CZ284454B6

CZ284454B6 - Příprava enzymy potaženého nosičového materiálu

Info

Publication number: CZ284454B6
Application number: CS913995A
Authority: CZ
Inventors: Klaus Dr. Sauber
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1990-12-24
Filing date: 1991-12-20
Publication date: 1998-12-16
Also published as: JPH04365484A; US5599702A; AU660438B2; AU8989591A; EP0492495A2; MX9102792A; CA2058194A1; TW198064B; CS399591A3; NZ241116A; ZA9110119B; EP0492495A3; KR920012449A

Abstract

Enzymy potažený nosičový materiál, tvořený oxidázou D-aminokyselin a nosičovým materiálem. Nosičem je zesíťovaný kopolymerisát, který je tvořen vinylacetátovými a/nebo vinylalkoholovými jednotkami a jednotkami síťovadla. Nosič potažený oxidázou D-aminokyselin může být přídavně potažen katalázou. Uvedený materiál může být použit pro přípravu léčiv.ŕ

Description

Oblast techniky

Řešení se týká enzymy potaženého nosičového materiálu, který obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu, způsobu jeho výroby a jeho použití.

Dosavadní stav techniky

D-aminokyselinová oxidáza (dále DAO) katalyzuje oxidativní deaminaci D-aminokyselin na odpovídající α-ketokyseliny, amoniak a peroxid vodíku.

Kromě komerčně dostupné DAO z vepřových ledvin se enzym syntetizuje z bakterií, kvasinek a hub. Z nich vyniká jako výhodný producent DAO Trigonopsis variabilis. Kromě použití tohoto enzymu ke štěpení racematů D,L-aminokyselin v různých roztocích je obzvláště významná schopnost oxidativní deaminace cefalosporinu C. Tato katalytická vlastnost se využívá k přípravě a-ketoadipinyl-7-aminocefalosporanové kyseliny a glutaryl-7-aminocefalosporanové kyseliny, které se mohou potom převést pomocí acelázy na kyselinu 7-aminocefalosporanovou.

V DE-OS 22 19 454 (US-P3 801 458) je popsána reakce derivátů cefalosporinu Cm pomocí aktivovaných buněk Trigonopsis variabilis CBS 4095. „Aktivovaný“ zde znamená, že buňky kvasinek byly podrobeny fyzikálnímu a/nebo chemickému procesu, takže v buňkách obsažená DAO, ačkoliv byla v podstatě neuvolněná, získala schopnost katalyzovat oxidaci cefalosporinu C.

V patentové přihlášce WO 86 04 087 je popsáno čištění a imobilizace DAO z Trigonopsis variabilis a její použití k oxidativní desaminaci cefalosporinu C. Nejsou zde však uváděny žádné údaje o operační stabilitě a je stanovena výtěžnost vazeb 40 %.

Podstata vynálezu

Úlohou předloženého vynálezu bylo zlepšit stabilitu D-aminokyselinové oxidázy. S překvapením bylo nyní nalezeno, že naváháním D-aminokyselinové oxidázy na nosičový materiál ze zesíťovaného kopolymerisátu, který je v podstatě tvořen jednotkami vinylacetátu a/nebo vinylalkoholu a jednotkami síťovadla, se vytvoří komplex v němž si enzym DAO dlouhou dobu udržuje svou enzymatickou aktivitu.

Vynález se proto týká nosičového materiálu opatřeného vrstvou enzymů, který zahrnuje Daminokyselinovou oxidázu a porézní nosičový materiál ve tvaru perliček, kde materiál nosiče je tvořen zesíťovaným kopolymerisátem, sestávajícím v podstatě z vinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a jednotek síťovadla, kde jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců 1 a/nebo II

O

II

R₄—N—C—N—R₂ (I)

- 1 CZ 284454 B6

0Ηο=0 I x (Π) kde R], R₂ ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, l-acyloxyvinyl, allyl nebo 5 2-acyloxyallyl, A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B ve vzorci II znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku a X znamená acyloxyskupinu, kde acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 % hmot., vztaženo na polymer, a acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek, jsou jako takové přítomny, nebo jsou částečně nebo zcela zmýdelněny na 10 hydroxyskupiny, střední velikost perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm.

