FR2542010A1 - Procede pour immobiliser l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transferase - Google Patents
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Abstract
POUR IMMOBILISER L'ENZYME CYCLODEXTRINEGLYCOSYLTRANSFERASE, ON ACTIVE D'ABORD UN POLYMERE CONTENANT AU MOINS 0,1MEQUVG DE GROUPEMENTS FONCTIONNELS -COOH, LEQUEL A ETE PREPARE A PARTIR DES MONOMERES ACIDE ACRYLIQUE ETOU METHACRYLIQUE ET ACRYLAMIDE ETOU METHACRYLAMIDE SOUS L'INFLUENCE D'UN AGENT DE RETICULATION DE TYPE ACRYLIQUE OU ALLYLIQUE, COMME SUPPORT, AVEC UN DERIVE DE CARBODIIMIDE SOLUBLE DANS L'EAU OU SOLUBLE DANS LES SOLVANTS ORGANIQUES A UNE TEMPERATURE INFERIEURE A 0C, PUIS ON AMENE L'ENZYME CYCLODEXTRINEGLYCOSYLTRANSFERASE AU SEIN D'UNE SOLUTION AYANT PH DE 4,5 A 8,5 SUR LE POLYMERE AINSI ACTIVE, ON LAVE LE PRODUIT AINSI OBTENU ET LE SECHE EVENTUELLEMENT EN FIN DE COMPTE. L'AVANTAGE DU PROCEDE CONFORME A L'INVENTION RESIDE DANS LE FAIT QUE L'ENZYME IMMOBILISEE PEUT, CONTRAIREMENT A L'ENZYME LIBRE, ETRE APPROPRIEE A UNE UTILISATION DURABLE ET QU'ELLE PEUT DE CE FAIT ETRE MISE EN OEUVRE DANS UN PROCESSUS CONTINU.
Description
542 1 o Procédé pour immobiliser l'enzyme cyclodextrineglycosyl-
transférase
L'invention concerne un procédé pour l'immobi-
lisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase.
Lors du traitement d'un amidon partiellement hydrolysé avec une enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase (dénommée ci-après CG Tase), il se forme des noyaux molécu- laires formés par des unités 6, 7 ou 8- glucopyranose (qu'on
appelle cyclodextrines,et plus exactement a-, B et y-cyclo-
dextrines)qui sont capables d'encapsuler des molécules
d'autres composés Ce processus qui est dénommé "encapsu-
lation moléculaire" peut être utilisé pour l'amélioration des propriétés de certaines substances sensibles, volatiles,
facilement oxydables ou difficilement solubles.
Par mise en oeuvre d'une enzyme CG Tase solubili-
sée, on ne peut réaliser qu'un procédé discontinuo Dans le cas d'une mise en oeuvre continue, on immobilise l'enzyme avantageusement sur un support solide Un tel procédé a été décrit dans la publication Biotechnol -Bioeng 19, 87 ( 1977) D'après cette publication, on peut immobiliser une forme succinée de l'enzyme CG Tase sur un échangeur
anionique copolymère de vinylpyridine, et ce par des liai-
sons ioniques Bien que dans le cas de cette méthode, la
succination préalable accroît la force des liaisons io-
niques, on doit compter avec une désorption progressive
de l'enzyme La désorption peut être évitée en fixant l'en-
zyme sur le support par des liaisons covalentes; dans ce cas, il se forme un catalyseur solide nouveau qui maintient
l'activité catalytique de l'enzyme et qui est moins sensi-
ble à l'égard des conditions réactionnelles.
Le but de l'invention réside dans la fabrication
d'une enzyme CG Tase immobilisée qui est fixée sur un sup-
port solide par des liaisons covalentes.
Conformément au procédé selon l'invention, on fabrique une telle préparation d'enzyme CG Tase immobilisée qui est appropriée à une utilisation durable et qui main- tient l'enzyme liée à un support relativement stable du point de vue chimique ou inertes résistant partiellement ou de façon illimitée à l'influence de microorganismes,qui
possède des propriétés mécaniques favorables et qui garan-
tit un débit élevé Une autre exigence réside dans le fait que l'enzyme doit être liée au support sous des conditions
réactionnelles ménageantes.
