JPH04365484A - 固定化ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび医薬の製造のためのその使用 - Google Patents

固定化ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび医薬の製造のためのその使用

Info

Publication number
JPH04365484A
JPH04365484A JP3337430A JP33743091A JPH04365484A JP H04365484 A JPH04365484 A JP H04365484A JP 3337430 A JP3337430 A JP 3337430A JP 33743091 A JP33743091 A JP 33743091A JP H04365484 A JPH04365484 A JP H04365484A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
vinyl
group
acid oxidase
formula
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP3337430A
Other languages
English (en)
Inventor
Klaus Sauber
クラウス・ザウバー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Publication of JPH04365484A publication Critical patent/JPH04365484A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/18—Multi-enzyme systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
    • C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/911—Microorganisms using fungi

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（以下ＤＡＯと
いう）は、Ｄ−アミノ酸の、相当するα−ケト酸、アン
モニアおよび過酸化水素への酸化的脱アミノ化を触媒す
る。
【０００２】ブタ腎臓からの市販ＤＡＯのほかに、この
酵素は、細菌、酵母およびかびによっても合成される。 Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓは、こ
れらの中でも、最も強力なＤＡＯ産生酵母として傑出し
ている。この酵素は、Ｄ，Ｌ−アミノ酸のラセミ体の分
離、および各種溶液中のＤ−アミノ酸の定量に使用され
るほかに、そのセファロスポリンＣを酸化的に脱アミノ
化する能力はとくに価値がある。この触媒作用は、α−
ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸およびグ
ルタリル−７−アミノセファロスポラン酸の製造に使用
され、これらはついでアシラーゼによって７−アミノセ
ファロスポラン酸に変換できる。
【０００３】ドイツ公開公報２２　１９　４５４号（米
国特許３　８０１４５８号）にはＴｒｉｇｏｎｏｐｓｉ
ｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ　ＣＢＳ　４０　９５の活性
化細胞を用いるセファロスポリンＣの変換が記載されて
いる。この場合、「活性化」の語は、酵母細胞が物理的
および／または化学的処理に付され、細胞中のＤＡＯが
セファロスポリンＣの酸化を触媒するために利用される
ことを意味しているが、大量には遊離はしない。
【０００４】特許出願ＷＯ　８６　０４　０８７号には
、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓから
のＤＡＯの精製および固定化、ならびにセファロスポリ
ンＣの酸化的脱アミノ化に際してのＤＡＯの使用が記載
されている。しかしながら、操作安定性についての詳細
は示されておらず、固定化の収率は４０％とされている
。
【０００５】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼの安定性を改善
することが本発明の目的であった。今回、驚くべきこと
に、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼを、実質的に酢酸ビニル
単位および／またはビニルアルコール単位ならびに架橋
剤単位からなる架橋共重合ポリマーから作成された支持
体にカップリングさせると、酵素ＤＡＯの活性が長期に
わたって保持される複合体が形成されることが見出され
たのである。
【０００６】したがって、本発明は、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼおよび多孔性のビーズ形状の支持体からなる、
酵素でコーティングされた支持体であって、支持体は実
質的にビニルアシレート単位および／またはビニルアル
コール単位ならびに架橋剤単位からなる架橋共重合ポリ
マーであり、架橋剤単位は、式
【化３】 〔式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２は互いに同種または異種
