JPH01500482A - 核酸の配列決定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の配列決定法 本発明は改良された核酸の配列決定法、殊に、しかし排他的でなく、改良された ＤＮＡの配列決定法に関する。

ヌクレオチド配列分析の技術は分子生物学および生物工学において中心的に重要 である。配列決定の現在の方法は王にポリアクリルアミドゲル電気泳動の高い分 解能に基く。この技（＋ｉによると華に華個ヌクレオチドＦＡ基による大きさの 異なる２つのオリゴヌクレオチドをゲルマトリックスとのそれらの異なる相対相 互作用により分解することができる。他の分解法、例えば高速液体クロマトグラ フィー（ＨＰＬＣ）のようなカラムを基にした系が現在研究されている。

核酸中のヌクレオチド例えばＤＮＡの配列を決定するために、普通の１端と鎖に 沿った位置の変動する他端を有する一連のフラグメントが生成される。最少４つ の型の一連のフラグメントが生成され、各群は特定の化学的または酵素的方法に より４つの可能な塩基の１つにより終結されるかまたは切断される。

４塩基のそれぞれで終るかまたは切断されたＤＮＡフラグメントが配列分析のた めに生成される２つのよく知られた方法がある。

マキサムはか（Ｍａｘａｍａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ）　（参照文献１および２） により記載された方法では一本鎖または二本鎖Ｄ　Ｎ　Ａ分子が５′または３′ 端に放射性３２ｐホス　フェートで標識され、ヌクレオチド鎖が特異塩基で化学 的に修飾され、次いでアルカリまたはピペリジン加水分解により切断される。サ ンガー（Ｓａｎｅｅｒ）ほか（参照文献３〜６）の連鎖停止法は制御条件下に鎖 の特定領域を転写するためにＤＮＡポリメラーゼを用いる一本鎖ＤＮＡフラグメ ントの酵素複写を含む。

前記方法はともに配列決定反応の開始前に核酸を抽出および精製することが必要 である。Ｍｉｉｔ、細胞、プラスミドおよびウィルスからの普通のＲＮＡおよび ＤＮＡは、タンパク質コー（・を溶解または消化しく例えば、プロテアーゼ例え ばプロテアーゼに１これはタンパク質コーＩ・を核酸の分解なく消化できる）、 次いで溶媒例えばフェノール−クロロホルムで抽出し、例えばエタノールで沈殿 させることにより抽出され、精製される。溶媒中の懸、濁液からの核酸の分剤は 繰返し遠心分１離することにより達成される。

フェノール−クロロホルム試薬は取扱いに快適でない毒性腐食ｊｉ液体である。

フェノール−クロロホルム抽出後に有機相から水性相を分離することが必要であ る。抽出／精製操作中の遠心分肺段Ｉ：Ａは手動で行なうときに時間がかかって 冗長であり、十分に自動化することが困難である。

本発明は、配列決定前の精製の間の遠心分離段階を排除し、抽出生成物の操作を 減少し、自動化に通ずる核酸例えばＤＮＡの配列決定をする改良法を徒供する。

本発明によれば、改良が精製段階にあり、それは、核酸を保持しそれらをメンプ ラン上その場で、配列決定を直接開始できる状態で与えるフィルターメンプラン を用いる限外濾過により消化懸、濁液からＤＮＡまたはＲＮＡを加圧活性化分離 することを含む。

フィルターメンプランは（ａ）サイズ排除により核酸を保持することができ、お よび（または）（１）１表面結合により核酸を吸着できる。ｆａＪ型のフィルタ ーメンプランの例は異方性低吸着性限外濾過メンプラン例えばアミコン社（ｌｌ ｍｉｃｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により市販されるクイブＹＭメンプラン （米国特許第３，４８８，７６８号）である、（ｂ）型のフィルターメンプラン の例はニトロセルロースメンプランＮＡ４．５（商標）、ＤＥ８１（商標）、ジ ェネスクリーン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）　（商標）、ハイボンド（ｌ（ｙｂｏ ｎｄ）　（商標）などであり、非特異的結合部位を有するフィルターメンプラン はウシ血清テルプミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）または他の不活性物質で部分遮断すること ができる。

核酸の分離および精製に限外濾過を用いる利点はメンプラン上に捕集された物質 をその場でさらに処理できることである。例えば、濾過後、配列決定のために捕 捉核酸を調製するために化学的または酵素的試薬をメンプラン表面に適用するこ とができる。

