CZ284454B6 - Příprava enzymy potaženého nosičového materiálu - Google Patents
Příprava enzymy potaženého nosičového materiálu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ284454B6 CZ284454B6 CS913995A CS399591A CZ284454B6 CZ 284454 B6 CZ284454 B6 CZ 284454B6 CS 913995 A CS913995 A CS 913995A CS 399591 A CS399591 A CS 399591A CZ 284454 B6 CZ284454 B6 CZ 284454B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- units
- carrier material
- carbon atoms
- vinyl
- crosslinker
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 22
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 102000004674 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 37
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims abstract description 9
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical group OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 239000004971 Cross linker Chemical group 0.000 claims description 24
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 18
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 claims description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 12
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims description 11
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 10
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 9
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 8
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 claims description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 5
- -1 1-acyloxyvinyl Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 claims description 4
- IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N (7R)-7-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid Chemical class S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCC(O)=O)[C@@H]12 IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical group CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 241001480015 Trigonopsis variabilis Species 0.000 description 6
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical group CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 239000011049 pearl Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical group CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical group CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;sulfate Chemical compound OS([O-])(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC SHFJWMWCIHQNCP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 238000007833 oxidative deamination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- NMRPBPVERJPACX-UHFFFAOYSA-N (3S)-octan-3-ol Natural products CCCCCC(O)CC NMRPBPVERJPACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HMYBDZFSXBJDGL-UHFFFAOYSA-N 1,3-bis(ethenyl)imidazolidin-2-one Chemical compound C=CN1CCN(C=C)C1=O HMYBDZFSXBJDGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VAYTZRYEBVHVLE-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxol-2-one Chemical compound O=C1OC=CO1 VAYTZRYEBVHVLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YIWUKEYIRIRTPP-UHFFFAOYSA-N 2-ethylhexan-1-ol Chemical compound CCCCC(CC)CO YIWUKEYIRIRTPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 238000006887 Ullmann reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000005907 alkyl ester group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004716 alpha keto acids Chemical class 0.000 description 1
- XYLMUPLGERFSHI-UHFFFAOYSA-N alpha-Methylstyrene Chemical compound CC(=C)C1=CC=CC=C1 XYLMUPLGERFSHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920006037 cross link polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002431 hydrogen Chemical class 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 239000012434 nucleophilic reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000466 oxiranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920002689 polyvinyl acetate Polymers 0.000 description 1
- 239000011118 polyvinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005029 sieve analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010557 suspension polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N thioacetamide Natural products CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/18—Multi-enzyme systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
- C12N11/082—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
- C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Enzymy potažený nosičový materiál, tvořený oxidázou D-aminokyselin a nosičovým materiálem. Nosičem je zesíťovaný kopolymerisát, který je tvořen vinylacetátovými a/nebo vinylalkoholovými jednotkami a jednotkami síťovadla. Nosič potažený oxidázou D-aminokyselin může být přídavně potažen katalázou. Uvedený materiál může být použit pro přípravu léčiv.ŕ
Description
Oblast techniky
Řešení se týká enzymy potaženého nosičového materiálu, který obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu, způsobu jeho výroby a jeho použití.
Dosavadní stav techniky
D-aminokyselinová oxidáza (dále DAO) katalyzuje oxidativní deaminaci D-aminokyselin na odpovídající α-ketokyseliny, amoniak a peroxid vodíku.
Kromě komerčně dostupné DAO z vepřových ledvin se enzym syntetizuje z bakterií, kvasinek a hub. Z nich vyniká jako výhodný producent DAO Trigonopsis variabilis. Kromě použití tohoto enzymu ke štěpení racematů D,L-aminokyselin v různých roztocích je obzvláště významná schopnost oxidativní deaminace cefalosporinu C. Tato katalytická vlastnost se využívá k přípravě a-ketoadipinyl-7-aminocefalosporanové kyseliny a glutaryl-7-aminocefalosporanové kyseliny, které se mohou potom převést pomocí acelázy na kyselinu 7-aminocefalosporanovou.
V DE-OS 22 19 454 (US-P3 801 458) je popsána reakce derivátů cefalosporinu Cm pomocí aktivovaných buněk Trigonopsis variabilis CBS 4095. „Aktivovaný“ zde znamená, že buňky kvasinek byly podrobeny fyzikálnímu a/nebo chemickému procesu, takže v buňkách obsažená DAO, ačkoliv byla v podstatě neuvolněná, získala schopnost katalyzovat oxidaci cefalosporinu C.
V patentové přihlášce WO 86 04 087 je popsáno čištění a imobilizace DAO z Trigonopsis variabilis a její použití k oxidativní desaminaci cefalosporinu C. Nejsou zde však uváděny žádné údaje o operační stabilitě a je stanovena výtěžnost vazeb 40 %.