であって、ビニル、１−アシルオキシビニル、アリルま
たは２−アシルオキシアリルであり、Ａは炭素原子２〜
８個を有する２価の炭化水素基であり、式（ＩＩ）中、
Ｂは炭素原子１〜８個を有する２価の炭化水素基であり
、Ｘはアシルオキシであり、アシルオキシ基は炭素原子
２〜１８個を有する基である〕で表される共重合可能な
化合物であり、架橋剤の量はポリマーに対して１〜６０
重量％とし、ビニルアシレート単位のアシルオキシ基は
そのままの形またはその一部もしくはすべてがヒドロキ
シ基に加水分解された形で存在し、ビーズの平均粒子サ
イズは２０〜８００μｍであり、平均孔径は２〜１０，
０００ｎｍである上記支持体を提供する。他の既知の酵
素支持体、たとえば、ＲＥｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒｏｅｈｍ
）、ビニル−ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｋｅｍ−ｅｎ−ｔ
ｅｃ）、ＢｒＣＮ−活性化　ＲＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ）と比較して、本発明の支持体は、驚
異的に高いＤＡＯの固定化収率および長期にわたる操作
安定性を示した。Ｒｉｅｄｅｌ　ｄｅ　Ｈａｅｎからの
酢酸ビニル−エポキシ支持体、たとえばＶＡ−Ｅｐｏｘ
ｙ−ＲＢｉｏｓｙｎｔｈの使用がとくに好ましい。
【０００７】使用される多孔性のビーズ形状の支持体の
製造は、ＤＥ−Ａ３３　４４　９１２号に記載されてい
る。この記載を本明細書に引用する。
【０００８】本発明で使用される酵素と支持体とのカッ
プリング反応は、既知の方法、たとえばＤＥ−Ａ　２４
　０７　３４０号またはドイツ特許２２　１５　６８７
号に記載されたようにして実施できる。
【０００９】本発明は、セファロスロリンＣ誘導体の酸
化的脱アミノ化のための、本発明による支持体の使用に
関する。
【００１０】セファロスロリンＣ誘導体の語は、たとえ
ば、式ＩＩＩ
【化４】 （式中、Ｘはアセテート基、求核基、ヘテロ環、ヒドロ
キシル基または水素である）で表される誘導体、および
それらの塩を意味する。
【００１１】セファロスロリンＣは、式ＩＶ
【化５】 （式中、Ｒは
【化６】 である）の化合物である。
【００１２】α−ケトアジピル−７−アミノセファロス
ポラン酸は、式ＩＶにおいてＲが
【化７】 の化合物である。
【００１３】グルタリル−７−アミノセファロスポラン
酸は、式ＩＶにおいてＲが
【化８】 の化合物である。
【００１４】７−アミノセファロスポラン酸は、式ＩＶ
においてＲが水素の化合物である。
【００１５】本発明はさらに、Ｄ−アミノ酸オキシダー
ゼ含有溶液を、実質的にビニルアシレート単位および／
またはビニルアルコール単位ならびに架橋剤単位からな
る架橋共重合ポリマーで作成された多孔性のビーズ形状
の支持体とインキュベートし、この場合、架橋剤単位は
、式
【化９】 〔式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２は互いに同種または異種
であって、ビニル、１−アシルオキシビニル、アリルま
たは２−アシルオキシアリルであり、Ａは炭素原子２〜
８個を有する２価の炭化水素基であり、式（ＩＩ）中、
Ｂは炭素原子１〜８個を有する２価の炭化水素基であり
、Ｘはアシルオキシであり、アシルオキシ基は炭素原子
２〜１８個を有する基である〕で表される共重合可能な
化合物であり、架橋剤の量はポリマーに対して１〜６０
重量％とし、酢酸アシレート単位のアシルオキシ基はそ
のままの形またはその一部もしくはすべてがヒドロキシ
基に加水分解された形で存在し、ビーズの平均粒子サイ
ズは２０〜８００μｍであり、平均孔径は２〜１０，０
００ｎｍである、コーティングされた支持体の製造方法
に関する。
【００１６】支持体ポリマーのビニルアシレート単位は
、アシレート基に炭素原子２〜１８個、とくに２〜６個
を含有することが好ましい。これは好ましくは、アセテ
ートまたはプロピオネート基である。ポリマー中には異
なるアシレート基が存在してもよい。すなわち、その製
造には相当するビニルアシレートの混合物も使用できる
。
【００１７】式（Ｉ）の架橋剤において、Ａは、好まし
くは炭素原子２〜５個、とくに２〜３個を有する分岐状
または直鎖状の脂肪族炭化水素基である。エチレンまた
はプロピレン基がとくに好ましい。この式（Ｉ）のＲ１
／Ｒ２が１−アシルオキシビニルまたは２−アシルオキ
シアリルである場合は、そのアシルオキシ基は好ましく
は炭素原子２〜１８個、とくに好ましくは炭素原子２〜
６個を含有する。Ｒ１／Ｒ２基は好ましくはビニルであ
る。本発明に用いられるポリマー中の好ましい架橋剤単
位は、Ｎ，Ｎ′−ジビニルエチレン尿素から適宜誘導さ
れる。この架橋剤はとくに加水分解抵抗性の強いカップ
リングを生じる。他の好ましい例にはＮ，Ｎ′−ジビニ
ルプロピレン尿素がある。
【００１８】式（ＩＩ）の架橋剤において、Ｂは好まし
くは２価の炭化水素基、とくに炭素原子２〜６個を有す
る分岐状または直鎖状のアルキレン基であり、式（Ｉ）
のＲ１およびＲ２について上述したのと同じ意味を有す
ることが好ましい。この種類の好ましい架橋剤には、た
とえば３，３−ジメチルペンタジエン２，４−ジアセテ
ートがあり、これはビニルアセテートととくに容易に共
重合する。
【００１９】架橋剤単位（ＩＩ）の量はポリマー中の架
