oder Hydroxylgruppen an der Oberfläche zu bilden. Zur Adsorption von z. B. Glucoseisomerase
auf porösem Aluminiumoxid wird eine Hydratation mit einem Puffer mit mehr als 7 pH bevorzugt. Zur
Bindung durch Adsorption wird zunächst der Puffer entfernt, jedoch werden die Partikeln feucht gehalten.
Sodann wird das Enzym mit einer die optimale Adsorption oder optimale Beschickung der verfügbaren
Oberfläche gewährleistenden Konzentration zugesetzt.
Die Adsorption und Massendiffusion des Enzyms in den Poren kann durch Bewegung beschleunigt
werden, z. B. Umlauf, Rühren, Umkippen, Verwendung eines fluiden Betis und dergleichen. Die erforderliche
Dauer der optimalen Adsorption hängt vom Träger der Porengröße, Partikelgröße, Größe und Spin der
Enzymmoleküle, Temperatur, pH-Wert, Bewegung usw. ab, jedoch ist für ausreichende Adsorption und
Beschickung mindestens eine halbe Stunde erforderlich, meist l'/2-5Std. Meist sollte der pH-Wert so
gewählt werden, daß die Oberflächenladung des
Enzyms umgekehrt der Oberflächenladung des Trägers ist. Nach der Adsorption wird loses Enzym abgewaschen,
ζ. B. mit Wasser, Salzlösung (ζ, Β. 0,5 MNaCl) u. a., die das Präparat nicht beeinträchtigen.
Bei Anwendung katin das Enzympräparat in einer verstöpselten Durchlaufkolonne, einem ständig gerührten
Umsetzungsgefäß, einem fiu'den Bett und dergleichen mit der Möglichkeit der Substrataufgabe
zur Inkubation gehalten werden. In den Beispielen wurde die Enzymaktivität wiederholt unter statischen
und dynamischen Bedingungen untersucht. Bei Prüfung unter dynamischen Bedingungen (entsprechend
der geplanten Anwendung) wurde die Halbzeit des Enzyms (Verlust der halben Anfangsaktivitäi) gemessen.
Je länger diese Halbzeit, desto wertvoller ist auch das Enzym. Die Beispiele zeigen durchweg
sehr lange Halbzeiten und gute Lagerfähigkeit.
Meist wird kontinuierliches Arbeiten dem abschnittsweisen gegenüber bevorzugt. Bei Verwendung in einer
Kolonne kann mit Hilfe eines Wassermantels eine optimale Inkubationstemperatur und eine die Halbwertszeit
möglichst verlängernde Temperatur eingehalten werden; z. B. bei Herstellung von Fructose
Glucose-Substrat und Glucoseisomerase ist für beide Gesichtspunkte 60° günstig. Der pH-Bereich und das
Puffersystem für die Inkubation hängen auch vom jeweiligen Enzymsystem ab, z. B. bei Herstellung von
Fructose, 7,2-8,2 oder, besonders günstig, 7,4-7,8. In der Regel wird das Puffersystem im Hinblick auf
die saure oder alkalische Beschaffenheit des Substrats gewählt, die durch die Substratlösung selbst und/
oder die Gegenwart verschiedener, zugesetzter aktivierender Ionen verursacht wird, sowie den optimalen
pH-Wert des Enzymsystems.
In den folgenden Beispielen wurden als Träger für die angegebenen Enzyme poröse Keramikkörper verschiedener,
kieselsäurefreier Metalloxide mit Porengrößen von 140-985 Ä verwendet Die Partikelgröße
der Träger lag zwischen etwa 25 und 80 mesh. Die Träger bestanden jeweils aus
Al2O5 - (175 Ä)
ZrO2 - (175 Ä)
TiO2 - (350 Ä) (420 Ä) (820 Ä) (855 Ä)
TiO2-Al2O3 - (220 Ä)
Der zuletzt aufgeführte Träger bestand aus 44 Gew.-% TiO2 und 56% Al2O3.
