JP2005253436A - ポリマー膜を用いるプロテアーゼ活性測定法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】 プロテアーゼ活性を測定する方法であって、(a)プロテアーゼを含有するサンプルをポリマー膜上に付着する工程、(b)プロテアーゼとプロテアーゼ特異的合成基質とを該膜上で反応させる工程、および(c)プロテアーゼと基質との反応により生じるシグナルを測定する工程、を包含する、方法。
【選択図】 なし
Description
以下に、本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての用語は、本発明の属する分野の当業者によって、一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先される。
以下に、本発明の最良の形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のより詳細な理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は、以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
好ましくは、本発明の方法において使用するプロテアーゼは、ニューロプシンである。上述のように、ニューロプシンは、セリンプロテアーゼの一種であり、脳、腎臓、胸腺、皮膚、および子宮などで発現されることが見出されている(Chen,Z−L.et al.,J.Neurosci.,15,5088(1995))。また、ニューロプシンは、その配列相同性からカリクレインファミリーのメンバーであると考えられている。カリクレインは、活性中心にセリン残基を有する点、およびN末端に疎水性のシグナル様配列を有する点で共通している。従って、ニューロプシンを含め、カリクレインファミリープロテアーゼは、分泌タンパク質であり、細胞内機能よりも細胞外機能と深く関わっていると考えられている(Shiosaka,S.et al.,Neurosci.Res.,237,85(2000))。また、カリクレインファミリープロテアーゼは、癌組織において高発現され、血液中または組織液中に分泌されるので、有用な癌マーカーとして注目されている(Diamandis EP,Yousef GM,Luo LY,Magklara A,Obiezu CV,The new human kallikrein gene family:implications in carcinogenesis,Trends Endocrinol Metab.2000;11(2):54−60)。ニューロプシンは、卵巣癌、皮膚癌、および乾癬症、アルツハイマー病、子宮頸癌などにおいて高発現されるのでこれらの疾患の診断マーカーとして注目されている(Cane,S.,Bignotti,E.,Bellone,S.,Palmieri,M.,De las Casas,L.,Roman,J.J.,Pecorelli,S.,Cannon,M.J.,O’Brien,T.and Santin,A.D.,2004,The novel serine protease tumor−associated differentially expressed gene−14(KLK8/Neuropsin/Ovasin) is highly overexpressed in cervical cancer,Am J Obstet Gynecol.190,60−66)。よって、上記疾患を有すると疑われる被験体から組織を得、組織中で発現されたニューロプシンを膜面に付着し、そのプロテアーゼ活性を測定することで、癌の診断を行うことも可能である。プロテアーゼ活性が、通常レベルよりも有意に高い場合、被験体は、上記疾患を有する可能性があると診断される。
マウスより得た海馬スライスを、培養液(ACSF:127mM NaCl、1.6mM KCl、1.24mM KH2PO4、1.3mM MgSO4、2.4mM CaCl2、26mM NaHCO3、10mM グルコース)中に浮遊させ、一定時間後に海馬スライス中および培養液中のニューロプシンタンパク質含有量を測定した。タンパク質含有量は、免疫沈降法によって定量した。その結果を図1に示す。図1に示されるよう、ニューロプシンは、培養開始後わずか30分で培養液中に遊離した。
