JPS5948080A - 固定化複合酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は、触媒等として用いられる固定化複合酵素の
製法に関する。

近年、酵素は医薬品工業１食品工業等、各種分野で利用
が進みつつある。酵素を触媒とする反応は常温、常圧と
いう緩やかな条件で進行し、しかも、従来の化学反応に
比べ公害の発生する心配がない。さらに、酵素は基質特
異性が優れていることから副反応を生じさせず、反応生
成物の処理等を極端に軽減させるという長所も併せて持
っている。しかし、酵素は水溶性であって、従来では酵
素を水に溶解させた状態で酵素反応を行なうようにして
いたので、反応終了後に反応溶液中から酵素のみを分離
回収し、酵素を再利用することは技術的、こ極めて困難
であった。酵素は高価であるので、酵素を再利用するこ
とができないということは、コスト的に非常に不利であ
る。そこで、このような欠点を除くため、何らかの形で
酵素に修飾を行なって酵素を水不溶性にすること等、酵
素を固定化することが提案された。

これまでに提案された酵素の固定化法は、一般に三つの
方法、すなわち担体結合法、架橋法および包括法に大別
することができる。もつとも普通の場合について述べれ
ば、担体結合法は酵素を担体に結合させて水不溶性とす
る方法、架橋法は酵素を２個もしくはそれ以上の官能基
を有する試薬（架橋剤）と反応させ、酵素同士を架橋剤
で結合さ・υて水不溶性とする方法、包括法は酵素をゲ
ルの微細な格子の中に包み込んだり（格子型）、半透膜
性のポリマーの皮膜によって被覆する（マイクロカプセ
ル型）方法である。

これらの方法で得られた固定化酵素を用いるようにすれ
ば、従来では酵素反応を回分式（ハツチ式）でしか行う
ことができなかったのに対し、連続法で行うことが可能
となる。また、酵素が失活あるいは変性するまで何度も
反応に利用できるので、コスト的にも非常に有利となる
。さらに、酵素の基質特異性を利用して、特定の物質を
検出するセンサをつくることができるようにもなる。

ところで、２段階以上の一連の酵素反応に使用される酵
素の群は複合酵素と呼ばれるが、複数の酵素が複合的に
固定されてなる固定化酵素、すなわち固定化複合酵素が
最近使用されるようになってきた。固定化複合酵素を酵
素反応に用いるようにすると、１種類あれば、１段階の
酵素反応のみならず２段階あるいはそれ以上の段階の酵
素反応も行なうごとができるので、１種類の酵素が固定
された固定化酵素を２種類以上用いるようにする場合に
１ヒベ、非常に便利である。

従来、複合酵素の固定化は、複合酵素をポリマーマトリ
ックス中に１度に包括するという方法がとられていた。

しかしながら、この方法により得られる固定化複合酵素
は、ポリマーマトリックス中で、特定の異種酵素同士の
みが接近したり、特定の酵素が局在したりする等の原因
により、不均一な反応系、すなわち拡散抵抗の大きな反
応系になってしまうことが多く、このことが酵素反応の
反応速度を遅くさせる等種々の問題を生じさせていた。

また、複合酵素の各酵素についての最適の固定化条件が
それぞれ異なることが多いので、一度に全酵素をポリマ
ーマトリックスで包括すると、複合酵素中のいくつかの
酵素が失活あるいは変性し、一連の酵素反応が進まない
、すなわち複合酵素としての活性を示さないというよう
なことも起きることが多かった。

この発明は、このような事情に鑑みなされたもので、基
質の拡散抵抗が小さい等、性能のすぐれた固定化複合酵
素を提供するものである。

すなわち、この発明は、複数の酵素が複合的に固定され
てなる固定化複合酵素であって、前記複数の酵素がいず
れも膜状となって担体表面に積層固定されていることを
特徴とする固定化複合酵素をその要旨とする。以下、こ
の発明の詳細な説明する。

この発明にかかる固定化複合酵素は、複数の酵素（複合
酵素）が順次膜状に積層固定されているので、担体と最
も外の酵素膜の間に他のすべての酵素膜がはさまれ５、
特定の異種酵素同士のみが接近したり、特定の酵素が局
在したりしていない。

したがって、この発明にかかる固定化複合酵素を酵素反
応に使用すると反応速度が速い。また、これをセンサに
使用すると応答速度が速くなる。そして、固定化複合酵
素をつくる場合、酵素を順次膜状に固定するので、各酵
素について最適の固定化条件を用いて固定することがで
きる。したがって、酵素が失活、変性する恐れが少なく
なり、製造された固定化複合酵素が複合酵素としての活
性を示さないというようなことはほとんど起こらなくな
る。