Il a été trouvé que les polymères obtenus à par-
tir de monomères d'acide acrylique et/ou méthacrylique et d'acrylamide et/ou de méthacrylamide avec mise en oeuvre d'un agent de réticulation du type acrylique ou allylique
(par exemple le N,N'-méthylène-bis-acrylamide, le diacryla-
te d'éthylène ou le N,N'-diallyl-tartramide), ces polymères contenant au moins 0,1 mequv /g avantageusement 2-8 mequv / g de groupement fonctionnel -COOH répondent complètement
aux exigences susmentionnées.
Les supports susmentionnés peuvent être préparés
par mise en oeuvre de procédés en soi connus.
On active les groupements carboxy de façon en soi connue avec du carbodiimide et on-les rend ainsi capables à
la fixation de l'enzyme CG Tase La mise en oeuvre de carbo-
diimides'en tant qu'agents d'activation présente l'avantage que la réaction d'activation peut être mise en oeuvre sous
conditions ménageantes ( 0-40 C, p H = 6,0-8,0).
L'invention a pour objet un procédé pour l'immo-
bilisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase, caractérisé par le fait que: on active d'abord un polymère contenant au moins 0,1 mequv/g de groupements fonctionnels -COOH, lequel a été
préparé à partir des monomères acide acrylique et/ou métha-
crylique et acrylamide et/ou méthacrylamide sous l'influence d'un agent de réticulation de type acrylique ou allylique, comme support, avec un dérivé de carbodiimide soluble dans
l'eau ou soluble dans les solvants organiques à une tempéra-
ture inférieure à O C, puis on amène l'enzyme cyclodextrineglycosyltransférase au sein d'une solution ayant un p H de 4,5 à 8,5 sur le polymèreainsi activé, on lave le produit
ainsi obtenu et le sèche éventuellement en fin de compte.
En tant que polymère, on peut utiliser de façon
particulièrement avantageuse des copolymères acrylamide-N,N'-
méthylène-bis-acrylamide-acidc acrylique (Akrilex C).
Dans le procédé conforme à l'invention, on peut utiliser en tant qu'enzyme toute enzyme CG Tase quelconque
isolée d'une manière quelconque et d'origine quelconque.
On peut utiliser comme dérivé carbodiimide activant
par exemple le sulfonate de N-cyclohexyl-N'-Z 2-( 4-morpholi-
nyl)-éthyl 7-carbodiimide-méthyl-p-toluène ou le chlorhydra-
te de N-éthyl-N-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide On
peut utiliser avantageusement en tant que dérivé de carbo-
diimide des substances solubles dans l'eau Parmi les dé-
rivés de carbodiimide solubles seulement dans des solvants organiques, on peut utiliser dans le cadre du procédé conforme à l'invention ceux qui sont solubles dans des solvants organiques indiqués à froid (c'est-à-dire à une température inférieure à O C) L'enzyme CG Tase est amenée sur le support au sein d'une solution ayant une valeur de p H de 4,5-8,5 avantageusement 6,5 - Le milieu réactionnel peut avantageusement être constitué par une solution tampon d'acétate de sodium
(p H 6,5).
Les préparations enzymatiques formées par la réaction de couplage sont lavées de façon en soi connue et si nécessaire séchées Les préparations enzymatiques peuvent toutefois être également conservées en suspension
aqueuse ou stockées à des températures de O à 4 C.
L'activité des préparations enzymatiques,obte-
nues selon le procédé conforme à l'invention,immobilisées, est de 13-450 unités Kitahata/g de Xerogel, ce qui peut
être considéré comme très favorable du point de vue appli-
cabilité pratique (l'unité en question correspond à une quantité d'enzyme qui occasionne à 40 C par minute une
élévation de transmission,linéaire,de 1 %).