Podstata vynálezu
Úlohou předloženého vynálezu bylo zlepšit stabilitu D-aminokyselinové oxidázy. S překvapením bylo nyní nalezeno, že naváháním D-aminokyselinové oxidázy na nosičový materiál ze zesíťovaného kopolymerisátu, který je v podstatě tvořen jednotkami vinylacetátu a/nebo vinylalkoholu a jednotkami síťovadla, se vytvoří komplex v němž si enzym DAO dlouhou dobu udržuje svou enzymatickou aktivitu.
Vynález se proto týká nosičového materiálu opatřeného vrstvou enzymů, který zahrnuje Daminokyselinovou oxidázu a porézní nosičový materiál ve tvaru perliček, kde materiál nosiče je tvořen zesíťovaným kopolymerisátem, sestávajícím v podstatě z vinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a jednotek síťovadla, kde jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců 1 a/nebo II
O
II
R4—N—C—N—R2 (I)
- 1 CZ 284454 B6
0Ηο=0 I x (Π) kde R], R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, l-acyloxyvinyl, allyl nebo 5 2-acyloxyallyl, A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B ve vzorci II znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku a X znamená acyloxyskupinu, kde acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 % hmot., vztaženo na polymer, a acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek, jsou jako takové přítomny, nebo jsou částečně nebo zcela zmýdelněny na 10 hydroxyskupiny, střední velikost perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm.
Bylo překvapující, že enzym v imobilizované formě vykazuje po navázání na uvedený nosič stabilitu při skladování nejméně 6 měsíců. Na rozdíl od jiných známých nosičů enzymů, jako 15 např. REupergit (Róhm), Vinyl-RSepharose (Kem-en-tec), BrCN-aktivovaná RSepharose (Pharmacia), projevuje nosič s DAO podle vynálezu překvapivě vysoký výtěžek vazeb, jakož i delší operativní stabilitu. Zvlášť výhodně jsou nasazovány vinylacetát-epoxy-nosiče od Riedel de Haen, například VA-Epoxy-RBiosynth.
Příprava použitých porézních perlových nosičových materiálů, které se potom potahují, je známá z DE-OS 33 44 912.
Ukotvovací reakce mezi enzymy použitými podle vynálezu a materiálem nosiče se provádí známým způsobem, jak je popsáno např. v DE-OS 24 07 340 nebo v DE-P 22 15 687, 24 21 789 25 a25 52 510.
Vynález se týká také použití nosičových materiálů podle vynálezu pro oxidativní desaminaci derivátů cefalosporinu C.
Výrazem deriváty cefalosporinu C se rozumí například sloučeniny vzorce I
(I) ve kterém X znamená acetátovou skupinu, zbytek nukleofilního činidla, heterocyklus, hydroxyskupinu nebo vodík, jakož i jejich soli.
Cefalosporin C představuje sloučeninu vzorce IV
-2CZ 284454 B6
(IV) kde R znamená skupinu
COOH O
I II
H2N—C—(CH2)3— c— ·
H a-K.etodipinyl-7-aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce IV, kde R znamená skupinu
OO
IIII
HOOC—C—(CH2)3— C ·
Glutaryl-7-aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce IV, kde R znamená skupinu
O
II
HOOC—(CH2)3—C ·
7-Aminocefalosporanová kyselina je sloučenina vzorce IV, kde R znamená vodík.
Dále se vynález týká způsobu přípravy potažených nosičových materiálů, který spočívá v tom, že roztok obsahující D-aminokyselinovou oxidázu se inkubuje s porézním nosičovým materiálem ve tvaru perel, tvořeným zesíťovaným kopolymerisátem, sestávajícím v podstatě zvinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a z jednotek síťovadla, kde jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II
O
R-N-(!-N-R2 (I) CH2=c|--B (Π) kde R|, R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2-acyloxyallyl, A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku, B ve vzorci II znamená dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku a X znamená acyloxy, kde acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 % hmot., vztaženo na polymer, acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jsou jako takové
-3CZ 284454 B6 přítomny, nebo jsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxyskupiny, a střední velikost částic perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm.
Vinylacetátové jednotky nosičového polymerisátu obsahují v acylátovém zbytku výhodně 2 až 18 atomů uhlíku, zvláště pak 2 až 6 atomů uhlíku. Přednostně je to acetátový nebo propionátový zbytek. V polymerisátu mohou být také různé acylátové zbytky, tzn., že mohou být k přípravě použity také směsi odpovídajících vinylacylátů.
V síťovadle vzorce I představuje A s výhodou rozvětvený nebo nerozvětvený alifatický uhlovodíkový zbytek se 2 až 5 atomy uhlíku, zejména se 2 nebo 3 atomy uhlíku. Zvlášť výhodně je to ethylenový nebo propylenový zbytek. Jestliže Rt/R2 ve vzorci I znamenají 1-aceloxyvinyl nebo 2-acyloxyallyl, pak obsahuje tato acyloxyskupina přednostně 2 až 18 atomů uhlíku, zvláště pak 2 až 6 atomů uhlíku. Přednostně znamená aceloxyskupina acetátový nebo propionátový zbytek. Výhodným významem zbytků R]/R2 je vinyl. Výhodná jednotka síťovadla v použitém polymerizátu podle vynálezu se odvozuje z příslušné Ν,Ν’-divinylethylenmočoviny. Toto síťovadlo působí spojení zvlášť odolné vůči hydrolýze. Dalším výhodným zástupcem je N,N’divinylpropylenmočovina.
