CN104293980A

CN104293980A - 检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN104293980A
Application number: CN201410515902.9A
Authority: CN
Inventors: 文心田; 黄小波; 曹三杰; 姜来生; 文翼平; 伍锐; 黄宁; 胡中凯; 肖驰; 张焕容
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2014-09-29
Publication date: 2015-01-21

Abstract

本发明公开了一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，它包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片。本发明检测试剂盒可以准确、有效的检测繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和猪流行性乙型脑炎病毒，且特异性强、灵敏度高、耗时短，检测快速，应用前景良好。

Description

检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。

背景技术

多病原混合感染是当前猪场疫病的普遍现象，猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪流行性乙型脑炎这三种猪病毒引起的疾病症状相似且常常呈混合感染,是当前危害养猪业的3种重要病毒性疾病，因此早期鉴别诊断并及时了解流行状况对控制这3种病的流行显得尤其重要。目前对这3种病的诊断多采用病原的分离及常规的血清学方法，但需时间较长。最近国外和国内均建立了病原的分离鉴定、免疫胶体金技术、酶联免疫吸附试验、血清中和实验、聚合酶链反应等，但是还不能更加快速的检测多种病原的混合感染。

基因芯片技术是近年来新兴起的一种生物高新技术，该技术可以同时定量或定性的检测成千上万个基因信息，具有无选择性、客观、高通量的特点。基因芯片计划开展后,许多部门、大学、重点实验室及制药公司参与了该项目的研发,我国相继也成立了一大批基因芯片公司。随着基因组数据的增长以及分子生物学相关学科的快速发展,基因芯片技术得到迅猛发展和广泛应用。但生物芯片技术发展时间较短，很多技术还处于初级研发阶段，要成为实验室研究或临床可以普遍采用的技术仍有诸多关键问题亟待解决。(1)基因芯片的特异性的提高；(2)增加信号检测的灵敏度；(3)简化样品制备和标记操作；(4)设备与操作人员的要求较高；(5)应用标准的统一。

目前，昊时友等，“猪病毒性繁殖障碍综合征基因芯片诊断方法的建立”，中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次学术研讨会，2007年公开了检测日本乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒等6种病毒的基因芯片，但是该文件中没有芯片灵敏度试验，不能说明其可以灵敏地检出乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的可同时检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。

本发明检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，它包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片；

扩增猪流行性乙型脑炎病毒基因的试剂包括SEQ ID NO：7～8和/或SEQID NO：9～10所示引物对；扩增猪瘟病毒基因的试剂包括SEQ ID NO：11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对；扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒基因的试剂包括SEQ ID NO：15～16和/或SEQ ID NO：17～18所示引物对；引物对中，上游引物与下游引物的比例是1:1；

所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的探针；其中，探针包括SEQ ID NO：1或2所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，SEQ ID NO：3或4所示任意一个或者两个寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO：5或6所示任意一个或者两个寡核苷酸片段。

优选地，所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。进一步优选地，所述荧光染料为Cy3荧光染料或者Cy5荧光染料。

优选地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：20～21所示引物对；所述基因芯片还包括定位探针，定位探针是SEQ ID NO：19所示的基因片段。

优选地，所述固相载体为氨基化基片。

本发明提供了SEQ ID NO：7～8和/或SEQ ID NO：9～10所示引物对、SEQ ID NO：11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对以及SEQ ID NO：15～16和/或SEQ ID NO：17～18所示引物对，与SEQ ID NO：1或2所示任意一个或者两个基因片段、SEQ ID NO：3或4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQ ID NO：5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；

所述引物对为扩增试剂，上游引物与下游引物的摩尔比是1:1；SEQ IDNO：1～6所示基因片段为检测探针。

优选地，所述试剂盒还包括SEQ ID NO：20～21所示引物对以及SEQ IDNO：19所示的定位探针。

优选地，所述探针固定在氨基化基片上。

本发明试剂盒可以有效检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，敏感性高，三种病毒的最低检测浓度均为20pg/μl，特异性强，耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明权利要求书记载的内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1基因芯片四个重复检测区的分布及矩阵排列情况；

图2两种点样针点样效果；

图3不同点样缓冲液点样效果；

图4不同湿度下点样效果；

图5不同靶基因浓度和探针浓度对杂交信号强度的影响；

图6不同烘焙时间处理结果；

图7不同水合时间处理结果；

图8不同紫外交联时间处理结果；

图9基因芯片检测PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV、PEDV、TGEV的扫描结果。

具体实施方式

一、实验材料和仪器

毒株：

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株、猪瘟病毒(CSFV)毒株和猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)毒株，购自中国兽药监察所。