L'enzyme CG Tase immobilisée conformément au
procédé selon l'invention sur un copolymère d'acrylamide-
N,N'-méthylène-bis-acrylamide-acide acrylique (Akrilex C)
fait preuve d'une stabilité plus élevée en milieu faible-
ment acide (c'est-à-dire pour une valeur optimale de p H de l'application de 5,5) que l'enzyme dissoute Cet avantage est d'une importance particulièrement grande dans le cas
d'une mise en oeuvre durable.
D'autres détails relatifs à la présente invention résultent des exemples qui suivent sans toutefois limiter la
portée de l'invention à ces exemples.
Exemple 1.
On met en suspension 0,4 g d'un Xerogel du type
Akrilex AH-C 4 (capacité de fixation teneur en-COOH -
3,08 mequv /g) dans 8 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acé-
tate de sodium (p H 6,5) A cette solution, sur bain d'eau à la température de la glace, et avec agitation constante,
on ajoute une solution de 0,8 g de N-cyclohexyl-N'-f 2-( 4-
morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide-méthyl-p-toluène sulfonate dans 100 ml de tampon froid (+ 4 C) Le mélange réactionnel est agité pendant 10 minutes, après quoi on ajoute 40 ml d'une solution de CG Tase fl O mg/ml 7 Pour la dissolution
et la dialyse de l'enzyme, on utilise une solution de tam-
pon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) Le temps de
réaction brut est de 48 heures à 0-4 C, entretemps le mé-
lange est agité deux fois pendant chaque fois 6 heures.
Le gel est séparé par filtration, puis lavé successivement trois fois avec chaque fois 50 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5), trois fois avec chaque fois
ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium conte-
nant 1 mole de chlorure de sodium, et trois fois avec cha-
que fois 100 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so-
dium (p H 6,5) Le gel est ensuite lavé deux fois avec cha-
que fois 250 ml d'eau distillée pour éliminer le sel, puis
lyophilisé Le rendement est de 0,2 g d'enzyme CG Tase immo-
bilisée L'activité: 80 unités Kitataha/g Xerogelo
Exemple 2.
On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation teneur en-COOH 6,2 mequv / g; taille des particules 100-320 pm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,0), après quoi sous
agitation constante et à O C, on ajoute 0,25 g de N-cyclo-
hexyl-N'-Z 2-( 4-morpholinyl)-éthyl 7-carbodiimide-méthyl-p-
toluène sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire d'acé-
tate de sodium froid (+ 4 C) (p Hl 5,0) Le mélange réactionnel est agitépendant 10 minutes Après addition de 11 ml d'une solution de CG Tase ( 11, 4 mg/ml), on fixe la valeur de p H du mélange réactionnel à 5,0 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C et le mélange est entretemps agité deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de
la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les demi-
heures, puis plus tard toutes les heures, et on la corrige si nécessaire Après la fin de la réaction, on élimine le gel par centrifugation et on le lave successivement trois
fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acé-
tate de sodium (p H 5,0), trois fois avec chaque fois 30 ml
d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,0) con-
tenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 30 mi d'un tampon d'acétate de sodium (p H 5,0). Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 60 ml
d'eau distillée jusqu'à élimination des sels, puis lyophi-
lisé Rendement: 0,2 g d'enzyme CG Tase immobilisée Acti-
vité: 147 unités Kitahata/g de Xerogel.
Exemple 3.
On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation teneur en-COOH 6,2 mequv / g; taille des particules 100-320 vm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,5), après quoi on
ajoute à O C sous agitation constante 0,25 g de N-cyclo-
hexyl-N'-Z 2-( 4-morpholinyl)-éthy 17-carbodiimide-méthyl-p-
toluène sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molai:e d'acé-
tate de sodium (p H 5,5) froid (+ 4 C) Le temps de réaction brut est de 48 heures à-0 O-4 C et entretemps, on agite deux fois la suspension pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrÈle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures, et on la
corrige si nécessaire Apres la fin de la réaction, on éli-
mine le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,5), puis trois fois avec chaque fois 30 ml
d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 5,5) con-
tenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec
chaque fois 30 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 5,5).
Le gel est lavé ensuite trois fois avec chaque fois 60 ml
d'eau distillée jusqu'à élimination des sels et lyophilisé.