V síťovacím prostředku vzorce II má B výhodně význam dvojvazného uhlovodíkového zbytku, zejména rozvětveného nebo nerozvětveného alkylového zbytku se 2 až 6 atomy uhlíku, přednostně má stejný význam, který byl shora popsán pro zbytky Rj a R2 ve vzorci I. Výhodným síťovadlem tohoto druhu je příkladně 3,3-dimethylpentadien-2,4-diacetát, který se zvlášť snadno kopolymeruje s vinylacetátem.
Množství jednotek síťovadla (II) činí obecně 0 až 100%, obzvlášť 0 až 60 %, vztaženo na celkové množství jednotek síťovadla v polymerizátu.
Celkové množství jednotek síťovadla v nosičovém polymerizátu leží v uvedených rozmezích a závisí na požadované hustotě zesítění pro určitý účel použití. Tak například pro použití jako nosičového materiálu pro enzymatickou reakci v kotli s míchadlem nebo pro diagnostiku je výhodná relativně menší hustota zesítění, čehož předpokladem je nižší obsah zesítěných monomemích jednotek. Obsahy síťovadla pod 0,1 hmot. % vedou v některých případech k nežádoucím produktům. Jako spodní hranici je proto obecně možno uvést asi 1 hmot. %. Obsahy síťovadla nad 60 hmot. % jsou v zásadě možné, ale nepřinášejí zpravidla žádné další výhody.
Podle účelu použití je množství jednotek síťovadla přednostně 1 až 50 hmot. % a zvláště pak 1 až 40 hmot. %, vztaženo na polymer. Při použití jako nosičového materiálu pro DAO podle vynálezu, je spodní hranice výhodně 2,5 hmot. % a zvlášť výhodně 10 hmot. %. V případě, že se používají jen jednotky síťovadla vzorce II, činí tato spodní hranice přednostně 2,5 hmot. %.
Může být výhodné, když nosičový polymerizát obsahuje přídatně ještě monomemí jednotky monomeru schopného kopolymerace s vinylacetátem, přičemž jejich množství obecně nepřekračuje 10 hmot. %, vztaženo na celkový polymer, a přednostně je mezi 0,1 a 5 hmot. %. Příklady takových monomerů, které se mohou popřípadě nasazovat ve směsi jsou: N-vinylpyrrolidon, vinylenkarbonát, (meth)akrylová kyselina, (meth)akrylnitril, (meth)akrylamid, alkylester kyseliny (meth)akrylové se 2 až 12 atomy uhlíku, výhodně se 2 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, hydroxyalkylester kyseliny (meth)akrylové se 2 až 6 atomy uhlíku v alkylové skupině, N-vinyl-N-alkylacetamid, styrol, α-methylstyrol apod.
Zesíťovaný nosičový polymerizát se přednostně používá ve formě perel, majících převážně kulovitý tvar, jejichž střední velikost částic činí v suchém, nenabobtnaném stavu 20 až 800 pm a výhodně 50 až 300 μιη a výhodně vykazuje úzký rozptyl velikosti částic. Optimum velikosti
-4CZ 284454 B6 částic závisí přitom především na speciálním oboru nasazení. Při sloupcovém způsobu probíhajícím bez tlaku se příkladně velikost částic bude volit uvnitř dříve uvedených hranic příslušně větší než při způsobu probíhajícím za tlaku. Perly nasazených polymerizátů podle vynálezu jsou převážně makroporézní. Střední průměr pórů je obecně v rozmezí 2 až 10 000 nm, výhodně 5 až 200 nm a zvláště 20 až 200 nm.
Acylátové skupiny vinylacetátových jednotek v nasazeném polymerizátů podle vynálezu jsou jako takové, nebo jsou výhodně částečně nebo zcela zmýdelněny na OH-skupiny. Přitom je nejméně 10 hmot. % acyloxyskupin převedeno na hydroxyskupiny. Stupeň zmýdelnění činí však obecně více než 50%, s výhodou více než 70% a zvlášť pak 90 až 100%. V zesíťovaném polymeru (polyvinylalkoholu) získaném zmýdelněním je výhodně alespoň část OH-skupin obsazena takzvanými „spacer“ skupinami (příslušný „spacer“ viz dále).
Kopolymerizát ve formě polyvinylacetátového gelu není hydrofilní, pro použití ve vodě se musí esterová skupina hydrolyzovat. To se může provádět známým způsobem alkalicky, nabobtnáním produktů v alkoholu, např. methanolu a přidáním vodné zásady, jako hydroxidu sodného, nebo přeesterifikováním produktů nabobtnaných v alkoholu katalytickým množstvím kyseliny nebo zásady při průběžném odstraňování vytvořených esterů např. destilací (viz DE-PS 15 17 935). Zmýdelnění se může v libovolném stupni přerušit, takže podle účelu použití se může upravit stupeň hydrofilního gelu.