本発明の方法は次の段階を含む改良されたＵ素配列決定法に使用することができ る： １〕配列決定されるＤＮＡ挿入断片をもつベクターを宿主中で培養する段階、 ２）ＤＮＡ挿入断片を含むヘクター粒子を濾過により宿主から分離する段階、 ３〕ベクターのタンパク質コートをＤ　Ｎ　Ａの分解なく消化するプロテアーゼ を適用する段階、 ４）ＤＮＡを保持するメンプランに通ず加圧活性化限外濾過によりＤＮＡを精製 し！農縮する段階、 ５〕メンプラン上の抽出ＤＮＡにプライマーを加え、アニールする段階、 ６〕重合酵素並びに適当なヌクレオチド混合物をメンプラン上のＤＮＡに適用す る段階、該酵素は感作鋳型上のヌクレオチドの正確な取込みを触媒できるもので ある。

マ〕重合反応を終らせるために必要であれば追跡（ｃｈａｓｅ）ヌクレオチドを 添加する段階、 ８〕反応を終結させ、新合成りＮＡを鋳型から分離する段階、および ９）ＤＩ＝ＪＡ試粗を電気泳動用ポリアクリルアミドゲル上に、または他の分離 系に装荷する段階。

Ｌ記方法において任意の宿主／ヘクター系を用いることができ、その中でベクタ ーＤＮＡが宿主細胞から一般にタンパク質コートした粒子の形態で遊離される。

ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であることができ、ＤＮＡが二本鎖であればストラ ンドを分剤するためにアニーリング前に変性段階が包含されねばならない。選ば れるー、フタ−は配列決定されるＤＮＡフラグメントおよび適当なプライマーハ イブリッド形成部位の両方をもつように取扱わη、ねばならない。殊に適する宿 主は大腸菌（Ｅ、　Ｃｏ１１）であり、適当なベクターはバクテリオファージＭ １３、プラスミドｐＥＭＢＬおよびＦ’　ｌ誘導ヘクターである。

Ａ当なプロテアーゼの例はキモトリプシン、エラスターゼ、ズブチリシンおよび サーモリンである。残留プロテアーゼ活性は反応が完全に進行した後エタノール 洗浄またはプロテアーゼインヒビターの使用により終らせることができる。ある いはプロテアーゼが自己分解活性を有し、従って自己終結であることができる。

触媒作用酵素は、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ例えばＤＮＡポリメラーゼＩま たは逆転写酵素のフレノウフラグメントである。酵素は、プライマーを消化する エキソヌクレアーゼ活性を有すべきでなく、存在すればエキソヌクレアーゼ活性 は分子の５′端における保護基の旬月により遮断することができる。

上記方法をリボヌクレオチドで配列決定に適用すれば、リボヌクレオチドが重合 段階中のデオキシリボヌクレオチドの代りに使用されよう。そのような場合に適 当なＲＮＡポリメラーゼが、おそらくプライマーの必要なく使用されよう。ある いは、ＲＮＡに対する適当なベクターが開発されれば、ＲＮ　Ａを鋳型として使 用できよう。

次に本発明の１態様が華に例として詳細に記載される。実施例はサンガー（Ｓａ ｎｇｅｒ）により記載された連鎖停止法を用いるＤ　Ｎ　Ａ配列決定の改良法の 例示である。

実施例 方法は次の段階を含む： １）ＤＮＡ挿入断片を有するバクテリオファージＭＢを適当な培地中の大腸菌（ Ｅ、　Ｃｏ１１）中で一夜培養する段階、２）細菌を０．２２ミクロンメンプラ ン例えば親水性ズラボア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）　Ｃミリボア（門１１１ｉｐｏｒ ｅ）製〕で濾過することによりファージから分離する段階、細菌はフィルター上 に保たれ、ＤＮＡをもつファージはメンプランを通って捕集容器中へ移る、３） ファージを、タンパク質コートを消化するためにプロテアーゼ、例えばキモ）・ リプシン、とともにインキュベートする段階、４）ファージのＤＮＡを、ＤＮＡ を保持するが消化したクンバク質を保持しないメンプランに通ず加圧活性化限外 濾過により消化したタンパク質から分離する段階、好ましいサイズ排除メンプラ ンはＹＭｌｏ［アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）製〕であり、それは１．　Ｏｋダルト ンより大きいサイズの球状分子を保持する。あるいは吸着性メンプラン例えばニ トロセルロースを用いることができる。フィルターに対する試薬の井特異的結合 は１％ウシ血清アルブミンの添加により防ぐことができる、 ５）プライマーを小滴または噴霧としてフィルターメンプラン上のＤＮＡに加え 、５５〜６５℃で２０分間アニールして特異的ハイブリッド形成させる段階、 ６）予め混合したヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼ■クレノウフラグメントを 小滴または噴霧としてフィルターメンプランに加え、２０℃で１５分間インキュ へ−１・する段階、ヌクレオチドは感作鋳型上に取込まれ、鎖延長によりＤ　Ｎ 　Ａを合成する。ヌクレオチドは標識したヌクレオチドおよび連鎖停止ヌクレオ チドを含むこ７）追跡ヌクレオチドを必要であれば加える段階、８）ホルムアミ ド小滴または噴霧をメンプラン上に置き、反応を終らせるために９０℃で５分間 加熱し、新合成りＮＡを鋳型から分離させる段階、 ９）ＤＮＡ試料を普通のポリアクリルアミドゲル上へ装荷する段階・１０）ＤＮ Ａフラグメントを電気泳動により分離する段階。