Glucoseisomerase adsorbiert auf porösem Al2O3
Glucoseisomerase (größte molekulare Abmessung etwa -100 Ä, Molekülgewicht 180000) wurde auf porösem
Aluminiumoxidkörpern mit den folgenden physikalischen Merkmalen adsorbiert:
Poröser Al2O3-Träger
Durchschnittlicher Porendurchmesser
Porendurchmesser, Minimum
Porendurchmesser, Maximum
Porenvolumen
Oberfläche
Partikelgröße in mesh
Porendurchmesser, Maximum
Porenvolumen
Oberfläche
Partikelgröße in mesh
175 Ä
140 Ä
220 Ä
0,6 cmVg
100 m2/g
25-60
220 Ä
0,6 cmVg
100 m2/g
25-60
60 Das adsorbierte Enzym bestand aus roher Glucoseisomerase
enthaltend 444 internationale Giucoseisomeraseeinheiten
(IGIE) pro g. Die Enzymaktivität wurde mit einem modifizierten Cystein-Carbozolverfahren
bestimmt. Das stabilisierte Präparat wurde folgendermaßen hergestellt: einer Lösung von 28,7 mi
0,1 M Magnesiumacetat wurde 5 g des obigen rohen Glucoseisomerasepräparats zugesetzt. Die Aufschlämmung
wurde 25 Min. bei Zimmertemperatur gerührt und durch Filterpapier filtriert. Der Rückstand auf dem
Filterpapier wurde mit 14,3 ml 0,1 M Magnesiumacetatlösung und anschließend mit 14,3 ml 0,5 M NaHCO3
und 4,3 ml 0,5 M NaHCO3 gewaschen. Das Waschprodukt wurde direkt im Filterpapier aufgefangen.
Das Gesamtvolumen der Enzymwaschlösung betrug etwa 50 ml.
500 mg des porösen Aluminiumoxids wurden in eine 50-ml-Kugelflasche gegeben und 10 ml der Glucoseisomeraselösung
zugesetzt Die Flasche wurde an einem Rotationsverdampfer befestigt, ein Vakuum angelegt und die Flasche in einem auf 30-45° gehaltenen
Bad 25 Min. lang rotiert, Sodann wurden 10 weitere ml Glucoseisomeraselösung zugesetzt und die
Verdampfung unter den gleichen Bedingungen 35 Min. fortgesetzt. Dies wurde zweimal wiederholt, dann eine
abschließende Menge von 7 ml Glucoseisomerase zugesetzt und bei 45° weitere 70 Min. verdampft.
Die Flasche wurde dann übers Wochenende in einen kalten Raum verbracht Insgesamt 47 ml Glucoseisomeraselösung
waren den porösen Aluminiumoxidpartikeln zugesetzt worden.
50 ml Puffer aus 0,01M Natriummaleat mit pH
6,8-6,9 und enthaltend 0,001 Cobaltchlorid und 0,005 Magnesiumsulfat wurden dem Enzympräparat zugesetzt
und die Probe 1 Std. bei Zimmertemperatur extrahiert, dann mit 200 ml Wasser und anschließend
10 ml 0,5 M NaCl gewaschen. Die letzte Wäsche wurde über einem Glasfrittentrichter mit 50 ml Wasser
durchgeführt Das Enzympräparat wurde dann in einen 50-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und im Puffer bei
Zimmertemperatur gelagert Wiederholte Proben wurden während 106 Tagen entnommen. Der durchschnittliche
Wert der Prüfungen betrug 130IGIE pro 500 mg, die Enzymaktivitätsausbeute betrug 6%. Der
Durchschnittswert wurde durch 20 Prüfungen während der 106 Tage ermittelt, wobei 16 der Prüfungen eine
Aktivität von 100-150IGIE pro 500 mg (200-300IGIE pro g) zeigten. Diese Ergebnisse zeigen eine sehr
hohe statische Stabilität bei vergleichsweise starker Enzymbeschickung. Die zurückbehaltene Extraktlösung
wurde ebenfalls geprüft; sie enthielt 39,8IGIE pro ml, also eine Enzymaktivitätsausbeute von 90%.
Zur Prüfung unter dynamischen Bedingungen, die einen besonderen Wert der erfindungsgemäßen Präparate
ausmachen, wurde die Enzymwirkung bei der Isomerisation von Glucose zur Fructose unter industriellen
Einsatzbedingungen geprüft. Die Fructoseherstellung aus billiger Glucoselösung ist wegen der
doppelten Süßwirkung bei gleichem Kaloriengehalt, bzw. gleicher Süßwirkung bei halbem Kaloriengehalt
von besonderem wirtschaftlichen Interesse.
10 g des stabilisierten Glucoseisomerasepräparats wurden in mit Wasserkühlmänteln umgebene Kolonnen
gegeben. Die Kolonnen wurden durch Thermostate auf einer Temperatur von 60° gehalten. Eine
50%ige Glucoselösung wurde hindurchgepumpt, wobei der Durchsatz so eingestellt wurde, daß eine Fructoseumwandlung
von 80-85% der theoretischen erreicht wurde. Gegebenenfalls wurde der Durchsatz in bestimmten
Absätzen herabgesetzt Die Anfangsdurchsatzrate war 190 ml pro Std. Das Präparat wurde
folgendermaßen hergestellt.