Rendement: 0,2 g de CG Tase immobilisée Activité: 235 uni-
tés Kitahata/g de Xerogel.
Exemple 4.
On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv / g, taille des particules 100-320 pm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,0), après quoi on ajoute à O C sous agitation constante une solution de-0,26 g de Ncyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)-éthylj-carbodiimide- méthyl-p-toluène sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium froid (+ 4 C) et à p H 6,0 Apres une agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 13 ml d'une solution de CG Tase ( 10 'mg/ml) , après quoi on règle la valeur du p H du mélange réactionnel à 6,0 Le temps de réaction brut est de 48 heures à O-4 C et entretemps, on agite la suspension deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les dcmi-heures, puis plus tard toutes les heures et on la corrige si nécessaire Apres fin de la réaction, on isole le gel par centrifugation et on le lave successivement trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,0), trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire (p H 6,0) contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 6,0) Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 60 ml d'eau distillée pour l'élimination des sels, puis
lyophilisé Rendement: 0,2 g d'enzyme CG Tase immobilisée.
Activité: 380 unités Kitahata/g de Xerogel.
Exemple 5.
On met en suspension 0,13 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOHII 6,2 mequv / g; taille des particules 100-320 pm) dans 5 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5), après quoi-on ajoute à
0 C et sous agitation constante une solution de 0,26 g de N-cyclohexyl-
Nl-l 2-( 4-morpholinyl)-éthyll-carbodiimide-méthyl-p-toluène sulfonate dans ml de tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium froid (+ 4 C) de p H 6,5. Après agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 13 ml d'une solution de CG Tase
( 10 mg/ml) et on fixe la valeur du p H du mélange réaction-
nel à 6,5 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C; entretemps, on agite la suspension deux fois pendant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle le p H toutes les demi-heures, nuis plus tard toutes les
heures et on la corrige si nécessaire Après fin de la réac-
tion, on isole le mélange par centrifugation, puis on le lave trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5), puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 6,5) contenant 1 hole de chlorure de sodium,
puis trois fois avec chaque fois 30 ml d'un tampon d'acé-
tate de sodium (p H 6,5) Le ciel est ensuite lavé trois fois
avec chaque fois 60 ml d'eau distillée jusqu'à l'élimina-
tion des sels, puis lyophilisé Rendement: 0,2 g d'enzyme CG Tase immobilisée Activité: 450 unités Kitahata/g de Xerogel.
Exemple 6.
On met en suspension 1 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des particules 100-320 pm) dans 24 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0), après quoi on ajoute à O C et sous agitation constante une solution de
2 g de N-cyclohexyl-N'-l 2-( 4-morpholinyl)-éthvl 7-carbodiimi-
de-méthyl-p-toluène sulfonate dans 15 mnil d'une solution
0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0) froide (+ 4 C).
Apres une-agitation supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 113 ml d'une solution de CG Tase ( 12 mg/ml) et on fixe la valeur du p H du mélange réactionnel à 7,0 La durée de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C; entretemps, on agite le mélange deux fois pendant chaque
fois 6 heures Au début de la réaction, on contrôle la va-
leur du p H toutes les demi-heures, et ensuite toutes les heures et on la corrige si nécessaire Après fin de la réaction, on sépare le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,0), puis trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7, 0) contenant 1 mole de chlorure de sodium, puis trois fois avec chaque fois 300 ml d'une solution 0,05 molaire d'acé- tate de sodium (p H 7,0) Le gel est ensuite lavé trois fois avec chaque fois 300 ml d'eau distillée pour éliminer les sels, puis lyophilisé Rendement: 1,5 g de CG Tase
immobilisée Activité: 366 unités Kitahata/g de Xerogel.
Exemple 7.