试剂：

总RNA抽提试剂盒，为天根(北京)生化科技有限公司产品；PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，为宝生物工程(大连)有限公司产品；小量质粒提取试剂盒、小量胶回收试剂盒，均为OMEGA(美国)生物技术公司产品。

氨基载玻片、2×点样缓冲液、预杂交缓冲液、杂交缓冲液,均购自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP：25nmol，PA53021，Lot300989，Amersham Biosciences，UK；洗液Ⅰ：0.1％SDS 2×SSC；洗液Ⅱ：0.1％SDS 0.2×SSC；洗液Ⅲ：0.2×SSC；洗液4：双蒸水。

仪器：

超净工作台：SW-CJ-2FD，苏州安泰空气技术有限公司；

超纯水仪：Milli Qplus，法国产；

梯度PCR仪：P×2，Thermo hybaid，美国产；

高速冷冻离心机3K18型：德国产；

Mini-SUB凝胶电泳装置：意大利产；

电泳仪:POWER Pac300，意大利产；

凝胶电泳图像分析系统2000型：意大利产；

恒温摇床：Thermo Forma，美国产；

核酸蛋白检测仪：Bio-RAD，SmartSpaee TM 3010；

分子杂交仪：Thermo，美国产；

多样品围栏、多样品围栏粘贴工具、多样品围栏盖片，芯片杂交盒均为北京博奥生物公司；

SmartArrayer^TM48，微阵列芯片点样系统：Capitalbio Corporation，北京博奥生物公司；

LuxScan^TM10K微阵列芯片扫描仪：Capitalbio Corporation，北京博奥生物公司；

真空机：SinBo，香港；

CO₂恒温培养箱：Thermo，美国产。

实施例1 本发明试剂盒的制备

1、材料和仪器

同前述实验材料和仪器。

2、实验方法

2.1PCR引物、检测探针的制备

(1)设计病原特异性探针：通过对GenBnak中收录的猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸序列对位排列分析，选定保守区域序列：JEV C、M、E、NS1、NS5；CSFV 5’UTR、3’UTR、Npro、Erns、E2；PRRSV 5’UTR、ORF1b、ORF5、ORF6、ORF7。针对保守序列设计检测探针，从中挑选出特异性强的探针序列。

(2)设计探针序列的特异性引物：针对上述保守探针序列，利用生物信息学软件Primer5设计特异性引物。特异性引物由大连宝生物公司合成。

(3)探针制备：用小量病毒/液体样本RNA/DNA抽提试剂盒提取猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒，利用上述特异性引物对三种病原核酸进行PCR扩增，纯化浓度测定。

PCR扩增体系中优化的参数及其浓度

最终确定扩增探针时Mg²⁺终浓度为2.0mmol/L，dNTP浓度为200umol/L，扩增循环数为35个循环，选择用OMEGA试剂盒从PCR反应液中直接过柱纯化DNA来制备合格的探针浓度和纯度。

优化后PCR扩增体系及条件：

反应条件：l)94℃变性2min；2)94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸30S，共35个循环；3)72℃延伸10min，4℃保持。

(4)探针的筛选:将合成好的探针溶解并适量稀释后用基因芯片点样仪点在氨基化玻璃基片上制成基因芯片，通过杂交试验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明检测基因芯片所需的特异、灵敏的探针：JEV JEV-C(C)、PRM/M(M)；CSFV CSF1(5’UTR)、Erns(Erns)；PRRSV PS9(5’UTR)、Y11(ORF6)。

(5)探针基因组的建立：将胶回收纯化的JEV JEV-C(C)、PRM/M(M)；CSFV CSF1(5’UTR)、Erns(Erns)；PRRSV PS9(5’UTR)、Y11(ORF6)用pMD18-T Vector进行连接，连接体系为pMD 18-T Vector 0.5ul，胶回收探针5.0ul，连接液4.5ul，总量10.0ul。连接反应在16℃下进行16h；将10.0ul探针连接产物加入氯化钙法制备的200ul感受态细胞JM109中，轻轻混匀后冰浴30min，42℃热休克90s后立即放入冰浴中冷却5min，加入800ul LB液体培养基，37℃轻微振荡培养3h。取200ul培养物涂布于含有X--Gal、IPTG、含氨苄的LB琼脂平板培养基，37℃培养过夜，挑选白色菌落进行增菌培养及质粒PCR鉴定并送宝生物测序。