この発明にかかる固定化酵素は、たとえばつぎのように
してつくられる。複合酵素のうちのある酵素をイオン的
、物理的に結合させたのち、担体表面に架橋剤等の試薬
を用いて酵素と担体を架橋あるいは共有結合により固定
し、酵素膜を形成する。つぎに、固定化された酵素と他
の酵素をイオン結合させて、前記酵素膜の外側にざらに
酵素膜を形成させる。このようにすれば２層の酵素膜を
持つ固定化複合酵素が得られる。同様にして順次酵素膜
を形成させれば、３層以上の酵素膜を持つ固定化複合酵
素が得られる。担体としては、篩−ｂｅｒｌｉＬｅ　　
Ｉ　ＲＡ−９４やアミノ化ポリビニルアルコールで被覆
した白金等が使用され、複合酵素としては、たとえば、
グルコースイソメラーゼとインへルターゼの紹合わせ、
あるいは、グルコースオキシダーゼとインベルターゼの
組合わせ等が使用される。架橋剤を使用する場合は、グ
ルクルアルデヒド等が使用される。複合酵素のうちのあ
る酵素をイオン的に結合させる場合は、たとえば、酵素
の等電点に着目してつぎのようにして行うようにすると
よい。ある酵素の等電点ｐＩ、とは異なるｐ　ｌ（の溶
液中に担体とこの酵素を混合すると、ｐＨとｐ　Ｉ、と
いう水素指数（イオン指数）の差によって両者の間にイ
オン結合が生しる。先に固定された酵素に他の酵素をイ
オン的に結合させる場合も同様にして行うことができる
。すなわち、他の酵素の等電点ｐ■２とは異なるｐ　Ｈ
の溶液中に酵素を溶解して酵素溶液をつくる。この酵素
溶液に第１の酵素膜が形成された担体を浸せば、先に固
定された酵素と、他の酵素との間にイオン結合が生し１
．第１の酵素膜の外側に第２の酵素膜が形成される。第
３番目以降の酵素膜も同様にして形成させることができ
る。種類の異なる酵素同士をイオン結合させたあと、架
橋剤等の試薬を用い、両者を架橋あるいは共有結合によ
り固定するようにしてもよい。このようにすると、酵素
が脱離する恐れが少なくなる。

この発明にかかる固定化複合酵素は、このように構成さ
れるものであって、複数の酵素のうちのある酵素が担体
表面に膜状に固定され、その上に他の酵素が順次膜状に
積層固定されてなるので、ごれを酵素反応に用いると反
応速度が速くなり、センサに用いると応答速度が速くな
る。また、製造された固定化複合酵素が複合酵素として
の活性を示さないというようなことはほとんど起こらな
い。

つぎに、実施例および比較例について説明する。

〔実施例１〕 つぎのようにして、担体表面上に２Ｎの酵素膜が形成さ
れてなる固定化複合酵素をつくった。ただし、複合酵素
としてグルコースイソメラーゼとインへルターゼの組合
せを使用し、担体として静−ｂｅｒｌｉｔｅ　　Ｉ　Ｒ
Ａ　　９４を使用した。

グルコースイソメラーゼ３０■をｐ　Ｈ５，０，０，Ｏ
ＩＭの酢酸緩ｆ！ｊ　ｌ夜２０ｍ　ｌに熔解させて酵素
／８／＆をつくった。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　　ｌ　ＲＡ
−９４を充分に洗浄したあと乾燥させ、得られた乾燥物
５ｇを５℃において先につくった酵素／ｇ液液中分岐し
た。つぎに、酵素ン容液を５°Ｃに維持した状態で１５
時間回転攪拌を行い、グルコースイソメラーゼがイオン
的にＡｍｂｅ−ｒｌｉｔｅ　　ＩＲＡ　　９４に固定さ
れてなる第１の固定化標品を得た。固定化されなかった
残余酵素を濾過により除いたあと、第１の固定化標品を
ｐ　Ｈ５，０゜０、ＯＩＭの酢酸緩衝液で充分に洗浄し
た。このあと、第１の固定化標品を１％の冷グルタルア
ルデヒド水溶液中液中に３０分間浸した後、５℃を保っ
た状態で風乾して、グルコースイソメラーゼと担体がイ
オン的に結合されるとともに架橋された第２の固定化標
品を得た。つぎにインへルターゼ３５■をｐＨ５，５，
Ｏ，ＯＩＭの酢酸緩衝液２０ｎ＋１に熔解して酵素溶液
をつくった。この酵素／ｇ液に第２の固定化標品を浸し
、５°Ｃで１２時間インへルターゼの固定化処理を行な
って、インへルターゼがグルコースイソメラーゼにイオ
ン的に結合した第３の固定化標品を得た。この第３の固
定化標品を１％の冷グルタルアルデヒド水溶液中に３０
分間浸した後、風乾して固定化複合酵素を得た。

