CN105420817A - 一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片，包括固定在固相载体上的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针和阳性质控。本发明还公开了采用该基因芯片对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒和猪链球菌进行检测的方法。本发明的基因芯片实现了高效检测，一次性针对10种猪源病原微生物，大大提高了检测效率。此外，本发明的基因芯片敏感性高、特异性强。
Description
技术领域
本发明涉及猪疫病病原微生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片及其检测方法。
背景技术
随着规模化养猪业迅猛发展，猪病的发生对规模化养猪生产的危害日趋加重，特别是传染性疾病，成为严重影响我国规模化养猪业健康、稳定发展的主要疫病。我国猪病的种类越来越多，而且近几年新增疫病不少，疾病的复杂程度不断加剧，甚至老病新病混合感染，导致发病率和死亡率明显上升，致使猪场在经济上遭受重大损失。在临床上，猪病以病原体的多重感染或混合感染为主要流行形式，猪群发病往往不是以单一病原体所致，而是以两种或多种病原体相互协同作用所造成的，常常导致猪群的高发病率和高死亡率，危害极其严重，而且控制难度加大。继发感染现象在规模化猪场也十分普遍，特别是在猪群存在一些原发性感染(如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒等)情况下，一旦应激因素和饲养管理不良，就很容易发生继发感染。这种情况在猪呼吸道疾病中，表现得最为明显。猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型感染猪群可继发猪链球菌病、仔猪副伤寒、副猪嗜血杆菌感染、猪传染性胸膜肺炎等。猪群感染传染病之后，多病原混合感染和继发感染现象的存在，增加了临床诊断的难度，因此在实验室进行病原检测，成为诊断猪群疫病感染行之有效的方法。目前对猪源疾病的诊断，多采用病原分离及常规的血清学方法，但病原分离不仅费时费力，而且敏感性和特异性都较差，血清学诊断方法也因实验室条件和诊断方法的不同而产生不同的差异；虽然已有PCR诊断方法应用于病毒检测，但需分别进行诊断。因此，研发一种快速、准确、灵敏、特异性好且能够同时检出多种病原微生物的基因芯片，对养猪业疫情预警与防控，具有十分重要的指导意义和应用价值。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片及其检测方法。该基因芯片能够同时对10种猪疾病病原微生物实现快速、特异、灵敏的检测。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片，包括固定在固相载体上的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针和阳性质控；
所述寡核苷酸探针分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针、猪瘟病毒探针、猪副嗜血杆菌探针、猪流感病毒探针、猪肺炎支原体探针、猪圆环病毒Ⅱ型探针、猪细小病毒探针、猪蓝耳病毒探针、猪伪狂犬病病毒探针和猪链球菌探针，其分别相应于SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列；
所述阳性质控为美国INDVER公司提供的生物素标记的阳性质控基因片段；用于监控基因芯片检测方法的有效性。
所述固相载体为带有正电荷的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜。综合考虑上述固相载体的使用效果、使用方便性、储存方便性及保质期等因素，本发明优选玻璃片作为固相载体。
上述基因芯片，其阳性质控呈“T”字型分布；与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针呈微阵列分布。
上述基因芯片的制备方法，步骤为：将寡核苷酸探针点样在固相载体上，点好样的固相载体在长波紫外灯下进行交联；同时将阳性质控点样在固相载体上，即制得基因芯片。
本发明还提供了用于特异性扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒和猪链球菌病原微生物特定保守核苷酸序列的引物，其分别相应于SEQIDNO.11至SEQIDNO.30所示的序列。
上述用于特异性扩增的引物序列，具体如下：
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌：F:5＇GCGGTAATGGCGATGACAC3＇(SEQIDNO.11)
R：5＇TCGATATCTCTTGCGCGGTTA3＇(SEQIDNO.12)
猪瘟病毒：F:5＇GACTAGCAAACGGAGGGACTA3＇(SEQIDNO.13)
R：5＇GCCAGGGTTAAGGTGTGTCT3＇(SEQIDNO.14)
猪副嗜血杆菌：F:5＇TGATGAGGAAGGGTGGTGTTT3＇(SEQIDNO.15)
R：5＇TACGCCCAGTCATTCCGATTA3＇(SEQIDNO.16)
猪流感病毒：F:5＇TTATGCTGGAGCAAACAGC3＇(SEQIDNO.17)