(6)探针基因组的保存：将测序正确的质粒进行扩增培养，并用20％脱脂牛奶作为保护剂进行冻干，至于-80℃保存。

引物和探针的核苷酸序列如下：

SEQ ID NO：1(Prm/M)

源基因来源：JEV SA14-14-2株

基因大小及序列：451bp

catcaacaac acggacattg cagacgttat cgtgattccc acctcaaaag gagagaacagatgctgggtc cgggcaatcg acgtcg gcta catgtgtgag gacactatca cgtacgaatg tcctaagcttaccatgggca atgatccaga ggatgtggat tgctggtgtg acaaccaaga agtctacgtc caatatggacggtgcacgcg gaccaggcat tccaagcgaa gcaggagatc cgtgtcggtc caaacacatg gggagagttcactagtgaat aaaaaagagg cttggctgga ttcaacgaaa gccacacgat atctcatgaa aactgagaactggatcataa ggaatcctgg ctatgctttc ctggcggcgg tacttggctg gatgcttggc agtaacaacggtcaacgcgt ggtatttacc atcctcctgc tgttggtcgc t

SEQ ID NO：2(JEV-C)

源基因来源：JEV SA14-14-2株

基因大小及序列：238bp

gcttgttgga cggcagaggg ccagtacgtt tcgtgctggc tcttatcacg ttcttcaagt

ttacagcatt agccccgacc aaggcgcttt caggccgatg gaaagcagtg gaaaagagtg

tggcaatgaa acatcttact agtttcaaac gagaacttgg aacactcatt gacgccgtga

acaagcgggg cagaaagcaa aacaaaagag gaggaaatga aggctcaatc atgtggct

SEQ ID NO：3(Erns)

源基因来源：CSFV,Erns,强毒株

基因大小及序列：301bp

tcaatggaac ctgagtgaca acggcactaa tggtattcag catgctatgt accttagagg ggttagcagaagcttgcatg ggatctggcc ggaaaaaata tgcaaaggag tccccaccta cctggccaca gacacggaactgaaagaaat acagggaatg atggatgcca gcgaggggac aaactatacg tgctgtaagt tacagagacatgaatggaac aaacatggat ggtgtaactg gtacaatata gacccatgga tacagttgat gaatagaacccaagcagact tggcagaagg c

SEQ ID NO：4(CSF1)

源基因来源：CSFV，5’UTR强毒

基因大小及序列：143bp

acaggacagt cgtcagtagt tcgacgtgag cagaagccca cctcgagatg ctatgtggacgagggcgtgc ccaagacgca ccttaaccct agcgggggtc gctagggtga aatcacacca cgtgatgggagtacgacctg ata

SEQ ID NO：5(PS9)

克隆基因的源基因来源：PRRS US,5'UTRPS9-primer,C14-2分离株

基因大小及序列：174bp

cgtataggtg ttggctctat gccttggcat ttgtattgtc aggagctgtg accattggca cagcccaaaacttgccgcac agaaacaccc ttctgtgata gcctccttca ggggagctta gggtttgtcc ctagcaccttgcttccggag ttgcactgct ttacggtctc tcca

SEQ ID NO：6(Y11)

源基因来源：C14-2分离株，ORF6，PRRS-US type

基因大小及序列：155bp

tcacctccag atgccgtttg tgcttgctag gccgcaagta cattctggcc cctgcccacc acgttgaaagtgccgcaggc tttcatccga ttgcggcaaa tgataaccac gcatttgtcg tccggcgtcc cggctccactacggtcaacg gcaca

SEQ ID NO：7～8(Prm/M-primer)

F 5’CATCAACAACACGGACATTGC3’

R 5’AGCGACCAACAGCAGGAG 3’

SEQ ID NO：9～10(JEV-C-primer)

F 5’GCTTGTTGGACGGCAGAG3’

R 5’AGCCACATGATTGAGCCTTC3’

SEQ ID NO：11～12(Erns-primer)

F 5’TCAATGGAACCTGAGTGACAAC3’

R 5’TATTGTGCCAGTTACACCATCC3’

SEQ ID NO：13～14(CSF1-primer)

F 5’ACAGGACAGTCGTCAGTAGTTC3’

R 5’TATCAGGTCGTACTCCCATCAC3’

SEQ ID NO：15～16(PS9-primer)

F 5’CGTATAGGTGTTGGCTCTATGC3’

R 5’TGGAGAGACCGTAAAGCAGTG3’

SEQ ID NO：17～18(Y11-primer)