参照文献 １、　マキサムほか（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　 Ｗ、　）（１９７７）＋プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ　 Ｓ　Ａ）＋　７４　。

５６０〜５６４゜ ２、　マキサムほか（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　 Ｗ、）　（＋　９８０）＋「酵素学におＩ３る方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）　ｊ　（ウィル（賀ｉ１．Ｒ）繁）＋　６８，４９９頁、 アカデミツク、プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ　ａｎ ｄ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　）。

３、サンガーほか（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ａｒｉｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、 　Ｒ，）（１９７Ｂ）。

ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ　１ｅｔｔ、）　、８７．　１．０７〜１１０゜４ 、サンガーはか（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ ，）　（１９７５）＋ジャーナル、オブ、モレキュラー、バイオロジー（Ｊ、　 Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）。

９４、．４４．１〜４４８゜ ５、サンガーほか（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ−＋　ａｎｄ　Ｎ１ｃｋｌｅｎ、　Ｓ、 　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ　。

Ａ、Ｒ，）　（１９７７）、プロシーデインダス・オブ・ザ・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ）、７４．５４６３〜５４６７゜６、　エアほか（Ａｉｒ、　Ｇ、　Ｍ、 、　Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，）（１９７ ６）、ジャーナル、オブ、モレキュラー、バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、）、１０８．　５１９〜５３３゜特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１００３８４２、発明の名称　核酸の 配列決定法 ３、特許出願人 一 請求の範囲 １、宿主／ヘクター系から配列決定される核酸挿入断片を含むヘクター粒子を回 収し、ヘクター粒子をプロテアーゼで処理してタンパク質汚染物を消化し、消化 生成物を、精製核酸を保持するメンプランに通す■外濾過により除外し、その後 精製核酸をメンプランから取出すことなく処理して次の電気泳動による分離のた めの一連の核酸フラグメントを生成させることを含む＋ＫＨの配列決定法。

２、ＤＮＡに対する改良酵素配列決定法であって、次の段階、１〕配列決定され るＤＮＡ挿入断片をもつヘクターを宿主中で培養する段階、 １ｉ）ＤＮＡ挿入断片を含むヘクター粒子を濾過により宿主から分離する段階、 Ｉ１１〕ベクターのタンパク質コーＩ・をＤＮＡの分解なく消化するプロテアー ゼを通用する段階、 １ｖ）ＤＮＡを保持するメンプランに通す加圧活性化■外濾過によりＤＮＡを精 製し、濃縮する段階、 ■〕メンプラン上の抽出Ｄ　Ｎ　Ａにプライマーを加え、アニールする段階、 ｖｉ）重合酵素並びに適当なヌクレオチド混合物をメンプラン上のＤＮＡに適用 する段階、該酵素は感作鋳型上のヌクレオチドの正確な取込みを触媒できるもの である、ｖｎ〕重合反応を終らせるために必要であれば追跡ヌクレオチドを添加 する段階、 ｖｉａ）反応を終結させ、新合成りＮＡを鋳型がら分離する段階、および 他の分離系に装荷する段階、 を含む方法。