R：5＇ACATAGGCATCTGCATTTTGG3＇(SEQIDNO.18)
猪肺炎支原体：F:5＇GTGATGGGTGAACATGGTGAT3＇(SEQIDNO.19)
R：5＇GTGAAATCCGTATTCTCCTCGTA3＇(SEQIDNO.20)
猪圆环病毒Ⅱ型：F:5＇AGGTTTGGGGGTAAAGTAGC3＇(SEQIDNO.21)
R：5＇CTCTGTGCCCTTTGAATACTA3＇(SEQIDNO.22)
猪细小病毒：F:5＇CAGAATCAGCAACCTCACCAC3＇(SEQIDNO.23)
R：5＇GGGATCTGTTTGTTTGCCATGA3＇(SEQIDNO.24)
猪蓝耳病毒：F:5＇ATGAGTGAACCCGTACTTGTG3＇(SEQIDNO.25)
R：5＇GTTCTGCGATGGTGCTAGG3＇(SEQIDNO.26)
猪伪狂犬病病毒：F:5＇GTTCAACGAGGGCCAGTACC3＇(SEQIDNO.27)
R：5＇TGAAGCTGTCGTCGCTCCA3＇(SEQIDNO.28)
猪链球菌：F:5＇AGCAGTTCGCACGGACAT3＇(SEQIDNO.29)
R：5＇GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA3＇(SEQIDNO.30)
本发明还提供了一种非诊断目的的检测猪疫病病原微生物的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的总RNA，作为模板，采用RT-PCR扩增，以SEQIDNO.11至SEQIDNO.30所示的序列为扩增引物，并对扩增引物采用生物素标记；
(2)将RT-PCR过程中完成的生物素标记的产物进行双链解离，然后与基因芯片进行杂交；
(3)杂交后，通过试剂的添加，完成待测病原微生物核苷酸片段生物素、亲和素及化学发光基团的结合，通过芯片读取仪(INDVER公司，美国)，实现光激活状态下的化学反应，根据芯片上的颜色变化判断检测结果。
步骤(1)中，RT-PCR反应体系的组成为：
步骤(1)中，RT-PCR扩增的程序为：
1)45℃30min；
2)95℃2min；
3)95℃15s；
4)56℃40s；
5)72℃15s；
6)回到第3)步，重复40次。
步骤(1)中，采用维生素H对扩增引物进行生物素标记。
本发明的有益效果：
本发明的基因芯片实现了高效检测，一次性针对10种猪源病原微生物，大大提高了检测效率；实现了RNA病毒、DNA病毒和细菌在同一反应体系中的扩增，节约了时间，避免了常规检测方法的反复操作；敏感度高，样品中核酸含量为pg级同样可以检出；特异性强，本发明中设计的引物与探针均具有高度保守性和专属性，同时对芯片的布局设立三个重复，有效避免了非特异性结果的出现。
附图说明
图1：为本发明的基因芯片模式图，B系列呈“T”字型，标红处为阳性参照点，1系列点为3个平行的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针点，2系列点为3个平行的猪瘟病毒探针点，3系列点为3个平行的猪副嗜血杆菌探针点，4系列点为3个平行的猪流感探针点，5系列点为3个平行的猪肺炎支原体探针点，6系列点为3个平行的猪圆环病毒Ⅱ型探针点，7系列点为3个平行的猪细小病毒探针点，8系列点为3个平行的猪蓝耳病毒探针点，9系列点为3个平行的猪伪狂犬病毒探针点，10系列点为3个平行的猪链球菌探针点；
图2：猪瘟病毒(CSFV)检测结果；
图3：猪蓝耳病毒(PRRSV)检测结果；
图4：猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)检测结果；
图5：猪副嗜血杆菌(HPS)检测结果；
图6：猪伪狂犬病病毒(PRV)检测结果；
图7：猪蓝耳病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)检测结果。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1：基因芯片的制备
将设计的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针点样在带有正电荷的玻璃片(AMI公司，美国)上，点好样的玻璃片在长波紫外灯下进行交联10min左右，同时将0.2μL标记有生物素的阳性质控也点在每张玻璃片上。阳性质控的分布呈“T”字型，与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针呈微阵列分布。该基因芯片的模式图如图1所示。
与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针的序列如下：
(1)猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针
SEQIDNO.1：5＇gcaAAGGTAATGATATTCTAAgaggt
(2)猪瘟病毒探针
SEQIDNO.2：5＇GGTGGTCTAAGTCCTGAGtacag
(3)猪副嗜血杆菌探针
SEQIDNO.3：5＇cgttAGTCACAGAAGAAGCACC
(4)猪流感病毒探针
SEQIDNO.4：5＇gTACTGACCAACAAACTCTcta
(5)猪肺炎支原体探针
SEQIDNO.5：5＇cCGGGCTTATGAAATTATTaa
(6)猪圆环病毒Ⅱ型探针