F 5’TCACCTCCAGATGCCGTTTG3’

R 5’TGTGCCGTTGACCGTAGTG3’

定位基因(λDNA)的序列(SEQ ID NO：19)

aaagcgaggc tttttggcct ctgtcgtttc ctttctctgt ttttgtccgt ggaatgaaca atggaagtca

acaaaaagca gctggctgac attttcggtg cgagtatccg taccattcag aactggcagg aacagggaat

gcccgttctg cgaggcggtg gcaagggtaa tgaggtgctt tatgactctg ccgccgtcat aaaatggtat

gccgaaaggg atgctgaaat tgagaacgaa aagctgcgcc gggaggttga agaactgcgg caggccagcg

aggcagatct ccagccagga actattgagt acgaacgcca tcgacttacg cgtgcgcagg ccgacgcaca

ggaactgaag aatgccagag actccgctga agtggtggaa accgcattct gtactttcgt gctgtcgcgg

atcgcaggtg aaattgccag tattctcgac gggctccccc tgtcggtgca gcggcgtttt ccggaactgg

aaaaccgaca

SEQ ID NO：20～21(定位基因互补序列的扩增引物)

F：AAAGCGACGCAATGAGGCACT

R：GTTCCACGACCGCAACTGC

2.2标准质粒的构建

2.2.1基因组的抽提

总RNA抽提采用天根的总RNA提取试剂盒，参照说明，具体操作方法如下：

1)直接取200μL病毒尿囊液于1.5mL离心管中，加入600μL裂解液，充分振荡混匀；

2)将匀浆样品在15-30℃放置5min；

3)4℃，12000r/min离心5min，把上清液吸到新离心管中；

4)加200μL氯仿，剧烈上下振荡15sec，室温静置3min；

5)4℃，12000r/min离心10min，样品会产生分层，轻轻地将最上层无色的水相转到新管中；

6)加0.5倍体积无水乙醇，混匀，转移到吸附柱内，4℃，12000r/min离心30sec；

7)加500μL去蛋白液，4℃，12000r/min离心30sec；

8)加600μL漂洗液，静置2min，4℃，12000r/min离心30sec；重复一次

9)4℃，12000r/min离心2min，弃掉残余液体；

10)将吸附柱转到RNase-Free离心管中，加50μL RNase-Free超纯水，室温静置2min，4℃，12000r/min离心2min。离心液即得到的病毒RNA，于-20℃下保存备用或直接进行反转录。

2.2.2探针基因的RT-PCR及PCR扩增

以抽提的RNA为模板，以Random 6primers为引物合成cDNA，反应体系如下：

RT Enzyme Mix	0.5μL
		Random 6primers	0.5μL
5×PrimeScript RT Buffer	2.0μL
		RNA	2.0μL
RNase-Free超纯水	5.0μL
		Total	10.0μL

将上述体系混匀后按下面程序进行cDNA合成：反应程序为37℃，15min；85℃，5sec；4℃，保存。

以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix	12.5μL
		cDNA/DNA	2.0μL
上游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
		下游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
超纯水	9.5μL
		Total	25.0μL

反应条件如下：

PCR完毕后，分别取7μL扩增产物用琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2.2.3探针基因的胶回收

探针基因的胶回收，采用OMEGA小量胶回收试剂盒，参照说明进行回收操作，步骤如下：

1)取20μLPCR产物进行电泳，6V/cm，25min，紫外灯下切胶，称重。按照试剂盒说明进行胶回收；

2)按1:1的比例加入Binding Buffer(XP2)，55℃-60℃水浴直到胶全部融化，期间每隔2-3min上下颠倒离心管；

3)将液体加入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

4)加入300Binding Buffer(XP2)，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

5)加入700mL漂洗液SPW，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

6)室温12000r/min空离2min，倒掉滤液；

7)将吸附柱放于新离心管中，加入30mL洗脱缓冲液，室温静置1min；

8)室温12000r/min离心2min，取7μL回收产物进行电泳，验证回收效果，其余回收产物于-20℃保存备用。

2.2.4探针基因的连接重组

采用pMD19-T Simple Vector克隆试剂盒，进行探针基因的连接重组，具体步骤按说明进行。连接体系如下：

pMD19-T Simple载体	0.5μL
		胶回收PCR产物	5.0μL
Solution I	4.5μL
		Total	10.0μL

4℃连接过夜，连接产物用于转化DH5α感受态细胞。

2.2.5感受态细胞的制备及保存

参考《分子克隆实验指南》氯化钙法^[56]制备DH5α感受态细胞，制备好的感受态细胞分装为100μL/管，直接用于转化或于-70℃保存。

2.2.6连接产物的转化

将100μL感受细胞放在冰上，向其中加10μL连接产物，冰浴30min；42℃水浴热休克90s，快速冰浴冷却5min；立即加入600μL 37℃预热的LB液体培养基(无需冰上操作)，37℃，150r/min振荡培养1h，使受体菌恢复正常生长状态；取150μL培养物均匀涂布于LB平板(含100mg/mL Amp)，晾干，于37℃培养约12h，挑取菌落进行鉴定。