Bylo překvapující, že enzym v imobilizované formě vykazuje po navázání na uvedený nosič stabilitu při skladování nejméně 6 měsíců. Na rozdíl od jiných známých nosičů enzymů, jako 15 např. ^REupergit (Róhm), Vinyl-^RSepharose (Kem-en-tec), BrCN-aktivovaná ^RSepharose (Pharmacia), projevuje nosič s DAO podle vynálezu překvapivě vysoký výtěžek vazeb, jakož i delší operativní stabilitu. Zvlášť výhodně jsou nasazovány vinylacetát-epoxy-nosiče od Riedel de Haen, například VA-Epoxy-^RBiosynth.

Příprava použitých porézních perlových nosičových materiálů, které se potom potahují, je známá z DE-OS 33 44 912.

Ukotvovací reakce mezi enzymy použitými podle vynálezu a materiálem nosiče se provádí známým způsobem, jak je popsáno např. v DE-OS 24 07 340 nebo v DE-P 22 15 687, 24 21 789 25 a25 52 510.

Vynález se týká také použití nosičových materiálů podle vynálezu pro oxidativní desaminaci derivátů cefalosporinu C.

Výrazem deriváty cefalosporinu C se rozumí například sloučeniny vzorce I

(I) ve kterém X znamená acetátovou skupinu, zbytek nukleofilního činidla, heterocyklus, hydroxyskupinu nebo vodík, jakož i jejich soli.

Cefalosporin C představuje sloučeninu vzorce IV

-2CZ 284454 B6

(IV) kde R znamená skupinu

COOH O

I II

H₂N—C—(CH₂)₃— c— ·

H a-K.etodipinyl-7-aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce IV, kde R znamená skupinu

OO

IIII

HOOC—C—(CH₂)₃— C ·

Glutaryl-7-aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce IV, kde R znamená skupinu

O

II

HOOC—(CH₂)₃—C ·

7-Aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce IV, kde R znamená vodík.

Dále se vynález týká způsobu přípravy potažených nosičových materiálů, který spočívá v tom, že roztok obsahující D-aminokyselinovou oxidázu se inkubuje s porézním nosičovým materiálem ve tvaru perel, tvořeným zesíťovaným kopolymerisátem, sestávajícím v podstatě zvinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a z jednotek síťovadla, kde jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II

O

R-N-(!-N-R₂ (I) CH2=c|--B (Π) kde R|, R₂ ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2-acyloxyallyl, A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B ve vzorci II znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku a X znamená acyloxy, kde acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 % hmot., vztaženo na polymer, acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jsou jako takové

-3CZ 284454 B6 přítomny, nebo jsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxyskupiny, a střední velikost částic perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm.

Vinylacetátové jednotky nosičového polymerisátu obsahují v acylátovém zbytku výhodně 2 až 18 atomů uhlíku, zvláště pak 2 až 6 atomů uhlíku. Přednostně je to acetátový nebo propionátový zbytek. V polymerisátu mohou být také různé acylátové zbytky, tzn., že mohou být k přípravě použity také směsi odpovídajících vinylacylátů.

V síťovadle vzorce I představuje A s výhodou rozvětvený nebo nerozvětvený alifatický uhlovodíkový zbytek se 2 až 5 atomy uhlíku, zejména se 2 nebo 3 atomy uhlíku. Zvlášť výhodně je to ethylenový nebo propylenový zbytek. Jestliže R_t/R₂ ve vzorci I znamenají 1-aceloxyvinyl nebo 2-acyloxyallyl, pak obsahuje tato acyloxyskupina přednostně 2 až 18 atomů uhlíku, zvláště pak 2 až 6 atomů uhlíku. Přednostně znamená aceloxyskupina acetátový nebo propionátový zbytek. Výhodným významem zbytků R]/R₂ je vinyl. Výhodná jednotka síťovadla v použitém polymerizátu podle vynálezu se odvozuje z příslušné Ν,Ν’-divinylethylenmočoviny. Toto síťovadlo působí spojení zvlášť odolné vůči hydrolýze. Dalším výhodným zástupcem je N,N’divinylpropylenmočovina.

V síťovacím prostředku vzorce II má B výhodně význam dvojvazného uhlovodíkového zbytku, zejména rozvětveného nebo nerozvětveného alkylového zbytku se 2 až 6 atomy uhlíku, přednostně má stejný význam, který byl shora popsán pro zbytky Rj a R₂ ve vzorci I. Výhodným síťovadlem tohoto druhu je příkladně 3,3-dimethylpentadien-2,4-diacetát, který se zvlášť snadno kopolymeruje s vinylacetátem.