SEQIDNO.6：5＇CATAGGTGAGGGCTGTGGc
(7)猪细小病毒探针
SEQIDNO.7：5＇CACACCAGCAGCACCTAGaagt
(8)猪蓝耳病毒探针
SEQIDNO.8：5＇cTGACGCACCAGGATGAGC
(9)猪伪狂犬病病毒探针
SEQIDNO.9：5＇tGAACATCCTCACCGACTTcat
(10)猪链球菌探针
SEQIDNO.10：5＇cacagATCCAGATAGCGACATTC
实施例2：用于特异性扩增待检致病病原微生物特定保守核苷酸序列的引物的筛选
用于特异性扩增的引物的有效设计是决定实验成功的最关键环节。目前虽有一些设计引物的软件和设计引物的一些基本原则，但根据这些设计软件和设计原则，可以设计出多条不同的引物序列，而采用不同的引物序列会产生不同的效果，个别碱基的替换或增减都会对试验结果产生重要影响。因此，对于扩增引物的设计并非是常规的软件设计所能得到的。本实施例中，用于特异性扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒和猪链球菌病原基因最初设计有30对引物序列，具体如下：
NO.1-1-1：5＇GCGGTAATGGCGATGACAC
NO.1-1-2：5＇TCGATATCTCTTGCGCGGTTA
NO.1-2-1：5＇GCGGTAATGGCGATGACACCC
NO.1-2-2：5＇TCGATATCTCTTGCGCGGTTATCA
NO.1-3-1：5＇GCGGTAATGGCGATGA
NO.1-3-2：5＇TCGATATCTCTTGCGCGG
NO.2-1-1：5＇GACTAGCAAACGGAGGGACTA
NO.2-1-2：5＇GCCAGGGTTAAGGTGTGTCT
NO.2-2-1：5＇GACTAGCAAACGGAGGGACTAGCC
NO.2-2-2：5＇GCCAGGGTTAAGGTGTGTCTTGGG
NO.2-3-1：5＇GACTAGCAAACGGAGGG
NO.2-3-2：5＇GCCAGGGTTAAGGTGTGT
NO.3-1-1：5＇TGATGAGGAAGGGTGGTGTTT
NO.3-1-2：5＇TACGCCCAGTCATTCCGATTA
NO.3-2-1：5＇TGATGAGGAAGGGTGGTGTTTTAA
NO.3-2-2：5＇TACGCCCAGTCATTCCGATTAACGC
NO.3-3-1：5＇TGATGAGGAAGGGTGGTGT
NO.3-3-2：5＇TACGCCCAGTCATTCCGATT
NO.4-1-1：5＇TTATGCTGGAGCAAACAGC
NO.4-1-2：5＇ACATAGGCATCTGCATTTTGG
NO.4-2-1：5＇TTATGCTGGAGCAAACAGCTTCT
NO.4-2-2：5＇ACATAGGCATCTGCATTTTGGTAG
NO.4-3-1：5＇TTATGCTGGAGCAAAC
NO.4-3-2：5＇ACATAGGCATCTGCATT
NO.5-1-1：5＇GTGATGGGTGAACATGGTGAT
NO.5-1-2：5＇GTGAAATCCGTATTCTCCTCGTA
NO.5-2-1：5＇GTGATGGGTGAACATGGTGATCTTT
NO.5-2-2：5＇GTGAAATCCGTATTCTCCTCGTAAAT
NO.5-3-1：5＇GTGATGGGTGAACATGGT
NO.5-3-2：5＇GTGAAATCCGTATTCTCCT
NO.6-1-1：5＇AGGTTTGGGGGTAAAGTAGC
NO.6-1-2：5＇CTCTGTGCCCTTTGAATACTA
NO.6-2-1：5＇AGGTTTGGGGGTAAAGTAGCGGG
NO.6-2-2：5＇CTCTGTGCCCTTTGAATACTACAG
NO.6-3-1：5＇AGGTTTGGGGGTAAAG
NO.6-3-2：5＇CTCTGTGCCCTTTGAATA
NO.7-1-1：5＇CAGAATCAGCAACCTCACCAC
NO.7-1-2：5＇GGGATCTGTTTGTTTGCCATGA
NO.7-2-1：5＇CAGAATCAGCAACCTCACCACCAAC
NO.7-2-2：5＇GGGATCTGTTTGTTTGCCATGAGTG
NO.7-3-1：5＇CAGAATCAGCAACCTCACC
NO.7-3-2：5＇GGGATCTGTTTGTTTGCCAT
NO.8-1-1：5＇ATGAGTGAACCCGTACTTGTG
NO.8-1-2：5＇GTTCTGCGATGGTGCTAGG
NO.8-2-1：5＇ATGAGTGAACCCGTACTTGTGCCC
NO.8-2-2：5＇GTTCTGCGATGGTGCTAGGGGG
NO.8-3-1：5＇ATGAGTGAACCCGTACTT
NO.8-3-2：5＇GTTCTGCGATGGTGCTA
NO.9-1-1：5＇GTTCAACGAGGGCCAGTACC
NO.9-1-2：5＇TGAAGCTGTCGTCGCTCCA
NO.9-2-1：5＇GTTCAACGAGGGCCAGTACCGGC
NO.9-2-2：5＇TGAAGCTGTCGTCGCTCCAGCA
NO.9-3-1：5＇GTTCAACGAGGGCCAGT
NO.9-3-2：5＇TGAAGCTGTCGTCGCTCC
NO.10-1-1：5＇AGCAGTTCGCACGGACAT
NO.10-1-2：5＇GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA
NO.10-2-1：5＇AGCAGTTCGCACGGACATCCTTT
NO.10-2-2：5＇GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA
NO.10-3-1：5＇AGCAGTTCGCACGGAC
NO.10-3-2：5＇GACCCATTTGGACCATCTAA
在同一个RT-PCR反应体系中对上述引物的扩增效率进行测试，结果发现，针对每种病原体的不同引物对，扩增效率差别明显，根据扩增条带的亮度大小，最终确定适用的10对扩增引物如下：
NO.1-1-1：5＇GCGGTAATGGCGATGACAC；(SEQIDNO.11)
NO.1-1-2：5＇TCGATATCTCTTGCGCGGTTA；(SEQIDNO.12)
NO.2-1-1：5＇GACTAGCAAACGGAGGGACTA；(SEQIDNO.13)
NO.2-1-2：5＇GCCAGGGTTAAGGTGTGTCT；(SEQIDNO.14)
NO.3-1-1：5＇TGATGAGGAAGGGTGGTGTTT；(SEQIDNO.15)
NO.3-1-2：5＇TACGCCCAGTCATTCCGATTA；(SEQIDNO.16)
NO.4-1-1：5＇TTATGCTGGAGCAAACAGC；(SEQIDNO.17)
NO.4-1-2：5＇ACATAGGCATCTGCATTTTGG；(SEQIDNO.18)
NO.5-1-1：5＇GTGATGGGTGAACATGGTGAT；(SEQIDNO.19)
NO.5-1-2：5＇GTGAAATCCGTATTCTCCTCGTA；(SEQIDNO.20)
NO.6-1-1：5＇AGGTTTGGGGGTAAAGTAGC；(SEQIDNO.21)
NO.6-1-2：5＇CTCTGTGCCCTTTGAATACTA；(SEQIDNO.22)
NO.7-1-1：5＇CAGAATCAGCAACCTCACCAC；(SEQIDNO.23)
NO.7-1-2：5＇GGGATCTGTTTGTTTGCCATGA；(SEQIDNO.24)
NO.8-1-1：5＇ATGAGTGAACCCGTACTTGTG；(SEQIDNO.25)
NO.8-1-2：5＇GTTCTGCGATGGTGCTAGG；(SEQIDNO.26)
NO.9-1-1：5＇GTTCAACGAGGGCCAGTACC；(SEQIDNO.27)
NO.9-1-2：5＇TGAAGCTGTCGTCGCTCCA；(SEQIDNO.28)
NO.10-1-1：5＇AGCAGTTCGCACGGACAT；(SEQIDNO.29)
NO.10-1-2：5＇GACCCATTTGGACCATCTAAGTAA；(SEQIDNO.30)
实施例3：基因芯片的特异性验证
样本：特定的病毒和细菌培养液(特定的病毒和细菌分别为：猪瘟病毒、猪蓝耳病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪副嗜血杆菌和猪伪狂犬病病毒)。
1样品处理
离心100mL细菌培养液，生理盐水重悬后，加入冻干保护剂(5％的脱脂奶粉)，冻干保存；取10mL的病毒培养液，加入冻干保护剂(5％的脱脂奶粉)，冻干保存。
2总RNA提取
各取细菌和病毒冻干样品，PBS重悬至50-100μL，使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN，德国)，按照说明书进行操作。
3RT-PCR扩增
以实施例2优化得到的引物作为特异性扩增引物，并对特异性扩增引物进行生物素标记(以维生素H进行标记)，标记的方法按照生物素标记PCR引物试剂盒(上海胜隆，中国)说明书进行。
构建一步法RT-PCR反应体系，体系中含有作为扩增模板的总RNA、RNA酶抑制剂、MgCl2、dNTPs、生物素标记的特异性引物、反转录酶以及聚合酶等。设定反转录时间为30分钟，使总RNA反转录成cDNA，在DNA聚合酶的作用下，完成多重PCR。
RT-PCR反应体系各组分构成比例如下：
核酸扩增程序为：
(1)45℃30min
(2)95℃2min
(3)95℃15s
(4)56℃40s
(5)72℃15s
(6)回到第(3)步，重复40次
4PCR产物的双链解离
向20μLPCR产物中添加10单位酶活性的LambdaDNA酶，37℃作用10min进行DNA双链解离。
5杂交
在解离产物中加入等量的杂交缓冲液，混匀后，滴加到玻璃片上，室温下杂交1h。
6洗涤
将杂交后的玻璃片分别用洗涤液A、B、C和D(INDVER公司，美国)淋洗，晾干。
7标记
杂交斑点的标记与显色按照INDVER公司生物素-亲和素标记与检测试剂盒说明书进行。
8结果判读
结果如图2-6所示，玻璃片上阳性参照和猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪副嗜血杆菌(HPS)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的血红色斑点为阳性杂交结果，表明芯片上的探针已检出样品中所含有的特异性序列，继而判断检测出相应的病原体。
实施例4基因芯片对临床样本的检测
样本：病死仔猪的脾脏
1样品处理
将样品研磨后，混匀处理。
2总核酸提取
取PBS重悬的样品50-100μL，使用总RNA提取试剂盒(TIANGEN，德国)，按照说明书进行操作。
3一步法RT-PCR扩增
一步法RT-PCR反应体系同实施例3。
核酸扩增程序为：
(1)45℃30min
(2)95℃2min
(3)95℃15s