2.2.7探针质粒菌的鉴定及保存

2.2.7.1探针质粒菌的DNA抽提

将阳性质粒菌接种于5mL LB(含100mg/mL Amp)液体培养基中，37℃振荡培养12h；按Omega小量质粒提取试剂盒说明方法提取质粒。具体步骤如下：

1)吸1mL菌液到离心管中，室温12000r/min离心1min，吸弃上清；

2)加入250μL Solution I(4℃储存)，振荡使菌体悬浮；

3)加入250μL Solution II，轻轻地颠倒混匀，静置2min；

4)加入350μL Solution III，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀物，室温12000r/min，离心10min；

5)将上一步的液体转入吸附柱中，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

6)向其加500μL Buffer HB，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；

7)向其加700μL Buffer Wash Buffer，室温12000r/min离心1min，倒掉滤液；重复一次；

8)室温12000r/min空离2min，将柱子装于一个干净的离心管中，向其加30μL Elution Buffer，静置2min，12000r/min离心1min，收集的离心液即为提取的质粒DNA。

2.3.7.2探针质粒菌的PCR鉴定

对提取的探针质粒菌分别进行PCR鉴定，同时以pMD19-T Simple空白载体作阴性对照，反应体系如下：

2×Taq PCR MasterMix	7.5μL
		上游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
下游特异性引物(25.0μmol/L)	0.5μL
		质粒(50倍稀释)	2.0μL
超纯水	4.5μL
		Total	15.0μL

反应程序同上。反应完毕，分别取5μL于2.0％的琼脂糖凝胶进行电泳分析。

2.2.8探针质粒菌的序列测定和分析

采用Sanger双脱氧末端终止法对经过PCR鉴定为阳性的探针质粒菌进行序列测定，序列测定工作交由上海杰李生物技术有限公司完成。

得测序正确的质粒菌T/Prm/M、T/JEV-C、T/Erns、T/CSF1、T/PS9、T/Yll，分别包含SEQ ID NO：1(Prm/M)、SEQ ID NO：2(JEV-C)、SEQID NO：3(Erns)、SEQ ID NO：4(CSF1)、SEQ ID NO：5(PS9)、SEQ ID NO：6(Yll)所述基因片段。

2.2.9探针质粒菌的保存

把序列测定正确的探针质粒菌扩大培养，然后以20％脱脂奶粉作为保护剂冻干，-70℃保存。

2.3芯片制备

(1)芯片矩阵的设计：每张芯片分为四个区，四个区为四个重复阵列，用杂交围栏隔开，以便同时进行三个不同样本的杂交反应。每个阵列参数为：每排探针基因和定位基因均为12个样点，各样点中心间距650um，样点直径为220um。(图1)

基因芯片点制过程中质量控制

点制芯片点样针的选择：用SmartArrayer^TM48点样仪，分别以实心针和夹缝针在氨基化玻片上接触式点样方式进行点样，烘干，并用LuxScan^TM10K微阵列芯片扫描仪分别扫描观察。(注：点样液中添加有少量荧光素)(图2)

点样缓冲液的选择：将定位基因进行标记并纯化，分别用50％DMSO、3×SSC、点样缓冲液稀释到200ng/ul，用SmartArrayer^TM48点样仪在基片上点制，经过后处理固定，扫描观察样点形态。(注：定位基因扩增时用荧光素标记过，以便用于优化过程的质量控制，在基因芯片制备时定位基因和靶基因是没有被标记的)(图3)

点样过程中湿度的优化：用点样缓冲液对标记过的定位基因进行稀释，在40％、50％、60％、70％四个点样湿度下进行点样，烘干，扫描观察样点的形态。(注：点样液中添加有少量荧光素)(图4)