Množství jednotek síťovadla (II) činí obecně 0 až 100%, obzvlášť 0 až 60 %, vztaženo na celkové množství jednotek síťovadla v polymerizátu.

Celkové množství jednotek síťovadla v nosičovém polymerizátu leží v uvedených rozmezích a závisí na požadované hustotě zesítění pro určitý účel použití. Tak například pro použití jako nosičového materiálu pro enzymatickou reakci v kotli s míchadlem nebo pro diagnostiku je výhodná relativně menší hustota zesítění, čehož předpokladem je nižší obsah zesítěných monomemích jednotek. Obsahy síťovadla pod 0,1 hmot. % vedou v některých případech k nežádoucím produktům. Jako spodní hranici je proto obecně možno uvést asi 1 hmot. %. Obsahy síťovadla nad 60 hmot. % jsou v zásadě možné, ale nepřinášejí zpravidla žádné další výhody.

Podle účelu použití je množství jednotek síťovadla přednostně 1 až 50 hmot. % a zvláště pak 1 až 40 hmot. %, vztaženo na polymer. Při použití jako nosičového materiálu pro DAO podle vynálezu, je spodní hranice výhodně 2,5 hmot. % a zvlášť výhodně 10 hmot. %. V případě, že se používají jen jednotky síťovadla vzorce II, činí tato spodní hranice přednostně 2,5 hmot. %.

Může být výhodné, když nosičový polymerizát obsahuje přídatně ještě monomemí jednotky monomeru schopného kopolymerace s vinylacetátem, přičemž jejich množství obecně nepřekračuje 10 hmot. %, vztaženo na celkový polymer, a přednostně je mezi 0,1 a 5 hmot. %. Příklady takových monomerů, které se mohou popřípadě nasazovat ve směsi jsou: N-vinylpyrrolidon, vinylenkarbonát, (meth)akrylová kyselina, (meth)akrylnitril, (meth)akrylamid, alkylester kyseliny (meth)akrylové se 2 až 12 atomy uhlíku, výhodně se 2 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, hydroxyalkylester kyseliny (meth)akrylové se 2 až 6 atomy uhlíku v alkylové skupině, N-vinyl-N-alkylacetamid, styrol, α-methylstyrol apod.

Zesíťovaný nosičový polymerizát se přednostně používá ve formě perel, majících převážně kulovitý tvar, jejichž střední velikost částic činí v suchém, nenabobtnaném stavu 20 až 800 pm a výhodně 50 až 300 μιη a výhodně vykazuje úzký rozptyl velikosti částic. Optimum velikosti

-4CZ 284454 B6 částic závisí přitom především na speciálním oboru nasazení. Při sloupcovém způsobu probíhajícím bez tlaku se příkladně velikost částic bude volit uvnitř dříve uvedených hranic příslušně větší než při způsobu probíhajícím za tlaku. Perly nasazených polymerizátů podle vynálezu jsou převážně makroporézní. Střední průměr pórů je obecně v rozmezí 2 až 10 000 nm, výhodně 5 až 200 nm a zvláště 20 až 200 nm.

Acylátové skupiny vinylacetátových jednotek v nasazeném polymerizátů podle vynálezu jsou jako takové, nebo jsou výhodně částečně nebo zcela zmýdelněny na OH-skupiny. Přitom je nejméně 10 hmot. % acyloxyskupin převedeno na hydroxyskupiny. Stupeň zmýdelnění činí však obecně více než 50%, s výhodou více než 70% a zvlášť pak 90 až 100%. V zesíťovaném polymeru (polyvinylalkoholu) získaném zmýdelněním je výhodně alespoň část OH-skupin obsazena takzvanými „spacer“ skupinami (příslušný „spacer“ viz dále).

Kopolymerizát ve formě polyvinylacetátového gelu není hydrofilní, pro použití ve vodě se musí esterová skupina hydrolyzovat. To se může provádět známým způsobem alkalicky, nabobtnáním produktů v alkoholu, např. methanolu a přidáním vodné zásady, jako hydroxidu sodného, nebo přeesterifikováním produktů nabobtnaných v alkoholu katalytickým množstvím kyseliny nebo zásady při průběžném odstraňování vytvořených esterů např. destilací (viz DE-PS 15 17 935). Zmýdelnění se může v libovolném stupni přerušit, takže podle účelu použití se může upravit stupeň hydrofilního gelu.