実施例1のように組織外へ遊離したニューロプシンの膜への付着性について、ニトロセルロース膜およびPVDF膜を用いて検討した。当講座にて調製した、FITC標識したリコンビナントニューロプシンを含有する溶液と、各々の膜を接触させ、付着したニューロプシンの量を、画像解析法を用いて蛍光シグナルを検出することで測定した。次に、両方の膜を、TBS(pH 7.5)で10分、計6回洗浄した後に、同様の手順で蛍光を検出した。その結果を図3に示す。図3に示されるよう、ニューロプシンは、ニトロセルロース膜(図3パネルA)およびPVDF膜(図3パネルC)の両方に付着した。洗浄すると、ニトロセルロース膜に付着したニューロプシンは、大部分が洗い流されたが(図3パネルB)、PVDF膜に付着したニューロプシンは大部分が膜上に残存した(図3パネルD)。これらの結果から、ニューロプシンは、ニトロセルロース膜のような親水性膜よりも、PVDF膜のような疎水性膜により強く付着することが理解できる。本実施例で使用したPVDF膜以外の疎水性膜についても、同様の結果が得られると考えられる。
膜上に付着したニューロプシンが活性を有するか否かを検討するため、リコンビナントニューロプシン1ngをPVDF膜に付着し、膜上でニューロプシン特異的合成基質Val−Pro−Arg−MCA(VPR−MCA)(ペプチド研究所、大阪)と反応させた。合成基質が切断されて生じたAMCの蛍光強度を、F−4500 Fluorescence Spectrophotometer(日立製作所)で測定した(励起波長340nm、測定波長460nm)。これをリコンビナントニューロプシン蛋白質量に換算した。図5は、反応時間(x軸)に対する蛍光強度(y軸)の変化を示す。ニトロセルロース膜とPVDF膜の両方の膜上で、時間と共に、酵素反応により生じた蛍光強度(MCA)が増加した。このことは、両方の膜上で酵素反応が進行した(すなわち、ニューロプシンが両方の膜上に活性を保持したまま付着された)ことを示す。PVDF膜上で生じた蛍光は、18時間後には、ニトロセルロース膜と比較して約2.5倍の強度を示した。従って、酵素活性の面でも、PVDF膜のような疎水性膜が好ましいことがわかる。
PVDF膜上に付着するニューロプシンの量を0、5、10、25、50、および100pgと変化させて合成基質VPR−MCAと反応させ、酵素反応により生じる蛍光(MCA)を測定した。結果を、図7に示す。図7に示されるように、ニューロプシン量の増加に伴い、より鮮明に蛍光が見られるようになった。蛍光強度は、ニューロプシン量が0〜50pgの間で直線性を示した。この結果は、この測定系が、特に、0〜50pgのニューロプシン量で、酵素反応を高感度で検出することを示している。
Claims (8)
- プロテアーゼ活性を測定する方法であって、
プロテアーゼを含有するサンプルをポリマー膜上に付着する工程、
該プロテアーゼと該プロテアーゼ特異的合成基質とを該膜上で反応させる工程、および
該プロテアーゼと該基質との反応により生じるシグナルを測定する工程、
を包含する、方法。 - プロテアーゼ活性を測定する方法であって、
組織切片をポリマー膜と接触させて、該組織から分泌されるプロテアーゼを該膜上に付着する工程、
該プロテアーゼと該プロテアーゼ特異的合成基質とを該膜上で反応させる工程、および
該プロテアーゼと該基質との反応により生じるシグナルを測定する工程、
を包含する、方法。 - 前記プロテアーゼが、カリクレインファミリープロテアーゼである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記カリクレインファミリープロテアーゼが、ニューロプシンである、請求項3に記載の方法。
- 前記ポリマー膜が、PVDF膜である、請求項4に記載の方法。
- 前記合成基質が、Val−Pro−Arg−(4−メチルクマリル−7−アミド)(VPR−MCA)である、請求項4または5に記載の方法。
- 卵巣癌、皮膚癌、子宮頸癌および乾癬症からなる群より選択される少なくとも1つの疾患を診断するためのキットであって:
a)ポリマー膜;および
b)ニューロプシン特異的合成基質であって、ニューロプシンとの酵素反応により検出可能なシグナルを生じるよう標識された基質、
を備え、ここで、上昇したレベルのニューロプシン活性の検出は、被験体が該疾患を有することの指標となる、キット。 - 前記プロテアーゼが、ロイペプチンの存在下で調製される、請求項1ないし請求項6のいずれか1項に記載の方法。
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JPS5948080A (ja) * | 1982-09-14 | 1984-03-19 | Matsushita Electric Works Ltd | 固定化複合酵素 |
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