探针和靶基因浓度的确定：选择PRM/M(M)探针，用R点样液稀释成3.0、6.0、12.0、25.0、50.0、100.0、200.0、400.0ng/uL浓度点制芯片，然后用不同浓度(3pg/uL-24000pg/uL)的PRM/M(M)靶基因在48℃下杂交6h，按芯片洗涤程序洗涤后用激光共聚焦扫描仪扫读信号，探讨靶基因和探针浓度变化对杂交信号强度的影响。(图5)

烘培时间的优化：将点有定位基因的芯片分别按0h、2h、4h、8h、12h在80℃原位PCR上或烘箱中烘焙，最后用LuxScan^TM10K扫描，测定荧光信号强度(F2)。(图6)

水合时间的优化：将点有定位基因的芯片在80℃原位PCR上或烘箱中烘焙8h，然后在95℃-100℃水蒸汽上水合，水合时间按10s、20s、40s、60s、120s梯度进行，其他条件按照初步处理方法进行。将后处理好的芯片用杂交液模拟真实杂交条件和洗涤条件进行处理后用LuxScan^TM10K扫描，测定荧光信号强度(F2)。(图7)

紫外交联时间的优化：紫外交联时间按照0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min进行交联，将后处理好的芯片用杂交液模拟真实杂交条件和洗涤条件进行处理后用LuxScan^TM10K扫描，测定荧光信号强度(F2)。(图8)

优化后检测基因芯片的点制：

基因芯片点样缓冲液配制成点样液，将包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA探针、定位基因及阴性质控基因定量至使用浓度即为200ng/ul，加热至95℃保持5min，然后置于冰上冷却10min。

按芯片设计要求在96(384)孔载样板孔内加入稀释变性好的包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA探针、定位基因、阴性质控基因及空白质控缓冲液，封住孔板，用基因芯片点样系统(Microarray Printing System，SpotArrayTM 24)在氨基化基片上接触式点样。点样环境相对湿度为55％-65％，温度15-30℃。

点制好的芯片静置于点样仪上充分干燥过夜(至少6h)，然后用60-80℃水合处理10s，立即于加热至80℃原位PCR仪上烘干，紫外线交联25min后，以0.2％SDS液洗涤5min，再以蒸馏水快速洗涤后离心干燥，密封、室温保存备用。

实施例2 本发明检测方法

1、核酸抽提

病毒RNA的抽提：采用试剂盒方法抽提病毒RNA，试验使用上海华舜产小量病毒/液体样本RNA抽提试剂盒。按该试剂盒说明抽提RNA：

a.即取细胞培养的病毒液300ul反复冻融3次后在4℃下12000×g离心5min。

b.吸取250ul上清液置于离心管中，加入500ul RV液后高速振荡2min后室温静置5min。

c.加入750ul异丙醇，颠倒离心管以混匀。

d.移取750ul至吸附柱中，离心15s。

e.弃收集管中液体，将剩余的裂解物移入吸附柱中离心15s。

f.弃收集液后加入500ul RP液离心30s去除蛋白质。

g.加入500ul W3液，静置lmin后，离心洗涤15s。

h.重复步骤g。

i.将吸附柱转移到另一干净的离心管中，在吸附膜中央加入30ul超纯水，室温静置lmin。

j.12000×g离心1min，离心液为提取的RNA，-70℃保存备用。

病毒RNA的反转录：JEV、CSFV、PRRSV反转录体系20.0ul体系：

反转录反应程序为:

30℃保温10min，42℃反转录3Omin，99℃灭活反转录酶5min，5℃保持。

2、DNA的PCR扩增标记

试验中Cy3-dCTP荧光素使用终浓度为2.5umol/L，加入荧光素时及以后操作均在暗室中进行。按如下程序进行扩增反应程序为反应条件：l)94℃变性2min；2)94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸30S，共35个循环；3)72℃延伸10min，4℃保持。

3、cDNA的多重PCR扩增标记

多重PCR标记体系：

试验中Cy3-dCTP荧光素使用终浓度为2.5umol/L，加入荧光素时及以后操作均在暗室中进行。按如下程序进行扩增反应程序为反应条件：l)94℃变性2min；2)94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸30S，共35个循环；

3)72℃延伸10min，4℃保持。

4、检测

杂交质量优化控制

杂交温度优化：制备包含所有探针的基因芯片，探针浓度为200ng/pL。以各标记靶基因与其分别进行杂交，每种探针和其相应的靶基因均在44℃、48℃、52℃、56℃等不同温度下进行杂交，预杂交lh，杂交6h。最后根据SNR值筛选出探针序列的最佳杂交温度分别为：JEVC在44℃下杂交信号强；PRM/M在52-56℃下杂交信号强；CSF1在44-56℃下杂交信号强，SNR在1.97-6.12之间；Erns在44-56℃下杂交信号强，SNR值在5.21-15.4之间；PRRS_PS9探针在40-56℃下杂交信号强，其SNR值在2.40-4.79之间；Yll特异性较好，其杂交温度范围在40-52℃之间时为最佳。(表1)