橋剤単位の総量に対して、一般的には０〜１００％、と
くに０〜６０％である。
【００２０】支持体ポリマー中の架橋剤単位の総量は、
請求された範囲内で、特定の適用における所望の架橋程
度によって決定される。すなわち、たとえば撹拌容器内
での酵素反応または診断剤のための支持体としての応用
に際しては、比較的低い架橋度が有利であり、架橋モノ
マー単位の含量を低くする必要がある。架橋剤含量が０
．１重量％未満になると、多くの場合、有用な生成物は
得られない。したがって、下限は一般的に約１重量％で
ある。架橋剤含量を６０％より大きくすることも原理的
には可能であるが、一般にさらに利点を生じることはな
い。
【００２１】その適用により、架橋剤単位の量は、ポリ
マーに対して好ましくは１〜５０重量％、とくに１〜４
０重量％である。ＤＡＯの支持体としての本発明におけ
る使用に際しては、下限は、好ましくは２．５重量％、
とくに好ましくは１０重量％である。式（ＩＩ）の架橋
剤単位のみが存在する場合には、それらの下限は、好ま
しくは２．５重量％である。
【００２２】支持体ポリマーにさらに、酢酸ビニルと共
重合可能なモノマーのモノマー単位を含有させる場合は
、それらの量は一般的にポリマーに対して１０重量％を
越えないようにし、好ましくは０．１〜５重量％とする
。この種のモノマーの例には、Ｎ−ビニルピロリドン、
ビニレンカーボネート、（メタ）アクリル酸、（メタ）
アクリロニトリル、（メタ）アクリルアミド、アルキル
基に炭素原子２〜１２個、好ましくは炭素原子２〜４個
を有する（メタ）アクリル酸アルキルエステル、アルキ
ル基に炭素原子２〜６個を有する（メタ）アクリル酸ヒ
ドロキシアルキルエステル、Ｎ−ビニル−Ｎ−アルキル
アセトアミド、スチレン、α−メチルスチレン等、およ
びそれらの混合物がある。
【００２３】架橋支持体ポリマーは主として球形状のビ
ーズの型とすることが好ましく、平均粒子サイズは、乾
燥した非膨潤状態で、２０〜８００μｍ、好ましくは５
０〜３００μｍであり、粒子サイズは狭い範囲内に分布
することが好ましい。各場合の至適粒子サイズは、主と
して特定の応用形態によって決まる。非加圧下に行われ
るカラム操作の場合には、上述の限界内で選ばれる粒子
サイズは、加圧下に行われる操作の場合よりも適宜大き
くする。本発明において用いられるポリマーのビーズは
とくにマクロポーラスである。平均孔径は一般的に２〜
１０，０００ｎｍの範囲であり、好ましくは５〜２００
ｎｍ、とくに好ましくは２０〜２００ｎｍである。
【００２４】本発明で用いられるポリマー中のビニルア
シレート単位におけるアシレート基はそのままの形また
はそのすべてもしくは一部が好ましくはＯＨ基に加水分
解された形で存在する。少なくとも１０重量％のアシル
オキシ基がヒドロキシル基によって置換される。しかし
ながら、加水分解の程度は一般的には５０％以上、好ま
しくは７０％以上、とくに９０〜１００％である。加水
分解によって得られる架橋ポリマー（ポリビニルアルコ
ール）は少なくとも一部のＯＨ基がいわゆるスペーサー
基によって占拠されていることが好ましい（スペーサー
については後述）。
【００２５】ポリ酢酸ビニルゲルの形の共重合ポリマー
は親水性ではない。したがって、水中での使用に際して
はエステル基を加水分解しなければならない。これは、
既知の方法で、生成物をアルコールたとえばメタノール
に溶解し、アルカリ水溶液たとえば水酸化ナトリウム溶
液を加えることによりアルカリで、またはアルコール膨
潤生成物を、触媒量の酸もしくは塩基を用い、形成され
るエステルをたとえば蒸留で連続的に除去しながら、エ
ステル交換させることにより（ドイツ特許１５　１７　
９３５号参照）行うことができる。加水分解は、ゲルの
疎水性の程度がその適用に応じて調整されるように、所
望の任意の段階で停止させることができる。
【００２６】ビーズ形状の架橋ポリビニルアルコールゲ
ルをＤＡＯの支持体として使用し、ＤＡＯをその支持体
に共有結合で結合させるときは、多くの場合、ゲルをス
ペーサーで予め改変しておくことが有利である。スペー
サーとは、支持体ポリマーと、また生物活性物質とも反
応し、その両者の間にある程度の架橋を形成する化合物
を意味する。ビーズポリマーとスペーサーの反応は、直
後、または好ましくはアシレート基を予め加水分解した
のちに行うことができる。変換の程度は、とくにスペー
サーの大きさ、アシル基および／または生成した第二の
ヒドロキシル基の接近しやすさに依存する。本発明で使
用できるスペーサーとは、この目的で既知のホモおよび
ヘテロ二官能性化合物であって、その第二の官能基が固
定化される生物活性物質へカップリングできる化合物で
ある（ドイツ特許２４　２１　７８９号、Ｕｌｌｍａｎ
ｎ′ｓ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４版、第１０巻５４
０頁、ならびに“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　
ｏｆ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｂｉｏｃａｔａｌｙｓ
ｔｓ”，　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ，　Ｗｅｉｎｈ
ｅｉｍ，　１９７９，５３頁参照）。
【００２７】使用できるスペーサーは、たとえば、以下
の基
【化１０】 を導入する化合物である。
【００２８】好ましいスペーサーは、加水分解抵抗性の