Při nasazení perlovitého zesíťovaného polyvinylalkoholového gelu je nosiče DAO, která se na nosič fixuje kovalentní vazbou, je v mnoha případech účelné gel nejprve modifikovat tzv. „spacery“. „Spacerem“ se přitom rozumí sloučeniny, které reagují jak s nosičovým polymerem, tak s biologicky aktivní látkou a mezi oběma tvoří jakési mosty. Reakce perlového polymerizátů se spacerem může nastat buď přímo, nebo s výhodou po předchozím zmýdelnění acylátových skupin. Stupeň reakce závisí přitom mimo jiné na zablokování spaceru a dostupnosti acylátové skupiny, popřípadě z toho vzniklé sekundární hydroxyskupiny. Jako specery podle vynálezu přicházejí v úvahu k tomuto účelu známé mono- a heterobifunkční sloučeniny jejichž druhá funkční skupina přebírá vazbu s připojovanou aktivní látkou (srovnej DE-PS 24 21789 a 25 52 510, jakož i Ullmanns Encyclopádie der technischen Chemie, 4. vydání, díl 10, str. 540 a „Characterization of Immobilized Biocatalysts“, Verlag Chemie, Weinheim, 1979, S. 53).
U nasazených spacerů se jedná příkladně o sloučeniny, které zavádějí dále uvedené skupiny:
---(CH2)ň-NH2 n= 2-12
O
---(CH2)ň-CH—CH2 n = 1-8
NH
---(CH2)ň-CH—CH2 n = 1-8
--(CH2)—C'
X _OR
---(CH2)ň-Cir
OR n= 1-8
X= H, OH, halogen
N3, OR n= 1-6
R = alkylový zbytek s 1až 6atomy uhlíku
-5CZ 284454 B6
Výhodné spacery jsou takové, které nastolují chemické podmínky odolné vůči hydrolýze, jako epichlorhydrin nebo jeho monology (a,p-epoxy-a>-halogenalkany). Reakce polyvinylalkoholu (polyvinylacylátu) se provádí přitom bez rozpouštědla nebo v prostředí rozpouštědla, přednostně v přítomnosti katalyzátoru. Reakční doba je, v závislosti na teplotě, která může být mezi teplotou místnosti a teplotou zpětného toku epichlorhydrinu (113 až 115 °C), obecně mezi 30 minutami a 24 hodinami. Jako katalyzátory přicházejí v úvahu např. NaOH (v práškové formě) nebo vodné roztoky zásad, dimethylformamid, triethylamin a jiné akceptory kyselin.
Reakce mezi DAO a nosičem se provádí při teplotě mezi 0 a +40 °C, s výhodou při teplotě místnosti. Ukotvovací reakce se provádí s výhodou v blízkosti neutrální hodnoty pH, příkladně při hodnotách pH 5 až 9, výhodně v prostředí fosfátového pufru o iontové síle 0,5 až 1,5 M.
D-aminokyselinová oxidáza se může získat například z prasečích ledvin, bakterií, kvasinek nebo hub. Výhodně se k získání DAO používá kvasinek Trigonopsis variabilis CBS 4095. Pro vazbu na nosič enzymu se mohou užít vyčištěné, částečně vyčištěné nebo surové buněčné extrakty obsahující DAO. Čištění DAO se může provádět klasickým způsobem, např. srážením síranem amonným, iontoměničovou nebo gelovou permeační chromatografií. Přednostně se používají roztoky enzymu obsahující DAO, které se získají iontoměničovou chromatografií na RDEAECelluolose.
Dále se může na nosič spolu s DAO navázat také kataláza. Kataláza se může získat například ze zvířat, bakterií, kvasinek nebo hub. Přednostně se kataláza získává z kvasinky Trigonopsis variabilis CBS 4095. Pro navázání na nosič enzymu mohou být použity čištěné, částečně čištěné nebo surové buněčné extrakty obsahující katalázu. Kataláza se může navázat na enzymový nosič současně s DAO, před nebo po navázání DAO. Enzymové nosiče, na nichž je navrstvena pouze DAO nebo pouze kataláza se mohou smísit.
Vynález bude blíže vysvětlen na základě příkladů. Údaje o procentech se vztahují na hmotnost.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kultury Trigonopsis variabilis CBS 4095 byly nejprve vneseny do třepané baňky a potom do míchaného fermentoru, obsahujícího médium, které popsali Sentheshanmuganathan a Nickerson (J. Gen. Microbiol. 27, 465, 1962), buď s methioninem, nebo s alaninem jako zdrojem dusíku.
Ke stanovení DAO se 0,4 g buněk zmrazí, následně se roztaví při kyselém pH, např. asi při pH 3 až 4, zmrazení může probíhat při teplotě pod -10 °C, např. asi při -20 °C. Musí se mrazit dostatečně dlouho, aby se vyvolala permeabilita buněk, např. alespoň 1 hodinu při -20 °C.