Při nasazení perlovitého zesíťovaného polyvinylalkoholového gelu je nosiče DAO, která se na nosič fixuje kovalentní vazbou, je v mnoha případech účelné gel nejprve modifikovat tzv. „spacery“. „Spacerem“ se přitom rozumí sloučeniny, které reagují jak s nosičovým polymerem, tak s biologicky aktivní látkou a mezi oběma tvoří jakési mosty. Reakce perlového polymerizátů se spacerem může nastat buď přímo, nebo s výhodou po předchozím zmýdelnění acylátových skupin. Stupeň reakce závisí přitom mimo jiné na zablokování spaceru a dostupnosti acylátové skupiny, popřípadě z toho vzniklé sekundární hydroxyskupiny. Jako specery podle vynálezu přicházejí v úvahu k tomuto účelu známé mono- a heterobifunkční sloučeniny jejichž druhá funkční skupina přebírá vazbu s připojovanou aktivní látkou (srovnej DE-PS 24 21789 a 25 52 510, jakož i Ullmanns Encyclopádie der technischen Chemie, 4. vydání, díl 10, str. 540 a „Characterization of Immobilized Biocatalysts“, Verlag Chemie, Weinheim, 1979, S. 53).

U nasazených spacerů se jedná příkladně o sloučeniny, které zavádějí dále uvedené skupiny:

---(CH₂)ň-NH₂ n= 2-12

O

---(CH₂)ň-CH—CH₂ n = 1-8

NH

---(CH₂)ň-CH—CH₂ n = 1-8

--(CH₂)—C'

X _OR

---(CH₂)ň-Cir

OR n= 1-8

X= H, OH, halogen

N₃, OR n= 1-6

R = alkylový zbytek s 1až 6atomy uhlíku

-5CZ 284454 B6

Výhodné spacery jsou takové, které nastolují chemické podmínky odolné vůči hydrolýze, jako epichlorhydrin nebo jeho monology (a,p-epoxy-a>-halogenalkany). Reakce polyvinylalkoholu (polyvinylacylátu) se provádí přitom bez rozpouštědla nebo v prostředí rozpouštědla, přednostně v přítomnosti katalyzátoru. Reakční doba je, v závislosti na teplotě, která může být mezi teplotou místnosti a teplotou zpětného toku epichlorhydrinu (113 až 115 °C), obecně mezi 30 minutami a 24 hodinami. Jako katalyzátory přicházejí v úvahu např. NaOH (v práškové formě) nebo vodné roztoky zásad, dimethylformamid, triethylamin a jiné akceptory kyselin.

Reakce mezi DAO a nosičem se provádí při teplotě mezi 0 a +40 °C, s výhodou při teplotě místnosti. Ukotvovací reakce se provádí s výhodou v blízkosti neutrální hodnoty pH, příkladně při hodnotách pH 5 až 9, výhodně v prostředí fosfátového pufru o iontové síle 0,5 až 1,5 M.

D-aminokyselinová oxidáza se může získat například z prasečích ledvin, bakterií, kvasinek nebo hub. Výhodně se k získání DAO používá kvasinek Trigonopsis variabilis CBS 4095. Pro vazbu na nosič enzymu se mohou užít vyčištěné, částečně vyčištěné nebo surové buněčné extrakty obsahující DAO. Čištění DAO se může provádět klasickým způsobem, např. srážením síranem amonným, iontoměničovou nebo gelovou permeační chromatografií. Přednostně se používají roztoky enzymu obsahující DAO, které se získají iontoměničovou chromatografií na ^RDEAECelluolose.

Dále se může na nosič spolu s DAO navázat také kataláza. Kataláza se může získat například ze zvířat, bakterií, kvasinek nebo hub. Přednostně se kataláza získává z kvasinky Trigonopsis variabilis CBS 4095. Pro navázání na nosič enzymu mohou být použity čištěné, částečně čištěné nebo surové buněčné extrakty obsahující katalázu. Kataláza se může navázat na enzymový nosič současně s DAO, před nebo po navázání DAO. Enzymové nosiče, na nichž je navrstvena pouze DAO nebo pouze kataláza se mohou smísit.