化学結合を生じるスペーサー、たとえば、エピクロルヒ
ドリンまたはその同族体（α，β−エポキシ−ω−ハロ
アルカン）である。ポリビニルアルコール（ポリビニル
アシレート）との反応は、溶媒の存在下または不存在下
、好ましくは触媒の存在下に行われる。反応時間は、室
温からエピクロルヒドリンの還流温度（１１３〜１１５
℃）までの間とすることができる反応温度に応じて、一
般的に３０分から２４時間である。触媒としては、たと
えばＮａＯＨ（粉末形態で）またはアルカリ水溶液、ジ
メチルホルムアミド、トリエチルアミン、および他の酸
受容体を使用できる。
【００２９】ＤＡＯと支持体の間の反応は、０〜＋４０
℃、好ましくは室温で行われる。このカップリング反応
は、ほぼ中性で、たとえば５〜９のｐＨで、好ましくは
イオン強度０．５〜１．５のリン酸緩衝液の存在下に行
われる。
【００３０】Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、たとえば、
ブタ腎臓、細菌、酵母またはかびから単離できる。酵母
、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ　Ｃ
ＢＳ　４０９５（この微生物は、自由に入手可能で、Ｃ
ＢＳ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，　ＮＬ−３７４０　ＡＧ
　Ｂａａｒｎに公開されている）からのＤＡＯの使用が
好ましい。酵素支持体へのカップリングは、精製、部分
精製または粗製ＤＡＯ含有細胞抽出物で実施することが
できる。ＤＡＯの精製は、慣用操作たとえば硫酸アンモ
ニウム沈降、またはイオン交換もしくはゲル浸透クロマ
トグラフィーによって実施できる。ＲＤＥＡＥ−セルロ
ースイオン交換クロマトグラフィーによって得られたＤ
ＡＯ含有酵素溶液の使用が好ましい。
【００３１】さらに、カタラーゼをＤＡＯの場合と同様
の手段で酵素支持体にカップリングさせることもできる
。カタラーゼは、動物、細菌、酵母またはかびから単離
できる。酵母、Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂ
ｉｌｉｓ　ＣＢＳ　４０９５からのカタラーゼの使用が
好ましい。酵素支持体へのカップリングは、精製、部分
精製または粗製カタラーゼ含有細胞抽出物で実施するこ
とができる。カタラーゼはＤＡＯと同時にまたはＤＡＯ
の前もしくは後に酵素支持体へカップリングさせること
ができる。ＤＡＯのみまたはカタラーゼのみでコーティ
ングされた酵素支持体を混合してもよい。
【００３２】次に本発明を実施例によって説明する。実
施例中、百分率は重量％である。
【００３３】実施例１ Ｔｒｉｇｏｎｏｐｓｉｓ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ　ＣＢ
Ｓ　４０９５の培養体を、Ｓｅｎｔｈｅｓｈａｎｍｕｇ
ａｎａｔｈａｎ　＆　Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ（Ｊ．　Ｇｅ
ｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，　２７，４６５，１９６
２）によって記載されたメジウムを含有する。 最初は振盪フラスコ中、ついで撹拌ファーメンター中で
、窒素源としてメチオニンまたはアラニンを用い、増殖
させた。
【００３４】ＤＡＯの定量には、０．４ｇの細胞を凍結
し、ついで酸性のｐＨたとえば約ｐＨ３〜４で解凍する
。凍結は、−１０℃以下の温度たとえば約−２０℃で実
施することができる。凍結は、細胞を透過性にするのに
十分な時間、たとえば−２０℃で少なくとも１時間実施
しなければならない。
【００３５】活性は、以下のアッセイシステムを用いて
、光度測定法により定量する。 溶液： １）　　緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１００　ｍＭ　ＰＢＳ；ｐＨ　７．３；空気飽和 ２）　　ｏ−フェニレンジアミン　　　　水中０．０２
％３）　　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　緩衝
液中１ｍｇ／ｍｌ４）　　酵素または透過性細胞　　　
　　　至適：０．５〜１．０単位／ｍｌ ５）　　基質　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　緩衝液中１５０ｍＭ　Ｎａ−ＣＰＣ（１００％） アッセイ操作： λ＝４０５ｎｍ（最大） ε＝４０２０　リットル／ｍｏｌ＊ｃｍν＝３０℃
【００３６】
【００３７】計算：
【数１】 上述の条件下に、ファーメンター中の酵素活性２００Ｕ
／リットルが達成される。
【００３８】固定化酵素を用いた活性定量に際してはサ
ンプルをある間隔で採取し、ＣＰＣ濃度の低下をＨＰＬ
Ｃで測定する。移動相は、４０ｍＭリン酸カリウム緩衝
液（ｐＨ４．３）および１０ｍｇ／リットル硫酸水素テ
トラブチルアンモニウム含有２０％ＭｅＯＨとする。静
止相は、ＲＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ　１００　ＲＰ　１
８（５μｍ）とする。
【００３９】実施例２ ａ）　　懸濁重合 窒素気流下、撹拌器、還流冷却器および温度計を付した
１．４リットルのガラスフラスコ中、６０．０ｇの酢酸
ビニル、４０．０ｇのＮ，Ｎ′−ジビニルエチレン尿素