Aktivita se určí v následující násadou fotometricky:
roztoky:
1) pufr
2) o-fenylendiamin
100 nM KPP, pH 7,3, sycený vzduchem
0,02 % v H2O
-6CZ 284454 B6
3) peroxidáza
4) enzym nebo permeabilizované buňky
5) substrát
Průběh testu:
λ = 405 nm (maximum) ε = 4020 1/mol x cm v = 30 °C
Objemy:
1) 2,00 ml
2) 0,50 ml
3) 0,10 ml
4) 0,05 ml minuty čekat
5) 0,30 ml
2,95 ml
Výpočet:
jednotky E x zředění x celkový objem mg/ml v pufru optimálně: 0,5 - 1,0 jednotek/ml
150 mM Na-CPC (100 %) v pufru
Konečná koncentrace:
mM
0,0034 %
0,034 mg/ml
15,25 mM ml min x ε x d x objem vzorku
Při shora uvedených podmínkách byla dosažena aktivita enzymu ve fermentoru 200 U/l.
Při stanovením aktivity s imobilizovaným enzymem byly diskontinuálně odebírány vzorky a v odběru byla stanovena CPC-koncentrace pomocí HPLC. Mobilní fáze byla tvořena 40 mM kaliumfosfátového pufru (pH 4,3) a 20 % meOH s 10mg/l tetrabutylamoniumhydrogensulfátu. Stacionární fázi tvoří RLichrospher 100 RP 18 (5 pm).
Příklad 2
Syntéza nosiče
a) Suspenzní polymerace
Ve skleněné baňce o objemu 1,41 s míchadlem, zpětným chladičem a teploměrem byla za míchání a pod atmosférou dusíku suspendována organická fáze, tvořená roztokem 60,0 g vinylacetátu, 40,0 g N,N’-divinylethylenmočiviny, 80,0 g ethylhexanolu, 20,0 g polyglykolu B 11/50 (Hoechst AG) a 2,0 g azoisobutyronitrilu RPorofor N (Bayer AG) ve vodné fázi, sestávající z 3,2 g Na2HPO4, 8,0 g polyvinylpyrrolidonu (mol. hm. ca 360 00) a 800 ml vody. Zahřátím na 75 °C ve vyhřívané lázni byla nastartována polymerace. Po dvou hodinách byla teplota zvýšena na 85 °C a po dalších dvou hodinách byla polymerace skončena. Získaná suspenze byla ochlazena na 25 °C, odsáta a promyta čtyřikrát vždy 1 1 vody, třikrát vždy 1 1 methanolu a dvakrát vždy 1 I acetonu během 30 minut, odsáta a při 50 °C a 26,66 kPa se nechala přes nos ve vakuové sušárně pod dusíkem vysušit. Výtěžek činil 75 g, vzhledu zakalených perel s lesklým povrchem. Sypná hmotnost činila 300 g/1. Z toho plyne sypný objem 3,3 ml/g.
b) Parciální zmýdelnění g suchého produktu bylo promyto celkem 150 ml methanolu a roztokem 17,5 g NaOH ve 150 ml vody během 3 hodin při 30 °C, odsáto, neutralizováno v 500 ml methanolu kyselinou octovou, promyto jedenkrát 500 ml methanolu a dvakrát vždy 500 ml acetonu, odsáto, prosáto a vysušeno. Výtěžek činil 34,4 g (= 68,8 hmot.%), vztaženo na polymerizát. Perly byly zakalené a měly lesklý povrch. Sypná hmotnost činila 353 g/1 (počítaný sypný objem 2,8 ml/g).
Sítový rozbor: > 300 pm 19,0 g (55,2 hmot. %), 200 až 300 pm 8,9 g (25,9 hmot. %), 100 až 200 pm 6,1 g (17,9 hmot. %) a 50 až 100 pm 0,4 g (1,2 hmot. %). Stupeň zmýdelnění (IR, vztaženo na mol): 73 %
c) Adice spaceru
10,0g suchého sítového podílu 50 až 200 pm se nechalo nabobtnat 4 hodiny ve 100 ml epichlorhydrinu při 25 °C, potom se zahřívalo 4 hodiny za mírného míchání na 115 °C a po ochlazení na 25 °C se odsálo. Potom se promylo dvakrát, pokaždé 200 ml acetonu, během 30 minut, odsálo se a uschovalo přes noc v sušárně za sníženého tlaku při 50 °C pod dusíkovou vrstvou. Zvážení poskytlo 9,8 g suchého produktu o sypné hmotnosti 315 g a epoxidovém ekvivalentu 350 pmol/g.
Příklad 3 g vlhkých buněk připravených jako v příkladu 3, s aktivitou 30 U/g bylo smíseno a suspendováno ve stejném hmotnostním podílu s 20 mM kaliumfosfátového pufru, pH 8,0. Směs byla za chlazení rozemleta v Dyno-mlýně při době zdržení 3x5 min. Výtěžek aktivity v supematantu po odstředění při 13 000 g činí 60 až 80 %, v průměru je to 210 U. Lehce zakalený surový extrakt byl dialyzován při 20 mM kaliumfosfátového pufru, pH 8,0.