Vynález bude blíže vysvětlen na základě příkladů. Údaje o procentech se vztahují na hmotnost.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Kultury Trigonopsis variabilis CBS 4095 byly nejprve vneseny do třepané baňky a potom do míchaného fermentoru, obsahujícího médium, které popsali Sentheshanmuganathan a Nickerson (J. Gen. Microbiol. 27, 465, 1962), buď s methioninem, nebo s alaninem jako zdrojem dusíku.

Ke stanovení DAO se 0,4 g buněk zmrazí, následně se roztaví při kyselém pH, např. asi při pH 3 až 4, zmrazení může probíhat při teplotě pod -10 °C, např. asi při -20 °C. Musí se mrazit dostatečně dlouho, aby se vyvolala permeabilita buněk, např. alespoň 1 hodinu při -20 °C.

Aktivita se určí v následující násadou fotometricky:

roztoky:

1) pufr

2) o-fenylendiamin

100 nM KPP, pH 7,3, sycený vzduchem

0,02 % v H₂O

-6CZ 284454 B6

3) peroxidáza

4) enzym nebo permeabilizované buňky

5) substrát

Průběh testu:

λ = 405 nm (maximum) ε = 4020 1/mol x cm v = 30 °C

Objemy:

1) 2,00 ml

2) 0,50 ml

3) 0,10 ml

4) 0,05 ml minuty čekat

5) 0,30 ml

2,95 ml

Výpočet:

jednotky E x zředění x celkový objem mg/ml v pufru optimálně: 0,5 - 1,0 jednotek/ml

150 mM Na-CPC (100 %) v pufru

Konečná koncentrace:

mM

0,0034 %

0,034 mg/ml

15,25 mM ml min x ε x d x objem vzorku

Při shora uvedených podmínkách byla dosažena aktivita enzymu ve fermentoru 200 U/l.

Při stanovením aktivity s imobilizovaným enzymem byly diskontinuálně odebírány vzorky a v odběru byla stanovena CPC-koncentrace pomocí HPLC. Mobilní fáze byla tvořena 40 mM kaliumfosfátového pufru (pH 4,3) a 20 % meOH s 10mg/l tetrabutylamoniumhydrogensulfátu. Stacionární fázi tvoří ^RLichrospher 100 RP 18 (5 pm).

Příklad 2

Syntéza nosiče

a) Suspenzní polymerace

Ve skleněné baňce o objemu 1,41 s míchadlem, zpětným chladičem a teploměrem byla za míchání a pod atmosférou dusíku suspendována organická fáze, tvořená roztokem 60,0 g vinylacetátu, 40,0 g N,N’-divinylethylenmočiviny, 80,0 g ethylhexanolu, 20,0 g polyglykolu B 11/50 (Hoechst AG) a 2,0 g azoisobutyronitrilu ^RPorofor N (Bayer AG) ve vodné fázi, sestávající z 3,2 g Na₂HPO4, 8,0 g polyvinylpyrrolidonu (mol. hm. ca 360 00) a 800 ml vody. Zahřátím na 75 °C ve vyhřívané lázni byla nastartována polymerace. Po dvou hodinách byla teplota zvýšena na 85 °C a po dalších dvou hodinách byla polymerace skončena. Získaná suspenze byla ochlazena na 25 °C, odsáta a promyta čtyřikrát vždy 1 1 vody, třikrát vždy 1 1 methanolu a dvakrát vždy 1 I acetonu během 30 minut, odsáta a při 50 °C a 26,66 kPa se nechala přes nos ve vakuové sušárně pod dusíkem vysušit. Výtěžek činil 75 g, vzhledu zakalených perel s lesklým povrchem. Sypná hmotnost činila 300 g/1. Z toho plyne sypný objem 3,3 ml/g.

b) Parciální zmýdelnění g suchého produktu bylo promyto celkem 150 ml methanolu a roztokem 17,5 g NaOH ve 150 ml vody během 3 hodin při 30 °C, odsáto, neutralizováno v 500 ml methanolu kyselinou octovou, promyto jedenkrát 500 ml methanolu a dvakrát vždy 500 ml acetonu, odsáto, prosáto a vysušeno. Výtěžek činil 34,4 g (= 68,8 hmot.%), vztaženo na polymerizát. Perly byly zakalené a měly lesklý povrch. Sypná hmotnost činila 353 g/1 (počítaný sypný objem 2,8 ml/g).