、８０．０ｇの２−エチルヘキサノール、２０．０ｇの
Ｐｏｌｙｇｌｙｋｏｌ　Ｂ　１１／５０（Ｈｏｅｃｈｓ
ｔ　ＡＧ）および２．０ｇのアゾイソブチロニトリル　
ＲＰｏｒｏｆｏｒ　Ｎ（Ｂａｙｅｒ　ＡＧ）からなる有
機相を、３．２ｇのＮａ２ＨＰＯ４、８．０ｇのポリビ
ニルピロリドン（分子量約３６０，０００）および８０
０ｍｌの水からなる水相に撹拌しながら懸濁した。重合
は、加熱浴中で７５℃に加熱して開始させた。２時間後
に温度を８５℃に上昇させ、さらに２時間後に重合が完
結した。得られた懸濁液を２５℃に冷却し、吸引濾過し
、３０分間、各回１リットルの水と４回、各回１リット
ルのメタノールと３回、各回１リットルのアセトンと２
回撹拌し、吸引濾過し、窒素気体下、真空乾燥オーブン
中、２５℃、２００ｍｍＨｇで一夜乾燥した。収率は７
５％であった。表面に光沢のある白濁ビーズが得られた
。嵩密度は３００ｇ／リットルであった。これは、嵩容
量３．３　ｍｌ／ｇを与える。
【００４０】ｂ）　　部分加水分解 ５０ｇの乾燥生成物と、１５０ｍｌのメタノールおよび
１５０ｍｌの水中１７．５ｇのＮａＯＨの溶液を３時間
３０℃で撹拌し、吸引濾過し、５００ｍｌのメタノール
中酢酸で中和し、５００ｍｌのメタノールと１回、各回
５００ｍｌのアセトンと２回撹拌し、吸引濾過し、篩過
し、乾燥した。収率は３４．４ｇ（ポリマーをベースに
２５．９重量％）であった。ビーズは白濁し、光沢表面
を有した。嵩密度は３５３ｇ／リットルであった（計算
嵩容量は２．８ｍｌ／ｇ）。篩過分布：＞３００μｍ　
１９．０ｇ（５５．２重量％）、２００〜３００μｍ　
８．９ｇ（２５．９重量％）、１００〜２００μｍ　６
．１ｇ（１７．９重量％）、５０〜１００μｍ　０．４
ｇ（１．２重量％）。加水分解度（ＩＲ、モルベース）
：７３％。
【００４１】ｃ）　　スペーサーの結合乾燥５０〜２０
０μｍ篩過分画１０．０ｇを１００ｍｌのエピクロルヒ
ドリン中、２５℃で４時間膨潤させ、ついで穏やかに撹
拌しながら１１５℃に加熱し、２５℃に冷却したのち、
吸引濾過した。次に、混合物を各回、３０分間、２００
ｍｌのアセトンと２回撹拌し、吸引濾過し、窒素気体下
、５０℃の減圧乾燥オーブン中に一夜保持した。嵩密度
３１５ｇ／リットル、エポキシド価３５０μｍｏｌ／ｇ
の乾燥生成物９．８ｇが得られた。
【００４２】実施例３ 実施例１のようにして作成した湿潤細胞１０ｇに、同重
量の２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０を加え
て、懸濁液を得る。この混合物を、冷却Ｄｙｎｏミル中
、滞留時間３×５分で粉砕する。１３，０００ｇで遠心
分離後の上澄液中の活性の収率は６０〜８０％、それは
平均２１０Ｕである。わずかに白濁した抽出液を２０ｍ
Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ８．０に対して透析する
。ＷｈａｔｍａｎのＤＥＡＥ−セルロースを十分加えて
、ＤＡＯを完全に結合させる。ついで結合した酵素をカ
ラム中に注ぎ、イオン強度を上昇させて（０〜０．５ｍ
Ｍ　ＮａＣｌ）ＤＡＯを溶出させる。活性分画を合わせ
て、限外濾過で濃縮し、１　ｍＭリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）で再緩衝化する。この方法で精製したＤ
ＡＯ溶液は、平均２５Ｕ／ｍｌを含む。
【００４３】実施例４ 実施例３に従って得られた溶液５ｍｌをＲｉｅｄｅｌ　
ｄｅ　ＨｅａｎのＶＡ−Ｅｐｏｘｙ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈ
Ｒ１ｇを加え、密閉容器中、室温に３日間放置した。こ
の間に、酵素はオキシラン基含有支持体に共有結合する
。ついで固定化酵素を１Ｍ　ＮａＣｌ溶液で洗浄する。 平均結合効率は０．８３である。少量は洗浄水中に現れ
る。固定化酵素は約３２Ｕ／ｇ（湿重量、ｗｗｔ）を含
有する。これは、０．０２％ナトリウムアジド含有２０
ｍＭリン酸カリウム緩衝液中に、４℃で保存する。
【００４４】実施例５ 支持体としてＲｏｅｈｍからのＥｕｐｅｒｇｉｔＲ　を
用いるほかは、実施例２と同様に操作する。結果は表１
に示す。
【００４５】実施例６ ＤＡＯ溶液２ｍｌを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ＝８．６）に対して透析する。計６０Ｕを含有する緩
衝液をビニル−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ緩衝液（６０％）２
ｍｌと室温（ＲＴ）で１８時間インキュベートして、固
定化を行う。２２Ｕ／ｍｌを含むＳｅｐｈａｒｏｓｅ　
１．２ｍｌが得られ（表１参照）、これは固定化収率４
３％に相当する。１０Ｕは洗浄水中に存在する。したが
って、η値０．１５が計算される。
【００４６】実施例７ ０．５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ＝８．７）に対
して予め透析した、３．２Ｕ含有ＤＡＯ溶液１ｍｌを、
ＣＮＢｒ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）０．２ｇにＲＴで加える。 ９０分後にカップリングが完結し、支持体は製造業者の
指示に従って洗浄する。過剰の結合基はグリシンで不活
性化する。結果は表１参照。
【００４７】実施例８ 実施例４のように固定化された酵素を実施例４に示した