11g der im Beispiel I beschriebenen porösen Aluminiumoxidkörper
wurden in einen 100-ml-Glaszylinder
gebracht und unter Zusatz von 100 ml 0,05 M Magnesiumacetat und 0,01 M Cobaltacetat mit pH 7,5
vorbehandelt. Der Zylinder wurde verstöpselt und nach Mischen durch Umdrehen in ein 60° warmes Bad
gesetzt. Nach 15 Min. Umsetzung wurde der Zylinder umgedreht und die Flüssigkeit abgegossen. 100 ml
frisches Magnesium-Cobaltacetat wurden zugesetzt, durch Umdrehen des Zylinders gemischt und 2V2 Std.
bei Zimmertemperatur stehen gelassen.
Vor der Adsorption wurde eine rohe Enzymlösung bestehend aus 590IGIE pro ml in 0,6 gesättigtem
Ammoniumsulfat wie folgt gereinigt: 40 ml der GIucoseisomeraselösung
wurden, 1,4 weitere g Ammoniumsulfat zugesetzt, um das Enzym auszufällen. Die
Aufschlämmung wurde bei Zimmertemperatur 20 Min. gerührt, und dann bei 2° 30 Min. lang mit 16000UpM
zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgegossen und weggeworfen. 12 ml der obigen Magnesium-Cobaltacetatlösung
wurden der Ausfällung zugesetzt und gerührt. Sodann wurden 3 ml 0,5 M Natriumbicarbonat
zugegeben und bis zur Auflösung gemischt. Die Lösung wurde 15 Min. in ein 60° warmes Bad
gebracht und nach Entnahme 15 Min. bei 2° mit 16000UpM zentrifugiert. Die klare überstehende Enzymlösung
wurde abgegossen und die Ausfällung weggeworfen. Die Enzymlösung (28 ml) hatte einen pH-Wert
7,5. Falls bei der Reinigung keine Aktivität verlorenging, so betrug die Aktivität der Lösung
etwa 23 600IGIE.
Zur Adsorption wurde nun die Magnesium-Cobaltacetatlösung nach Umkehren von den porösen Aluminiumoxidkörpern
abgegossen und 28 ml Enzymlösung in einem Zylinder zugesetzt. Der Zylinder wurde verstöpselt, durch Umdrehen gemischt und in
ein 60° warmes Bad gesetzt. Die Enzyme wurden in die Poren diffundieren und mit dem porösen Aluminiumoxid
bei 60° 2V2 Std. umsetzen gelassen. Während dieses Zeitraums wurde der Zylinder alle
15 Min. durch Umdrehen gemischt. Nach Entnahme aus dem Bad wurde die Adsorption bei Zimmertemperatur
durch Umdrehen und Mischen alle 30Min. während 2 Std. fortgesetzt und über Nacht bei Zimmertemperatur
durch Stehenlassen au Ende geführt. Die Enzymlösung wurde abgegossen (28,5 ml, pH 74)
und für die weitere Prüfung aufbewahrt Das stabilisierte Enzympräparat wurde mit 60 ml destilliertem
Wasser und sodann mit 40 ml 0,5 M NaCl und schließlich 40 ml Magnesium-Cobaltacetatlösung gewaschen. Drei kleine Proben von je etwa 1 g wurden
für die weitere Prüfung entnommen,
Die übrigen 10 g wurden in eine thermostatisch
auf 60ό gehalten Kolonne gebracht; der Kolonne wurde
eine 50%ige Glucose und 0,005 M Magnesiumsulfat, mit Natriumsulfit auf pH 7,7-8 gepufferte Lösung
zugeführt. Während der ersten 26 Std. wurden der Speiselösung O1OOlM Cobaltchlorid zugesetzt, anschließend war der einzige Aktivator Magnesium. Der
anfängliche Durchsatz betrug 190 ml pro Std., der dann periodisch auf eine Umwandlungsrate von 80-85
der theoretischen (entsprechend einer Fructoseausbeute von etwa 40-42/2%) verringert wurde. Die
Durchlaufzeit betrug insgesamt 31 Tage. Die Kolonne wurde dann durch Abbruch der Lösungszufuhr ausgetrocknet,
Produktproben entnommen und die in g/Std. erzeugte Fructosemenge gemessen. Da der
Durchlauf periodisch verringert wurde, so daß eine konstante Umwandlungsrate von 80-85% gegeben war,
ist die an einem bestimmten Tag pro Std. erzeugte Fructosemenge ein getreuer Maßstab für die Enzymaktivität