On met en suspension 0,2 g de Xerogel Akrilex C-100 (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des Darticules: 100-320 vm) dans 5 ml d'une solution d'acétate de sodium (p H 7,5), après quoi sous agitation
constante et à O C, on ajoute une solution de 0,4 g de N-
cyclohexyl-N'-/2-( 4-morpholinyl)=-éthyll-carbodiimide-méthyl=
p-toluene sulfonate dans 5 ml de tampon 0,05 molaire dgacé-
tate de sodium (p H 7,5) froid (+ 4 C) Après une agitation
supplémentaire de 10 minutes, on ajoute au mélange réaction-
nel 21,6 ml d'une solution de CG Tase ( 12 mg/ml) et on règle le p H à 7, 5 Le temps de réaction brut est de 48 heures à
0-4 C et la suspension est entretemps agitée deux fois pen-
dant chaque fois 6 heures Au début de la réaction, on con-
trôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard to Utes les heures, et on la règle si nécessaire Après fin de la réaction, on isole le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,5), trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 7,5) contenant 1 mole de chlorure de sodium, et trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon d'acétate de sodium (p H 7,5), puis deux fois avec chaque fois 200 ml
d'eau distillée jusqu'à élimination des sels, puison lyophi-
lise Rendement: 0,3 g d'enzyme CG Tase immobilisée Acti-
vité: 370 unités Kitahata/g de Xerogel.
Exemple 8.
On met en suspension 0,26 g de Xerogel Akrilex C-100 O (capacité de fixation: teneur en-COOH 6,2 mequv /g; taille des particules 100-320 um) dans 10 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,0), après quoi on ajoute à O C sous agitation constante une solution de 0,52 g
de N-cyclohexyl-N'-Z 2-( 4-mor Dholinyl)-éthy 17-carbodiimide-
méthyl-p-toluène sulfonate dans 10 ml de tampon 0,05 molaire (p H 8,0) froid (+ 4 C) Apres une agitation de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 29 ml d'une solution de CG Tase ( 9,25 mg/ml) après quoi on fixe la valeur du p H du mélange réactionnel à 8,0 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C, et entretemps, on agite le mélange
réactionnel deux fois pendant chaque fois 6 heures Au dé-
but de la réaction, on contrôle la valeur du p H toutes les demi-heures, puis plus tard toutes les heures et on la corrige si nécessaire Après fin de la réaction, on élimine le gel par centrifugation et on le lave trois fois avec
chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so-
dium (p H 8,0), trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,0) contenant 1 mole de chlorure de sodium et trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire (p H 8,0) d'acétate de sodium Le
gel est ensuite lavé avec chaque fois 200 ml d'eau distil-
lée jusqu'à élimination des sels et lyophilisé Rendement: 0,3 g d'enzyme CG Tase immobilisée Activité: 300 unités
Kitahata/g de Xerogel.
Exemole 9.
On dissout 0,26 g de Xerogel Akrilex C-100 (ca-
pacité de fixation: teneur en -COOH 6,2 mequv /g; taille des particules 100-320 pm) dans 10 ml d'une solution 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,5), après quoi on ajoute à O C et sous agitation constante une suspension de 0,52 g il
de N-cyclohexyl-N'-l 2-( 4-morpholinyl)-éthyll-carbodiimide-
méthyl-p-toluène sulfonate dans 10 ml de tampon 0,05 molai-
re d'acétate de sodium (p H 8,5) froid (+ 4 C) Après une agitation de 10 minutes, on ajoute au mélange réactionnel 29 ml d'une solution de CG Tase ( 9,25 mg/ml), et on règle le p H à 8,5 Le temps de réaction brut est de 48 heures à 0-4 C et entretemps, on agitr le mélange réactionnel deux
fois pendant chaque fois 6 h"ureso Au début de la transfor-
mation, on contrôle la valeur du p H toutes les'demi-heures,
puis plus tard toutes les heures, et on la corrige si né-
cessaire Apres fin de la réaction, on élimine le gel par centrifugation et on le lave successivement trois fois avec
chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de so-
dium (p H 8,5), trois fois avec chaque fois 6 ml d'un tampon 0,05 molaire (p H 8,5) d'acétate de sodium contenant 1 mole de chlorure de sodium, et trois fois avec chaque fois 60 ml d'un tampon 0,05 molaire d'acétate de sodium (p H 8,5) Le gel est ensuite lavé deux fois avec chaque fois 200 ml d'eau
distillée jusqu'à élimination des sels, puis lyophilisé.