条件下に保存し、その活性を毎月測定した。６ヵ月中、
活性の５％を越えた低下は認められなかった。
【００４８】実施例９ セファロスポリンＣナトリウム（４０ｍＭ）をｐＨ７．
３で２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液に溶解し、この溶液
を撹拌しながら３０℃の恒温にして、酸素で処理する。 これに２％（ｗ／ｗ）の固定化ＤＡＯを加え、混合物を
自動滴定器により初期のｐＨに維持する。反応完了後、
溶液を排出し、反応器を再充填する。酵素は容器に残る
。反応回数は１２０である。反応時間は完全な変換が可
能なように選択される。これは、約４０反応までは１時
間、９０回までは１．５時間、最終的には２時間である
。
【００４９】
【表１】

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび多孔
    性のビーズ形状の支持体からなる、酵素でコーティング
    された支持体であって、支持体は実質的にビニルアシレ
    ート単位および／またはビニルアルコール単位ならびに
    架橋剤単位からなる架橋共重合ポリマーであり、架橋剤
    単位は、式 【化１】 〔式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２は互いに同種または異種
    であって、ビニル、１−アシルオキシビニル、アリルま
    たは２−アシルオキシアリルであり、Ａは炭素原子２〜
    ８個を有する２価の炭化水素基であり、式（ＩＩ）中、
    Ｂは炭素原子１〜８個を有する２価の炭化水素基であり
    、Ｘはアシルオキシであり、アシルオキシ基は炭素原子
    ２〜１８個を有する基である〕で表される共重合可能な
    化合物であり、架橋剤の量はポリマーに対して１〜６０
    重量％とし、ビニルアシレート単位のアシルオキシ基は
    そのままの形またはその一部もしくはすべてがヒドロキ
    シ基に加水分解された形で存在し、ビーズの平均粒子サ
    イズは２０〜８００μｍであり、平均孔径は２〜１０，
    ０００ｎｍである上記の支持体。
  2. 【請求項２】　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼは、酵母ま
    たはかび起源の酵素である請求項１記載の支持体。
  3. 【請求項３】　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼとカタラー
    ゼを含有する請求項１または２記載の支持体。
  4. 【請求項４】　　請求項１または２記載のコーティング
    支持体を製造するにあたり、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ
    含有溶液を、実質的にビニルアシレート単位および／ま
    たはビニルアルコール単位ならびに架橋剤単位からなる
    架橋共重合ポリマーで作成された多孔性のビーズ形状の
    支持体とインキュベートし、この場合、架橋剤単位は、
    式【化２】 〔式（Ｉ）中、Ｒ１およびＲ２は互いに同種または異種
    であって、ビニル、１−アシルオキシビニル、アリルま
    たは２−アシルオキシアリルであり、Ａは炭素原子２〜
    ８個を有する２価の炭化水素基であり、式（ＩＩ）中、
    Ｂは炭素原子１〜８個を有する２価の炭化水素基であり
    、Ｘはアシルオキシであり、アシルオキシ基は炭素原子
    ２〜１８個を有する基である〕で表される共重合可能な
    化合物であり、架橋剤の量はポリマーに対して１〜６０
    重量％とし、ビニルアシレート単位のアシルオキシ基は
    そのままの形またはその一部もしくはすべてがヒドロキ
    シ基に加水分解された形で存在し、ビーズの平均粒子サ
    イズは２０〜８００μｍであり、平均孔径は２〜１０，
    ０００ｎｍである上記の支持体の製造方法。
  5. 【請求項５】　　かびまたは酵母から得られたＤ−アミ
    ノ酸オキシダーゼ含有溶液を使用する請求項４記載の製
    造方法。
  6. 【請求項６】　　イオン交換クロマトグラフィーで精製
    されたＤ−アミノ酸オキシダーゼ含有溶液を使用する請
    求項４または５記載の製造方法。
  7. 【請求項７】　　Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ含有溶液お
    よびカタラーゼ含有溶液を使用する請求項４〜６のいず
    れかに記載の製造方法。
  8. 【請求項８】　　インキュベーションは０℃〜＋４０℃
    の温度で行われる請求項３〜７のいずれかに記載の製造
    方法。
  9. 【請求項９】　　請求項１〜３のいずれかに記載のコー
    ティング支持体とセファロスポリン誘導体を使用するグ
    ルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体または
    α−ケトアジピル−７−アミノセファロスポラン酸誘導
    体の製造方法。
JP3337430A 1990-12-24 1991-12-20 固定化ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび医薬の製造のためのその使用 Pending JPH04365484A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4041755 1990-12-24