（９） 実施例１の固定化複合酵素に含まれるのと同量のグルコ
ースイソメラーゼおよびインベルターゼをポリアクリル
アミドゲルで包括して比較例１の固定化複合酵素をつく
った。

実施例１および比較例１の固定化複合酵素を１σ３Ｍの
ショ糖−ｐ　Ｈ５，５，０，０１Ｍ＃酸緩衝液に加えて
酵素反応を行い、酵素活性（反応活性）の経時変化を測
定した。ただし、酵素活性は、固定化複合酵素に固定さ
れたのと同量の酵素の活性を１００とする比活性であら
れした。測定結果を第１表に示す。

第１表 第１表より、実施例１の固定化複合酵素は比較例１のも
のに比べ、酵素活性が高くなっていると（１０） ともに安定していることがわかる。

〔実施例２〕 つぎのようにして、担体表面上に２層の酵素膜が形成さ
れてなる固定化複合酵素をつくった。ただし、複合酵素
としてグルコースオキシダーゼとインへルターゼの組合
せを使用し、担体としてアミノ化ポリビニルアルコール
で被覆された白金板を使用した。

グルコースオキシダーゼ４０■をｐ　Ｈ５，０，０，０
１Ｍの酢酸縁ｆｉ液２Ｑｍｊ！に溶解して酵素溶液をつ
くった。この酵素溶液中にアミノ化ポリビニルアルコー
ルで被覆された白金板（縦５ｍ、横５ｉｎ、厚み７０μ
ｍ）を浸し、５℃に保ちながら１０時間回転攪拌を行っ
た。前記のような処理を行った白金板表面上に２％アル
ブミン水溶液５μｐ、１％グルタルアルデヒド水溶液１
０μｌをそれぞれ塗布し、このあと風乾を行った。イン
ベルターゼ５０ｍｇをｐＨ５，２，０，０１Ｍの酢酸緩
衝液２０ｍ１中に溶解した。

このインへルターゼ溶液中に風乾した白金板を浸し、５
℃に課った状態で１２時間回転攪拌を行った。

（１１） 得られた酵素固定化物（固定化標品）を再び１％の冷グ
ルタルアルデヒド溶液中に約２０分間浸し、つぎに、５
℃に保った状態で風乾を行って固定化複合酵素を得た。

得られた固定化複合酵素をセンサに用いてショ糖溶液（
反応溶液）の濃度の定量を行った。比較例２はグルコー
スオキシダーゼをグルタルアルデヒドを用いて白金板に
固定した固定化酵素と固定化されていないインベルター
ゼの組合せとし、これをセンサに用い、インへルターゼ
をシヨ糖１ｇＷＭ中に溶解させた状態でショ糖溶液の濃
度の定量を行った。実施例２および比較例２をそれぞれ
センサに用いて定量を行ったときの、シヨ糖濃度１０−
３Ｍ、　１０　　Ｍ、　１０　　Ｍ、における応答速度
（秒）および出力電流値（μＡ）を第２表に示す。

（以下余白） （１２） 第２表 第２表より、実施例２を使用した場合は比較例２を使用
した場合に比べ、いずれの濃度においても応答速度が速
く、しかも、出力電流値が高いことがわかる。したがっ
て、実施例２の固定化複合酵素をセンサに用いるように
すると、感度の高いものが得られる。

代理人　弁理士　　松　本　武　彦 （１３）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）複数の酵素が複合的に固定されてなる固定化複合
   酵素であって、前記複数の酵素がいずれも膜状となって
   担体表面に積層固定されていることを特徴とする固定化
   複合酵素。
2. （２）酵素の膜状となっての固定が、イオン結合によっ
   てなされている特許請求の範囲第１項記載の固定化複合
   酵素。
3. （３）　　酵素の膜状となっての固定が、イオン結合と
   架橋結合の併用によってなされている特許請求の範囲第
   １項記載の固定化複合酵素。