Potom bylo přidáno tolik DEAE-Cellulose od Whatmana, aby byla DAO zcela navázána. Nakonec byl navázaný enzym naplněn do sloupce kolony a DAO byla eludována se stoupající iontovou silou (0-0,5 M NaCl). Aktivní podíly byly spojeny, zahuštěny ultrafiltrací a pufrovány 1 M kaliumfosfátovým pufrem (pH = 8,0). V průměru obsahuje takto přečištěný roztok DAO 25 U/ml.
Příklad 4 ml roztoku získaného podle příkladu 3 se nanese na 1 g VA-Epoxy Biosynth R(RiedeldeHaen) a nechá se uzavřeno stát 3 dny při teplotě místnosti. Enzym se v této době kovalentně váže na nosič obsahující oxiranové skupiny. Potom se imobilizovaný enzym promyje 1 M roztokem NaCl. Vazebná účinnost činí v průměru 0,83. Nepatrná množství jsou v promývací vodě. Imobilizovaný enzym má ca 32 U/g (hmotnost ve vlhkém stavu, Fgw). Skladování se provádí ve 20 mM kaliumfosfátového pufru, který obsahuje 0,02 % azidu sodného, při 4 °C.
Příklad 5
Postupovalo se jako v příkladu 2, avšak jako nosič byl nasazen EupergitR, Riihm, Darstad. Výsledky jsou v tabulce I.
-8CZ 284454 B6
Příklad 6 ml roztoku DAO se diatyzovaly proti 50 mM kaliumfosfátového pufru (pH = 8,6). Pufrovaný roztok s celkem 60 U se inkuboval za účelem ustálení při teplotě místnosti (R.T) po dobu 18 hodin se 2 ml suspenze vinylsepharosy (60 %). Získalo se 1,2 ml sepharosy s 22 U/ml (viz tabulka 1), což odpovídá 43 % vazebného výtěžku. V promývací vodě je 10 U, vypočteno podle hodnot při η 0,51.
Příklad 7 ml roztoku DAO s 3,2 U, který byl dialyzován proti 0,5 M kaliumfosfátového pufru pH 8,7, byl přidán k 0,2 g CNBr-aktivované sepharose (Pharmacia) při teplotě místnosti. Po 90 minutách bylo navázání skončeno a podle výrobního předpisu proběhlo promývání. Přebytečné vazebné skupiny byly inaktivovány glycinem. Výsledek viz tabulka I.
Příklad 8
Enzym imobilizovaný jako v příkladu 4 byl za podmínek uvedených v příkladu 4 uskladněn a každý měsíc byla zjišťována aktivita. V 6 měsících neklesla aktivita více než o 5 %.
Příklad 9
Sodná sůl defalosporinu C (40 mM) byla rozpuštěna při pH 7,3 ve 20 mM kaliumfosfátového pufru a za míchání temporována na 30 °C a sycena kyslíkem. K. roztoku byly přidány 2 % hm. (hm.) imobilizované DAO a násada se prostřednictvím automatického titračního přístroje udržovala na počátečním pH. Po ukončení reakce se roztok vypustí a reaktor znovu naplní. Enzym zůstává v nádobě. Počet reakcí je 120. Reakční doba se volí tak, aby byla umožněna úplná reakce, a činí až asi 40 reakcí 1 hodinu, potom 1,5 až do 90 a konečně 2 h.
Tabulka I: Srovnání nosičů enzymu
| vazebná efektivita | U/g (FGW) | td při 30 °C, pH = 7,3 (η) | |
| Eupergit | 0,71 | 29 | «20 |
| (Rohm) VA-Epoxy | 0,83 | 32 | >40 |
| (Riedel-deHaen) Vinyl-Sepharosa | 0,51 | 22 | « 15 |
| (Kem-en-tec) BrCN-akt. | 0,7 | 6 | « 6 |
| Sepharosa (Pharmacia) |
-9CZ 284454 B6
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (6)
1. Enzymy potažený nosičový materiál, který obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu a porézní perličkový nosičový materiál, přičemž nosičový materiál je tvořen zesíťovaným kopolymerizátem, který v podstatě sestává z vinylacetátových a/nebo vinylalkoholových jednotek a jednotek síťovadla, přičemž jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II
O
II
Rl—Νς—C—;N—R2 (I)
CH2=C
I
X (II) kde
Ri, R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2acyloxyallyl,
A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku,
B ve vzorci II je dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 uhlíkovými atomy a
X znamená acyloxyskupinu, přičemž acyloxyskupinaje zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 hmotn. %, vztaženo na polymer a acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jsou přítomny jako takové, nebojsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxyskupiny, střední velikost částic perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm, vyznačující se tím, že uvedený zesíťovaný kopolymerizát je modifikována spacerem, vybraným ze skupiny zahrnující
N3, OR,
- 10CZ 284454 B6 .OŘ
---(CH2)—CH , kde XOR n je 1 -6,
Rje alkyl s 1-6 uhlíkovými atomy a
Y je NH2> N21 NCO.