in der Kolonne. Die Anfangsbeschickung der Kolonne betrug 381IGIE pro g, die gesamte Kolonne
enthielt 3810IGIE, die über 31 Tage 42-28 g Fructose pro Std. ergaben, so daß die Halbzeit des
Präparats etwa 42 Tage betrug. Der Versuch zeigt eine hohe Stabilität des Enzympräparats, der vermutlich
auf der spezifischen Auslegung des Trägers mit einer für die Glucoseisomerase optimalen durchschnittlichen
Porengröße beruht
Beispiele III und IV
Glucoseisomeidbc adsorbiert auf porösem ZrO2 und
TiO2-Al2O3
Die Träger hatten die folgenden Eigenschaften:
ZrO2 | TiO2-Al2O3 | |
Porendurchmesser, durchschn. |
175 Ä | 220 Ä |
Porendurchmesser, Minimum |
140 Ä | 140 Ä |
Porendurchmesser, Maximum |
200 Ä | 300 Ä |
Porenvolumen in ccm/g | 0,23 | 0,5 |
Oberfläche in qm/g | 50 | 75 |
Partikelgröße in mesh | 25-60 | 25-60 |
500 mg poröses ZrO2 und 300 mg TiO2-AI2O3 wurden
getrennt mit 0,05 M Mugnesiumacetat-0,01 M Cobaltacetatlösung,
pH 7,5, 60° während 15 Min. und dann bei Zimmertemperatur während 3 Std. vorbehandelt
Die Lösung wurde sodann abgegossen. Den Trägerr wurde 0,8 ml (672 IGIE) nach Beispiel II gereinigt«
Glucoseisomeraselösung beigegeben. Die Adsörptlor würde bei 60° während 4 Std. durchgeführt und dabe
alle 15 Min, durch Umdrehen gemischt, und übe Nacht ohne weiteres Mischen weiter adsorbieren ge
lassen. Die restliche Enzymlösung wurde dann abge gössen. ",■' 'Υ'" '■■■' " '■*'
Die stabilisierten Glucoseisomerasepräparate wur den dann nacheinander erst mit 0,5 M NaCl-Lösüng
mit 0,05 M Magneslumncetat-0,01 M Cobaltacetatlö
sung, pH 7,5 und zuletzt mit destilliertem Wasse gewaschen. Sie wurden dann getrennt bei Zimmertem
peratur in Wasser aufbewahrt. Sie wurden dann will·,
rend 18 Tagen auf Qlucoselsomeraseaktlvitiit geprüf Die Tabelle I enthUlt die Ergebnisse.
706634/4*
Statische Prüfung bei 60° auf Aktivität in IGIE/g
Träger (durchschnittliche Poren | TiO2-Al2O3 (220 Ä) |
größe in Ä) | 259 |
ZrO2 (175 A) | 259 |
53,6 | 213 |
50,0 | 213 |
43,6 | 199 |
57,4 | 198 |
41,6 | |
38,9 | |
Beide Träger ergaben ein stabiles Enzympräparat. TiO2-Al2O3 zeigte infolge größerer durchschnittlicher
Porenweite, größerer Oberfläche und größerem Porenvolumen eine stärkere Besetzung mit aktivem Enzym.
Beispiele V und VI
Papain adsorbiert auf porösem TiO2 und porösem
TiO2-Al2O3
Zur Herstellung stabilisierter Papainpräparate wurden Träger mit den folgenden physikalischen Eigenschaften
verwendet:
Poröse TiO2 und TiO2-Al2O3-Träger
TiO2 | TiO2-AI2O, | |
Porendurchmesser, durchschnittl. (A) |
350 | 220 |
Porendurchmesser, Minimum (A) |
220 | 140 |
Porendurchmesser, Maximum (A) |
400 | 300 |
Porenvolumen (ecm/g) | 0,45 | 0,5 |
Oberfläche in qm/g | 48 | 77 |
Partikelgröße in mesh | 25-60 | 25-60 |
parate wurden dann während 15 Tagen mit Casein geprüft. Sie hatten die folgende Aktivität:
Statische Prüfung bei 37° auf Aktivität in mg Papain/g
Träger
Tag
Jc 500 mg Träger wurden getrennt mit 9 ml 0,5 M
NaHCO3-Lösung während l'/üStd. bei 37° in einem
Rüttelwasserbad vorbehandelt. Der Puffer wurde dann abgegossen und die Träger mit destilliertem Wasser
gewaschen. 10 g Papin iMolekulguwictit 21000, größte
Abmessung 48 A) wurden In 50 ml 0,2 M Phosphatpufferlösung mit pH 6,95 enthaltend 86 mg Cysteinhydrochlorid und 37 mg Dinatrlumüthylendlamlntotraessigsäure suspendiert und auf den betreffenden Trägern adsorbiert. Die erhaltenen Präparate wurden mit
Casein (Molekülgewicht 121000) nach dem Verfuhren
der US-PS 35 56 945 geprüft. Dies geschuh im einzelnen
folgendermaßen.