３、　サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の連鎖停止法を用いるＤＮＡ配列決定の改良法 であって、次の段階、 ａ＞ＤＮＡ挿入断片を有するバタテリオファージＭ１３を適当な培地中の大腸菌 （Ｅ、　Ｃｏ１１）中で培養する段階、ｂ）細菌を親水性メンプランで濾過する ことによりファージから分離する段階、 Ｃ）ファージをキモトリプシンプロテアーゼとともにインキュベートする段階、 ｄ）ファージからのＤＮＡを、ＤＮＡを保持するメンプラン（例えば１０にダル トンより大きいサイズの球状分子を保持するサイズ排除メンプランまたはニトロ セルロースのような吸着性メンプラン）に通す加圧活性化限外濾過により精製し ７店縮する段階、 ｅ）プライマーを／ＪＸ？ｉまたは噴霧としてフィルターメンプラン上のＤＮＡ に加え５５〜６５℃で２０分間アニールする段階、ｆ）予め混合したヌク１／オ チドとＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを小滴または噴霧としてフィ ルターメンプランに加え２０℃で１５分間インキュベートする段階、ｇ）追跡ヌ クレオチドを必要であれば加える段階、ｈ）ホルムアミド小滴または噴霧をメン プラン上に置き、９０゛ｃで５分間加熱する段階、 １）ＤＮＡ試料をポリアクリルアミドゲル上に装荷する段階、および ｊ）ＤＮＡフラグメントを電気泳動により分離する段階、を含む方法。

４、実質的に前記された配列決定の改良法。

１、事件の表示　ＰＣＴ／ＧＢ８７１００３８４２、発明の名称　核酸の配列決 定法 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　昭和６３年１１月２２日手続補正書（方式） ％式％ ２、発明の名称　核酸の配列決定法 ３、補正をする者 事件との関係　出願人 ５、補正命令の日付　昭和６３年１１月２２日国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　ＴＯ−正ｙ、ドココひ訣τ１ＯＮｋＬ　５ＸＡＲＣＨ良テＯＲτＯ Ｎ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. １．核酸を保持しそれらをメンブラン上でその場で、配列決定を直接開始できる 状態で与えるフィルターメンプランを用いる限外ろ過により消化懸濁液からＤＮ ＡまたはＲＮＡを加圧活性化分離することを含む精製段階に改良がある改良され た核酸の配列決定法。
2. ２．ＤＮＡに対する改良酵素配列決定法であって、次の段階、ｉ〕配列決定され るＤＮＡ挿入断片をもつベクターを宿主中て培養する段階、 ｉｉ〕ＤＮＡ挿入断片を含むベクター粒子をろ過により宿主から分離する段階、 ｉｉｉ〕ベクターのタンパク質コートをＤＮＡの分解なく消化するプロテアーゼ を適用する段階、 ｉｖ〕ＤＮＡを保持するメンプランに通す加圧活性化限外準過によりＤＮＡを精 製し、濃縮する段階、 ｖ〕メンブラン上の抽出ＤＮＡにプライマーを加え、アニールする段階、 ｖｉ〕重合酵素並びに適当なヌクレオチド混合物をメンブラン上のＤＮＡに適用 する段階、該酵素は感作鋳型上のヌクレオチドの正確な取込みを触媒できるもの である、ｖｉｉ〕重合反応を柊らせるために必要であれば追跡ヌクレオチドを添 加する段階、 ｖｉｉｉ〕反応を終結させ、新合成ＤＮＡを鋳型から分離する段階、および ｉｘ〕ＤＮＡ試料を電気泳動用ポリアクリルアミドゲル上に、または他の分離系 に装荷する段階、 を含む方法。
3. ３．サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の連鎖停止法を用いるＤＮＡ配列決定の改良法で あって、次の段階、 ａ）ＤＮＡ挿入断片を有するバクテリオファージＭ１３を適当な培地中の大腸菌 （Ｅ．Ｃｏｌｉ）中で培養する段階、ｂ）細菌を親水性メンブランでろ過するこ とによりファージから分離する段階、 ｃ）フアージをキモトリプシンプロテアーゼとともにインキュベートする段階、 ｄ）フアージからのＤＮＡを、ＤＮＡを保持するメンブラン（例えば１０ｋダル トンより大きいサイズの球状分子を保持するサイズ排除メンブランまたはエトロ セルロースのような吸着性メンブラン）に通す加圧活性化限外ろ過により精製し 濃縮する段階、 ｅ）プライマーを小滴または噴霧としてフイルターメンブラン上のＤＮＡに加え ５５〜６５℃で２０分間アニールする段階、ｆ）予め混合したヌクレオチドとＤ ＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントを小滴または噴霧としてフィルターメ ンブランに加え２０℃で１５分間インキュベートする段階、ｇ）追跡ヌクレオチ ドを必要であれば加える段階、ｈ）ホルムアミド小滴または噴霧をメンブラン上 に置き、９０℃で５分間加熱する段階、 ｉ）ＤＮＡ試料をポリアクリルアミドゲル上に装荷する段階、および ｊ）ＤＮＡフラグメントを電気泳動により分離する段階、を含む方法。
4. ４．実質的に前記された配列決定の改良法。