预杂交和杂交的影响：试验选择JVE-PRM/M探针研究了不同预杂交和杂交时间对芯片杂交信号的影响。试验设计了预杂交时间0.5和1h，杂交时间0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、6.0h，杂交结束后根据SNR值筛选出探针序列预杂交和杂交时间。结果是预杂交时间和杂交时间长短对检测芯片的杂交效果影响不明显，无论预杂交0.5h或1h，杂交时间是0.5h还是延长至6h，样本信号强度和SNR值变化很小，对于本研究的检测基因芯片，预杂交0.5或lh，杂交1.0-6.0h，都能达到检测目的。(表2)

表1：不同温度下杂交结果

内容Item	44℃	48℃	52℃	56℃	内容Item	44℃
							PRM/M	12.7	12.4	13.3	13.4	PRM/M	12.7
JEV-C	9.27	7.10	8.56	7.64	JEV-C	9.27
							Erns	15.4	6.86	5.21	5.30	Erns	15.4
CSF1	6.12	1.97	1.98	5.28	CSF1	6.12

表2 不同预杂交和杂交时间对杂交信号的影响

预杂交时间(h)	0.5	0.5	1.0	1.0	1.0	1.0
							杂交时间(h)	0.5	1.0	1.5	2.0	3.0	6.0
样本信号强度	2098183	2555380	2604953	2455796	2410464	2234234
							样本SNR值	11.45	17.27	20.48	21.07	21.30	25.57
空白信号强度	112450	132000	135033	112089	109664	110408
							空白SNR值	0.05	0.03	0.03	0.03	0.04	0.03

优化后杂交过程：

芯片的预杂交：取制备保存的基因芯片，95-100℃双蒸水中变性1-2min.其间上下抽提以免在玻片表面形成气泡，立即置95％乙醇中快速冷却后离心干燥，将芯片置于杂交舱中，于芯片点样区加入预杂交液25ul，将盖玻片轻放其上，以免形成气泡，使预杂交液均匀覆盖芯片区，将芯片置于密封的湿盒内于44℃下预杂交lh。

芯片的杂交：吸除预杂交液，将利用单重PCR的标记好的核酸样本和多重PCR标记的核酸样本分别于95℃变性3min后，立即置冰中冷却5min，再与一定量预冷的杂交缓冲液混匀，取该混合液20-40ul加到芯片区，以盖玻片轻放其上，将芯片放入杂交舱内于一湿盒内避光杂交，于48℃杂交温度下杂交6h时间。

基因芯片的洗涤干操：杂交完毕的芯片，各洗涤3min，芯片离心干燥后用于扫描分析。芯片的洗涤在暗室中完成。杂交完毕后，轻轻移去芯片的盖玻片，将芯片放置在玻片架上，立即用温热的洗液1、洗液2、洗液3分别洗涤3min，然后再用三蒸水漂洗.芯片离心干燥后扫读分析。

芯片的扫描分析：离心干燥的基因芯片用基因芯片扫描仪扫描检测。扫描参数为Laserpower 95％，PMGT 75％，分辨率20um，扫描结果以16位TIFF和BMP格式保存图像。

数据输出与处理：根据结果判定样本的阴阳性。

实施例3 特异性试验

一、试验方法

采用实施例1制备的基因芯片，按照实施例2的方法(检测采用优化后的杂交过程)，检测PRRSV、CSFV、JEV、PPV、PRV、PEDV、TGEV七种病毒，以验证本发明基因芯片和试剂盒的特异性。

二、结果

实验结果如图9所示，本发明方法可以有效检出本发明PRRSV、CSFV、JEV，而不会检出其他病毒，如，PPV、PRV、PEDV、TGEV。

实验结果说明，本发明基因芯片和试剂盒的特异性强，不会检出其他病毒。

实施例4 灵敏度试验

一、试验方法

取实施例1制备的6种质粒，核酸蛋白仪测定各质粒的OD₂₆₀，换算成DNA的拷贝数，分别作10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹倍比稀释后，采用实施例1制备的基因芯片，按照实施例2的方法检测(检测采用优化后的杂交过程)。