10 ml enthaltend 2 g Enzym der Paplnlösung wurden jedem Träger zugegeben und dlo Adsorption während
3 Std. bei 37° In einem Schüttelwasserbad vorgenommen, Die Enzymlösung wurde dann abgegossen
und die Präparate mit destilliertem Wasser gewaschon,
anschließend mit 0,5 M NaCl und nochmals mit destilliertem Wasser nachgewaschen. Sie wurden dünn
bei Zimmertemperatur In Wasser aufbewahrt, Die Prä-
Träger (durchschnittliche Porengröße in A)
TiO2 (350 Ä) TiOj-Al2O3 (220 A)
7,41
6,82
3,84
2,24
6,82
3,84
2,24
9,06 6,80 4,85 4,00
Beispiele VII und VIII
Alkalischer Bacillus subtilis Protease adsorbiert auf porösem TiO2 und porösem TiO2-Al2O3
Ähnliche Träger wie in den vorigen beiden Beispielen wurden für die Adsorption des Bacillus subtilis
verwendet, der ein Molekülgewicht von 27000 und eine größte Abmessung von 42 A aufweist. Die
Enzympräparate wurden durch Verwendung einer aus 10 g alkalischer Protease suspendiert in 50 ml 0,1 M
Phosphatpuffer, pH 7,8 enthaltenden Lösung hergestellt. 10 ml (2 g Enzym) der Proteaselösung wurden
500 mg Proben jedes Trägers (350 A TiO2 und 220 A
TiO2-AI2O3) zugesetzt. Die Adsorption entsprach etwa
der für die obigen Papainbeispiele.
Die erhaltenen Präparate wurden wie gemäß der
US-PS 35 56 945 mit Casein (Molekülgewicht 121000) geprüft, jedoch enthielt die Substratlösung 0,1 M
Phosphatpuffer und der pH betrug 7,4. Die Proben enthielten weder Cysteinhydrochlorid noch Äthylenüiamintetraessigsäure.
Die Tabelle III enthält.die Prüfergebnisse von 15 Tagen.
Tabelle III
Statische Prüfung
Aktivität in mg alkalische Protease/g Träger
Statische Prüfung
Aktivität in mg alkalische Protease/g Träger
T"8 Träger, durchschnittl. Porengröße in A
TiO2 (350 A) TiO2-AI2Oj (220 A)
5,47
3,60
1,17
0,67
3,60
1,17
0,67
4,69 1,57 0,64 0,40
Urease adsorbiertaul'Trägern mit verschiedener Poretv·^
größe '■' ■'■■■ ';'■'"';°Ä!
Stabilisierte Ureasepräparate können zum ..MesÄty
des Harnstickstoffgehalts Im Blut verwendet
well Urease Harnstoff selektiv zu meßbaren NHj u"d COj hydrollslert, die Ihrerseits zum::rmM:f
stofTgehalt in Beziehung gesetzt werden könnerfite
den folgenden Beispielen wurde Urease an vecicHlefi
iAnQJei Keramikkörper mit PorengiößetvÄD
140-985 A und durchschnittlichen ~ " ^1'1 'UL"1
175-855 Ä gebunden, um den Träger mit der optimalen Porengröße für dieses Enzym zu bestimmen.