(4)56℃40s
(5)72℃15s
(6)回到第(3)步，重复40次
4PCR产物的双链解离
向20μLPCR产物中添加10单位酶活性的LambdaDNA酶，37℃作用10min进行DNA双链解离。
5杂交
在解离产物中加入等量的杂交缓冲液，混匀后，滴加到玻璃片上，室温下杂交1h。
6洗涤
将杂交后的玻璃片分别用洗涤液A、B、C和D(INDVER公司，美国)淋洗，晾干。
7标记
杂交斑点的标记与显色按照INDVER公司生物素-亲和素标记与检测试剂盒(INDVER公司，美国)说明书进行。
8结果判读
结果如图7所示，玻璃片上阳性参照和猪蓝耳病毒(PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的血红色斑点为阳性杂交结果，表明芯片上的探针已检出样品中所含有的特异性序列，继而判断检测出相应的病原体。
采用本发明的基因芯片检测猪10种常见原发性病毒疾病和继发性细菌性疾病，试验结果显示该检测方法特异性强，无假阳性和假阴性的结果。
Claims (10)
1.一种用于检测猪疫病病原微生物的基因芯片，其特征在于，包括固定在固相载体上的与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针和阳性质控；
所述寡核苷酸探针分别为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌探针、猪瘟病毒探针、猪副嗜血杆菌探针、猪流感病毒探针、猪肺炎支原体探针、猪圆环病毒Ⅱ型探针、猪细小病毒探针、猪蓝耳病毒探针、猪伪狂犬病病毒探针和猪链球菌探针，其分别相应于SEQIDNO.1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的序列。
2.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为带有正电荷的玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜或尼龙膜。
3.如权利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述固相载体为带有正电荷的玻璃片。
4.如权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，其阳性质控呈“T”字型分布；与待检致病病原微生物相对应的寡核苷酸探针呈微阵列分布。
5.权利要求1至4任一项所述的基因芯片的制备方法，其特征在于，步骤为：将寡核苷酸探针点样在固相载体上，点好样的固相载体在长波紫外灯下进行交联；同时将阳性质控点样在固相载体上，即制得基因芯片。
6.用于特异性扩增猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪肺炎支原体、猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪蓝耳病毒、猪伪狂犬病病毒和猪链球菌病原微生物特定保守核苷酸序列的引物，其特征在于，其分别相应于SEQIDNO.11至SEQIDNO.30所示的序列。
7.一种非诊断目的的检测猪疫病病原微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检样品中的总RNA，作为模板，以SEQIDNO.11至SEQIDNO.30所示的序列为扩增引物进行扩增，并对扩增引物采用生物素标记；
(2)将扩增过程中完成的生物素标记的产物进行双链解离，然后与权利要求1所述的基因芯片进行杂交；
(3)杂交后，通过试剂的添加，完成待测病原微生物核苷酸片段生物素、亲和素及化学发光基团的结合，在光激活状态下进行化学反应，通过芯片上的颜色变化判断检测结果。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增的反应体系的组成为：浓度为1U/μL的RNA酶抑制剂1μL、浓度为3U/μL的反转录酶0.5μL、浓度为5U/μL的TaqDNA聚合酶0.3μL、浓度为10μmol/LSEQIDNO.(11-30)F:混合液0.6μL、浓度为10μmol/LSEQIDNO.(11-30)R:混合液0.6μL、浓度为20mmol/LMgCl25μL、浓度为2.5mmol/LdNTPs2μL、模板2μL、双蒸水13μL。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，扩增的程序为：
(1)45℃30min
(2)95℃2min
(3)95℃15s
(4)56℃40s
(5)72℃15s
(6)回到第(3)步，重复40次。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用维生素H对扩增引物进行生物素标记。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110885899A (zh) * | 2018-09-10 | 2020-03-17 | 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） | 用于鉴别16种禽病病原冻干微芯片、试剂盒及方法 |