Sítový rozbor: > 300 pm 19,0 g (55,2 hmot. %), 200 až 300 pm 8,9 g (25,9 hmot. %), 100 až 200 pm 6,1 g (17,9 hmot. %) a 50 až 100 pm 0,4 g (1,2 hmot. %). Stupeň zmýdelnění (IR, vztaženo na mol): 73 %

c) Adice spaceru

10,0g suchého sítového podílu 50 až 200 pm se nechalo nabobtnat 4 hodiny ve 100 ml epichlorhydrinu při 25 °C, potom se zahřívalo 4 hodiny za mírného míchání na 115 °C a po ochlazení na 25 °C se odsálo. Potom se promylo dvakrát, pokaždé 200 ml acetonu, během 30 minut, odsálo se a uschovalo přes noc v sušárně za sníženého tlaku při 50 °C pod dusíkovou vrstvou. Zvážení poskytlo 9,8 g suchého produktu o sypné hmotnosti 315 g a epoxidovém ekvivalentu 350 pmol/g.

Příklad 3 g vlhkých buněk připravených jako v příkladu 3, s aktivitou 30 U/g bylo smíseno a suspendováno ve stejném hmotnostním podílu s 20 mM kaliumfosfátového pufru, pH 8,0. Směs byla za chlazení rozemleta v Dyno-mlýně při době zdržení 3x5 min. Výtěžek aktivity v supematantu po odstředění při 13 000 g činí 60 až 80 %, v průměru je to 210 U. Lehce zakalený surový extrakt byl dialyzován při 20 mM kaliumfosfátového pufru, pH 8,0.

Potom bylo přidáno tolik DEAE-Cellulose od Whatmana, aby byla DAO zcela navázána. Nakonec byl navázaný enzym naplněn do sloupce kolony a DAO byla eludována se stoupající iontovou silou (0-0,5 M NaCl). Aktivní podíly byly spojeny, zahuštěny ultrafiltrací a pufrovány 1 M kaliumfosfátovým pufrem (pH = 8,0). V průměru obsahuje takto přečištěný roztok DAO 25 U/ml.

Příklad 4 ml roztoku získaného podle příkladu 3 se nanese na 1 g VA-Epoxy Biosynth ^R(RiedeldeHaen) a nechá se uzavřeno stát 3 dny při teplotě místnosti. Enzym se v této době kovalentně váže na nosič obsahující oxiranové skupiny. Potom se imobilizovaný enzym promyje 1 M roztokem NaCl. Vazebná účinnost činí v průměru 0,83. Nepatrná množství jsou v promývací vodě. Imobilizovaný enzym má ca 32 U/g (hmotnost ve vlhkém stavu, Fgw). Skladování se provádí ve 20 mM kaliumfosfátového pufru, který obsahuje 0,02 % azidu sodného, při 4 °C.

Příklad 5

Postupovalo se jako v příkladu 2, avšak jako nosič byl nasazen Eupergit^R, Riihm, Darstad. Výsledky jsou v tabulce I.

-8CZ 284454 B6

Příklad 6 ml roztoku DAO se diatyzovaly proti 50 mM kaliumfosfátového pufru (pH = 8,6). Pufrovaný roztok s celkem 60 U se inkuboval za účelem ustálení při teplotě místnosti (R.T) po dobu 18 hodin se 2 ml suspenze vinylsepharosy (60 %). Získalo se 1,2 ml sepharosy s 22 U/ml (viz tabulka 1), což odpovídá 43 % vazebného výtěžku. V promývací vodě je 10 U, vypočteno podle hodnot při η 0,51.

Příklad 7 ml roztoku DAO s 3,2 U, který byl dialyzován proti 0,5 M kaliumfosfátového pufru pH 8,7, byl přidán k 0,2 g CNBr-aktivované sepharose (Pharmacia) při teplotě místnosti. Po 90 minutách bylo navázání skončeno a podle výrobního předpisu proběhlo promývání. Přebytečné vazebné skupiny byly inaktivovány glycinem. Výsledek viz tabulka I.

Příklad 8

Enzym imobilizovaný jako v příkladu 4 byl za podmínek uvedených v příkladu 4 uskladněn a každý měsíc byla zjišťována aktivita. V 6 měsících neklesla aktivita více než o 5 %.