Urease hat ein Molekülgewicht von etwa 480000 und eine größte Abmessung von etwa 125 A als Monomer
strat für Urease, im Verhältnis zum Enzym sehr klein ist, kann es bei Bestimmung der durchschnittlichen
Porengröße Tür den Träger außer acht bleiben, im Gegensatz zum Papainsubstrat Casein. Die Träger
und etwa 250 Ä als Dimer. Da Harnstoff, das Sub- 5 hatten die folgenden Physikalischen Eigenschaften:
Poröse Träger | AI2O3-TiO2 | TiO2 | TiO2 | TiO2 | |
AI2O3 | 220 | 350 | 420 | 855 | |
Durchschnittl. Porendurchmesser (A) | 175 | 140 | 220 | 300 | 725 |
Minimum Porendurchmesser (A) | 140 | 3OG | 400 | 590 | 985 |
Maximum Porendurchmesser (A) | 220 | 0,5 | 0,45 | 0,4 | 0,22 |
Porenvolumen, ccm/g | 0,6 | 77 | 48 | 35 | 9 |
Oberfläche, qm/g | 100 | 25-60 | 25-60 | 30-80 | 25-80 |
Partikelgröße, mesh | 25-60 | ||||
500 mg eines jeden dieser Träger wurden durch Schütteln in 11ml 0,5 M NaHCO3 bei 37° während
1 Std. und 40 Min. vorbehandelt. Die NaHCOrLösung
wurde dann abgegossen. Jeder 500 mg Probe des Trägers wurden 20 ml einer l%igen wässerigen Ureasesuspension
mit 400 Sumner-Einheiten (SE) Ureaseaktivität pro g oder 80 SE pro Probe beigegeben. Träger
und Ureaselösungen wurden 5 Std. in einem Wasserbad bei 37° geschüttelt und die Mischung dann bei
Zimmertemperatur 22 Std. stehengelassen. Dann wurde die Enzymlösung abgegossen und die Präparate
zuerst mit destilliertem Wasser, dann mit 0,5 M NaCl-Lösung und zuletzt wieder mit destilliertem Wasser
gewaschen. Sie wurden dann in kleine Kolonnen überführt und bei Zimmertemperatur während eines Zeitraums
von 32 Tagen auf Aktivität geprüft. Die Tabelle enthält die Ergebnisse.
Aktivität in SE/g mit Trägern verschiedener Porengrößen
Tage | Al2O3 | AI2O3-TiO2 | TiO2 | TiO2 | TiO2 |
(175) | (220) | (350) | (420) | (■355) | |
0 | 0,35 | 0,81 | 1,18 | 4,36 | 2,46 |
0 | 0,22 | - | - | - | - |
I | 0,11 | - | -· | - | - |
4 | - | 0,59 | 0,63 | 2,32 | 1,77 |
5 | 0,05 | 0,45 | 0,43 | 1,98 | 0,95 |
6 | 0,06 | 0,33 | 1,98 | 0,61 | |
7 | 0,05 | 0,29 | 1,56 | 0,36 | |
U | 0,03 | 0,16 | 1,11 | 0,19 | |
18 | 0,03 | 0,11 | 0,73 | 0,09 | |
27-28 | 0,01 | 0,07 | 0,47 | 0,03 | |
32 | - | 0,05 | 0,34 | ■ - |
erhellt auch aus den folgenden Beispielen, in denen zwei verschiedene Enzyme gleichzeitig in den Poren
eines Trägers mit kleinerer und eines Trägers mit größerer durchschnittlicher Porengröße als der Enzymgröße
adsorbiert wurden. Als Enzyme wurden UIucoseoxidase und Catalase mit den folgenden Eigenschaften
gewählt:
Glucoseoxidase - Molekülgewicht 150000, größte Abmessung 84 A, Catalase, Molekülgewicht 250000,
größte Abmessung 183 A.
Diese beiden Enzyme wurden auf einem porösen Aluminiumoxidträger nach Beispiel I und einem porösem
Titanoxidträger nach Beispiel V mit durchschnittlichen Porendurchmessern von 175 bzw. 350 A
adsorbiert. Das Adsorptionsverfahren entsprach dem der oben erwähnten gleichlaufenden Anmeldung.
Durch Einwirkung von Glucoseoxidase auf Glucose in Gegenwart von Sauerstoff entsteht Gluconsäure
und Wasserstoffsuperoxid. Es wird also fortlaufend sauerstoff benötigt, gleichzeitig aber oxidiert das Wasserstoffsuperoxid
das Enzym, das dadurch seine Aktivität einbüßt. Dem kann durch gleichzeitige Adsorption
von Catalase entgegengewirkt werden, du diese durch Einwirkung auf das Wasserstoffsuperoxid
Sauerstoff freisetzt. Bei kleineren Porengrößen, wie Aluminiumoxid (175 A) bleibt Catalase (183 A) ubei
ausgeschlossen, und die Tabelle zeigt die Folgen hiervon im Vergleich zum Träger mit weiterer Porengröße.