2. Nosičovy materiál podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje D-aminokyselinovou oxidázu a katalázu.
3. Způsob přípravy povlečeného nosičového materiálu podle nároku 1, při kterém se roztok, obsahující D-aminokyselinovou oxidázu inkubuje s porézním perličkovým nosičovým materiálem ze síťovaného kopolymerizátu, který je v podstatě tvořen vinylacetátovými a/nebo vinylalkoholovými jednotkami a jednotkami síťovadla, přičemž jednotky síťovadla jsou zabudované sloučeniny obecných vzorců I a/nebo II
O
II
R—N—C—;N—R2 (I)
CH2=C --B (Π) kde
Ri, R2 ve vzorci I mohou být stejné nebo různé a znamenají vinyl, 1-acyloxyvinyl, allyl nebo 2acyloxyallyl,
A představuje dvojvazný uhlovodíkový zbytek se 2 až 8 atomy uhlíku,
B ve vzorci lije dvojvazný uhlovodíkový zbytek s 1 až 8 atomy uhlíku a
X znamená acyloxyskupinu, přičemž acyloxyskupina je zbytek se 2 až 18 atomy uhlíku, množství jednotek síťovadla činí 1 až 60 hmotn. %, vztaženo na polymer a acyloxyskupiny vinylacylátových jednotek jsou přítomny jako takové, nebojsou částečně nebo zcela zmýdelněny na hydroxylové skupiny, střední velikosti částic perel činí 20 až 800 pm a střední průměr pórů činí 2 až 10 000 nm, vyznačující se tím, že uvedený síťovaný kopolymerizát se modifikuje spacerem, vybraným ze skupiny zahrnující
---(CH2)— NH2, kde n je 2-12,
O
---(CH2)—CH—CH2, kde n je 1-8,
- 11 CZ 284454 B6
NH
---(CH2)—CH—CH2. kde
---(CH2)—c^° ,kde
X _0R
---(CH2)ň-CH · kde X0R nje 1-S n je 1-8.
Xje H, OH, halogen,
N3, OR, n je 1-6.
R je alkyl s 1-6 uhlíkovými atomy a
Y je NH2, N2, NCO.
4. Způsob podle nároku 3, pro přípravu nosičového materiálu podle nároku 2, vyzná5 čující se tím, že se používají roztoky obsahující D-aminokyselinou oxidázu a katalázu.
5. Způsob podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že se inkubace provádí při teplotě mezi 0 °C až +40 °C.
10 6. Použití potaženého nosičového materiálu podle nároku 1 nebo 2 pro výrobu derivátů glutaryl-7-aminocefalosporanové kyseliny nebo a-ketoadipinyl-7-aminocefalosporanové kyseliny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4041755 | 1990-12-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS399591A3 CS399591A3 (en) | 1992-11-18 |
| CZ284454B6 true CZ284454B6 (cs) | 1998-12-16 |
Family
ID=6421427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS913995A CZ284454B6 (cs) | 1990-12-24 | 1991-12-20 | Příprava enzymy potaženého nosičového materiálu |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599702A (cs) |
| EP (1) | EP0492495A3 (cs) |
| JP (1) | JPH04365484A (cs) |
| KR (1) | KR920012449A (cs) |
| AU (1) | AU660438B2 (cs) |
| CA (1) | CA2058194A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ284454B6 (cs) |
| MX (1) | MX9102792A (cs) |
| NZ (1) | NZ241116A (cs) |
| TW (1) | TW198064B (cs) |
| ZA (1) | ZA9110119B (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4342770A1 (de) * | 1993-12-15 | 1995-07-06 | Boehringer Mannheim Gmbh | Trägerfixierte Enzyme |
| US5980883A (en) * | 1996-10-02 | 1999-11-09 | Kuraray Co., Ltd. | Polymer gel for medical use |
| CN1515679A (zh) * | 1997-09-09 | 2004-07-28 | ���������ﻯѧ����˾ | 不含酯酶的酶 |
| WO2002086143A2 (en) | 2001-04-19 | 2002-10-31 | Bioferma Murcia, S.A. | Enzymatic process for preparing cephalosporin derivatives |
| CN102417557B (zh) * | 2005-08-03 | 2015-03-11 | 默克专利股份公司 | 亲水交联聚合物 |
| EP1754534A1 (de) * | 2005-08-03 | 2007-02-21 | MERCK PATENT GmbH | Hydrophiles vernetztes Polymer |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1385685A (en) * | 1971-04-21 | 1975-02-26 | Glaxo Lab Ltd | Cephalosporin derivatives |
| DE2911192A1 (de) * | 1979-03-22 | 1980-10-02 | Boehringer Sohn Ingelheim | Neuartiges immobilisiertes glucoseoxidase-katalasepraeparat und seine verwendung zur enzymatischen glucoseoxidation |
| DE3404021A1 (de) * | 1983-05-28 | 1984-11-29 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Makroporoese perlpolymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung |
| DE3344912A1 (de) * | 1983-12-13 | 1985-06-20 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Vernetzte polymerisate, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung |
| SE8500157D0 (sv) * | 1985-01-11 | 1985-01-11 | Mosbach Klaus | Isolation and partial characterization of a d-amino acid oxidase active against cephalosporin c from the yeast trigonopsis variabilis |
| DE3629177A1 (de) * | 1986-08-28 | 1988-03-17 | Hoechst Ag | Vernetzte polymerisate und verfahren zu ihrer herstellung |
| DE3818851A1 (de) * | 1988-06-03 | 1989-12-14 | Hoechst Ag | Neue transaminase, ihre herstellung und ihre verwendung |
| DE4028119C1 (cs) * | 1990-09-05 | 1991-12-05 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De | |
| IT1252308B (it) * | 1990-12-21 | 1995-06-08 | Antibioticos Spa | Procedimento enzimatico per la produzione di acido 7- amminocefalosporanico e derivati |
-
1991
- 1991-11-29 TW TW080109397A patent/TW198064B/zh active
- 1991-12-20 CA CA002058194A patent/CA2058194A1/en not_active Abandoned
- 1991-12-20 AU AU89895/91A patent/AU660438B2/en not_active Ceased
- 1991-12-20 EP EP19910121931 patent/EP0492495A3/de not_active Withdrawn
- 1991-12-20 CZ CS913995A patent/CZ284454B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1991-12-20 NZ NZ241116A patent/NZ241116A/xx unknown
- 1991-12-20 JP JP3337430A patent/JPH04365484A/ja active Pending
- 1991-12-23 ZA ZA9110119A patent/ZA9110119B/xx unknown
- 1991-12-24 MX MX9102792A patent/MX9102792A/es unknown
- 1991-12-24 KR KR1019910024113A patent/KR920012449A/ko not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-05-17 US US08/443,017 patent/US5599702A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5599702A (en) | 1997-02-04 |
| ZA9110119B (en) | 1992-09-30 |
| JPH04365484A (ja) | 1992-12-17 |
| AU8989591A (en) | 1992-06-25 |
| TW198064B (cs) | 1993-01-11 |
| EP0492495A2 (de) | 1992-07-01 |
| CS399591A3 (en) | 1992-11-18 |
| CA2058194A1 (en) | 1992-06-25 |
| MX9102792A (es) | 1992-06-01 |
| AU660438B2 (en) | 1995-06-29 |
| KR920012449A (ko) | 1992-07-27 |
| NZ241116A (en) | 1993-11-25 |
| EP0492495A3 (en) | 1993-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4478976A (en) | Water-insoluble protein material, its preparation and its use | |
| US4266030A (en) | Macroporous polymeric carrier for covalently binding proteins, its preparation and its use for fixing active proteins | |
| US4568706A (en) | Macroporous bead polymers, a process for their preparation and their use | |
| Zaborsky et al. | The immobilization of glucose oxidase via activation of its carbohydrate residues | |
| US4438196A (en) | Immobilization of biocatalysts on granular carbon | |
| CA1154715A (en) | Process for the preparation of copolymers of polysaccharides as supports of enzymatic activity and copolymers thus obtained | |
| CN112662656B (zh) | 酶固定化载体及其制备方法、固定化酶及其制备方法 | |
| US4542069A (en) | Vinylene carbonate polymers, a process for their preparation and their use | |
| CA1173766A (en) | Inulinase | |
| CZ284454B6 (cs) | Příprava enzymy potaženého nosičového materiálu | |
| US4931476A (en) | Crosslinked polymers and a process for their preparation | |
| Hirano et al. | Aminoacylase pellets | |
| JP2719047B2 (ja) | 担体固定化ペニシリンｇアミダーゼ、グルタリル−７−ａｃａアシラーゼ又はｄ−アミノ酸オキシダーゼ | |
| Bahulekar et al. | Immobilization of penicillin G acylase on functionalized macroporous polymer beads | |
| US3981775A (en) | Enzyme insolubilization | |
| US4767620A (en) | Crosslinked polymers with carbonate ester groups, and a process for their preparation | |
| FI103806B (fi) | Menetelmä kefalosporiinijohdannaisten saattamiseksi jatkuvatoimisesti reagoimaan glutaryyli-7-aminokefalosporiinihappojohdannaisiksi | |
| Wójcik et al. | Immobilization of enzymes to porous‐bead polymers and silica gels activated by graft polymerization of 2, 3‐epoxypropyl methacrylate | |
| US5266471A (en) | Solid carriers modified with 2,4,6-trichloro-s triazine to immobilize biomolecules | |
| JPS5810077B2 (ja) | 固定化酵素の製造方法 | |
| CA1104110A (en) | Enzyme-immobilization carriers and preparation thereof | |
| JP2944194B2 (ja) | 固定化酵素の製造法 | |
| Kennedy et al. | Immobilisation of biocatalysts by metal-link/chelation processes | |
| de Silva et al. | The application of radiation-induced processed copolymers to biocatalysis immobilisation | |
| Áabrahám et al. | Immobilized triosephosphate isomerases a comparative study |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 19991220 |