Rendement: 0,4 g d'enzyme CG Tase immobilisée Activité
173 unités Kitahata/g de Xerogel -
Immobilisation
T A B L E A U I
de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-transférase.
Support Protéine Activité Activité Perte en Activité du immobilisée, immobilisée, récupérée activité produit, unités (%) (%) à l'état (%) Kitahata/g de dissous substance sèche (%) Akrilex AH-C 4 27,9 0,1 11,5 88, 4 80,0 Akrilex C-100 39,4 3,84 63,0 33,16 450,0 r'ti ul r> -o
T A B L E A U II
Influence de la valeur du p Hi sur l'immobilisation de l'enzyme cyclodextrineglycosyl-
transférase par mise en oeuvre d'un support Akrilex C. p H du mélange Protéine Activité Activité Perte en Activité du réactionnel immobilisée, immobilisée, récupérée activité produit, unités (M) (%) à l'état (%) Kitahata/g de dissous substance sèche (%)
,0 36,6 0,75 38,9 60,35 147
,5 26,0 1,20 40,0 58,80 235
6,0 36,0 3,25 78,0 18,75 380
6,5 39,4 3,84 63 O,0 33, 16 450
7,0 47,4 1,83 41,0 57,17 366
7,5 48,8 1,93 73,0 25,07 370
8,0 52,0 0,50 43,0 56,50 300
8,5 53,5 0,39 50,6 49,01 173
1 O rla ui Or CD 0.
Claims (5)
1 Procédé pour l'immobilisation d'enzyme cyclo-
dextrineglycosyl-transférase, caractérisé par le fait que l'on active d'abord un polymère contenant au moins 0,1 mequv/g de groupements fonctionnels -COOH, lequel a été
préparé à partir des monomères acide acrylique et/ou métha-
crylique et acrylamide et/ou méthacrylamide sous l'influence d'un agent de réticulation de type acrylique ou allylique, comme support, avec un dérivé de carbodiimide soluble dans
l'eau ou soluble dans les solvants organiques à une tempéra-
ture inférieure à O C, puis on amène l'enzyme cyclodextrine-
glycosyltransférase au sein d'une solution ayant un p H de 4,5 à 8,5 sur le polymère ainsi activé, on lave le produit
ainsi obtenu et le sèche éventuellement en fin de compte.
2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'on amène l'enzyme glycosyl-transférase sur un copolymère acrylamide-N,N'méthylène-bis-acrylamide-acide acrylique.
3 Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2,
caractérisé par le fait que l'on effectue l'activation avec
du N-cyclohexyl-N'-l 2-( 4-morpholinyl)-éthyll-carbodiimide-
méthyl-p-toluène sulfonate ou avec du chlorhydrate de N-éthyl-
N-( 3-diméthylaminopropyl)-carbodiimide.
4 Procédé selon l'une des revendications 1 à 3,
caractérisé par le fait que l'on effectue la réaction d'im-
mobilisation dans une solution de tampon avantageusement
0,05-0,1 Solaire d'acétate de sodium ayant un p H de 6,5.
Procédé selon l'une des revendications 1 à 4,
caractérisé par le fait que la réaction d'immobilisation est effectuée à une température de 0-4 C en un laps de temps
de 45-55 heures, de préférence 48 heures.
6 Procédé selon l'une des revendications 1 à 5,
caractérisé par le fait que le produit brut immobilisé est lavé avec une solution tampon d'acétate de sodium, un tampon
contenant du chlorure de sodium et avec de l'eau distillée.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| FR2542010B1 FR2542010B1 (fr) | 1989-09-29 |
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ID=10960783
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Non-Patent Citations (3)
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| CHEMICAL ABSTRACTS, vol. 100, no. 11, 12 mars 1984, page 239, résumé no. 81993j, Columbus, Ohio, US; K. IVONY et al.: "Immobilization of starch-degrading enzymes. I. A comparative study on soluble and immobilized cyclodextrin glycosyltransferase", & J. APPL. BIOCHEM. 1983, 5(3), 158-64 * |
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