Vergleich der Glucoseoxldase-AkUvitfiten (GOU) prc
g poröses AI2O3 und TIO1
Wie die Tabelle zeigt, liegt die durchschnittliche
Porengröße für Urease bei etwa 420 A, wenn auch eine kleinere EnzymuktivlWt mit Trägern durchschnittlicher Porengrößen von 175 oder 855 A erhalten
bleibt.
Die kritische Bedeutung einer zumindest der Enzym· größe entsprechenden durchschnittlichen Porengröße
PrUfünßS· üoispiol XIV
la» Poröses (175 A) AI2O3
. Botspiel XV
Poröses
(3SOA)TIO2
(3SOA)TIO2
I | 12,9 |
1 | 18,7 |
4 | 11,7 |
5 | 10,1 |
6 | 8,5 |
7 | 7,0 |
20,5
36,2
36,2
36,2
36,2
36,2
'""hvr^.
■»■>.
1.A
Fortsetzung
Prü rungstag
Beispiel XIV
Poröses (175 Ä) AI2O3
Poröses (175 Ä) AI2O3
Poröses
(350A)TiO2
(350A)TiO2
38 | zu niedrig, unmeßbare | 32,5 |
Werte | ||
59 | - | 36,2 |
83 | - | 35,9 |
103 | - | 35,5 |
136 | - | 32,5 |
165 | - | 29,6 |
Die Aktivität wurde hierbei durch Einsetzen von 300 mg Proben in eine Durchlaufkolonne gemessen.
Eine Standardlösung von Glucose wurde mit einem Durchsatz von 145ml/Std. eingeführt. Die Glucoseeinheiten
wurden indirekt durch periodische Messung des Gluconsäureanteils bestimmt.
Beispiele XVI-XIX
Weitere 300 mg Präparate wurden hergestellt, bestehend aus Glucoseoxidase und Catalase, adsorbiert
auf porösem Titanoxidträgern mit durchschnittlichen Porengrößen von 350, 420, 820 und 855 Ä und den
folgenden Eigenschaften:
Das Adsorptionsverfahren ist in der gleichlaufenden Anmeldung beschrieben.
Die Präparate wurden während 42 Tagen wie in den vorigen Beispielen wiederholt geprüft, wobei das
Substrat in die Kolonnen aber mit dem höheren Durchsatz von 390ml/Std. eingeführt wurde. Infolge
verstärkter Substratdiffusion ist hier eine gesteigerte Glucoseoxidaseaktivität zu erwarten.
Vergleich der Glucoseoxidaseaktivität pro g TiO2
Träger mit steigenden durchschnittlichen Porendurchmessern
Prüflings- TiO2 Träger, durchschn. Porengröße in A
tag
tag
350 Ä 420 A 820 Ä 855 Ä
Tabelle Vl | Poröse | Träger | TiO2 | TiO2 |
TiO2 | TiO2 | 820 | 855 | |
350 | 420 | |||
Durchschnittl. | ||||
porendurch- | 760 | 725 | ||
messer (A) | 220 | 300 | ||
Minimum | ||||
Porendurch | 875 | 985 | ||
messer (λ) | 400 | 590 | ||
Maximum | ||||
Porendurch- | 0,2 | 0,22 | ||
mosser (A) | 0,45 | 0,4 | ||
Porenvolumen, | 7 | 9 | ||
ccm/g | 48 | 35 | 25-80 | 25-80 |
Oberfläche, qro/g | 25-60 | 30-80 | ||
Partikelgröße, | ||||
mesh | ||||
0 | 66,0 | 56,4 | 43,9 | 37,8 |
3 | 66,0 | 77,7 | 43,9 | 39,7 |
8 | 66,0 | 84,5 | 46,2 | 40,3 |
13 | 66,0 | 84,5 | 46,2 | 44,3 |
42 | 66,0 | 80,5 | 40,3 | 42,0 |
Wie die Tabelle zeigt, ist die langfristige Glucoseoxidaseaktivität
(GOE/g) aller vier Präparate außerordentlich beständig. Dies gilt ganz besonders für
poröse Titanoxidträger mit durchschnittlichen Porengrößen von 350 A; über einen Zeitraum von 42 Tagen
konnte hier kein Aktivitätsverlust beobachtet werden, und das unter Bedingungen mit gesteigertem Durchsatz
der Substratlösung (390 ml/Std. gegenüber 145 ml/ Std,), die an sich eine größere Enzymablösung erwarten
ließen. Bei größerem durchschnittlichem Porendurchmesser des Trägers, über 420 A, war eine abnehmende
Enzymbeschickung zu beobachten, die auf die geringere Oberfläche (7-9qm/g) der porösen TiO2-Träger
mit durchschnittlichen Porengrößen von 820 und 855 A zurückgeführt werden kann. Präparate mit
Trägern aus porösem Titanoxid mit durchschnittlichem Porendurchmesser von 420 A zeigten die stärkste Beschickung
in GOE/g. Ein diesem etwa entsprechender
poröser Träger (Porendurchmesser 300 A Minimum, 590 A Maximum) wird für ein synergistisches Glucose-Oxidase-Catalasesystem
daher bevorzugt. Selbst Präparate mit Trägern einer durchschnittlichen Porengröße
von 855 A (725 A Minimum und 985 A Maximum) waren bemerkenswert beständig, obgleich die
Zahl der GOE/g infolge der kleineren Oberfläche geringer war.