Příklad 9

Sodná sůl defalosporinu C (40 mM) byla rozpuštěna při pH 7,3 ve 20 mM kaliumfosfátového pufru a za míchání temporována na 30 °C a sycena kyslíkem. K. roztoku byly přidány 2 % hm. (hm.) imobilizované DAO a násada se prostřednictvím automatického titračního přístroje udržovala na počátečním pH. Po ukončení reakce se roztok vypustí a reaktor znovu naplní. Enzym zůstává v nádobě. Počet reakcí je 120. Reakční doba se volí tak, aby byla umožněna úplná reakce, a činí až asi 40 reakcí 1 hodinu, potom 1,5 až do 90 a konečně 2 h.

Tabulka I: Srovnání nosičů enzymu

	vazebná efektivita	U/g (FGW)	t_d při 30 °C, pH = 7,3 (η)
Eupergit	0,71	29	«20
(Rohm) VA-Epoxy	0,83	32	>40
(Riedel-deHaen) Vinyl-Sepharosa	0,51	22	« 15
(Kem-en-tec) BrCN-akt.	0,7	6	« 6
Sepharosa (Pharmacia)

-9CZ 284454 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Enzymy potažený nosičový materiál, který obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu a porézní perličkový nosičový materiál, přičemž nosičový materiál je tvořen zesíťovaným kopolymerizátem, který v podstatě sestává z vinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a jednotek síťovadla, přičemž jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II

O

II

Rl—Νς—C—_;N—R₂ (I)

CH2=C

I

X (II) kde

Ri, R₂ ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2acyloxyallyl,

A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku,

B ve vzorci II je dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 uhlíkovými atomy a

X znamená acyloxyskupinu, přičemž acyloxyskupinaje zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 hmotn. %, vztaženo na polymer a acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jsou přítomny jako takové, nebojsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxyskupiny, střední velikost částic perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm, vyznačující se tím, že uvedený zesíťovaný kopolymerizát je modifikována spacerem, vybraným ze skupiny zahrnující

---(CH₂)—NH₂, kde nje 2-12, O ---(CH₂)—CH—CH₂. kde n je 1-8, NH ---(CH₂)—CH—CH₂, kde nje 1-8 ---(CH₂)—, kde X nje 1-8. Xje H, OH, halogen,

N₃, OR,

- 10CZ 284454 B6 .OŘ

---(CH₂)—CH , kde ^XOR n je 1 -6,

Rje alkyl s 1-6 uhlíkovými atomy a

Y je NH_2> N₂₁ NCO.

2. Nosičovy materiál podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu a katalázu.

3. Způsob přípravy povlečeného nosičového materiálu podle nároku 1, při kterém se roztok, obsahující D-aminokyselinovou oxidázu inkubuje s porézním perličkovým nosičovým materiálem ze síťovaného kopolymerizátu, který je v podstatě tvořen vinylacetátovými a/nebo vinylalkoholovými jednotkami a jednotkami síťovadla, přičemž jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II

O

II

R—N—C—;N—R₂ (I)

CH2=C --B (Π) kde

A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku,

B ve vzorci lije dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku a

X znamená acyloxyskupinu, přičemž acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 hmotn. %, vztaženo na polymer a acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jsou přítomny jako takové, nebojsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxylové skupiny, střední velikosti částic perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm, vyznačující se tím, že uvedený síťovaný kopolymerizát se modifikuje spacerem, vybraným ze skupiny zahrnující

---(CH₂)— NH₂, kde n je 2-12,

O

---(CH₂)—CH—CH₂, kde n je 1-8,

- 11 CZ 284454 B6

NH

---(CH₂)—CH—CH₂. kde

---(CH₂)—c^° ,_kde

X _0R

---(^CH2)ň-^CH · ^kde ^X0R nje 1-S n je 1-8.

Xje H, OH, halogen,

N₃, OR, n je 1-6.

R je alkyl s 1-6 uhlíkovými atomy a

Y je NH₂, N₂, NCO.

4. Způsob podle nároku 3, pro přípravu nosičového materiálu podle nároku 2, vyzná5 čující se tím, že se používají roztoky obsahující D-aminokyselinou oxidázu a katalázu.

5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že se inkubace provádí při teplotě mezi 0 °C až +40 °C.

10 6. Použití potaženého nosičového materiálu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu derivátů glutaryl-7-aminocefalosporanové kyseliny nebo a-ketoadipinyl-7-aminocefalosporanové kyseliny.