二、结果

结果如表3～4所示：

表3 基因芯片敏感性检测结果

表4 基因芯片敏感性检测结果

扫描结果和数据显示：当质粒稀释至100倍时，信噪比开始下降，当稀释到10⁶倍时，眼观杂交斑点微弱，但仍检测到荧光信号大于1000，SNR_m>2(此时模板的浓度分别为：PRM/M，8.26×10⁶copies/μL；JEV-C，5.17×10⁶copies/μL；PS8，3.51×10⁶copies/ul；CSF1，4.68×10⁶copies/μL；PS9，7.01×10⁶copies/μL；Y11，6.15×10⁶copies/ul)，说明PRRSV、CSFV、JEV的最低检测浓度均为10⁶copies/ul。

实验结果说明，采用本发明试剂盒和基因芯片检测，PRRSV、CSFV、JEV的最低检测浓度均为10⁶copies/ul，灵敏度高。

实施例6 保存期检测

将制备好的基因芯片，放置于芯片盒中，用真空机干燥密封，分别保存30天、60天、90天、120天利用定位探针和靶探针进行杂交检测验证。

结果显示，在120天时芯片仍能够有效检测，说明本发明试剂盒中，基因芯片的稳定性好。

实施7 采用本发明试剂盒检测病料

一、检测方法

病料的采取与预处理：

1)病料的采取：收集四川省5个市县(德阳、绵阳、资阳、泸州丹林、永川)31份疑似乙脑、猪瘟、蓝耳病的猪繁殖障碍症状的样本，包括扁桃体、肺脏、肝脏和脑髓样本

2)病料的预处理：

器脏组织的处理：将采集的病料用灭菌PBS研磨，加入终浓度1000单位/ml的双抗，37℃下作用30分钟，反复冻融3次并用超声波处理，离心，上清液加体积分数50％氯仿作用15分钟，期间不停振摇，离心，取上清用0.45um微孔滤膜过滤，-20℃保存。

2、从186份临床样本中随机抽取70份，采用实施例1制备的基因芯片，按照实施例2的方法检测(检测采用优化后的杂交过程)。

二、检测结果

表5 猪乙型脑炎病毒单一感染

样品	microarrays
		流产胎儿样	4/10
蚊虫样品	4/10
		总检出率	40％(8/20)

表6 猪瘟病毒单一感染

样品	microarrays
		肺	2/10
淋巴结	2/10
		总检出率	20％(4/20)

表7 猪繁殖与呼吸综合征病毒单一感染

样品	microarrays
		肺	9/10
淋巴结	7/10
		总检出率	80％(15/20)

表8 混合感染

类别	microarrays	检出率
			PRRSV+CSFV	5/10	50％
CSFV+JEV	0	0
			PRRSV+JEV	0	0
PRRSV+CSFV+JEV	0	0

采用试剂盒和基因芯片，20份样品中，流行性乙型脑炎样品的总检出率为40％；20份样品中，猪瘟样品的总检出率为20％；20份样品中，猪繁殖与呼吸综合征的总检出率为80％；10份样品中，猪瘟与猪繁殖与呼吸综合征混合感染的检出率为50％，其余混合感染的检出率为0。

实验结果说明，本发明试剂盒和基因芯片可以有效检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。

综上，本发明基因芯片可以有效检测瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性乙型脑炎病毒，特异性强、敏感性高、耗时短，检测快速，具有良好的应用前景。

Claims

1.一种检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒，其特征在于：它包括猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的基因扩增试剂以及检测用基因芯片；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光染料为Cy3荧光染料或者Cy5荧光染料。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQID NO：20～21所示引物对；所述探针还包括SEQ ID NO：19所示定位探针。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述固相载体为氨基化基片。

6.SEQ ID NO：7～8和/或SEQ ID NO：9～10所示引物对、SEQ ID NO：11～12和/或SEQ ID NO：13～14所示引物对以及SEQ ID NO：15～16和/或SEQID NO：17～18所示引物对，与SEQ ID NO：1或2所示任意一个或者两个基因片段、SEQ ID NO：3或4所示任意一个或者两个基因片段以及SEQ ID NO：5或6所示任意一个或者两个基因片段在制备检测猪流行性乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒中的用途；

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述扩增试剂还包括荧光染料标记的dNTP。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述荧光染料为Cy3荧光染料或者Cy5荧光染料。

9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述试剂盒还包括SEQ IDNO：20～21所示引物对以及SEQ ID NO：19所示的定位探针。

10.根据权利要求6或9所述的用途，其特征在于：所述探针固定在氨基化基片上。