Claims (5)
1. Immobilisiertes Enzympräparat, bei dem das Substrat-Kombination wiederum die Verwendung von
Enzym an ein im wesentlichen kieselsäurefreies 5 porösem Glas als Trägermaterial bevorzugt, vgl. den
anorganisches Material gebunden ist, dadurch Anspruch 1, und in jedem Falle die Bedeutung
gekennzeichnet, daß eas Material ein poröser wesentlicher physikalischer Merkmale nicht behandelt.
Keramikkörper mit einer durchschnittlichen Korn- Zwar erörtert Messing in Enzymologia, Bd. 39,
größe von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnitt- S. 12-14 das Verhältnis von Porengroße und Ober,
licher Porendurchmesser wenigstens so groß wie io flächengröße auf die Quantität adsorbierter Enzyme,
die größte Abmessung des Enzyms, aber kleiner beschränkt diese Betrachtung aber auf poröse Glasais
1000 Ä, und daß das Enzym an die Innen- träger und auf den rein quantitativen Gesichtspunkt
fläche des porösen Keramikkörpers gebunden ist. der adsorbierten Enzymmengen.
2. Enzympräparat nach Anspruch I, dadurch ge- Demgegenüber wurde gefunden, daß kieselsäurehalkennzeichnet,
daß derPorendurchmesser 100-1000 Ä, 15 tige Träger, wie z.B. poröses Glas in alkalischer Umvorzugsweise
100-500 Ä, beträgt. gebung nur eine sehr kurze Lebensdauer haben; das
3. Enzympräparat nach Anspruch 2, dadurch ge- ist umso bedauerlicher, als viele Enzyme bei alkalikennzeichnet,
daß der Keramikkörper wenigstens sehen pH-Werten katalytisch besonders wirksam sind,
teilweise aus Aluminiumoxid, Titanoxid oder Zink- Die Alkalifestigkeit kann durch Überzug mit einem
oxid besteht. 20 Metalloxid, z. B. Zirkonoxid, verbessert werden. Je-
4. Enzympräparat nach Anspruch 3, dadurch ge- doch bedeutet dies einen weiteren Bearbeitungsschritt
kennzeichnet, daß die durchschnittliche Korngröße und höhere Gestehungskosten.
0,177-0,71 mm beträgt Auch ein Überzug von organischen Polymeren wurde
5. Immobilisiertes Enzympräparat, bei dem das bereits vorgeschlagen, US-PS 37 05 084. Auch dies erEnzym
an ein im wesentlichen kieselsäurefreies 25 fordert aber ein aufwendiges Beschichtungsverfahren
anorganisches Material gebunden ist, dadurch ge- und führt wiederum die Nachteile organischer Stoffe
kennzeichnet, daß das Material ein poröser Ke- ein.
ramikkörper mit einer durchschnittlichen Korn- Besondere Schwierigkeiten entstehen auch bei den
größe von 0,074-4,76 mm ist, dessen durchschnitt- für die großindustrielle Produktionsweise in Durchlicher
Porendurchmesser wenigstens so groß wie die 30 laufkolonnen, die eine besonders zuverlässige und
größte Abmessung des Enzymsubstrates, aber klei- dauerhafte Immobilisierung der benötigten Enzyme
ner als 1000 Ä ist, und daß das Enzym die Innen- verlangt
fläche des porösen Keramikkörpers gebunden ist. Es ist daher Aufgabe der Erfindung, immobilisierte,
auch für die Verwendung in großem Umfang, insbe-35 sondere Durchlaufkolonnen und dergleichen, geeig-
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