| CN114317816A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-04-12 | 台州市药品检验研究院 | 一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102943129A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-02-27 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针 |
| CN104293980A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒 |
| CN104328218A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-02-04 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法 |
| CN105063760A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-18 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于七种猪病病原鉴定的基因芯片及其检测方法 |
| CN105063237A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-18 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法 |
-
2015
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102943129A (zh) * | 2012-11-30 | 2013-02-27 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 一种用于同时检测5种猪病病毒的多重连接探针扩增检测试剂盒及引物和探针 |
| CN104293980A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-21 | 四川农业大学 | 检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒 |
| CN104328218A (zh) * | 2014-10-30 | 2015-02-04 | 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 同步检测五种猪病毒的液相基因芯片的核酸及其检测方法 |
| CN105063760A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-18 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于七种猪病病原鉴定的基因芯片及其检测方法 |
| CN105063237A (zh) * | 2015-08-07 | 2015-11-18 | 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 用于六种猪病病原鉴别的基因芯片及其检测方法 |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110885899A (zh) * | 2018-09-10 | 2020-03-17 | 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） | 用于鉴别16种禽病病原冻干微芯片、试剂盒及方法 |
| CN110885899B (zh) * | 2018-09-10 | 2023-04-14 | 中国动物疫病预防控制中心（农业部屠宰技术中心） | 用于鉴别16种禽病病原冻干微芯片、试剂盒及方法 |
| CN114317816A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-04-12 | 台州市药品检验研究院 | 一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒 |
| CN114317816B (zh) * | 2021-10-28 | 2023-09-01 | 台州市药品检验研究院 | 一种同时检测复可托原料及其产品中六种猪常见病毒的试剂盒 |
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Denomination of invention: Gene chip and method for detecting pathogenic microorganisms of porcine epidemic disease Effective date of registration: 20180413 Granted publication date: 20180109 Pledgee: Bank of Tai'an Limited by Share Ltd Pledgor: Shandong Baolai-leelai Bio-engineering Co., Ltd. Registration number: 2018370000070 |
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