DE40417557 1990-12-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH04365484A true JPH04365484A (ja) 1992-12-17

Family

ID=6421427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3337430A Pending JPH04365484A (ja) 1990-12-24 1991-12-20 固定化ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび医薬の製造のためのその使用

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5599702A (ja)
EP (1) EP0492495A3 (ja)
JP (1) JPH04365484A (ja)
KR (1) KR920012449A (ja)
AU (1) AU660438B2 (ja)
CA (1) CA2058194A1 (ja)
CZ (1) CZ284454B6 (ja)
MX (1) MX9102792A (ja)
NZ (1) NZ241116A (ja)
TW (1) TW198064B (ja)
ZA (1) ZA9110119B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009503203A (ja) * 2005-08-03 2009-01-29 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 親水性架橋ポリマー

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4342770A1 (de) * 1993-12-15 1995-07-06 Boehringer Mannheim Gmbh Trägerfixierte Enzyme
US5980883A (en) * 1996-10-02 1999-11-09 Kuraray Co., Ltd. Polymer gel for medical use
KR100481138B1 (ko) * 1997-09-09 2005-04-11 바이오케미 게젤샤프트 엠베하 효소 활성을 갖는 미생물을 함유하는 구형 입자 및 구형 입자의 제조방법
EP1379531A2 (en) 2001-04-19 2004-01-14 Bioferma Murcia, S.A. Enzymatic process for preparing cephalosporanic acid derivatives using alpha-ketoacid derivatives
EP1754534A1 (de) * 2005-08-03 2007-02-21 MERCK PATENT GmbH Hydrophiles vernetztes Polymer

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1385685A (en) * 1971-04-21 1975-02-26 Glaxo Lab Ltd Cephalosporin derivatives
DE2911192A1 (de) * 1979-03-22 1980-10-02 Boehringer Sohn Ingelheim Neuartiges immobilisiertes glucoseoxidase-katalasepraeparat und seine verwendung zur enzymatischen glucoseoxidation
DE3404021A1 (de) * 1983-05-28 1984-11-29 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Makroporoese perlpolymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
DE3344912A1 (de) * 1983-12-13 1985-06-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Vernetzte polymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung
SE8500157D0 (sv) * 1985-01-11 1985-01-11 Mosbach Klaus Isolation and partial characterization of a d-amino acid oxidase active against cephalosporin c from the yeast trigonopsis variabilis
DE3629177A1 (de) * 1986-08-28 1988-03-17 Hoechst Ag Vernetzte polymerisate und verfahren zu ihrer herstellung
DE3818851A1 (de) * 1988-06-03 1989-12-14 Hoechst Ag Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung
DE4028119C1 (ja) * 1990-09-05 1991-12-05 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De
IT1252308B (it) * 1990-12-21 1995-06-08 Antibioticos Spa Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009503203A (ja) * 2005-08-03 2009-01-29 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング 親水性架橋ポリマー

Also Published As

Publication number Publication date
CA2058194A1 (en) 1992-06-25
MX9102792A (es) 1992-06-01
AU8989591A (en) 1992-06-25
AU660438B2 (en) 1995-06-29
KR920012449A (ko) 1992-07-27
CS399591A3 (en) 1992-11-18
US5599702A (en) 1997-02-04
EP0492495A2 (de) 1992-07-01
CZ284454B6 (cs) 1998-12-16
EP0492495A3 (en) 1993-06-16
NZ241116A (en) 1993-11-25
TW198064B (ja) 1993-01-11
ZA9110119B (en) 1992-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4478976A (en) Water-insoluble protein material, its preparation and its use
US3625827A (en) Water-soluble polymer-enzyme products
US4371612A (en) Immobilization of biological material with an acrylonitrile polymer
GB1568328A (en) Immobilized enzymes on pullulan carriers and preparation thereof
JPS6321474B2 (ja)
Fernández-Lorente et al. Immobilization of proteins on glyoxyl activated supports: dramatic stabilization of enzymes by multipoint covalent attachment on pre-existing supports
US3706633A (en) Preparation of water-insoluble enzyme derivatives
JPH04504362A (ja) 酵素による７―アミノセフアロスポラン酸の製造
JPH04365484A (ja) 固定化ｄ−アミノ酸オキシダーゼおよび医薬の製造のためのその使用
US4931476A (en) Crosslinked polymers and a process for their preparation
JP3117092B2 (ja) セファロスポリン誘導体をグルタリル−７−アミノセファロスポラン酸誘導体に連続転化する方法
JPS6044917B2 (ja) ２−ケト−ｄ−グルコン酸及び過酸化水素の製法
JP2719047B2 (ja) 担体固定化ペニシリンｇアミダーゼ、グルタリル−７−ａｃａアシラーゼ又はｄ−アミノ酸オキシダーゼ
US4767620A (en) Crosslinked polymers with carbonate ester groups, and a process for their preparation
JPS6029473B2 (ja) ザルコシン・オキシダ−ゼの製法
Wang et al. Immobilization of lipase on epoxy activated (1→ 3)-α-d-glucan isolated from Penicillium chrysongenum
AU729928B2 (en) Immobilized esterases from crude extract and their use
Svensson et al. Entrapment of chemical derivatives of glycoamylase in calcium alginate gels
JPH0779696B2 (ja) 新規調整物及びその製法
JPH10150981A (ja) 生体触媒固定化用硬化性液状樹脂組成物、及びその硬化方法
CA1104110A (en) Enzyme-immobilization carriers and preparation thereof
US4794083A (en) Process for immobilization of glucoamylase
JP2786679B2 (ja) 新規なω位カルボキシアルコール酸化酵素
JPS5860987A (ja) 酵素もしくは微生物菌体の固定化方法
JPS5945887A (ja) 固定化酵素の製造方法